（食品科学专业论文）大豆脂肪氧化酶活性影响因素研究及其应用.pdf

大豆脂肪氧化酶活性影响因素研究及其应用 摘要 大豆脂肪氧化酶( l o x ) 是种新型的食品添加剂和品质改良剂，由于其 在豆类植物中含量少且容易变性，因而制约了它的应用开发研究如何提高大 豆脂肪氧化酶的活性是一项重要的应用基础研究工作 本文运用正己烷和超临界二氧化碳对大豆粉进行脱脂，通过单因素和正交 试验优化正己烷脱脂和超临界二氧化碳脱脂大豆粉的最佳工艺条件；探索了提 取方式对大豆脂肪氧化酶活性的影响，以及化学微环境对其稳定性的影响；通 过在馒头粉中的应用，证实了大豆脂肪氧化酶的增白作用。试验研究的主要结 论如下： 1 以脱脂率为考察指标，在单因素试验的基础上，通过l 9 ( 3 4 ) 正交试验， 优化出正己烷脱脂大豆粉的最佳工艺条件为：正己烷添加量3 ：l ，脱脂时间 2 0 m i n 次，脱脂次数3 次；通过l 9 ( 3 4 ) 正交试验和验证试验，优化出超i 豳界二 氧化碳脱脂大豆粉的最佳工艺条件为：萃取压力3 0 m p a ，萃取温度3 5 ，流体 流量1 0l h 。 2 浸泡处理可以提高榨油豆和豆腐豆的脂肪氧化酶的活性。研磨打浆操作 中，打浆前的浸泡时间可以促进豆腐豆中脂肪氧化酶的活性，但打浆操作却使 豆腐豆中脂肪氧化酶活性降低。脱脂处理对不同品种大豆脂肪氧化酶的活性都 有显著提高。 3 通过大豆脂肪氧化酶活性稳定性试验可知，大豆脂肪氧化酶的粗提液在 4 c 贮存条件下可以存放3 d ，最适反应温度为2 5 3 5 ，最适反应d h 为8 0 9 0 。 巯基乙醇、柠檬酸、半胱氨酸和茶多酚各自对大豆脂肪氧化酶均有抑制作用， 其中以巯基乙醇的抑制作用效果最明显，其次为茶多酚、半胱氨酸，柠檬酸抑 制效果最低。在协同抑制试验中，所有组合的抑制效果均有不同程度的增加， 说明对大豆脂肪氧化酶的抑制作用均具有协同增效作用。 4 以馒头粉和馒头的白度为指标，评价大豆脂肪氧化酶的添加对馒头粉白 度的影响。当添加o 8 的大豆脂肪氧化酶裉提物时，馒头成品的自度最高。 关键词：大豆脂肪氧化酶脱脂酶活性面粉增白 s t u d yo nf a c t o r so fs o y b e a nl i p o x y g e n a s ea c t i v i t y a n di t sa p p l i c a t i o n a b s t r a c t s o y b e a nl i p o x y g e n a s e ( l o x ) i sak i n d o fn e w l yf o o da d d i t i v e b u ti t s a p p l i c a t i o ni sl i m i t e db e c a u s eo fi t sl o wc o n t e n ta n di t se a s yi n a c t i v a t i o n t h e f a c t o r so fl o xa c t i v i t ya n di t sa p p l i c a t i o nw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r h e x a n ea n ds u p e r e r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o nw c r cu s e dt od e g r e a s ef a te l e m e n t f r o ms o y b e a ni nt h i sp a p e r t h ef a c t o r so fe f f e c t i o no nl i p o x y g e n a s ea c t i v i t yw e r e s t u d i e d a n di tp r o v e dt h a tl i p o x y g e n a s ec a ni m p r o v et h ew h i t ed e g r e eo fw h e a t p o w e r t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tf a c t o r sw h i c hi n c l u d eh e x a n ea d d i t i v e d o s a g e ， r e a c t i o nt i m e sa n dr e a c t i o nt i m ew e r es t u d i e d o nt h eb a s i so fo n e f a c t o r e x p e r i m e n t s ，w es e l e c t e dh e x a n ea d d i t i v ed o s a g e ，r e a c t i o nt i m e sa n dr e a c t i o nt i m e a st h ev a r i a b l e s ，t h er a t eo fd e g r e a s ea si n d e x e s ，u s i n gl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t 。