（食品科学专业论文）建立IACHPLC检测红曲米中的桔霉素.pdf

摘要 摘要 桔霉素( c i t d n i n ，c i t ) 是由青霉属、曲霉属和红曲霉的某些菌株产生的一 种广泛污染玉米、大米、小麦等农作物的真菌毒素，在红曲米中的污染尤为普 遍，对动物及人类具有肾毒性、致畸性、致癌性等。目前检测c 1 t 的主要方法 有薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附检测法等。 本研究建立了免疫亲和柱联高效液相色谱法( i m m u n i t yc o l u m n m g h p c f f o r m a u c 跫m q m dc l n o m a t o g r a p h y ，i a c - h p i c ) 检测红曲米中的c i t ；并用此 方法检测了4 1 份市售及实验室自制的红曲米样品中的c i t 含量。主要研究内 容和结果如下： 1 抗c i t 单克隆抗体免疫亲和柱的制备 将纯化好的抗c i t 单克隆抗体与溴化氰( c n b r ) 活化的琼脂糖凝胶 ( s q 】h a r o s c ) 4 f f 偶联。采用紫外扫描鉴定偶联反应，间接竞争e l i s a 方法 及i - i p l c 方法检测制各好的免疫亲和柱的柱容量每根抗c i t 单克隆抗体免疫 亲和柱，用0 5m l 活化胶，0 5 0m g 抗c i t 单克隆抗体，柱容量为0 3 5 z g 。 2 建立了分析红曲米中c 盯l 屺，l c 该方法线性范围1 0 0 p 班g 6 0 0 p 班g ，信噪比为3 ：1 时，最低检测限为1 0 0 j 【, g k g ，超过日本的限量标准( 2 0 0 肛班g ) ；红曲米样品添加c i t 标准品( 1 0 0 p 班g 6 p g 瓜g ) ，用7 0 甲醇水溶液提取样品中c 1 t ，经免疫亲和柱净化、 0 0 1m o v l 的p b s 淋洗、纯甲醇洗脱，田，l c 荧光法检测，平均回收率分别为 7 4 2 8 7 1 4 ，相对标准偏差分别为2 8 5 1 3 1 2 3 市售红曲米中c i t 含量的测定 采用本研究建立的i a c - - h p l c 方法对4 1 份红曲米样品中的c i t 含量 进行了检测。i a c - - h p l c 分析的结果显示，其中有2 5 份红曲米样品中桔霉素 含量超过日本的标准( 2 0 0p 1 【g ) ，超标率6 1 0 ，红曲米中c i t 含量为1 0 0 f l g k g 9 8 6p g ，l 【g 关键词：桔霉素；红曲米；免疫亲和柱；高效液相色谱 c i t r i n i n ( c a t ) i san e p h r o t o x i nw h i c h i sm a i n l yp r o d u c e db yi l u m c r o u ss p e c i e s o f p e n i c i l l i u m a s p e r g i l l u s a n d m o n a s c u s c o n t a m i n a t i o n s o f c i t r i n i n w c r e “x 蛇删i n an u m b 盯o fa 鲥c u t t u r a tc o m m o d i t i e s ，f o o d s ，f e e d s t u f f s s of a r , c o m m o n l yu s e d m e t h o d st oa n a l y z ec i t r i n i na r et h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h yf i l e 3 ，h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p t q w i t hu vo rf l u o r e s c e n c e 蛐( f l u ) ，a n d c l l z y m e 1 n k c di m m u n o s o r b c n ta s s a yf s l i s a ) a m e t h o d ( l a c - h p l of o rd e t e r m i n a t i o no fc r ri nr e dr i c ew a sd e v e l o p m e n t 4 1s a m p l e so fr e dr i c ew e r ed e t e c t e db yt h ei a o h p l c t h em a i nc o n t e n ta n dr e s u l t so ft h es t u d ya r ed e s c r i p t e da sf o u o w ： 1p r e p a r a t i o no fc i u i n i ni m m u n o a f f i n i t vc o l u m n t h cc i w i n i ni m m u n o a f f i n