（食品科学专业论文）影响啤酒中有机酸因素的研究.pdf

甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 啤酒中有机酸既是主要呈酸味物质，同时又是决定啤酒p h 值、缓冲性和总 酸的主要因素。啤酒的缓冲性是指啤酒在一定p h 值范围内，具有控制自身p h 值变化幅度的能力，啤酒缓冲性对啤酒质量稳定性有一定影响。适量的酸不仅赋 予啤酒协调的口感，而且可以赋予酒体一定的缓冲能力，有利于提高啤酒的风味 稳定性。但是，啤酒中有机酸种类众多且含量相对较低，影响因素复杂，如何评 价和控制啤酒中的有机酸含量和组成就成了亟待啤酒科技人员解决的难题。 本文在对啤酒中有机酸代谢过程的初步研究基础上，通过对影响啤酒缓冲性 因素的研究，采用了目前国际上广泛应用的s a s 统计分析系统，确定了影响啤 酒缓冲性、p h 值的主体有机酸成分，并对酿造过程中有机酸的影响因素进行了 研究。主要结论如下： 1 有机酸随着发酵过程的进行，其含量是线性增加的。其中一部分有机酸有 着非常亲缘性的代谢途径和生理机制。乙酸作为有机酸的重要组成部分，控制乙 酸的代谢过程很大程度上决定着有机酸含量的高低；不同种类有机酸含量差异的 原因十分复杂，不仅与啤酒酵母在不同生理阶段对某种有机酸的积累，而且与代 谢途径的相关酶系、代谢网络有关，还与有机酸跨膜运输和发酵后期阶段有机酸 的分解有关。 2 从有机酸在酵母代谢中作用及其对啤酒缓冲性、p h 值的影响程度确定了 构成啤酒主体有机酸成分是乳酸、柠檬酸、富马酸、乙酸、琥珀酸。 3 既影响啤酒缓冲性又影响啤酒p h 值的3 种有机酸是乳酸、柠檬酸、乙酸。 正是这些有机酸的双重作用，充分说明了啤酒缓冲性在决定啤酒p h 值及控制其 变化幅度上的重要作用，进一步确立了啤酒中有机酸在酿造过程中重要的指导地 位。 4 。麦汁组成在很大程度上决定了啤酒中有机酸的组成，但是啤酒的发酵过程 决定了啤酒中有机酸含量，原麦汁浓度、麦汁p h 值、发酵温度、酵母菌株、接 种量都对啤酒中有机酸形成有一定影响。 关键词：啤酒，缓冲性，有机酸，p h 值，发酵工艺 甘肃农业大学2 0 0 8 届顾士学位论文 s u m m a r y o r g a n i ca c i d si nb e e ra l eo n eo fi m p o r t a n tf l a v o u rs u b s t a n c e s ，w h i c hh a v et h e i r c h a r a c t e r i s t i cs o u r n e s s ，a n dk e yf a c t o r sw h i c hi n f l u e n c eo nb e e rp h ，b e e rb u f f e r i n g c a p a c i t ya n d t o t a la c i d i t y b e e rb u f f e r i n gc a p a c i t ym e a n st h a tb e e rh a si n t r i n s i ca b i l i t y t oc o n t r o lv a r i a t i o no fi t s e l fp hd u r i n gr a n g eo fb e e rp h i th a sc o r r e l a t i o nw i t hb e e r q u a l i t ys t a b i l i t ya ts o m ee x t e n t o p t i m a la m o u n to fo r g a n i ca c i d sc a nb r i n gb e e r h a r m o n i o u sm o u t h f e e l ，b u ti ft h ec o n t e n to fs o m eo r g a n i ca c i di sh i g h e r , i tc o u l d c a u s ec h o a s eo ro b v i o u ss o u r n e s st a s t e s oi ti sn e c e s s a r yt od e c i d et h e m a j o r c o m p o n e n t so fo r g a n i ca c i d sw h i c hs i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c eo nb e e rm o u t h f e e la n ds e t u pa ne v a l u a t i o ns y s t e ma c c o r d i n gt ot h eo r g a n i ca c i d si nb e e r i nt h i sp a p e r , t h em e t a b o l i s mo no r g a n i ca c i d si nb e e rw a ss t u d i e da tf i r s t t h e n t h ee f f e c to ff a c t o r so nb e e rb u f f e r i n gc a p a c i t ya n db e e rp hw a sr e s e a r c h e d ，a n du s i n g i n t e r n a