（食品科学专业论文）基于酪蛋白美拉德改性产物构建辅酶Q10复合物胶束.pdf

摘要 | | i l llli ii il ll l li ii ii ii 摘要 y 18 8 9 3 9 9 蛋白质等天然大分子来源广泛且安全性高，是构建绿色、安全的营养素纳米载体 的良好材料。蛋白质在等电点附近溶解性较差，因此以其作为载体材料时应用范围受 到一定程度的限制。本文以酪蛋白与葡聚糖的美拉德反应产物作为基质，以辅酶q l o ( c o q l o ) 作为代表性的营养素，采用乙醇注入超高压均质法制得酪蛋白葡聚糖复 合物辅酶q l o 纳米胶束( 简称复合物胶束) ，建立了复合物胶束中c o q l o 总量的分析 方法；确立了美拉德反应时间与复合物胶束包埋性质、稳定性的关系；采用冷冻干燥 法制得前体胶束，旨在改善产品的运输性能、拓宽其应用范围。 首先，基于十二烷基硫酸钠( s d s ) 对蛋白质的增溶作用，确立了一种分析复合 物胶束中c o q l o 总量的方法。当s d s 浓度为0 3 1m o l l 、孵育温度3 0o c 、硼氢化钠 ( 7m g m l ) 用量1 0 0i t l 、还原时间3 5m i n 时，s d s 增溶法加样回收率在( 9 8 7 74 - 1 6 0 ) ( 9 5 9 04 - o 8 0 ) 之间。同时复合物中酪蛋白单元的内源荧光和外源芘荧光光谱 分析显示，当s d s 浓度为o 0 5m o l l 时，s d s 通过部分改变酪蛋白单元的疏水结 构达到快速增溶的效果，。从而使c o q l o 充分释放，以便定量分析。 探索了美拉德反应时间与所形成复合物制得的胶束包埋性质及稳定性之间的关 系。随着美拉德反应时间延长，复合物胶束的平均粒径在1 9 0 - - 2 1 0n n l 之间变化，表 观形态呈球形或椭球形。以美拉德反应时间较长( 2 0 - - 2 4h ) 的复合物获得的胶束在 储藏期间平均粒径变化较小、保留率较高。外源芘荧光光谱分析表明，复合物胶束中 营养素的稳定性与胶束疏水区范围有关。复合物胶束在p hl - - - 8 范围内具有良好的 p h 耐受性。z e t a 电位与接枝度分析显示，胶束之间的静电排斥作用并非维持其稳定 的主要因素，而是与胶束表面亲水性葡聚糖的空间位阻效应有关。 采用冷冻干燥法制得前体胶束，在储藏过程中保持较高稳定性。x 射线衍射以及 差示扫描量热技术分析表明前体胶束中c o q l o 以无定形存在，因而储藏稳定好。复水 后所得的胶束形态与原胶束基本相同，类似于球形，粒径略有增加，分散性较好。这 与具有多羟基结构的葡聚糖在冻干过程中的保护作用相关。 关键词：酪蛋白；胶束；增溶；复合物；辅酶q l o ；荧光 a b s t r a c t a b s t r a c t p r o t e i ni sw i d e l ya v a i l a b l ea n ds a f er a wm a t e r i a l sf o rc o n s t r u c t i o no fn a n o c a r r l e r s u s e dt od e l i v e rn u t r i e n t s h o w e v e rt h es o l u b i l i t yo fp r o t e i ni sv e r yp o o ra tp i i nt h i s c a s e ，t h ea p p l i c a t i o no fp r e t e i na sd e l i v e r ys y s t e r mh a sb e e nr e s t r i c t e dt os o m ee x t e n t t h eo b j e c t i v eo ft h i sw o r kw a st op r e p a r ec a s e i n - s e x t r a nc o p o l y m e r ( m a i l l a r dr e a c t i o n p r o d u c t s ) b ye t h a n o li n je c t