t h ef o l l o w i n go p t i m u mp r o c e s s i n gc o n d i t i o n sf o rh e x a n ed e g r e a s ea r e o b t a i n e d h e x a n ed e g r e a s eo fs o y b e a nw e r e ：h e x a n ea d d i t i v ed o s a g ei s3 ；i ， r e a c t i o nt i m ei s2 0 r a i n t i m e r e a c t i o nt i m e sa r e3t i m e s u s i n gl 9 ( 3 ) o r t h o g o n a l e x p e r i m e n ta n dv a l i d a t i o ne x p e r i m e n t ，s u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o no fs o y b e a na r e ： e x t r a c t i o np r e s s u r ei s3 0 m p a ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ei s3 5 ，f l u xo fc o zi s 1 o l h d e g r e a s eo fs o y b e a nc o u l dr e d u c et h ec o n t e n to ff a t t h em o d eo fb u r g e o nc a ni m p r o v et h ea c t i v i t yo fl o xw h e r e a sr u b b i n g r e d u c e st h ea c t i v i t y a c c o r d i n gt or e s u l t so fe x p e r i m e n t s ，d e g r e a s i n gi st h eb e s tt o i m p r o v et h ea c t i v i t yo fl o x t h ef o l l o w i n go p t i m u mp r o c e s s i n gc o n d i t i o n sf o rs t a b i l i t yo fl o xa c t i v i t ya r e ； r e s e r v e3d a y su n d e r 一4 c ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s2 5 3 5 c ，r e a c t i o np hi s8 0 - 9 0 c i t r i ca c i d ，2 - m e r c a p t o e t h a n o l ，c y s t e i n ea n dt e a - p o l y p h e n o lc o u l dr e d u c el o x a c t i v i t y t h e nt h ee f f e c to f r e d u c i n gl o xa c t i v i t yi sm o r ew h e nt h e yc o o p e r a t ew i t h e a c ho t h e r i na d d i t i o n ，a d d i n gl o xi n t ow h e a tp o w e rc o u l di m p r o v ei t sw h i t ed e g r e e w h e na d d i t i v ed o s a g ei s0 8 t h ew h i t ed e g r e eo fs t e a m e db r e a di sm o s t k e yw o r d s ：s o y b e a nl i p o x y g e n a s e ( l o x ) d e g r e a s ee n z y m ea c t i v i t y w h i t e d c g r e e 插图清单 图1 1 脂肪氧化酶在主要底物上的加氧碳位6 图1 2 脂肪氧化酶催化亚油酸反应方程式7 图2 1 正己烷用量对正己烷脱脂大豆的影响1 4 图2 2 脱脂次数对正己烷脱脂的影响1 4 图2 3 脱脂时阃对正己烷脱脂的影响一1 5 图3 1 豆腐豆浸泡1 2 h 后l o x 活性2 3 图3 2 豆腐豆浸泡2 4 h 后l o x 活性2 3 图3 3 榨油豆浸泡1 2 h 后l o x 活性2 3 图3 - 4 榨油豆浸泡2 4 h 后l o x 活性2 3 图3 5 豆腐豆浸泡1 3 h 打浆l o x 活性2 4 图3 - 6 豆腐豆浸泡1 8 h 打浆l o