i t yc o l u m n0 a c ) w a sp r e p a r e db yc o u p l i n g c n b r - a c t i v a t e ds c p h a r o s e4f a s tf l o w ( 4 f f ) w i t ht h ea n t i c r rm o n o c l o n a la n u b o d y w h i c hw a s p u r i f i e db yt h ec a p r y l i ca c i da m m o n i u ms u l f a t em e t h o d 田地c o u p l i n g r e a c t i o nw a si d e n t i f i e db yu v a b s o r b a n c 圮m e a s u r e m e n t sa n dt h ei a ct ob ep r e p a r e d w a se v a l u a t e db yi n d i r e c t - c o m p e t i t i v ee l i s aa n dh p l c t h ec o l u m uc a p a c i t yw a s d e t e r m i n e dt ob e0 3 5 肛gw h e nu s i n g0 5m lc n b ra c t i v a t e ds e p h a r o s e4 f fa n d0 5 0 m gp u r i f i e da n t i - c r rm o n o c l o n a la n t i b o d y 2d e v e l o p m e n to f 工a c h p l ct oq u a n t i f yc i t r i n i ni nr e dr i a v e r a g er e c o v e r i e so fc i tf r o mr e dr i c es p i k e da tl e v e l so f1 0 0 z g k g 6 0 0 z g k gr a n g e d f r o m7 4 2 8 7 1 4 w i t hr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n sf r o m2 8 5 1 3 1 2 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s1 0 0f l g k gb a s e do n as i g n a l - t o - n o i s er a t i oo f3 ：1 3 d c t 睨 m i n a t i o no f 4 1r e dr i c es a m p l e sf l o mm a r k e ta n do u rl a b o r a t o r yb v i a c h p i ca n de ii s a 4 1r e dr i c es a m p l e sw e r ed e t e c t 伽lb vh p l c t h er e s u l to fl 、c h p l c ：2 5r e d r i c es a m p l e sw e r ep o l l u t e db yc i t 9t h ec o n t e n to fc r r w a sr a n g e df r o m1 0 0 z g k g 9 8 6 u g k g k e yw o r d s ：c i t r i n i n ；r e dr i c e ；i m m u n o a f 砌t yc h r o m a t o g r a p h y ；h p l c v 缩略语 缩略语( a b b r e v i a t i o n s ) a f b l ：a f l a t o x i nb i黄曲霉毒素b 1 a f m l ：a f l a t o x i nm i黄曲霉毒素m l b s a ：b o v m es 锄a l b u m i n 牛血清白蛋白 a t c i u i n i n 桔霉素 d o n ：d e o x y n i v a l e n o l脱氧雪腐镰刀菌烯醇 e u s 丸e n z y m e - l i n k e c li m m t m o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附法 f b l ：f u m o n i s i nb 1伏马菌素b l f b 2 ：f u m o n i s i nb 2伏马菌素b 2 n d ：f l u o r e s c e n c ed e t e c t o r荧光检测器 g ) ，0 ：g l u c o s eo x i d a s e 葡萄糖氧化酶 h p l c ：h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱法 h r p ：h o r s 既a d i s hp c m