i o na n dh i g hp r e s s u r eh o m o g e n i z a t i o nm e t h o d t h e d e t e r m i n a t i o no fc o q i oc o n t e n ti nm i c e l l e sw a sd e v e l o p e d f u r t h e r m o r e ，t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nm a i l l a r dr e a c t i o nt i m ea n dt h ep r o p e r t i e s o fm i c e l l e sw a s e s t a b l i s h e d f i n a l l y , p r o m i c e l l e sw e r ep r e p a r e du s i n gf r e e z e - d r y i n gi no r d e rt oi n c r e a s e t h ep r o p e r t i e so ft r a n s p o r ta n dw i d e nt h rs c o p eo fa p p l i c a t i o n i nt h i ss t u d y , t h er e c o v e r yr a t eo fc o q t 0f r o mb l a n km i c e l l e sr a n g e df r o m ( 9 8 7 74 - 1 6 0 ) t o ( 9 5 9 04 - 0 8 0 ) w i t hc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ：s d sc o n c e n t r a t i o n0 31m o l l ， i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e3 0o c ，s o d i u mb o r o h y d r i d e ( 7m g m l ) 10 0 此，r e d u c t i o nt i m e 3 5m i n t h ea n a l y s i so fc a s e i ns y n c h r o n o u sa n de x o g e n o u sp y r e n ef l u o r e s c e n c e s p e c t r ai n d i c a t e dt h a tt h eh y d r o p h o b i cr e g i o no fc a s e i nu n i to fc o p o l y m e rw a sp a r t l y c h a n g e dd u r i n gs o l u b i l i z a t i o na ts d sc o n c e n t r a t i o nf o r m0t o 0 5m o l l ，s oa st o r e l e a s ec o q l oa tah i g hs p e e d t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm a i l l a r dr e a c t i o nt i m ea n de n c a p s u l a t i o np r o p e r t i e so f c o p o l y m e rm i c e l l e sw a ss t u d i e d t h ez - a v e r a g ed i a m e t e ro f m i c e l l e sw a sb e t w e e n19 0 a n d210n mr e a c t i n gf o r4 - 2 4h ，p r e s e n t i n ga ss p h e r i c a ls h a p eo re l l i p s o i d