x 活性2 4 图3 7 豆腐豆浸泡2 4 h 打浆l o x 活性2 4 图3 8 未脱脂豆腐豆中l o x 活性2 5 图3 - 9 未脱脂榨油豆中l o x 活性2 5 图3 1 0 脱脂豆腐豆中l o x 活性2 6 图3 i l 脱脂榨油豆中l o x 活性“2 6 图3 1 2 脱脂前巨丰豆粉l o x 活性2 6 图3 1 3 脱脂后巨丰豆粉l o x 活性一2 6 图3 1 4 脱脂前中黄1 3 豆粉l o x 活性“2 7 图3 1 5 脱脂后中黄1 3 豆粉l o x 活性2 7 图3 1 6 脱脂前中豆2 0 豆粉l o x 活性2 7 图3 1 7 脱脂后中豆2 0 豆粉l o x 活性2 7 图3 1 8 脱脂前皖豆1 5 豆粉l o x 活性2 7 图3 1 9 脱脂后皖豆1 5 豆粉l o x 活性一2 7 图3 2 0 脱脂前合丰2 5 豆粉l o x 活性2 8 图3 2 l 脱脂后合丰2 5 豆粉l o x 活性2 8 图4 1 - 4 贮存对大豆脂肪氧化酶活性的影响3 2 图4 2 温度对大豆脂氧合酶活性的影响”3 3 图4 3p h 值对大豆脂肪氧化酶活性的影响3 4 图4 42 - 巯基乙醇对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 4 图4 5 柠檬酸对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 5 图4 - 6 半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 6 图4 7 茶多酚对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 7 图4 8 巯基乙醇与柠檬酸对大豆脂肪氧化酶活性的协同抑制影响”3 7 图4 9 巯基乙醇与半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性的协同抑制影响3 8 图4 1 0 柠檬酸与半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性的协同抑制影响3 9 图4 1 1 柠檬酸与茶多酚对大豆脂肪氧化酶活性的协同抑制影响4 0 图4 1 2 茶多酚与半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性的协同抑制影响4 l 图5 1 添加剂对超级试制小麦粉白度的影响4 3 图5 2 不同品种大豆l o x 对小麦馒头粉白度的影响4 5 图5 3 储存时间对特一试制小麦粉白度的影响4 5 图5 - 4 储存时间对超级试制小麦粉白度的影响4 6 图5 5 添加量对特一试制小麦粉白度的影响4 7 图5 - 6 添加量对超级试制小麦粉白度的影响4 7 表格清单 表l l 大豆和其它粮食作物蛋白质含量2 表1 2 大豆蛋白分级组分2 表1 3 主要有机溶剂的理化特性4 表2 1 超临界c 0 2 脱脂大豆粉试验的因素水平表1 3 表2 - 2 正己烷脱脂实验正交试验因素水平表及试验结果1 6 表2 3 正交试验极差分析表1 6 表2 4 正己烷脱脂实验的方差分析表“1 6 表2 5 超临界c 0 2 脱脂实验方案及试验结果分析1 7 表2 - 6 正交试验极差分析表1 8 表2 - 7 正交试验方差分析表1 8 表2 8 验证试验结果1 8 表3 1 几种脂肪氧化酶同工酶性质比较2 0 表3 2 浸泡处理对大豆l o x 酶活的影响2 4 表3 - 3 浸泡打浆对豆腐豆l o x 酶活的影响2 5 表3 - 4 脱脂处理对大豆中l o x 酶活的影响一2 5 表3 5 脱脂处理对不同品种大豆l o x 酶活的影响2 8 表4 1 巯基乙醇对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 4 表4 2 柠檬酸对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 5 表4 3 半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 6 表4 4 茶多酚对大豆脂肪氧化酶活性的抑制影响3 6 表4 5 巯基乙醇与柠檬酸对大豆脂肪氧化酶活性的协同抑制影响3 7 表4 6 巯基乙醇与半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性协同抑制影响3 8 表4 7 柠檬酸与半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性协同抑制影响”3 9 表4 8 柠檬酸与茶多酚对大豆脂肪氧化酶活性协同抑制影响3 9 表4 - 9 茶多酚与半胱氨酸对大豆脂肪氧化酶活性协同抑制影响4 0 表5 - l 添加剂对馒头白度的影响4 3 表5 - 2 不同大豆品种豆粉脂肪氧化酶粗提物对馒头粉白度的影响”4 4 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 金超至些太坐或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。