x i d a s c辣根过氧化物酶 h t - 2f i l n g a lt o x i n h t - 2 毒素 i a c ：i m m t m o a f f i n i t yc o l u m n免疫亲和柱 i c s o ：5 0 i n h i b i t i o nb i n d i n g5 0 抑制率 l d s o ：l e t h a ld o s e5 0半数致死剂量 l o d ：l i m i to fd e t e c t i o n最低检测限 l o q ：l i m i t o f q u a n t i t a t i o n最低定量限 m c a b ：m o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 m s ：m a s ss p e c 缸o m e t r y质谱 o d ：o p t i c a ld e n s i t j ，吸光度 0 r l a ：o c l a t o x i na赭曲霉毒素a 0 钆o v u m a l b u m i n卵清白蛋白 p b s ：p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸缓冲液 p b s t ：0 0 5 t w e e n 2 0i np b s 磷酸缓冲液+ 0 0 5 吐温- 2 0 s e p h a r o s e4 f f ：s e p h a r o s e4f a s th o w4 f f 琼脂糖凝胶 s p e ：s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n固相萃取 h i 缩略语 1 1 b ：3 , 3 5 , 5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e t l c t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y t - 2 f i i n g a lt o x i n u v u l t r a y i o l c td e t e c t o r 础：z c a r a l c n o n e i v 3 , 3 5 , 5 四甲基联苯胺 薄层层析法 t - 2 毒素 紫外检测器 玉米赤霉烯酮 学位论文独创性声明 - 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：吾芦雪萄签字日期：2 呻年j 2 月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌盔茔有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌盔堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 第一章综述 1 1 桔霉素的研究进展1 1 , 习 第一章综述 桔霉素( c i t r i n i n ，c i t ) 是青霉属和曲霉属的某些菌株产生的真菌毒素，桔 青霉( p a z c u mc t r n u m ) 是产c 盯的特征菌，于1 9 3 1 年首次在其蔡氏培养 液中分离纯化得到的1 9 7 9 年c a r l t o n 将其作为抗菌素进行检测时，发现它对 实验动物具有显著的肾脏毒性。后来，又发现c 1 t 能引起许多动物的肾脏毒害， 并有致癌性。调查发现一些c i t 的产生菌在自然界分布广泛，经常引起纤维的 降解以及玉米、大米等农作物的霉变。近年来，c i t 在食品中的污染问题越来 越引起人们的关注在1 9 9 1 年法国里昂召开的真菌毒素和地方肾病与泌尿道二。 肿瘤研讨会上，讨论了c 盯在7 b a l c a n 地方肾病发生中的作用，引起了国际癌 症研究会的高度重视因此c i t 被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分 会列为必须检测的毒素之一 1 - 1 桔霉素的物理化学特性，刁 c l t 的分子式是c l 担1 4 0 5 ，分子量为2 5 0 2 5 。化学结构是( 3 r ，4 s ) 。- 4 。 6 二氢一8 羟基- 3 ，4 ，5 三甲基岳氧3h - 2 苯吡7 羧酸现代化学研究证明： c i t 实际上是几种非对映异构体的混合物，由于存在着二个分子内氢键以及烯 醇式和酮式的互变效应，使得对其分子结构的研究相当复杂，。r i c c a r d o 等认为 c i t 存在着分子内质子的交换，实际上是一种混乱的结构体，存在二种分子结 构式( 图1 1 ) c 1 t 在常温下是一种柠檬黄色针状菱形结晶物质，熔点为1 7 0 1 7 3 在长波紫外灯的激发下能发出黄色荧光，其最大紫外吸收在3 1 9 珊、2 5 3 衄和 2 2 2r i m 处。纯品c r r 很难溶于水，完全溶解于甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、苯、 氯仿等有机溶剂中在适宜的p h 值条件下，该毒素能溶解于水及大多数有机 溶剂中，并极易在冷乙醇溶液中结晶析出。