t h e s t a b i l i t ya n dr e t e n t i o nr a t ew e r eh i g h e ro fm i c e l l e sw i t hr e a c t i o nt i m e2 0 - - 2 4 h e x o g e n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r ao fp y r e n es h o w e dt h a tt h es a b i l i t yo fc o p o l y m e r m i c e l l e sw a sr e l a t e dt oh y d r o p h o b i cr a n g e t h es t a b i l i t yo fc o p o l y m e rm i c e l l e sw a s v e r yw e l la tp h1 8 t h em a j o rp a r a m e t e rf o rt h es t a b i l i t yo fc o p o l y m e rm i c e l l sw a s n o te l e c t r o s t a t i ce x c l u s i o ni n t e r a c t i o nb u ts t e r i ce f f e c tf r o md e x r e a no b t a i n e df r o m z e t a - p o t e n t i a la n df r e ea m i n oa n a l y s i s p r o m i c e l l e sk e e p e dah i g hs t a b i l i t yd u r i n gs t o r a g e i nw h i c hc o q i oe x i s ta s a m o r p h o u ss t a t ef r o mp o w d e rx - r a yd i f f r a c t i o na n dd i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y a n a l y s i s a f t e rr e h y d r a t i o n ，t h es h a po fm i c e l l e sw e r es i m i l a r l ya sp r i m a r yo n e sa n d t h ez - a v e r a g ed i a m e t e ri n c r e a s e da tal i t t l ee x t e n td u r i n gs t o r a g e t h er e a s o nw a st h a t d e x t r a np l a y e da sap r o t e c t i v er e a g e n td u r i n gf r e e z e d r y i n g k e y w o r d s ：c a s e i n ，m i c e l l l e s ，s o l u b i l i z a t i o n ，c o p o l y m e r , c o e n z y m eq l o ，f l u o r e s c e n c e u 1 4 立题背景和意义5 1 5 主要研究内容6 2 实验材料和方法7 2 1 材料与设备7 2 1 1 实验材料7 2 1 2 实验设备。7 2 2 实验方法7 2 2 1 酪蛋白葡聚糖复合物胶束的制备7 2 2 2 复合物胶束中c o q i 0 总量的测定7 2 2 3 复合物胶束中游离c o q l o 含量的测定8 2 2 4 包封率、载量、产率、泄漏率的计算8 2 2 5 复合物中游离氨基的测定9 2 2 6 褐变程度的测定一9 2 2 7 溶解度的测定9 2 2 8 复合物的氨基酸分析。