， 学位论文作者签名：l 趑嘲噍i签字日期：曲刁年占月z 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金胆王业盔堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权金肥王壁太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：越碡0 目 导师签名： 签字日期：口7 年月k 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 胁午 签字嗍：? 7 钆肌日 电话： 致谢 本研究及学位论文是在我的导师潘丽军教授的亲切关怀和悉心指导下完 成的。她严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风。深深地感 染和激励着我。同时我还要感谢姜绍通教授，从课题的选择到项目的最终完成， 姜老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持两年多来，潘老师和姜老师不 仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀， 在此谨向两位老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意! 在此，我还要感谢在一起愉快的度过研究生生活的高慧、张婵婵，陈晓燕、 程璐、李岩、朱羽、黄开华、肖小发和胡海江等各位同门，正是由于你们的帮 助和支持，我才能克服一个个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。特别感 谢唐文婷师姐和许彬师姐，她们对本课题做了不少工作，给予我不少的帮助。 最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们! 作者：赵晓园 2 0 0 7 年4 月 1 1 大豆简介 i 1 1 大豆蛋白 第一章前言 中国是大豆的故乡，在中国已有五千年栽培史。远自商代就己经有了种植 大豆的记载，在商代出土的甲骨文中已有稷、菽等字，其中菽字即为豆类的总 称。这说明在商代以前，中国人民就己经开始种植大豆i 。经考证，东北、黄 河流域、长江流域、江南、西南等地都有关于大豆的文字记载1 2 1 。中国栽培大 豆和食用豆类历史悠久，如大豆、小豆原产中国，蚕豆和豌豆虽为引进豆类， 但在中国栽培也已有2 0 0 0 多年。 中国大豆于公元前2 0 0 年左右开始外传。最早是由华北经朝鲜传至日本，后 来又由华北和华中地区传至东南亚一带。到了近代大豆才开始传播到欧美等地。 1 7 4 0 年，法国传教士将中国大豆引入法国：1 7 9 0 年传入英国：1 8 4 0 年传入意大 利；1 8 7 0 年传入德国：1 8 7 4 年俄国才开始种植大豆；1 8 0 4 年有人在美国种植大 豆，1 8 8 2 年才进行生产性种植；i 9 0 8 年巴西也引进了大豆，并很快大规模种植 大豆【3 l 。目前，世界上六大洲都已经种植大豆，而且世界各国都特别重视大豆 种植。由此可见，中国对世界大豆的生产发展做出了卓越的贡献。 中国栽培的食用豆类除了上述几个以外，还有豇豆、普通菜豆、多花菜都、 利马豆、小扁豆、鹰嘴豆、扁豆、木豆、黎豆、四棱豆、香草豌豆、瓜尔豆、 刀豆、直立刀豆和黑谷豆等。全国( 包括台湾省) 3 2 个省、区、市均有食用豆 类分布。过去我国曾将它们称为“杂豆”，直到在1 9 7 9 年一1 9 8 0 年间，全国从 事食用豆类研究的科技工作者开过两次学术讨论会，将所谓“杂豆”改为“食 用豆类”。 豆类是人类三大食用作物( 谷类、豆类和薯类) 之一，在农作物中的地位 仅次子谷类。在过去的半个世纪内，大豆是种植面积和产量增加数倍的农作物 之一，与稻谷、玉米和小麦一起，构成了我国四大粮食作物。在我国农业统计 口径中，大豆是列入粮食作物范畴内统计。这充分表明了大豆在我国农业生产 和食物消费系统中的地位和作用。大豆是粮食作物中蛋白质含量最丰富的作物， 平均含量在4 0 左右，接近于动物食品中蛋白质含量，比任何一种粮食作物的蛋 白质含量都高，见表1 1 1 ”。是玉米蛋白质含量的3 倍，小麦的4 倍，水稻的1 0 倍。 大豆蛋白质量好，营养价值高。 大豆蛋白质所含氨基酸比值非常接近于“人体氨基酸模式”，接近人体需 求，也接近动物性蛋白质此外，大豆还含有脂肪酸、磷脂和多种矿物质等营 养成分，是一种巨大的植物蛋白资源。豆类种子干基蛋白质含量一般在2 0 一 2 5 ，存在的蛋白质种类繁多，结构复杂。由于研究的出发点不同，其分类方法 也不尽相同。常用的蛋白质分类方法有：根据溶解度分类的方法、根据构成蛋 白质的最基本单位分类的方法、根据结构分类的方法、根据生理功能分类的方 法f 5 1 表1 一l 大豆和其它粮食作物蛋白质含量 单位： t a b i - it h ec o n c e n t r a t i o no f f o o dp r o t e i n 根据蛋白质的溶解特性，大豆蛋白可分为两类，即清蛋白和球蛋白。