在水溶液中，当口h 值下降到l 5 时 也会沉淀析出因此，可以根据这些特性进行对其分离纯化 第一章综述 图1 - 1 c r r 对映异构体图 1 1 2 桔霉素的产生及其自然分布口忉 有多种青霉属真菌和曲霉属真菌能在自然或人工条件下产生c l t 如青霉 中的桔青霉( p e n c i l l i u mc i t r i n i u m ) 、纠缠青霉( p e n i c i f f f u g hi s l a n d i c u m ) 、瘿青霉 ( p e n i c i l l i u mi m p l i c a t u m ) 、黄绿青霉( p e n i c i l l i u mc i 打i n u m ) 、点青霉( p e n i c i l l i u m n o t a t u r a ) 、扩展青霉( p e n i c i l l i u m f e l l u t a n u m ) 、詹森青霉( p e n i c i l l i u m j e n s e n i i ) 等；曲霉有土曲霉( a s p e r g i l l u st e r r e u s ) 、白曲霉( 4 甲盯酊池f k a w a c h i i ) 等。其 中桔青霉是自然界中最重要的c i t 产生菌，其在自然界中分布广泛，在温暖的 气候条件下生长繁殖迅速，在3 0 左右产毒量达到最高，超过3 7 产毒量 迅速下降。桔青霉在低于0 7 7 5 的水活度下仍能生长，但c l t 只在水活度大于 0 8 的条件下才产生，并随水活度的升高而增加，到达最高值后又迅速下降。c l t 经常和纤维的降解，玉米、大米、面包等农产品或食品的霉变有关在大米中 及大米的产地该菌是普遍存在的。近年来的调查研究发现：在许多农产品如玉 米、大米、奶酪、苹果、梨和果汁等食品和农产品中都有可能检测到c i t ，并 分离到产c 1 t 的菌株，不同菌株之间产毒能力和产毒条件差异很大，为预防和 控制带来了困难。 1 1 3 桔霉素的抑菌性啊 c 1 t 首先是作为抗菌素从青霉属中分离并加以研究的，它具有良好的抑菌 性，能抑制芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、结核分枝杆菌和金黄色 葡萄球菌等革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌抑制弱，还能抗某些真菌和原生动 2 第一章综述 物，只是因为较强的毒性而无法应用。利用e r r 的该性质，可以用抑菌圈法检 测其含量，此法比较简单直接，利用红曲中所含c 1 t 的抗菌性可间接定性和半定 量确定红曲中c 靠的含量该法的缺点是红曲中的抗菌物质种类较多，除c t f ， 之外，还有a n k , a h c t o n e 、橙色素、几丁质酶等，且影响该法的因素较多，因此 不够准确。 1 1 4 桔霉素的毒性伊堋 c r r 主要是一种肾毒性真菌毒素，又叫肾毒素( n c p h r o t o x n ) ，能引起狗、 猪、鼠、鸡、鸭和鸟类等多种动物肾脏病变。大鼠的7 l d s o 是- 6 7m g 】k g ，小爵 的u 是3 5m k g ，豚鼠的u ，5 0 是3 7m g k g 。它引起的肾脏损害主要表现 为：管状上皮细胞的退化和坏死、肾肿大、尿量增加、血氮和尿氮升高等等 并可引起一系列的生理失常i s 同时，c r r 还有致畸性。据。c i c g l e r 等人的研究 结果显示，在给发育4 天的鸡胚胎注射c l t 后，胚胎中的脚发生了变形另4 。 外，c r r 还能与其它真菌毒素，如赭曲霉素( o c h r a m x i n ) 、展青霉素( p a t u l i n ) 等起协同作用，增加对机体的损害 1 1 5 红曲霉产桔霉素问题及控制措施 1 1 1 2 1 红曲霉的应用源远流长，用红曲霉发酵可生产多种传统食品，如红曲米、 红曲酒、红腐乳等。；世界各国的学者，尤其是在日本，对于红曲菌进行了广泛 而深入的研究，近年来对红曲的多项研究表明：红曲霉能产生多种对人类有益 的代谢产物，如水解酶、酸、酯、醇及其他一级代谢产物。此外，还能产生多 种次级代谢产物，如色素、抗生素、胆固醇合成抑制剂( m o n a c o l i nk ) 、降血 压、降血脂的成分等等，这些都成为近年研究的热点。但是1 9 9 5 年法国学者 b l a n c 首次在红曲霉的培养物中检测出了一种对人畜有害的真菌毒素桔霉 素，这一发现在食品界引起了不小的震动，引起了国内外一些专家学者的关注 并对红曲霉产c 的问题进行了深入的研究，同时也使红曲菌产品在世界范围 内应用受到限制。当前，德国及欧盟各国正拟制订红曲及其相关产品的标准， 其中将严格控制红曲类产品中c 耵的含量，欧盟的参考标准是c i t 限量指标 定为1 0 0 i c 1 【g ；日本厚生省在1 9 9 9 年颁布、2 0 0 3 年修订的日本食品添加一 剂标准中对红曲色素的c 1 t 含量做了限定，限量指标定为2 0 0 # g k g 目前 第一章综述 我国涉及红曲的两个国家标准中，均未建立c i t 检测方法及其控制指标。