9 2 2 9 复合物胶束的平均粒径和电位分析9 2 2 1 0 流变性的测定1 0 2 2 1 l 傅里叶红外光谱分析1 0 2 2 1 2 前体胶束中c o q l o 存在状态分析1 0 2 2 1 3 胶束的超微结构观察1 0 目 录 3 结果与讨论1 1 3 1 复合物胶束中c o q l o 总量的分析方法的建立1 2 3 1 1 基于蛋白质的酶解与酸解分析复合物胶束中c o q l o 总量1 2 3 1 2s d s 及复合物对c o q l 0 含量测定的影响1 3 3 1 3s d s 浓度对增溶效果的影响1 3 3 1 4 温度对s d s 增溶效果的影响1 5 3 1 5 硼氢化钠溶液用量及还原反应平衡时间的确定1 6 3 1 6s d s 增溶法的回收率及复合物胶束中c o q l o 的产率1 6 3 2 美拉德反应时间对复合物胶束性质的影响1 7 3 2 1 美拉德反应时间对复合物胶束平均粒径的影响1 7 3 2 2 反应时间对复合物胶束超微结构的影响。2 0 3 2 3 美拉德反应时间对复合物胶束储藏稳定性的影响2 1 3 2 4 复合物胶束的p h 敏感性2 3 3 2 5 美拉德反应时间对复合物胶束微结构的影响2 4 3 3 复合物胶束的制备工艺2 4 3 3 1 乳化方式的选择2 4 3 3 2 载量对复合物胶束性质的影响2 6 3 4 前体胶束性质的研究2 6 3 4 1 前体胶束的储藏稳定性2 6 3 4 2 前体胶束中c o q i o 存在状态的分析2 7 3 4 3 前体胶束复水性质的研究2 9 3 4 4 前体胶束复水后的稳定性3 l 主要结论3 3 致 谢3 4 参考文献。3 5 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文4 1 i i 1 引言 1 1 纳米技术 1 1 1 纳米技术概述 1 引言 纳米技术是指在纳米尺度上研究物质的特性和相互作用，以及利用这些重要特性 的多交叉科学和技术。这一技术使人类认识和改造物质世界的能力延伸到了原子和分 。子水平，成为当今最重要的新兴科学技术之一。纳米粒子由于尺寸处在微观世界和 宏观物体的过渡区域，因此有着独特的化学性质和物理性质，如表面效应、体积效应 和量子尺寸效应【2 】，在医药、材料、信息与通讯技术以及环保与能源开发等领域内已 经得到广泛应用【3 】。2 0 0 3 年9 月，纳米技术在农业与食品工业上的应用由美国农业部 首次提出【4 】。随着纳米技术的科学价值逐渐被认识和纳米材料的制造技术不断完善， 纳米技术作为一门高新技术在食品科学领域的研究将得到越来越多的关注。 纳米输送载体是纳米技术应用在食品领域的重要体现。从材料方面来讲，目前纳 米载体的研究多应用于药物领域【5 】。药物载体的生物相容性要求很高【6 1 ，所以仅有限 的复合物被用作药物载体，其中聚酯和聚乙二醇嵌段复合物经常被用作疏水性药物载 体。这些材料大多通过化学合成方法制得，其生物可降解性及降解产物的毒副作用是 限制其应用的重要因素。天然大分子材料，由于来源广泛、价格便宜、细胞相容性和 生物降解性高、异体免疫性反应较弱【7 1 ，与合成大分子材料相比具有更加光明的前景。 应用食品级或者“公共认为安全”的原料是生产功能性添加剂的良好选择，主要包括植 物多糖( 果胶、淀粉、阿拉伯胶等) 、微生物多糖( 葡聚糖、黄原胶) 、食品中的蛋 白质( 大豆蛋白、酪蛋白、明胶等) 、卵磷脂、糖酯掣引。 1 1 2 大分子自组装 在超分子结构和功能材料的发展中，分子自组装引起了人们的注意。自组装的概 念源自于生命科学领域，生物或生物分子材料的一个重要特征是自组装性质。单个的 生物分子可以自发地组装成复杂的结构，如蛋白质折叠、d n a 碱基互补配对以及生 物膜的形成等。也可以说复杂生命体本身就是自组装形成的产物。分子自组装就是在 平衡条件下，分子间通过非共价相互作用自发组合形成的一类结构明确、稳定、具有 某种特定功能或性能的分子聚集体或超分子结构的过程【9 】。自组装是实现材料设计的 一种新技术，它打破了传统的“自上而下”的材料制备原则，采取“自下而上”的分子构 建模式，合理利用特殊分子结构中所蕴含的各种相互作用，从而获得具有多级结构的 新型材料【l o 】。