清蛋 白一般占大豆蛋白质的5 ( 以粗蛋白计) 左右；球蛋白约占9 0 大豆球蛋白 是由奥斯本( o s b o r n ) 和丹皮鲍尔( d a m p b a l l ) 首先用食盐溶液萃取，经反复 透析沉淀而得到的一种蛋白质。从免疫学角度出发，大豆球蛋白又可分为大豆 球蛋白( 占4 0 o ) 、小伴大豆球蛋白( 占1 3 8 ) 、b 伴大豆球蛋自( 占2 7 9 ) 、t 伴大豆球蛋白( 占3 0 ) 。大豆乳清蛋白则主要由t 球蛋白( 1 7 0 k d 的三聚体) 、7 s 碱性球蛋白、o - 葡萄糖苷酶、脂肪氧合酶、磷酸酶、b 淀粉酶、 细胞色素c 组成，这些蛋白质含量不高，但对食品加工影响很大1 6 1 表i - 2 大豆蛋白分级组分 t a b 1 2c h e m i c a lc o m p o n e n t so fs o y b e a np r o t e i n 根据生理功能分类法，大豆蛋白可分为贮藏蛋白和生物活性蛋白两类。贮 藏蛋白是主体，约占总蛋白的7 0 左右，如l l s 球蛋白、7 s 球蛋白等，它与大豆 的加工性关系密切。储藏蛋白的特征包括几个方面：( 1 ) 从生理学的角度来看， 储藏蛋白能起初始供养作用：( 2 ) 从细胞生物学的观点来看，大量的储藏蛋白被 积累和储藏在蛋白质体内，就象淀粉储藏于淀粉粒和油脂储藏于圆球体一样， 这些储藏性细胞器都是位于储藏组织中的；( 3 ) 从分子水平的角度来看，储藏蛋 2 自是由特殊形状的亚基构成特殊的四级结构，这些结构特别适合于在蛋白质体 内形成最大密度的填充；( 4 ) 从生物化学的角度来看，储藏蛋白分子的种类并不 多，但却占了种子蛋白质的很大的数量比例；( 5 ) 储藏蛋白既是稳定的，但又是 可变的。生物活性蛋白包括较多，如脂肪氧化酶、胰蛋白酶抑制剂、b 一淀粉酶、 血球凝集素等，它们在总蛋白中所占比例虽不多，但对大豆制品的质量却非常 重要1 7 o 1 i 2 国内外大豆需求现状和前景 历史上，在2 0 世纪3 0 年代中国曾是全球最大的生产国和出口国，平均年产 量超过1 0 0 0 万吨，约占全球总产量的9 0 。中国大豆在全球大豆市场中曾占绝对 垄断地位，但近年来迅速下降。 自2 0 世纪8 0 年代以来我国大豆的年产量一直保持在1 0 0 0 万吨左右直到 1 9 9 3 年，我国大豆的播种面积出现飞跃性增长，达9 4 5 4 万公顷，产量达1 5 3 0 7 万吨，分别比上一年度增长3 1 和4 7 。1 9 9 4 年产量创记录地达到1 6 0 0 万吨。此 后，大豆生产出现了徘徊，近几年甚至呈现萎缩的趋势，到了1 9 9 5 年我国更是 由传统的大豆的出口国变成大豆进口国。与此同时，美国、巴西、阿根廷等国 的大豆总产量大幅度增加”1 。 2 0 0 3 年与1 9 9 6 年相比，中国大豆产量从1 3 2 2 万t 增至1 5 3 9 万t ，增加了1 6 4 ， 而同期全球大豆产量增加了4 5 3 。如果不考虑大豆年度库存情况，仅从国内产 量、进口量和出口量方面计算国内供给情况，2 0 0 3 年与1 9 9 6 年相比，中国大豆生 产占国内供给的份额从9 3 下降至4 3 ，下降了5 4 。国内大豆供给形势由自给有 余转为基本能自给、到自给率不到5 0 。在全球大豆生产中的地位，2 0 0 3 年与1 9 9 6 年相比，中国大豆生产所占份额由1 0 降至约8 9 1 上述数据表明，中国对大豆 的旺盛需求，并未推动中国大豆生产快速发展。 1 1 3 大豆脱脂 大豆在生长过程中会形成豆腥昧，在加成中产生的豆腥昧物质更多，大豆 具有的这种特殊的豆腥味是不受欢迎的。除去这些豆腥味成分已成为大豆新产 品开发利用的一大难题” 对豆腥味形成比较公认的看法是源于大豆中不饱和脂肪酸的氧化。而大豆 脂肪氧化酶是促使不饱和脂肪酸氧化的主要因素。其大致机制如下：不饱和脂 肪酸氧化后形成氢过氧化物，它们极不稳定，裂解后形成异味物质。将大豆中 的油脂去除后，脂肪氧化酶失去了作用的底物，可减轻异味的产生。此外，大 豆经过脱脂还可以减少大豆粉从土壤中带来的耐热菌，提高豆粉的稳定性；可 以降低皂脚苷、异黄酮等苦涩味物质的含量，改善豆粉作为添加i f ! l 加入到面粉 中的风味和口感。 目前制取大豆油的方法有压榨法、预浸法和低温浸出法。冷榨法虽然得油 率低、蛋白质易变性，但其具有油质纯正，无溶剂残留的优点因此冷榨油在 一些发达国家备受青睐，常贴以“未经化学处理的自然自然品”的标签上市 预浸法和低温浸出法是目前应用最广泛的制油方法，且以低温浸出法在得率、 脱溶和保护大豆蛋白质方面效果为佳。但这两种方法致命的弱点是有机溶剂的 残留近年来不少研究者将超临界c o ：萃取技术应用于大豆油的提取【5 】。 1 1 3 1 溶剂浸出法 溶剂浸出法是1 9 世纪中叶发明并用于工业化生产的，与传统制油方法相比 较具有生产效率高、出油率高、成本低、适合于工业化大生产等特点，在2 0 世 纪得到了广泛的推广和应用。 