经江 南大学和中国疾病预防控制中心合作课题组、中国食品添加剂协会等组织的红 曲中c i t 的普查，结果表明，我国红曲色素中c i t 的含量普遍偏高。红曲色 素中c i t 含量的控制已被各生产企业定为攻关目标。c i t 的存在不仅使我国的 红曲产品出口受到了损失，还严重地威胁到人们的健康。目前，国内外许多学 者都在致力于筛选低产或不产c i t 的生产菌株，探索控制c i t 产生的生产工 艺，和建立c i t 快速检测的方法。 1 2 桔霉素的检测方法幽 自1 9 3 1 年c i t 被首次纯化以来，用于其分析检测的主要方法是薄层层析 法( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t i c ) 、酶联免疫吸附法( e n z y l n cl i n k e d i m m 嘲r b c n ta s s a y s ，e l i s a ) 、高压液相色谱法( h i 吐p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h i i c ) 。目前，t i c 和i - 口l c 法是最常用的检测方法。t i c 方法操作简便，但其灵敏度和特异性都较差。e l i s a 具有较高的灵敏度和特异 性，对样品的纯度要求不高，特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛应 用于各种真菌毒素的检测，但是该法可能出现交叉反应，使得结果不可靠m 忧 法具有更高的灵敏度，可以精确地对样品中的c i t 进行定性和定量分析。但是 由于其设备昂贵、操作复杂和对样品的纯度有较高的要求，检测时间较长，不 适合对大批量的样本进行检测，因而使用受到限制。 1 2 1 薄层层析法 t i c 简便，灵敏，适合成分简单样品的定性及半定量。此法在检测真菌毒 素方面的应用国内外早已有相关报道。 m a r t i 盥1 1 3 】等用t i c 对3 5 1 个苹果样品中的c i t 进行了检测，得到c i t 最低检测限为1 5 2 0 喇【g ，样品含c r r 的概率为3 9 。n a g y l l 4 】等用氯仿 提取样品后，用甲苯：乙酸乙酯：乙酸为展开剂，用t l c 法检测了样品提取液 中的c 1 t 的含量，得到c 1 t 的检测下限为2 0 m g k g 。m a r i a l l 5 等将桔青霉菌 接种在瓶装矿泉水中，储存5 个月后，用t l c 法检测到了c i t 的含量为 0 5 1 7 - - 0 2 0 2p g m l 4 第一章综述 胡晓清1 1 6 1 等以酸性水溶液作为提取剂，甲苯：乙酸乙酯：甲酸( 6 0 ：3 0 ：1 0 ， v v v ) 为展开剂，对2 2 个红曲霉制备的红曲样品中的c i t 进行了分析，结果 显示：其中1 4 个红曲样品所含a c i t ；的含量范围为0 3 7 3 3 6 5m g k g 。 有时由于样品中成分复杂，互相影响，用一般的单向t l c 对c i t 进行检 测时，结果不理想，很难在板上分辨出来，因此考虑- 了用双向展开薄层层析法 采用这种方法可避免其他成分对c 盯荧光点的视觉干扰有报道表明，利用双 向展开法，可以检测出大部分样品中的c r r 宫慧梅1 1 7 l 等运用双向薄层层析检 测了红曲样品中的- c i t ，第一相分离红曲中除c i t 外的其他成分，第二相主娶 分离c r r 第一相展开剂选用的是氯仿：丙酮( 9 0 ：1 0 ，v v ) ，第二相展开卉簪 选用的是苯：乙酸乙酯：甲酸( 6 0 ：3 0 ：1 0 ，v v v ) ，得到c 盯的最低检测限 为o r u g g t ic 法作为较早被广泛应用的一种检测方法，主要是因为它的快速，成本 低，但是同时由于它的低灵敏度，低回收率，限制了它的进一步被推广，一般 只能用来定性。 1 2 2 酶联免疫吸附法 。 e l i s a 是利用抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种 新方法。因其具有灵敏性高、简单、无需特殊设备、一次可检测多个样品等优 点，己成为毒素、细菌、农兽药残留、抗生素、有害化合物、病毒检测中最重 要的检测技术之一，展示了良好的应用前景。该技术的主要依据有三点：抗 体吸附在固相载体表面后，仍具有与抗原产生免疫反应的特性；抗原和酶结 合后所形成的结合物( 酶标抗原) ，仍具有免疫反应特性和酶的催化特性；酵 标抗原和抗体结合后，结合物中的酶，能催化底物生成有色物质，且颜色的深 浅，可作为判定抗原含量的依据根据抗体抗原反应动力学可将e l i s a 分为 竞争e l i s a 和非竞争e l i s a ，根据反应体系与检测体系之间的关系又分为直 接e l i s a 和间接e l i s a 直接竞争e l i s a 的操作步骤少，耗时少，变异系数 小，重复性好，但在酶标毒素的构建过程中，对毒素的结构可能造成破坏，以 致破坏毒素的抗原性，影响实验的可靠性和准确性，且可能降低酶的效价，导 致灵敏度也降低，灵敏度的不足可能导致在检测样品时，需对样品进行多次纯 化浓缩处理以提取纯化毒素，这将消耗较多的试剂和需较长的样品处理时间； 5 第一章综述 间接竞争e l i s a 则克服了以上缺点，其灵敏度高，样品处理时间短，但变异系 数大，但其变异系数可以通过实验条件的优化得到控制l l s j 。 