t i o n a lw i d e l ya p p l i e ds t a t i s t i c a la n a l y s i ss y s t e m ，t h em a j o rc o m p o n e n t so f o r g a n i ca c i d sw h i c hi n f l u e n c e do nb e e rb u f f e r i n gc a p a c i t ya n db e e rp hw e r e d e t e r m i n d e d t h ei n f l u e n c ef a c t o r so fo r g a n i ca c i d si nb r e w i n gw a sa l s os t u d i e d t h e m a i nc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 w i t ht h eo r g a n i ca c i d s f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，i t sc o n t e n ti st h el i n e a ri n c r e a s e p a r to fo r g a n i ca c i d sh a st h eg e n e t i cp a t h w a ya n dp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m s a sa l l i m p o r t a n tp a r to fo r g a n i ca c i d s ，c o n t r o l l i n ga c e t i ca c i dm e t a b o l i s mt oal a r g ee x t e n t d e t e r m i n et h ec o n t e n to ft h eo r g a n i ca c i d s ；d i f f e r e n tt y p e so f o r g a n i ca c i dc o n t e n to f t h er e a s o n sf o rt h ed i f f e r e n c ei sv e r yc o m p l i c a t e d ，n o to n l yw i t hb r e w e r sy e a s ti na d i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a ls t a g eo ft h ea c c u m u l a t i o no fo r g a n i ca c i d s ，b u ta l s ow i t ht h e m e t a b o l i cp a t h w a y sr e l a t e de n z y m e s ，m e t a b o l i cn e t w o r k s ，w i t ht h ef e r m e n t a t i o no f o r g a n i ca c i d st r a n s m e m b r a n et r a n s p o r ta n da d v a n c e ds t a g eo fd e c o m p o s i t i o no ft h e o r g a n i ca c i d s 2 i na c c o r d a n c ew i t ht h er o l eo fo r g a n i ca c i d si ny e a s tm e t a b o l i s m ，t h ee f f e c to f o r g a n i ca c i d so nb e e rb u f f e r i n gc a p a c i t ya n db e e rp ha n dt h em a j o rc o m p o n e n t so f l i 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 o r g a n i ca c i d si nb e e rw e r ed e t e r m i n d e d ，a n dt h e yw e r ec o m p o s e do f l a c t i ca c i d ，c i t r i c a c i d ，f u m a r i ca c i d ，a c e t i ca c i da n ds u c c i n i ca c i d 3 t h e r ew e r et h r e eo r g a n i ca c i d si n c l u d i n gl a c t i ca c i d ，c i t r i ca c i da n da c e t i ca c i d ， w h i c hi n f l u e n c e do nn o to n l yb e e rb u f f e r i n gc a p a c i t yb u ta l s ob e e rp h b e c a u s eo ft h e d o u b l ee f f e c to ft h e s eo