纳米高分子材料作为药物靶向输送和控释的载体是利用自组装构建控释 体系的成功典型i l 。 江南大学硕士学位论文 1 2 酪蛋白的性质与研究现状 1 2 1 酪蛋白的基本性质 酪蛋白等电点为4 6 - - - 4 7 ，不易溶于水、有机溶剂，而可溶于碱性溶液生成酪蛋 白酸盐。酪蛋白不是单一的蛋白质，而是由一类结构和性质上( 线状、两亲性等) 较 接近的4 种蛋白质组成的混合物，包含a s l 酪蛋白、a s 2 酪蛋白、p 酪蛋白、1 ( 酪蛋 白，在母牛乳中质量比约为3 ：0 8 ：3 ：1 ，相对分子质量在1 9 0 0 0 - 2 5 0 0 0d a 的范围内。 牛乳中9 5 以上酩蛋白以胶束形式存在，通过高分辨率的环境扫描电镜观察到酪 蛋白胶束表面呈粗糙的不规则球状，尺寸在1 0 0 - 3 0 0n n l 左右【i2 1 。胶束的内部结构 及组成较复杂，目前较流行的是h o m e 提出的内部结构模型【l3 1 。h o m e 模型能够成功 解释酪蛋白胶束受p h 、温度、离子强度的影响而产生的变化以及钙导致的酪蛋白聚 集现象。当酪蛋白溶液的p h 值逐渐降低靠近等电点时，酪蛋白胶束会产生聚集并且 形成凝胶【1 4 j 。 1 2 2 酪蛋白的包埋性质 酪蛋白是必须微量营养素、氨基酸、免疫系统组成成分的天然载体。目前认为他 们可能对额外营养素的输送、生物活性物质在食品或药物领域的应用具有独特的效 果。在过去的两年中，对其创新型应用方面的研究逐渐增多【l5 。 d a y 等以牛奶蛋白为壁材，以酪蛋白酸钠为乳化稳定剂，经预乳化、均质对鱼油 进行包埋，制得粒径约1 1 0p m 的乳状液【1 6 】。胶束自身也是良好的营养素输送载体， s e m o 等将维生素d 2 载入酪蛋白胶束中，第一次利用胶束的自组装包埋营养素。将维 生素d 2 在血浆中的溶解度提高4 5 倍，且粒径接近于天然胶束【l 丌。r o a c h 等发现磺 甲硝咪唑经脱脂乳包埋后，溶解度提高4 0 倍【1 8 】。但天然蛋白质在应用过程中存在水 溶性不高、p h 耐受范围窄、胶束再聚集等问题。 1 2 3 酪蛋白改性后产物的应用 针对酪蛋白作为营养素载体所存在的问题，国内外学者采用改性的方式提高其溶 解度、环境适应性。主要包括物理、化学或酶法等改性方法，这些方法会改变蛋白质 的结构和构象，进而改变蛋白质的物理化学性质以及功能。化学改性是常用的较为彻 底、永久性的改性方法，指通过接枝共聚等方法在分子链中引入其它链节和功能基团。 接枝改性可通过将官能团直接连接于表面来实现化学修饰。多糖是由醛糖或酮糖通过 糖苷键连接而成的一种天然大分子化合物，广泛存在于植物、微生物、动物等有机体 中，是生物体维持正常生命活动的必需物质。多糖与生命的各种生理机能密切相关， 具有多种多样的生物学功能，如免疫调节功能、抗感染、抗肿瘤、抗凝血、降血糖和 抗病毒等。因此糖基化接枝改性是改善蛋白质功能性质的较佳选择。 美拉德反应是自然常见反应，已应用于为食品提供天然绿色风味【1 9 1 。美拉德反应 使蛋白质与糖共价结合，不需要任何化学试剂作为催化剂，仅加热就可使该反应自发 进行。目前，蛋白质与还原糖通过美拉德反应进行接枝改性的方法主要有两种：( 1 ) 2 1 引言 干法反应，通过控制自发的美拉德反应来实现，主要应用于蛋白质与多糖之间。( 2 ) 湿法反应【2 0 埘】，蛋白质与糖的水溶液在一定的条件下反应，主要应用于蛋白质与单糖 或双糖之间。g u 等研究酪蛋白和葡萄糖湿法反应制备美拉德反应产物，发现产物具 有良好的乳化性、还原性和抗氧化能力【2 2 1 。刘娟等以酪蛋白和葡聚糖为原料，采用湿 法反应对酪蛋白进行接枝改性【2 3 】。改性后酪蛋白溶解度有显著提高，乳化性及乳化稳 定性也有不同程度提高，从而有效改善了酪蛋白的功能性。但湿法反应时间短、美拉 德反应程度高、褐变严重、反应较难控制，而干法则比较温和，可通过控制反应条件， 使反应维持在初级阶段，有效的降低褐变程度。a k i o 等发现美拉德干法反应2 4h 所得 酪蛋白葡聚糖和半乳甘露聚糖复合物的乳化性较酪蛋白提高1 5 倍，乳化稳定性提高 1 0 倍，在酸性和高盐浓度的体系中仍具有较好的乳化性【2 4 j 。