溶剂浸出法用溶剂从压扁的大豆中抽取油脂的一种方法采用了相似相溶 原理，用特定的有机溶剂浸泡经过一定预处理的大豆，即可把其所包含的油脂 提取出来，再经蒸馏、脱溶，即可得到脱脂豆粕、毛油及回收溶剂。 溶剂浸出法所采用的溶剂的成分及性质，对油脂浸出工艺的指标和产品质 量都会产生不同程度的影响。用作溶剂浸出法的溶剂应具备以下要求( 8 】： ( 1 ) 对油脂有强的溶解能力在室温或稍高于室温的条件下，该溶剂能与 油脂以任意比例互溶。对大豆中的其它成分，如蛋白质、糖类等，溶解能力要 尽可能小，甚至不溶。 ( 2 ) 既要容易气化，又要容易冷凝回收。经实践证明溶剂的沸点在6 5 7 0 范围内比较合适。 ( 3 ) 溶剂本身要稳定。 表l - 3 主要有机溶剂的理化特性 t a b 1 - 3t h ef u n c t i o n a l i t i e so f 基本满足以上条件的主要溶剂为工业己烷和石油醚。以前使用石油醚作为 制造脱脂大豆的溶剂，石油醚并非单一物质，也含有高沸点的成分，所以除掉 溶剂要用很高的温度，因此制成的脱脂大豆变性程度很高，在食品领域只能用 于生产酱油或味精。而正己烷是低沸点、高纯度的疏水性溶剂，因此脱溶时， 4 只要控制的好，可以得到蛋白质变性程度很低的脱脂豆柏。表1 3 所示为主要有 机溶剂的理化特性【s j 1 1 3 2 超临界c o ：萃取技术 超临界流体萃取技术是一种新型的分离技术。经过多年的研究和实践，基 础理论和应用领域都有了进一步的深化和发展超临界流体技术的应用已从简 单萃取发展到有机合成，材料加工，环境保护和生物技术等多种领域对某些 热敏性的生物药物、制剂或食品，用超临界二氧化碳处理，可在比较温和的条 件下作用，抑制酶活和灭菌，避免因高温消毒引起的不良影响。在用超临界二 氧化碳从新鲜小麦胚芽中萃取胚芽油的试验中，发现新鲜小麦胚芽由于脂肪氧 化酶( l p o ) 和微生物的作用，室温条件下数日内便变质发霉，而经超临界二 氧经碳处理后却变得非常稳定】。 目前在超临界流体( s c f ) 技术研究和应用最多的是萃取，它被广泛地应 用于生物技术、医学、环境保护、材料加工、油漆、喷涂、印染等行业1 1 2 14 1 。 由于超临界c o 蓐取技术有诸多优点，近年来在食品和发酵行业得到了广 泛应用：菌体生成物的分离：香精香料的提取；动植物脂肪和脂溶性成分的提 取；植物碱的提取；脱臭、脱色、脱酸和脱除有机溶剂；有害有毒物质的脱除 1 5 1 。 超临界流体萃取技术在脂类资源开发利用中发挥着越来越重要的作用，其 优势主要表现在：( 1 ) 选择与正己烷同等程度无极性的二氧化碳作为超临界流 体萃取的溶剂，各种脂质或脂肪很容易溶解在超临界二氧化碳中：( 2 ) 超临界 c 0 ：对卵磷脂、铁、磷的溶解能力低，因而可以减少萃取油中此类杂质，有望省 略脱胶和脱臭工艺：( 3 ) 超临界c 0 ：对于油脂中的生理活性成分起到了保护作 用而使之不被破坏，最大程度地保持了产品的营养价值。另外，通过适当地控 制操作条件还可以降低油的着色度和酸度，在一定程度上可以控制所得的脂肪 酸含量的分布。 美国f r i d r i c h 等人报道了大豆油萃取的试验，它们先将含水量为9 8 的大 豆粉碎、轧胚，用0 3 8 0 5 l m m 的科胚进行超临界c o ：萃取【l “。1 9 8 4 年日本的谷 口正之等报道了小麦胚芽油超临界c o ：萃取的试验研究，对不同条件下胚芽油的 萃取率作了测试，并对该方法和有机溶剂法所得小麦胚芽油的理化指标进行了 比较7 1o1 9 8 5 年进行了进一步的试验，研究表明：采用该方法所得的油脂色泽 浅淡、磷脂含量很少。1 9 9 4 年刘崇义等报道了超临界c 0 ：提取小麦胚芽油的工艺 研究，对小麦胚芽油的溶解度进行了测定i i ”。马海乐等从1 9 9 5 年起对小麦胚芽 中主要有效成分在超临界c o ：中的溶解度进行了研究【”j 。武练增等进行了沙棘油 的超临界c 0 ：萃取试验研究，成功地克服了现有萃取方法所存在地缺点1 2 0 i 。赵威 祺等系统研究了米糠油的超临界c o 。萃取，研究除了比较了超临界c o ：萃取和己 烷萃取所得米糠油的得率和品质外，还研究了超临界c o 。萃取的选择性1 2 c h a o 等1 9 9 3 年进行了采用超临界c 0 ：从牛脂中脱除胆甾醇的研究1 2 2 1 a n 1y e h 等1 9 9 1 年进行了用超临界e 0 。从自然和人工合成的混合物中分离脂肪酸和胆甾醇的研 究1 2 3 】。1 9 9 0 年c y g n a r o w i c z 等人报道了测试1 3 一胡萝卜素在超i 临界c o ：中( 没有和 有夹带剂) 溶解度的研究【2 ”1 9 8 8 年f a v a t i 等人报道了采用超临界c 0 ：从苜蓿叶 蛋白浓缩物中分离胡萝卜素( 叶红素) 和叶黄素的研究1 2 5 1 1 9 9 1 年l o r e n z o 等 人报道了采用超i | 岛界从海藻中萃取b 一胡萝卜素的研究。1 9 9 3 年s p a n o s 等人采用 普通的萃取设施进行了用超l 晦界c 0 2 从甜薯中萃取b 一胡萝卜索的研究 2 6 1 。