r g a n i ca c i d s ，t h ec o n c l u s i o nt h a tb e e rb u f f e r i n gc a p a c i t yp l a y a n i m p o r t a n tr o l ei nd e t e r m i n i n gb e e rp ha n dc o n t r o l i n gv a r i a t i o no fb e e rp hw a s c o n f i r m e d t h ei m p o r t a n ta n di n d i c a t i v ep o s i t i o no f o r g a n i ca c i d si nb r e w i n gp r o c e s s w a se s t a b l i s h e d 4 a l t h o u g ht h ec o m p o s i t i o no fo r g a n i ca c i d si nb e e rd e p e n d e do nc o m p o s eo f w o r ta tg r e a te x t e n t ，t h ec o n c e n t r a t i o na n dp r o p o r t i o no fo r g a n i ca c i d si nb e e rw e r e d e t e r m i n d e di nf e r m e n t a t i o n p r o c e s s i n g o r i n g i n a l w o r t e x t r a c t ，w o r tp h ， f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，y e a s ts t r a i na n dp i t c h i n gr a t ea l lh a ds o m ei n f l u e n c eo nt h e f o r m a t i o na n dc o n t r o lo fo r g a n i ca c i d si nb e e r k e y w o r d s ：b e e r , b e e rb u f f e r i n gc a p a c i t y , o r g a n i ca c i d s ，b e e rp h ，f e r m e n tt e c h n o l o g y i i i 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 皇曼皇蔓曼皇皇璺曼曼鼍曼曼鼍曼鼍鼍皇曼曼鼍曼曼皇曼皇量! 曼曼曼曼曼蔓曼曼曼曼鼍皇曼皇曼! 舅曼曼曼皇。一一一一一一i i i 量i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 舜争 4 7 签字日期：月乡日 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第一章绪论帚一早珀t 匕 啤酒是由麦汁经啤酒酵母发酵后产生的一类风味独特的含酒精饮料，其独特 的风味主要是由酵母在麦汁中的总体代谢产物所产生并决定的( 顾国贤1 9 9 6 ) 。 啤酒的主要风味物质包括：醇类、酯类、羰基化合物、有机酸、硫化物、胺以及 酚类等物质，其中啤酒中的有机酸类物质不仅是啤酒的重要风味、口味物质，而 且还在一定程度上决定和影响着啤酒酒体的p h 值以及酒体的缓冲能力，进而刑 啤酒的生物稳定性和非生物稳定性产生重要的影响( t h o m a s2 0 0 1 ) 。 另外，由于有机酸本身所具有的酸味和特殊口味，使得它对酒类风味影响的 重要性仅次于酯类( d b l a n c og o m i s1 9 9 2 ) 。而且酸类物质虽然并不构成啤酒的香 味，但它是主要呈昧物质。啤酒中适量的酸会使啤酒口感好、爽口；缺乏酸味， 啤酒口感呆滞、粘稠、不爽口；而过量的酸又使啤酒口感粗糙、不柔和、不协调 ( m a r o ld e k k e r1 9 9 2 ) ，同时过量的酸也意味着啤酒发酵异常，是污染产酸菌的标 志。各国对啤酒总酸都规定了最高含量。可见，酸对啤酒质量影响非常之大。 国外从2 0 世纪5 0 年代左右开始对麦汁、啤酒中的有机酸及其代谢进行研究。 目前，我国啤酒工业研究人员也已经开始重视啤酒中有机酸的研究，但是研究工 作还只是刚刚起步。因此，有必要对啤酒中的有机酸进行系统的总结以及研究， 找出影响有机酸的重要因素，以及通过控制有机酸的含量和比例改善并且进一步 提高我国啤酒质量( s c h n e i d e r19 8 7 ) 。 1 1 啤酒中有机酸的来源及分类 啤酒中的有机酸主要来自麦芽、用于工艺调节的外加酸和发酵过程中酵母 的代谢。 来源于麦芽中的酸可分为麦芽中的原始总酸和糖化过程生化反应产生的酸。 存在于麦芽中的原始总酸主要有磷酸，其次还有甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、苹 果酸、琥珀酸、草酸、硫酸、丙酮酸、乳酸、高级脂肪酸和各种氨基酸等( 陈思 妩，萧熙佩1 9 9 0 谷桐彦等2 0 0 4 ) 。这些酸主要是在发芽过程中通过一系列生化反 应形成的。