而且j i n g 等通过细胞试验 证明美拉德反应产物没有生理毒性1 2 引。 基于复合物良好的乳化性和乳化稳定性，k o s a r a j u 等以酪蛋白葡萄糖浆接枝复合 物为壁材，经喷雾干燥制备微胶囊【2 6 。在脂肪含量小于1 的条件下，包封率可达9 7 。 体外释放实验发现微胶囊释放率小于2 。但微胶囊粒径较大，约为1 3 p m 。p a n 等研 究了挥发法和透析法制备纳米粒子。将p 胡萝卜素溶解于无水乙醇，基于蛋白质的疏 水特性将添加剂包埋于载体材料中，经过不断的洗涤并挥发有机溶剂或者更换透析 液，除掉有机溶剂，得到耐稀释、耐p h 的纳米载体【2 7 】。该方法成功的利用了蛋白质 的自组装特性对脂溶性营养素进行包埋，但对于包封率、释放效率等指标的研究过程 中所用的营养素含量测定方法比较繁琐，且对于美拉德反应时间与复合物的包埋性质 之间的关系研究较少。 综上所述，国内外就蛋白质与糖的湿法美拉德反应产物的乳化性、抗氧化性、抗 菌性、清除自由基等性质已有广泛的研究。对于干法反应产物的乳化性、乳化稳定性 等的研究也逐渐增多，但基于复合物构建纳米载体的研究尚处于起步阶段，因而包埋 方法不够成熟、不够系统，并且测定方法比较繁琐。 1 3 辅酶q l o 的性质与研究现状 1 3 1 辅酶q l o 的性质与功能 辅酶q l o 是生物体内广泛存在的苯醌化合物，亦称泛醌，其还原型为泛醇。泛醌 和泛醇的化学结构式与维生素k 类似【2 8 】，侧链有多个异戊烯基。c o q l o 具有耐热( 小 于1 2 0 ) 2 9 】、耐湿性相对较高、耐碱性差、水溶性低、遇光易分解等特点【3 0 1 。 c o q l o 存在于线粒体内膜中，在人体呼吸链中质子移位及电子传递中起到重要作 用，是人体内良好的还原剂和抗氧化剂。同时，c o q l o 在增强免疫系统功能、延缓老 化、防治癌症、高血压和心脏病等多种老年性及退行性疾病中扮演着重要角色。 人体能够利用酪氨酸自行合成c o q l o ，但过程较复杂，而且自身合成易受饮食失 衡、年龄因素、体力运动过于激烈等因素的影响。据报道7 7 岁的老人较2 0 年轻人心肌 中的c o q l 0 减少了5 7 ，因此，外源。 生c o q l 0 的补充尤为重要。 江南大学硕十学位论文 1 3 2c o q l o 的应用现状 目前，外源性c o q l o 的补充主要集中于在医药、食品、化妆品等行业。c o q l 0 在医 药方面的产品形式主要为注射液，对于心血管疾病、肝炎、癌症等疾病具有良好 辅助治疗效果。n i i b o r i d 等 3 1 】对心肌缺血灌注损伤的大鼠注射日本卫材株式会社生 产的c o q l o 脂质体注射液后，发现其血液和一i i , 肌中辅酶q l o 的水平显著提高，缺血灌 注损伤后心肌的功能得到改善，氧化损伤降低。对于化妆品行业，例女n d h c 、高丝、 f a n c l 等公司的高端产品，具有帮助皮肤吸收、柔嫩肌肤、有效阻止紫外线等对 皮肤的伤害、减少皱纹的产生等效果。食品行业中形式包括片剂( 粉剂) 、硬胶囊 ( 粉剂) 、软胶囊、油丸以及咀嚼片、舌下喷雾等，在发达国家广泛使用，特别是c o q l 0 原料丰富的美国和日本。2 0 0 8 年，我国开始允许将c o q l o 作为食品原料使用，其在食 品方面的应用具有美好的发展前景。 1 3 3c o q | o 的研究现状 关于c o q l o 的研究随着市场需求的加大而日益深入。日本最早完善- j c o q l 0 的开发 技术，并成为世界上最大的生产国家。清渊化工、日清制粉和协和发酵株式会社占据 c o q l o 全球产量的前三位。但c o q l o 水溶性差，口服摄取后经胃肠道吸收率低，极大 程度上限制了其应用。因此各国学者采用多种手段提高其溶解性和生物利用率。较早 的方法从改善c o q l o 自身结构入手，通过酯化方法可以明显提高血药浓度1 3 引，但是不 能提高各器官的c o q l 0 含量。 为了提高c o q ，。的体外溶解性并改善食品强化方面的应用，各公司相继推出粉剂 型产品。