目前已有不少e l i s a 方法用于c i t 检测的相关报道。1 9 9 5 年到1 9 9 9 年 期间，a b r a m s o n 1 蛇1 l 等多次用多克隆抗体建立了间接、直接竞争e l i s a 检测 红曲菌发酵液、大麦样品中c i t 的含量，由于红曲菌发酵提取液中有许多结构 类似物可能会有非特异性交叉反应，而造成假阳性，因此其精确度仍有待改善。 v r a b c h e v a1 2 2 等建立的e l i s a 的最低检测限是5n g g h e b e r1 2 3 1 等用间接竞 争酶联免疫法检测食品中的c i t ，得到的最低检测限为1 5 u g g 。a b r a m s o n l 2 4 1 等 为了考察不同湿度( 1 6 、2 0 ) 下，储存在粮仓中的小麦含桔霉素的变化情况， 用了德国b i o p h a r m 公司的c i t 酶联免疫法快速检测试剂盒检测了小麦样品 中的c i t 含量，得到的最低检测限为1 5 z g k g ，结果还显示，当小麦样品被储 存在湿度为1 6 的环境中时，2 0 周后，小麦样品仍不含桔霉素，而小麦样品 被储存在湿度为2 0 的环境中时，5 周后，样品就开始含桔霉素，2 0 周后， 其含量达到1 2 m g k g 。k o n o n c n k 0 1 2 5 烽分别用牛血清白蛋白( b o v i n es 锄 a l b u m e n ，b s a ) 和葡萄糖氧化酶( g l u c o s eo x i d a s e ，g o x ) 与c 耵偶联制成两 种不同人工抗原免疫动物，得到的两种不同兔抗血清，用c 1 t 与卵清蛋白( e g g a l b u m i n ，队) 的偶联物作为包被抗原，建立间接竞争酶联免疫试剂测定谷类( 小 麦、大麦、玉米等) 样品中的c 1 t ，其最低检测限为0 4 1 0n g m l ，c i t 的检 测范围为2 0 5 0 0 z g k g ，变异系数( r s d ) 小于5 。 陈福生1 2 6 】等制备了b s a - c i t 包被抗原和o v a - c i t 免疫抗原，用卵清蛋 白c i t 连接物免疫小白鼠，间接e l i s a 测小鼠抗血清效价，待血清效价达到 要求后，腹腔注射骨髓瘤细胞，1 0 1 5d 后抽取腹水离心纯化得单克隆抗体， 建立了间接竞争e l i s a 检测红曲样品中c 1 t 含量的方法。结果表明，c i t 的 测定浓度范围为5 0 2 0 0n g m l ，回收率为9 r 7 1 0 4 。由此可见，采用的 抗体、检测方法及样品的提取方法不同，都会导致回收率、灵敏度等存在极大 的差异。黄思敏【2 7 l 等以抗c i t 的单克降抗体为配基，淘选以融合蛋白形式表达 在丝状噬菌体m 1 3 外壳蛋白上的随机7 肽库和1 2 肽库，以e l i s a 方 法鉴定阳性克隆，经过3 轮淘选后，得到了能与抗c i t 单克隆抗体特异性结 合的阳性克隆，且该结合能被c 1 t 阻断。结果表明，以7 肽库中亲和力最强 的克隆建立了竞争e l i s a 检测方法，线性范围为1 0 3 2 5n g m l 。最低检测限 为1 0n g m l ，样品加标回收率为8 0 6 1 0 2 1 ；以1 2 肽库中亲和力最强的克 6 第一章综述 隆建立了竞争f j l s a 检测方法，线性范目为1 0 4 3 9n g m l ，最低检测限为l o n g m l ，样品加标回收率为6 4 2 1 0 8 4 e l i s a 法也存在某些缺陷，如对试剂的选择性很高，不能同时分析多种成 分，与结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，得到的结果往往偏高，分析 分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难闭，而( 耵就是一种分 子量很小且不稳定的化合物 1 ，2 3 高效液相色谱法 i - i p l c 法是目前最常用于食品中真菌毒素检测的一种确证方法，它的优点 是可精确地进行定性和定量分析，并可配套使用不同的萃取、纯化及柱静、柱 后衍生和灵敏的检测系统，结果准确、可靠、灵敏度高、重现性好，得到越来 越广泛的应用但因为设备昂贵、对样品中真菌毒素纯度的要求较高，导致检 测成本高、周期长，无法满足大批量样本快速筛查的需要，使得它的使用受期， 了一定的限制。 1 2 3 1 高效液相色谱一紫外检测法 皇 紫外检测器( u l t r a v i o l e td e t e c t o r ，u v ) 是h p l c 中应用最早和最广泛的 检测器之一，几乎所有的色谱都配有这种检测器。