例如：磷酸酶对有机化合物分解释放出磷酸；糖类缺氧呼吸产生少量 有机酸：氨基酸的碱性氨基被利用，生成相应的酮酸；麦粒中硫化物转化成少量 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 硫酸等。糖化中生化反应产生的酸是在糖化开始后，由麦芽所含磷酸盐的分解和 蛋白质分解成氨基酸形成的( s o u t h19 9 5 ) 。 来源于发酵产酸酵母菌在进行酒精发酵的同时也形成许多有机酸。其中包括 酮酸、羟酸、羧酸及脂肪酸等( 管敦仪1 9 9 8 ) 。酮酸中主要有丙酮酸和a 酮戊二 酸。丙酮酸是糖酵解途径产物；a 酮戊二酸是三羧酸循环的中间产物。羟酸的主 要代表是乳酸。羧酸主要有苹果酸、柠檬酸和琥珀酸，它们都是在三羧酸循环中 形成的。脂肪酸以乙酸为主，是丙酮酸歧化反应形成的。此外，少量乙酸菌、乳 酸菌会产生相应的酸( b a m f o r t h1 9 9 9 ) 。 根据测定方法的不同，可将有机酸分为挥发性酸和非挥发性酸( 固定酸) 两大 类。挥发酸是用蒸汽蒸馏后测定的，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸以及其它脂肪 酸，其中以乙酸为主。非挥发性酸包括丙酮酸、a - 酮戊二酸、乳酸、苹果酸、琥 珀酸、柠檬酸、酒石酸等( b a t t e r m a n n1 9 9 1 ) 。 1 2 啤酒中有机酸的测定方法 测定发酵产品中有机酸的方法包括比色法、荧光法、薄层层析法( t l c ) 、酶 法、分光光度法、气固或气液色谱法( g s c 或g l c ) 以及高效液相色谱法 ( h p l c ) ( k a s a i1 9 7 5 黄志先，戴仁泽1 9 8 5b e l l1 9 9 1s a r i p1 9 9 3f a l q u e 1 9 9 6 ) ，其中气相和液相色谱法是目前最精确和直接的方法。无锡轻工大学食品 学院肖刚，杨严俊，邬仁娜( 肖刚，杨严俊，邬仁娜1 9 9 7 ) 等人采用有机溶剂萃取 啤酒中游离脂肪酸( c 6 ：0 c 1 2 ：0 ) ，并用毛细管色谱测定了市售啤酒中c 6 ：0 c 1 2 ：0 含量。其相对偏差在1 6 到4 9 ，回收率在8 3 8 9 到1 0 2 1 。青岛啤酒集团 公司科研中心的科研人员( 武千钧，张沛，王家林1 9 9 9 ) 采用气相色谱法准确的测 定了啤酒中辛酸n - 十二碳酸共1 1 种游离脂肪酸。 1 3 啤酒中有机酸的作用 1 3 1 啤酒中有机酸对风味的影响 啤酒中的有机酸类物质是酒体口味的重要组成部分，它们赋予酒体特定的口 感和味道。所有的有机酸都给人以酸感，但是不同有机酸则有其特有的风味或味 道，从而使类型、风格不同的啤酒具有自己独特的风味( 刘邻渭1 9 9 8 朱宝镛 1 9 9 5 ) 。例如，柠檬酸具有与苹果酸不同的淡酸味，而琥珀酸除了具有自身的酸 2 甘肃农业大学20 0 8 届硕士学位论文 量量曼曼皇量曼曼曼皇皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼鼍鼍曼i 一i l l i l l l 鼍皇詈量曼曼曼鼍蔓曼曼曼皇曼曼皇量曼曼量曼曼皇曼曼曼! 皇曼皇曼曼皇皇皇曼曼曼曼曼 味外，还呈现一种特殊的咸味、苦味。脂肪酸中的乙酸具有对味觉后部有刺激的 香味特性( 见表1 1 ) ( w h i t i n g1 9 7 6 ) 。每一种长链的脂肪酸都有自已的香味特性， 但是在酒精饮料中这种香味令人不愉快( h e n k1 9 9 1p o l l o c k1 9 8 1d a v i d 1 9 9 4 孙明波1 9 9 1 ) 。啤酒中适宜的p h 值和可滴定总酸能赋予啤酒柔和清爽的 口感，缺乏酸类啤酒呆滞，粘稠，不爽口。而过量的酸又使啤酒口感粗糙，不柔 和，不协调( l e o1 9 9 2 ) 。 表1 1 啤酒中有机酸的风味阂值及风味特征 1 h b l e l 1f l a v o rt h r e s h o l da n df l a v o rc h a r a c t e r i s t i co fo r g a n i ca c i d si nb e e r 1 3 2 啤酒中有机酸对及啤酒p h 值的重要影响 2 0 0 1 年，b a m f o r t h ( b a m f o r t h2 0 0 1 ) 在对啤酒p h 值的综述中，提出影响啤 酒p h 值的主要因素是麦汁缓冲容量和发酵过程中形成的有机酸。 大量研究表明，啤酒p h 值对啤酒质量稳定性( 包括风味稳定性、非生物稳定 性、生物稳定性、泡沫稳定性) 具有重要影响( 见表1 2 ) ( b r e n n e r1 9 7 2r i g b y1 9 7 2 ) 。 但影响啤酒p h 值和缓冲性的主要有机酸成分还不清楚，有待进一步研究以期对 啤酒酿造有一定指导意义。 3 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论丈 寡一一_ i , i 鼍曼曼曼舅舅曼蔓寰 表1 2 国外关于啤酒p h 值对啤酒质量稳定性影响的研究 t a b l e l 2s t u d yo f t h ee f f e c tb e e rp ho nb e e rs t a b i l i t yi no t h e rc o u n t r i e s 1 3 3 啤酒中有机酸对啤酒缓冲性的重要影响 1 3 3 i 啤酒缓冲体系概念的初步形成 1 9 8 1 年，h a m m o n d ( h a m m o n d1 9 8 1 ) 曾经提出啤酒中主要缓冲物是多肽和 4 甘肃农业大学20 0 8 届硕士学位论文 量量曼量皇曼曼曼曼曼曼曼皇曼量曼皇曼曼曼皇量曼曼舅寰曼皇舅皇i i； i 曼量曼曼舅曼皇曼蔓曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼量量 有机酸。 