德国b a s f 公司提供了两种形式的产品，一款适合于浓缩制成片剂，可快速 的发挥作用：另一款是增溶型产品，适合于软件囊的应用【3 3 1 。杨海英等研究b 环糊精 ( 3 - c d ) 对c o q l o 的包结行为【3 4 】。采用极谱法证实c o q l 0 与p c d 可形成包结物，并在 一定程度上提高t c o q l 0 的光稳定性。 随着纳米技术的蓬勃发展，输送体系在营养素的包埋、增溶、控释、靶向释放等 方面表现出良好的特性，因而逐渐受到研究者们的重视，已有多方面的报道。早期的 研究多利用表面活性剂的乳化作用对c o q l o 进行包埋。k o m m u r u 等研究了4 种含有油、 表面活性剂、辅助表面活性剂的c o q l o 自乳化载药输送体系。c o q l 0 的载量可达5 6 6 ( w ：w ) ，通过动物实验表明此体系能够提高脂溶性药物口服吸收效率1 3 5 1 。n a z z a l 等基 于c o q l o 熔融特性构建半固体自乳化纳米乳状液药物传递系统p6 。，制得平均粒径为 1 0 0n i n 的乳状液，此乳状液克服常规乳化体系溶解度低、随着时间延长所包埋活性物 质发生不可逆沉降的缺点。但是乳化过程中添加了大量的表面活性剂和辅助表面活性 剂，存在绿色、安全性问题，因而难以在食品工业中推广。k r i s h n a 等将不同摩尔比 的泊洛沙姆和水的混合溶液与c o q l o 形成双重固体分散体系，此方法简单、快速、成 本低，且能够明显提高c o q l o 在水中的溶解性【3 7 】。但差示扫描量热和扫描电镜分析共 同显示c o q l o 并不是以分子状态分散，可能会对c o q l o 的生物利用度造成一定的影响。 j u n y a 等采用表面活性剂、大豆磷脂、甘油、中链甘油三酯经高速分散和均质制备c o q i 0 4 1 引言 纳米乳状液，同时采用干燥的方法制得便于储藏的乳状液产品【鲻j 。此产品提高了 c o q l o 口服摄入的吸收效率且具有良好的分散性。但乳状液制备过程中添加较大量的 表面活性剂( 1 2 干重) 。 基于天然材料对c o q l o 包埋的研究随着人们对健康的更加关注而日益受到重视。 x i a 等采用天然磷脂制备纳米脂质体，粒径较小、稳定性高、易吸收【3 9 1 。s h i n 等采用 以阿朴脂蛋白a i 为基材采用纳米技术对c o q l o 进行包埋，并对其外观形状态和稳定进 行了研究。所得纳米粒子的粒径1 2n m ，比脂质体更小、具有较好的可重复性h o 。可 见磷脂、蛋白质等天然生物资源作为营养素载体己逐渐受到人们的关注。但是磷脂易 氧化和热不稳定、蛋白质的溶解度低等问题限制了其广泛应用。 综上所述，国内外就提高c o q l o 溶解度、利用率等已经开展了相当多的研究工作， 包括酯化改性、乳剂、多重乳状液、纳米粒等。由于乳状液的制各过程中，一般需要 通过添加表面活性剂作为主要或助乳化剂对c o q l o 进行包埋，其大量使用将不利于人 体健康，与绿色安全食品理念不符；载体的材料自身对环境较敏感，不利于产品的有 效保护；乳状液以液体状体存在，运输及应用范围受到限制。 因此目前还有相当多的研究工作需要开展。首先，纳米载体的材料需要进一步开 发，绿色、安全的天然材料需要得到进一步的重视，目前针对改善蛋白质的溶解性、 乳化性、起泡性等功能性质的的研究较多，对于输送载体的研究却非常少；制备工艺 需要进一步改进、优化，操作时间短、低成本是技术工业化的基本要求，因此简化制 备工艺是不可或缺的一步。再者，对于材料的包埋性能需要进行深入研究，美拉德反 应历程一般分为三个阶段，反应的早期阶段，蛋白质与多糖已完成共价结合；进展阶 段，a m a d o r i 产物降解形成大量裂解产物；最终阶段，裂解产物继续反应，生成类黑 精。仅早期阶段共价结合生成的大分子具有良好的乳化、乳化稳定性能适合于作为营 养素输送的基质。因此，对于美拉德反应时间的调控是影响包埋性质的关键问题。最 后，载体性质的表征以及包埋效果的评价是评定工艺优劣的重要指标。营养素的载量、 包封率等指标是评价包埋效果的重要指标，但目前针对基于蛋白质的输送载体的这一 指标没有形成简单、快速、有效的测定方法，且对其测定机理也未见报道。 