它不仅有较高的选择性和灵、 敏度，对强吸收物质最低检测限可达1n g t 2 9 j ，而且噪音低，线性范围宽，对流 速和温度的波动不灵敏，还适用于制各色谱，所以i - i p i c u v 在真菌毒素检测， 上得到了广泛的应用。但它只能检测有紫外吸收的物质，而且流动相也有一定 的限制。即流动相的截止波长应小于检测波长 h a n s 3 e 研究了利用反相色谱柱检测c r r 的各种影响因素，包括五种作为 固定相的碳十八衍生物的理化性质、洗脱液成分、p h 值、温度、五种调节p r - i 值 的酸实验发现，这五种固定相各有所长，选择最佳的分离c i t 的条件一定要 综合考虑固定相、洗脱液成分、p h 值、温度和调节p h 值的酸。h a s s a ni - x a j j a j ( 3 1 1 等将红曲霉菌发酵液用尼龙膜( 直径为0 4 5 衄，孔径为0 8 m ) 过滤后， 利用c 1 8 反相色谱柱，应用梯度洗脱检测c i t ，色谱条件为：3 0r a i n 内使流动 相甲醇：水( 2 0 ：加，v v ) 直线增加到1 0 0 甲醇，流速0 8 m l m i n ，检测波 长7 , m a x - - 2 6 0n m ，检测出了发酵液中c r r 的增长情况m c r ik o k k o n e n 3 2 1 等用 7 第一章综述 该法检测了1 0 种真菌毒素c t r 的检测波长为3 2 8 皿，前2 6m i l l 流动相为 乙腈：水：三氟乙酸( 7 5 ：2 5 ：0 0 5 ，v v v ) ，流速为0 7 m i m i n ，接着1 4 m i l l 内流动相改为乙腈：水( 9 5 ：5 ，v v ) ，流速为1m l , m i n ，检测出青霉菌在酵母 培养基上几乎都产c i t ，只是不同菌株产毒量不同而已 1 2 3 2 高效液相色谱一荧光检测法 荧光检测器( f l u o r e a c g n c ed e t e c t o r ，f l d ) 的灵敏度比u v 高，选择性好， 但只适合于能产生荧光的物质的检测。可直接检测，也能通过荧光衍生化可以 使本来没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了f l d 的应用范围。 f u ) 的原理与荧光分析法相同，化合物受紫外光激发后，发射出比激发波长更 长的光，称为荧光。由于c 1 1 r 在长波紫外线的激发下可发射荧光，根据这一特 性可检测c i t ，因此荧光检测器在c i t 的检测中已得到了广泛的应用【2 】 赖卫华p 3 肄用此法初步研究了红曲霉培养过程中c i t 积累规律，色谱条件 如下：流动相，乙腈：甲醇：水( 5 0 ：3 0 ：2 0 ，v 咖) ；检测波长，九既= 3 1 3n m ， x c m - - - 4 9 5n m ，桔霉素的保留时间为4 2 r a i n ，线性范围为1 2 5 0 u g m i - 许赣荣 1 3 4 - 3 f l 等用h p l c - f l d 法对红曲米提取液进行了分析，色谱条件如下：流动相， 乙腈：水( 3 5 ：6 5 ，v v ，p h 为2 5 ) ；检测波长，k x = 3 3 1n m ，沁m = 5 0 0 n m ， 最低检测限为0 1m g l 。王友志【划等将黄曲霉发酵液用磷酸调p h 至3 0 ，经 过两次过滤，1 2 0 0 0g 离心3 0m i n 后，上清液用i - i p l c - f l d 法检测，色谱条件 如下：流动相，甲醇：乙腈：水( 3 0 ：3 0 ：4 0 ，v 咖，p h 为2 5 ) ；检测波长， 九懿- - 3 3 1n m ，h m _ 5 0 0 姗，流速为0 1 5m l d m i n ，进样量为2 0 口l 结果成功地 监督了红曲霉培养过程中c r r 的变化情况，红曲霉在三s 培养基中产桔霉素 的含量为6 5 4 8 0m g l 。陈蕴阳等比较了t i e 法、h p l c - u v 法和h p l c - f l d 法检测c i t 的效果。t i c 法的条件：展开剂，甲苯：乙酸乙酯：甲酸 ( 7 0 ：3 0 ：1 0 ，v 咖) ；紫外灯下( x = 3 5 0 3 6 5 n m ) 观察，在点样量为1m l 点样长度5 c m 条件下通过目视法，c i t 的最低检测限可达0 2 m g l h p l c 的 色谱条件如下：流动相，甲醇：水( 5 5 ：4 5 ，v v ，用磷酸调口h 至4 0 ) ；运 用紫外检测器0 , = 2 5 4r i m ) 时，得到的最低检测限为1m g l ；运用荧光检测器 ( k x - - 3 3 1n m ，九e m = 5 0 0r i m ) 时，流动相的流速为1 0m l d m i n ，得到的最低检 测限为0 1m g l 在0 1 1 0 m g l 浓度范围内，标准c i t 溶液的质量浓度与 峰面积的线性关系良好，r 2 = 0 9 9 8 。