用超 临界二氧化碳处理骨骼和人造血浆可以脱脂和杀灭其中的病毒，保证异源骨骼 移植和输血的安全性1 2 7 】；利用超i 临界二氧化碳处理，在1 3 1 7m p a 、6 0 、7 5 m i n 条件下，可使桔汁中的果胶酶全部失活1 2 引：超临界二氧化碳还可以作为一种微 生物灭菌方法，在2 5 m p a 、3 5 、3 0 m i n 条件下使乳酸短杆菌，啤酒酵母完全灭 菌 2 9 1 ；在5m p a 、3 5 、3 0 m i n 条件下用超临界二氧化碳处理，大肠杆菌l o g c f u 后c f u 前= 1 0 6 1 3 0 l 。 1 2 脂肪氧化酶简介 1 2 1 脂肪氧化酶的来源及生化特性 脂肪氧化酶( l i p o x y g e n a s e ) ，通称脂氧酶( l o x ) ，分子量为9 4 9 7 k d ， 等电点的范围从p h 5 7 到p h 6 4 ，大豆中的脂肪氧化酶通常是可溶的。l o x 报道 始见于1 9 3 2 年，它来源于植物中的大豆【3 1 l ；而动物中的报道却是在四十多年后 的1 9 7 5 年3 2 m 1 。在自然界中广泛存在，不仅在植物、动物中存在l o x ，在藻类 1 3 4 】、面包酵母1 3 ”、真菌以及氰细菌1 3 6 】中均发现有l o x 的存在。 r 、1 、3r 口 邺卢、弋式饥 亚麻酸 亚油酸 花生四烯酸 图1 - l 脂肪氧化酶在主要底物上的加氧碳位 f i g 1 - lt h el o c a t i o no f e n z y m eo nt h el i n o l e i ea c i d 、l i o n l e n i ca c i da n da r a c h i d o n i ea c i d l o x 是一种含非血红素铁的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，是一种单一的多 肽链蛋白质，其成熟的大豆种子中l o x 含量很高，约占种子蛋白质含量的1 2 它的酶促反应也十分强烈，它专门催化具有顺，顺一1 ，4 戊二烯结构的不饱 和脂肪酸的加氧反应，在植物中其底物主要是亚油酸( l i n o l e i ca c i d ) 和亚麻酸 ( l i o n l e n i ea c i d ) ，在动物体内其底物主要是花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ) 在亚油酸和亚麻酸上的加氧位置是c 9 和c 1 3 ，在花生四烯酸上的加氧位置主要是 c 5 、c 1 2 和c 1 5 ，也可在c o 、c 9 和c i i 位上加氧，见图1 - 1 植物中含有各种类型的 6 脂肪氧化酶，其中某些酶只作用于脂肪酸，而另外一些酶还作用于甘油三酸酯。 这种具有类似酶活性的不同蛋白质的酶被称为同功酶。大豆中的脂肪酶同功酶 至少有三种【3 7 1 脂肪氧化酶途径，简称l o x 途径，是脂肪酸氧化的途径之一高等植物的 植物酸氧化途径有4 条，即n 氧化、b 氧化，1 ，氧化和l o x 途径。l o x 途径是指多 不饱和脂肪酸在有氧条件下经脂肪氧化酶催化生成氢过氧化物，再经一系列不 同的酶的作用最终生成具有一定生理功能的化合物。在高等植物体内l o x 途径 多以十八碳酸为初始底物，因此又称十八碳酸途径，动物体内则以花生四烯酸 为初始底物故称而是二十碳酸途径。由于l o x 途径的初始底物脂肪酸来自经脂 肪酶或水解酶水解的甘油酸，因此广义上的l o x 途径还包括甘油酯的水解过程， 而狭义上的l o x 途径则是从脂肪酸氧化开始的。脂肪氧化酶途径通常处于静止 状态，只有当生物体发育到一定阶段或受到环境胁迫时才启动p ”。 大豆l o x 的研究最清楚，就目前所知，大豆种子中的l o x 具有3 种同功酶 类型，即l o x l 、l 0 x 2 和l o x 3 。l o x l 、l o x 2 和l o x 3 的等电点分别为5 6 5 、 5 8 5 和6 1 3 | 3 9 】。3 种同工酶的生化特性是：l o x i 对带电脂肪酸有明显的选择性， 与亚油酸的反应产物几乎全是1 3 氢过氧亚油酸，在反应产物中占9 5 ；l o x 2 对中性脂肪酸表现更强的活性，与亚油酸的反应产物为9 氢过氧亚油酸和1 3 氢 过氧亚油酸，两者在反应产物中各占5 晰；l o x 3 与亚油酸的反应产物为9 氢过 氧亚油酸和1 3 氢过氧亚油酸，两者在反应产物中分别占6 5 和3 5 1 4 0 l 。由于大 豆l o x 在催化反应中，不仅生成具有共轭双键的过氢化物，还继续分解产生醛、 酮等具有挥发性的物质，使豆制品产生腥味。通过对分离得到的大豆子叶l o x 的研究发现，每个l o x 是一条m r 为9 6 0 0 0 左右的多肽，每个多肤中含有一个铁 原子。实验证明，当大豆子叶l o x 处于静止、无活性状态时，铁以f e ”存在； 当加入底物后，l o x 中的铁以f 一+ 存在，使l o x 具有催化活性大豆种子中的 l o x 都是球形水溶性蛋白除催化原初反应外，l o x 还催化次级反应而形成脂 肪酸的二聚苯和羰基二烯酸，类胡萝卜素的漂白即是由l o x 次级反应的中间产 物一一脂肪氢过氧化物实现的【4 1 1 ，如图1 2 。 