1 9 9 0 年，t a y l o r ( t a y l o r1 9 9 0 ) 在对啤酒p h 值控制的研究中，首先正式提 出麦汁和啤酒缓冲体系的概念。他认为麦汁和啤酒中主要缓冲物质是天冬氨酸、 谷氨酸及含有这些氨基酸的肽类和有机酸( 如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、丙酮酸) 。 2 0 0 1 年，b a m f o r t h ( b a m f o r t h2 0 0 1 ) 在对啤酒p h 值的综述中，更全面地提 出了从缓冲体系的角度，把握啤酒p h 值的研究。b a m f o r t h 还同时认为从缓冲溶 液角度出发，啤酒和麦汁中的主要缓冲物质应选择其p k a 值在啤酒p h 值范围内 的物质组成。他认为缓冲体系中缓冲物质的组成和浓度，决定着麦汁和啤酒的 p h 值。麦汁和啤酒中主要缓冲物质是含有天冬氨酸、谷氨酸残基的肽类和有机 酸。 但影响麦汁和啤酒缓冲性的主次因素还未有进一步研究，有机酸对啤缓冲性 的贡献程度也还需深入研究。 1 3 3 2 啤酒缓冲力概念的提出 19 6 5 年，m a c k e n z i e ( m a c k e n z i e19 6 5 ) 等在对发酵过程中不挥发性有机酸 及p h 值变化的研究中，首先引入了缓冲能力的概念。他将麦汁和糖化醪的缓冲 能力定义为：1 0 0 m l 麦汁或糖化的p h 值从5 6 上升至7 0 所消耗n a o h 的毫升 数。 1 9 9 0 年，t a y l o r ( t a y l o r1 9 9 0 ) 在对啤酒p h 值控制的研究中，将缓冲容量 的概念定义为一个比值，即单位【旷】变化所消耗的 h + 】或 o h 。】的浓度。 啤酒缓冲容量是从总体上衡量啤酒缓冲能力大小的尺度。啤酒缓冲容量大小 与缓冲组分的总浓度和浓度比相关。我们在对啤酒缓冲体系的研究中，综合考虑 上述定义，认为在啤酒是偏酸( p h 值3 8 4 3 ) 的前提条件下，用h c l 滴定更 能贴近缓冲物质实际缓冲力的值。具体计算方法为缓冲力= 加入的【h + 】摩尔数溶 液中增加的【h + 】摩尔数。相同p h 值的麦汁和啤酒可能具有不同的缓冲力，而不 同p h 值的麦汁和啤酒也可能具有相同的缓冲力。这就使得我们可以进一步推论： 影响啤酒p h 值和缓冲性的主要因素可能既有区别又有联系。 1 3 3 3 有机酸对啤酒缓冲性的重要影响 19 0 6 年，c o o t e 和k i r s o p ( c o o t e19 7 6 ) 研究发现全麦麦汁和啤酒具有相似 的缓冲容量。他认为发酵过程p h 值的降低主要是酵母对麦汁中缓冲物质的消耗 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 和有机酸释放所造成的。 1 9 9 0 年，t a y l o r ( t a y l o r1 9 9 0 ) 对麦汁缓冲容量对啤酒p h 值的影响进行研 究。研究发现虽然从全麦麦汁到啤酒这个过程中，缓冲体系的主要缓冲物质发生 了变化，但是整个缓冲体系的缓冲容量保持相对不变。麦汁或啤酒缓冲容量在一 定程度上控制着成品啤酒p h 值及其变化幅度。掌握酿造过程中缓冲容量的变化 是控制成品啤酒p h 值的最有效办法。 许多研究事实表明( c h r i s2 0 0 1d a v i d1 9 9 4d o n h a u s e r1 9 9 4f u r u k u b o1 9 9 3 ) ： 从麦汁到啤酒这个过程中，唯一大量存在的缓冲物质就是有机酸和磷酸盐。因为 做为麦汁缓冲物质之一的氨基酸，在发酵过程中大部分都被酵母消耗，形成有机 酸及其他风味物质。而脂肪酸在定型麦汁和啤酒中的浓度很小，所以从缓冲物质 浓度这个角度讲，脂肪酸对啤酒和麦汁缓冲性的贡献很小，在啤酒缓冲性上没有 深入探讨的意义。 同时从麦汁到啤酒这一过程中p h 值是逐渐下降的，这也说明影响啤酒p h 值的主要因素是发酵过程中形成的有机酸。 因此啤酒中的有机酸既决定着啤酒的p h 值，又控制着啤酒p h 值的变化幅 度，是造成啤酒p h 值与缓冲容量既有区别又有联系的主要因素。但是啤酒中的 有机酸种类较多，确定影响啤酒p h 值与缓冲容量的主体有机酸成分是项具有 深远影响的工作。 1 4 国外啤酒有机酸研究概况 啤酒中主要有机酸包括乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、酮酸、乙 酸及长链不饱和脂肪酸。啤酒发酵过程中形成的多种有机酸，使发酵液p h 值很 快降低，口感趋于协调。发酵过程中形成的多数有机酸对啤酒风味、p h 值、缓 冲性有一定影响( m a c k e n z i e1 9 6 5 ) 。 随着色谱理论的发展与完善，人们对有机酸的重要作用将会有更清楚的认 识。1 9 7 3 年，英国c o o t e & k i r s o p ( c o o t e & k i r s o p1 9 7 3 ) 采用硅酸凝胶柱色谱 法测定了1 6 种市售啤酒中有机酸的含量。