与u v 相比，f l d 的灵敏度提高了1 0 倍， 8 第一章综述 相对标准偏差为0 0 0 1 ，表现出良好的重现性黄志兵闭等对橙色红曲菌 a s 3 4 3 8 4 及其诱变菌株大米固态发酵物中c 1 t 的h p l c 分离进行了优化，比 较了不同色谱柱、流动相、检测器及萃取剂组成对分离效果的影响，分别采用 紫外检测器( z = 2 5 4n m ) 、荧光检测器( k x - 3 3 1 皿，k m = 5 0 0n m ) 及两者串 联对c i t 进行了监测，当采用u v 检测时，在o 5 2 5 m g l ，浓度范围内，线 性关系良好，r 2 - - - 0 9 9 9 8 ，检出限为o 1m g l ；当采用f l d 检测时，在0 0 1 1 2 5m | 皿浓度范围内，线性关系良好，r 2 = o 9 9 9 9 ，检出限为0 0 0 1m g l 国外有学剥剪删也应用该方法检测了桔霉素m o t i n i d 3 9 ) 等用h p l c - f i _ d 法检测了4 5 个样品中的c i t ，色谱条件如下：流动相，0 3 3m o l l 磷酸溶液： 乙腈：丙醇( 7 0 ：3 0 ：5 ，v v v ) ：检测波长，x e x = 3 3 1n n l ，7 e r a = 5 0 0n l n ；流速， 0 7m l m i n ，结果得到：c 1 t 的保留时间风为1 9r a i n ，平均回收率为j 如3 5 ， 线性系数r 2 = o 粥，检测检测限( 1 i m i t o f d c t c = c d ，l o d ) 、定量下限( 1 i m i t o f q u a n t i t 删o n ，l ( ) q ) 分别为0 5 p g k g 、1 5 g ，l 【g ，对c i t 浓度为3 _ g 】唔的样 品检测5 次得到的平均浓度为2 4 3 - + 0 3 0 肛g ，】曜。1 8 的样品中检测到了a 心， 其含量范围为1 5 4 2 h g k g 。 1 2 3 。3 高效液相色谱一质谱检澍法 质诺( m a s ss p e c t r o m e t r y ，m s ) 是用来测定化合物的组成、结构及含量的一 种仪器灵敏度高，用样量极少，鉴定的最小用量可达1n g ，同时还可以确定 分子式，无需使用标准品等优点，在有机化学、生物化学、石油化工、环境保 护化学、食品化学、农业科学、生命科学、医药卫生和临床等领域得到了广泛 的应用。此法应用于检测c r r 上，国内外也都有相关报道 陈蕴1 4 1 j 等用h p l c - f l d - m s 法，对c i t 进行了分析，流动相为乙腈：水 ( 3 5 ：6 5 ，v v ，口h2 5 ) ，荧光检测波长，z e x = 3 3 1n m ，沁m = 5 0 0 衄，结果得 到：低浓度标准样品的质量浓度与峰面积的线性关系怠好，r r 2 曲9 9 9 7 ，最低检 测限为0 0 5m g l ，相对标准偏差为2 1 9 r i c h a r d l 4 2 1 等用h p l c - m s 法同时检测被真菌污染了的玉米样品中的黄曲 霉毒素、c 1 t 、赭曲霉毒素a ( o c h r a t o x i n a ，o t a ) 等7 种真菌毒素的含量。该 研究中用甲醇：水( 8 0 ：2 0 ，v v ) 作为样品的提取剂，色谱条件如下：流动相， 乙腈和0 5 乙酸水溶液( p h3 ) ，运用梯度洗脱，在0 - 1 5m i n 内，乙腈含量 由5 线性增加至5 0 ，1 5 2 5 m i n 内，再次线性增至。流速为0 3 9 第一章综述 m 1 m i n ，进样量2 5 l 结果得到：c i t 的保留时间焉为1 6 7 r a i n ，回收率为 8 0 - 8 6 ，最低检测限为舡班g ，样品中含c i t 的量为2 6 9 3 6 6 j u g k g 1 2 3 4 免疫亲和柱联高效液相色谱法 随着h p l c 设备和技术不断优化和日趋完善，h p l c 的检测工作逐渐简 化，而样品的前处理越来越成为分析过程中的关键。因待测样品中c 盯的痕量 及生物样品的复杂性，将待测毒素从生物流体或生物基质中释放出来、除去其 中的干扰杂质并达到仪器可检测的浓度范围成了检测桔霉素的技术壁垒。样品 的前处理过程涉及的因素很多，直接影响各项分析指标、成本和效率，占用7 0 以上的分析工作量。有许多学者使用了不同的方法对样品进行提取和净化， t u o m i 4 3 1 采用c 8 固相萃取( s o l i dp h a s e b 咖a c i i ，s p e ) 法将液体样品中的c r r 吸附，然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。s e h n e w e i s l 4 4 1 采 用色谱柱纯化技术，n i e l s e n 4 5 则采用固相超微抽提技术，m e i s t e 一4 6 1 采用聚酰 胺柱。尽管这些方法取得了一定的效果，但总体看来都存在繁琐复杂、操作时 间长、选择性差、回收率低、变异系数大等问题，无法满足现代c i t 分析方法 的发展需要。与其它纯化技术相比，免疫亲和柱( i m m t m o a 茄m i 竹c o l u m n ，i a c ) 技术最大优点在于：利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高 纯度的活性