c h ，( c h l l r c h h - c h ：i + = c h 舔h 2 ) r c 0 0 h f 锄 c h ，- ( c h l h c h c h = c h - c h = c h ( c h 2 ) r c o o h i o o h c h r ( c h z ) 4 - c h = c h - c h = c h - c h ( c h 小- c o o h i o o h 图1 2 脂肪氧化酶催化亚油酸反应方程式 f i g 1 - 2t h er e a c t i o ne q u a t i o no fl o xa n dl i n o l e i ca c i d 1 2 2 脂肪氧化酶的研究进展 7 人类食用富含蛋白质和油脂的大豆已有悠久历史a n d r e 和h o u ( 1 9 3 2 ) 首 先发现大豆蛋白制品产生豆腥味是因聚不饱和脂肪酸的酶促反应的结果，其中 的关键酶是脂肪氧化酶t | 2 1 大豆脂肪氧化酶最初是c a t h e o r e l l ( 1 9 4 7 ) 分离精制为晶体的i ”】。结晶或精制 的脂肪氧化酶无辅基，也不要求辅酶和金属，相对分子质量为1 0 2 1 0 ，等电 点为5 4 ，最适p h 为7 ，4 c h a r t ( 1 9 7 3 ) 对大豆脂肪氧化酶辅基的研究表明，大豆脂肪氧化酶也含有 铁离子，并且铁离予以三价状态存在于大豆脂肪氧化酶的内部 1 9 6 7 年，d o l e a 等在研究脂肪氧化酶催化多不饱和脂肪酸氧化机理时，确认 脂肪氧化酶对底物的专一要求是脂肪酸残基上舍有顺，顺一1 ，4 - 戊二烯的不饱 和脂肪酸，如亚油酸，反应形成对应的脂肪酸氢过氧化物，之后经酶催化( 或 自动) 分解成各种挥发性化合物，其中多种化合物具有异味。其途径为： 肪酸 用近代的分析手段，已鉴定出近百种氧化降解产物，其中许多成分与大豆 的腥味有关。正己醛是最具有代表性的挥发性化合物。研究表明，当正己醛永 溶液浓度达到l m g k g 时，就能察觉到明显的青草味。因此，可利用己醛含量定 量评定大豆制品的风味。 1 9 8 6 年，王志海、李玉振等人在研究大豆制品中脂肪氧化酶活性与正己醛 含量的关系时指出，国产大豆在生长期间，特别是贮存期间，大豆籽粒中已有 己醛存在；在室温条件下，干粉碎大豆，其己醛含量在短时间内不会有明显增 长，但用水浸泡后的大豆在磨碎时，其己醛含量将急剧增加：在恒温、恒湿条 件下贮存粉碎后的大豆，其己醛含量将逐渐增加。 1 9 7 0 年c h r i s t o p h e r 等利用交换层析法将l o x 分离成i 型和i i 型两个组分， 两组分在许多性质上都不同。研究表明，大豆l o x 有四种电泳类型，l o x i 主 要出现在层析法分离的i 型中，也正是最早被t h o r e l ! 分离结晶的那一种1 4 4 1 。 l o x 2 和l o x 3 出现在i i 型中。层析法的不断改进又将l o x 3 分离成3 a 和3 b 两种， 不过由于两者在许多性质上的相似，仍被认为是一种同工酶【4 5 j ，这几种同工酶 在酶活性的最适p h 、热稳定性、与c 矿+ 关系、等电点、底物专一性和许多生化 性质上都不同【4 6 1 。在适当条件下，破碎的种子与底物中的亚油酸接触就会发生 反应。一粒干重1 6 0 m g 的大豆种子含0 2 3 m g l o x l 和0 4 5 m g l o x 2 。 近年来，随着现代分子生物学技术的不断发展，植物l o x 生理功能研究进 展很快。根据现有报道植物l o x 的可能生理功能包括：( 1 ) 为植物激素茉莉酸 ( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 及其甲酯和愈创激素( t r a u m a t i n ) 提供合成的前体物质； ( 2 ) 代谢产物作为抗菌或抗虫性物质【4 刀；( 3 ) 代谢产物中含有活性氧和氧自 8 由基，对细胞膜具有破坏作用，参与植物的衰老【椰1 和抗病性过敏坏死反应【们。 动物体内l o x 虽然发现较晚，但其生理功能已基本确定，其代谢产物主要参与 炎症反应的重要调节分子，如白三烯( l e u k o t r i e n e ) 和前列腺素( p r o s t a g l a n d i n ) 的形成5 0 1 l o x 具有广泛的生理效应。h i l d e b r a n 等人观察到大豆叶片受伤后l o x 酶活 性和基因表达都因为叶片受伤而增加d b e l l 报道大豆根浸在0 6 m o l l 的甘露 醇中4 h 后，下胚轴l o x - a 和l o x b 的m r n a 会迅速增加i y 2 w e n n u a n 等人发现， 大豆胚形成过程中胚脱水再重新水合2 4 h 后，l o x 基因复制增加t 5 3 1 据报道， 在苹果果实储藏过程中，l o x 活性的增加与乙烯生成正相关1 5 4 l 。d r o i l a r d 等发 现番茄果实采后初期l o x 活性的增加与果实成熟的启动和成熟衰老伴随的膜功 能丧失有关p ”s