1 9 9 0 年，美国l o ye b a r b e r ( l o ye b a r b e r1 9 9 0 ) 分别采用离子色谱法和酶法测定了5 种市售啤酒中6 种有机酸的含 量。 1 5 发酵过程中有机酸的分泌机理以及影响因素的研究 1 5 1 发酵过程中有机酸的分泌机理 其机理为酵母在有氧状态下呼吸时，经过e m p 途径生成的丙酮酸经p d h 6 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 ( 丙酮酸脱氢酶系统) 脱氢生成乙酰辅酶a ，后者进入t c a 环被完全氧化生成 二氧化碳和水，并产生大量的a t p 。在t c a 循环中同时合成核酸、氨基酸的前 体物质，如柠檬酸、异柠檬酸，这些有机酸类物质也会分泌到啤酒发酵醪中去。 在进行有氧呼吸的细胞中，分子氧被用作最终的质子受体，葡萄糖被完全氧化， 同时在呼吸酵母中n a d + 通过氧化磷酸化和t c a 循环完成再生( 张星元1 9 9 7 ) 】。 当从供氧条件转入厌氧条件后，丙酮酸脱氢酶系统( ( p d h ) 被丙酮酸一甲酸裂 合酶替代，a 酮戊二酸脱氢酶合成受阻遏，延胡索酸还原酶被诱导合成，从而构 成从草酸到琥珀酸的逆t c a 环的还原途径。这时t c a 环的环式运行方式被中断， 变成如图1 1 所示的分叉途径，形成还原支路和氧化支路，由于这时氧化支路的 酶也受到一定程度的阻遏，t c a 环中的中间产物虽然仍有合成但是合成速度下 降，与此同时，细胞呼吸链功能下降，氧化磷酸化减弱，胞内a t p 浓度下降， 细胞生长速率下降，细胞转入发酵状态，由于酸类中间代谢产物的积累，胞内 p h 值会降低；另一方面，在糖降解途径中消耗的辅助因子n a d + 在厌氧条件下 就不可能选择氧作为最终质子受体，那么只能选择其它的物质作为质子受体，这 时包括双乙酞、富马酸、草酞乙酸、乙醛等物质就会作为最终的质子受体，进而 细胞内就会产生并积累一定量的有机酸类物质( 董霞2 0 0 3 ) 。 i 峄 。o 篡、一。乙赢瓤赴弋乏嗣嘲队乙硪葶哪 。、弋 薹反声x 差革厂、 一彳”l 鼬酸卜瞅黛 麓k口一灞 一 1 5 2 影响发酵过程中有机酸分泌的主要因素的研究 影响发酵过程中以及啤酒中有机酸含量的因素有很多，包括原料、麦汁制 备工艺、菌种以及发酵条件等各个方面。啤酒麦汁的浸出物中，糖类约占9 0 7 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 左右，其中葡萄糖和果糖约占糖类物质的1 0 ，麦芽糖约占4 5 - - 一5 0 ，麦芽三 糖约占1 0 一 1 5 ，d p 4 8 的寡糖约2 0 2 5 。还有少量的戊糖和戊聚糖、b 葡 萄糖和异麦芽糖( 约占3 5 ) 。麦芽四糖以上的寡糖、戊糖、异麦芽糖等均不能 被酵母利用。啤酒酵母对各种可发酵性糖类的发酵，均是通过e m p 途径代谢生 成丙酮酸后，进入有氧t c a 循环或无氧酶解。在正常情况下，约有1 5 2 5 的糖类转化成发酵副产物，比如高级醇、有机酸和酯类等。所以麦汁中糖类组成 对最终啤酒中有机酸的含量和比例有着显著的影响( b e l l1 9 9 1 ) 。 麦芽蛋白质水解最终产物一氨基酸是合成啤酒酵母含氮物质的主要来源，在 啤酒发酵初期，接种啤酒酵母必须通过吸收麦汁中的含氮化合物，用于合成酵母 细胞蛋白质。酵母的氨基酸代谢与t c a 循环有着紧密的联系，不同的氮源组成， 不仅对酵母的增值有显著的影响，而且对酵母的代谢，各类风味副产物的形成有 重要影响。 酵母是整个发酵的灵魂，酵母菌种的特性深刻的影响到糖类的发酵、氨基酸 的同化、酒精和发酵副产物的形成、啤酒的风味、啤酒的稳定性等方面，在选择 优良酵母的条件下，还必须注意啤酒酵母菌株对发酵过程的影响。尤其是接种酵 母的活力对发酵过程中的有机酸含量和比例有着显著影响。加拿大萨斯喀彻温 ( s a s k a t c h e w a n ) 大学的n e e l a k a n t a m v n 等人( n e e l a k a n t a m2 0 0 1 ) 。研究了部分有 机酸对酵母细胞胞内p h 值以及酵母活力的影响。研究表明发酵过程中和最终发 酵液中各种有机酸的含量和酵母的活力、酵母胞内p h 值都有密切的关系 ( c a s s i o1 9 8 7c h e n g1 9 9 9 ) 。 1 6 立题背景 啤酒和麦汁是一个由多种缓冲物质组成的缓冲体系。啤酒缓冲容量是衡量啤 酒缓冲性大小的尺度。对于啤酒缓冲性的研究，目前国内外相关的详细报道较少， 但是在美国、英国等越来越引起广泛重视。认识到啤酒p h 值和缓冲性的对啤酒 质量的重要影响，则有必要对啤酒缓冲体系进行全面深入研究，特别是有机酸与 啤缓冲性关系的研究更有理论与现实意义。 酒类饮料的生产和消费在我国国民经济中占有十分重要的地位，尤其是啤酒 的生产和消费，自2 0 0 2 年起中国的啤酒产量己连续两年位居世界第一，人均消 费量也有较大幅度的增长。国内外对葡萄酒、黄酒中的部分有机酸研究较多，而 8 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 啤酒中的有机酸还没有引起足够的重视，研究工作还只是刚刚起步。因此，有必 要对啤酒中的有机酸进行系统的总结以及研究。 1 7 主要研究内容 ( 1 ) 啤酒中有机酸变化趋势的初步研究。 ( 2 ) 啤酒缓冲体系组成的研究。 ( 3 ) 啤酒酿造过程中影响有机酸因素的研究。 9 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 第二章啤酒中有机酸的变化趋势 2 。l 前言 有机酸是啤酒中的主要呈味物质包括柠檬酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、乳 酸、甲酸、乙酸等，要研究有机酸，首先要研究有机酸在整个发酵过程中的变化 趋势。本章主要考察啤酒中的各种有机酸含量在不同发酵阶段的变化过程，绘出 变化曲线图，从而通过研究有机酸的含量变化来研究各有机酸变化趋势。通过试 验发现发酵过程中的各个阶段，啤酒中的有机酸含量都会发生变化，且变化曲线 都有所不同。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要材料 宁波澳麦、大连加麦，某啤酒有限公司提供；粳米，市售粳米：b d 酵母1 代、2 代、3 代，某啤酒有限公司提供；酵母、青岛酵母，实验室保藏菌株；苦 型酒花，某啤酒有限公司提供。 2 2 2 主要试剂 甲醇( 色谱纯) ，永华精细化学品有限公司出：乙酸( a r ) ，中国医药集团上海 化学试剂公司；天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、 苏氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、丙 氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，中国科学院上海生物化学研究所；蔗糖、葡萄糖、麦 芽糖，中国医药集团上海化学试剂公司。 2 2 3 主要仪器设备 糖化仪，l b 一8 ，瑞士一l b 公司；液相色谱2 6 9 5 型，美国沃特斯公司：离 子色谱8 6 1 型，瑞士万通公司；超纯水系统m i l l i q 型，美国m i l l i 公司；可 见紫外分光光度计u v q 4 5 0 型，日本岛津公司：s c a b a 全自动啤酒分析仪 l 5 6l0 5 0 2 7 型，瑞士f o s s 公司；a n t o np a a r 啤酒分析仪i 型，奥地利a n t o np a a r 公司：精密恒温水浴锅n e s l a b 型，瑞士f o s s 公司：电热恒温鼓风干燥箱 1 0 1 b 2 型，浙江萧山科学仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱d h g 9 0 3 0 型，立式灭 菌锅l m q r - 4 0 6 0 型，山东新华医疗器械股份有限公司；生化培养箱 1 0 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 皇曼曼曼鼍曼曼曼皇皇曼曼曼兰皇曼曼量鼍曼曼曼皇曼曼皇ii 曼! 曼曼曼曼量皇皇曼曼曼曼曼皇曼量曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼 l r h - - 2 5 0 a 型，广东省医疗器械厂：酸度计d e l t a 3 2 0 型，梅特勒一托利多( 上 海) 有限公司；电子天平a e 一2 0 0 s 型，梅特勒一托利多( 上海) 有限公司；微 孔过滤器，上海医疗工业研究院；注射器( 5 m l ) ，上海注射器厂；移液枪，日本 制造；t g l 1 6 c 型高速离心机，上海安亭科学仪器厂：附温比重瓶( 2 5 m l ) ，江 苏海门青龙港仪表厂：恒温磁力搅拌器7 9 3 型，上海司乐仪器厂。 2 2 4 测定方法 2 2 4 1p h 值，总酸国标法( 啤酒国家标准1 9 9 1 ) 2 2 4 2 麦汁氨基酸的测定：色谱分离柱：w a t e r sc 1 84 岬3 9 m m 1 5 0 m m ，流 动相：色谱纯乙腈，高纯水，w a t e r s a c c q t a g 缓冲液，检测器波长：u v 2 4 8 n m ； 流速：1 0 m l m i n ；进样量：l o l l ；柱温：3 7 2 2 4 3 麦汁糖组分的测定：色谱分离柱：w a t e r sn o v a p a k4 岬4 6 m m x 2 5 0 m m ， 流动相：7 5 乙腈；示差检测器温度：4 0 c ；流速：1 4 m l m i n ；进样量：1 0 p l ； 柱温：4 0 2 2 。4 4 按表2 1 的数据自己配制培养基，在发酵之前先把培养基的p h 值调到 5 4 5 ，再进行实验室三角瓶发酵，主酵温度1 2 ，接种量1 3 5 0 万r n l ，发酵周 期为1 1 天。 表2 1 自配培养基组成 t a b l e lt h ec o m p o s i t i o no fs e l f - m e d i u m 表2 1 中氨基酸含量为总量，其具体添加量按表2 2 数据添加。 表2 2 氨基酸添加量 单位：m g l t a b l e 2t h ea d d i n gc o n t e n to f a m i n oa c i d u n i t s ：m g l 2 2 4 5 啤酒中有机酸的测定 测定啤酒中有机酸的方法包括比色法、荧光法、薄层层析法( t l c ) 、酶法、 分光光度法、气固或气液色谱法( g s c 或g l c ) 以及高效液相色谱法( h p l c ) ( ( k a s a i1 9 7 5 黄志先，戴仁泽1 9 8 5b e l l1 9 9 1s a r i p1 9 9 3f a l q u e1 9 9 6 ) ) ， 其中气相和液相色谱法是目前最精确和直接的方法。无锡轻工大学食品学院肖 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 曼皇曼皇寰ii l l 舅曼量皇曼皇曼舅曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼舅曼曼! 皇曼量皇曼曼曼曼曼曼! 曼皇詈曼皇量曼曼曼量毫舅曼曼曼曼皇皇量 刚，杨严俊，邬仁娜( 肖刚1 9 9 7 ) 等人采用有机溶剂萃取啤酒中游离脂肪酸 ( c 6 ：0 , - c 1 2 ：0 ) ，并用毛细管色谱测定了市售啤酒中c 6 ：0 - 4 2 1 2 ：0 含量。 本实验采用离子色谱法( 武千钧1 9 9 9b a r b e r1 9 9 0 ) ，先把样品前处理，处 理方法为取发酵液1 2 5m l 用丙酮溶液定容至2 5 m l ，即稀释2 0 倍，用0 2 1 x m 微 孔过滤膜过滤，制成样品，然后把样品放入离子色谱仪进行检测得出有机酸种类 及含量。 离子色谱仪分析有机酸条件：流动相0 3 m m o l lh 2 s 0 4 + 1 5 a c e t o n ( 丙酮) ； 进样体积2 0 此；柱温2 0 0 c ；恒温模拟及数字输出式电导检测器。 2 2 4 6 协定糖化麦汁的制备 2 3 结果与分析 2 3 1 啤酒发酵过程中有机酸变化趋势的研究 2 3 1 1 啤酒发酵过程中有机酸总量变化趋势的研究 从图2 1 可以看出有机酸总量随着发酵时间的延长是递增的，发酵前两天有 机酸含量的增加呈直线上升，之后平稳上升，在第六天与第八天之间则含量变化 不明显。 7 j 害 蜊 蠖 链 墨 枢 5 0 0 4 0 0 0 0z 4 6 81 0 发酵天数d 图2 1 啤酒发酵过程中有机酸总量的变化趋势 f i g u r e 2 1 t r e n dd i a g r a mo f o r g a n i ca c i d si nb r e w i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s i n g 2 3 1 2 啤酒发酵过程中乙酸含量的变化趋势 由图2 2 可知，乙酸含量的变化曲线与有机酸总量的变化曲线相似，而且乙 酸含量占有机酸总量比例很高，因此，可以说乙酸的含量决定着有机酸的含量。 从发酵液的乙酸变化情况来看，发酵时间的延长会明显导致发酵液中乙酸含量的 增加，这会对啤酒柔和协调的口感产生不利影响，因此应采取快速发酵的方法可 减少乙酸的产量。 1 2 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 3 0 0 2 5 0 j 乙2 0 0 目 篓1 5 0 冀1 0 0 忙 5 0 o 02468l o 发酵天数d 图2 2 啤酒发酵过程中乙酸含量的变化趋势 f i g u r e 2 2t r e n dd i a g r a mo fa c e t i ca c i di nb r e w i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s i n g 2 3 1 3 啤酒发酵过程中苹果酸含量的变化趋势 丙酮酸脱羧转化为乙酰辅酶a 进入t c a 循环产生苹果酸，从图2 3 我们可 以看到苹果酸含量一直是上升的，这表明在酵母细胞衰老凋亡时，苹果酸不利于 作为经济性碳底物未能被回归酵母细胞内，大部分通过代谢分泌到细胞外并滞留 于发酵液中；而且越在发酵后期积累的越多。 024681 0 发酵天数d 图2 3 啤酒发酵过程中苹果酸含量的变化趋势 f i g u r e 2 3t r e n dd i a g r a m o fm a l i ca c i di nb r e w i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s i n g 2 3 1 4 啤酒发酵过程中琥珀酸含量的变化趋势 琥珀酸和苹果酸同处于t c a 三羧酸循环的链环上，琥珀酸代谢过程如图4 所示。由图2 4 可知，琥珀酸的含量随着发酵时间的延长而增加，但是增加幅度 平缓，而且第六天至第九天有明显下降现象。 7 6 5 4 3 2 1 0 ，一巡蟥镫墨扭 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 4 0 1 2 0 71 0 0 均 螽8 0 誊6 0 罨4 0 2 0 0 o 2 4 6 8 1 0 发酵天数d 图2 4 啤酒发酵过程中琥珀酸含量的变化趋势 f i g u r e 2 4t r e n dd i a g r a mo fs u c c i n i ca c i di nb r e w i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s i n g 2 3 1 5 啤酒发酵过程中富马酸含量的变化趋势 由图2 5 可知，富马酸的变化曲线与其他有机酸变化曲线都有所不同，在啤 酒发酵初期，富马酸含量呈倍数增长，接着含量几乎没变化，而后有快速增长达 到一个峰值，发