1 4 立题背景和意义 纳米技术在近十几年的新技术发展中，占据了重要地位。纳米技术的应用已从鲜 为人知的新材料、医药领域逐渐扩大到深入百姓生活的化妆品、食品领域。其中，纳 米载体由于其特殊的结构而具有表面效应和小尺寸效应，如颗粒小、表面积大、表面 反应活性高、吸附能力强等，因此具有靶向性、控释性等独特性质【4 1 - 4 2 1 ，可以作为改 善营养素生物利用率的有效输送载体。目前，天然生物大分子的绿色、安全、生物相 容性好等特征赋予其得天独厚的优势，其作为乳化剂、营养素载体的研究日益受到关 注。由于目前研究不够成熟，因而寻找具有良好输送性能的天然大分子、优化其包埋 工艺参数、建立简单有效的评价方法，是亟待解决的问题。 c o q l o 作为一种具有重大医学价值的生化药物或作为保健食品的良好材料，其医 江南大学硕+ 学位论文 疗价值及保健功能在不断受到重视和开发。但c o q l o 在人体中的自身合成效率低、条 件要求苛刻，且随年龄增长及健康状况的下降而需要量增加，因而必需通过体外补充。 c o q l o 的溶解性是限制其广泛应用的一大瓶颈，其产品的稳定性也是人们关注的焦 点。 因此需要选择合适的材料采用有效技术改善c o q l o 的水溶性进而提高其营养水 平。选择能够较好包埋营养素的天然大分子载体。酪蛋白是乳中特有的一组含有大 量磷和钙的蛋白质，线性大分子结构使其具有较强的抗诱变性和热稳定性，在食品加 工过程中显示出独特的优势。酪蛋白自身的胶束结构是天然的营养素载体，大量的疏 水区域能够对营养素起到良好的稳定、控释效果。而且文献报道酪蛋白是目前所研究 的蛋白质中美拉德反应活性较高的一种，因此避免了某些蛋白质干法美拉德反应长的 情况。葡聚糖是一种典型的多糖，在食品领域的应用已有较完善的基础。酪蛋白一葡 聚糖复合物既继承了蛋白质的疏水自组装特性又兼备多糖良好的水溶性，大分子的空 间位阻效应能够有效避免颗粒间的聚集、沉降而均匀的分散。加上良好的生物相容性、 抗菌效果使其作为营养素输送载体具有光明的前景。制备技术简单、易操作、环境 污染小。采用美拉德反应制备复合物，在一定湿度条件下加热即可实现，无须引发剂 等其他试剂。载体的稳定性。在食品加工过程中，难免有高压、高温等剧烈的处理 条件，酪蛋白葡聚糖复合物的线性大分子结构使其具有较强的抗压、抗热能力。而 且复合物的溶解度较酪蛋白明显提高，其多羟基结构解决了酪蛋白在等电点附近不溶 解的问题。环境适应性。人体各个部位的内环境较复杂，离子强度、p h 差别较大， 复合物胶束的广泛适应性极大满足了不同营养素补充剂的需求。 1 5 主要研究内容 本论文以美拉德反应产物( 酪蛋白葡聚糖复合物) 为基质制备复合物胶束，意 在进一步促进基于蛋白质的纳米载体在功能食品领域的应用。选择脂溶性的c o q l 0 为代表性营养素，研究纳米载体对脂溶性营养素的包埋效果，旨在改善其水溶性及储 藏 1 2 3 2 实验材料和方法 2 实验材料和方法 2 1 材料与设备 2 1 1 实验材料 辅酶q l o 原料( 9 8 0 一1 0 1 0 ) ，日清制药；辅酶q l o 标准品( 9 8 ) 、胃蛋白酶、 芘( 荧光光谱级) 、三硝基苯磺酸( t n b s ) ，s i g m a 公司产品；a l c a l a s e ，诺维信；n 酶，日本株式会社；十二烷基硫酸钠( s d s ) 等其他它材料( 分析纯) ，中国医药上 海化学试剂公司。 2 1 2 实验设备 v c x 5 0 型超声处理器( 2 0k h z ) ，美国s o n i c s & m a t e r i a l s 公司；c l 2 0 b 型冷冻离 心机，上海安亭科学仪器厂；z e t a s i z e rn a n o z s 型纳米粒度分析仪，英国m a l v e m 公司； 超高压均质机n s l 0 0 1l 2 k ，意大禾l j n i r os o a v i 公司；u v 1 6 0 0 紫外可见分光光度计， 上海美普达仪器有限公司；a r l 0 0 0 流变仪，英国t a 公司；荧光分光光度计f 7 0 0 0 ， 日本日立公司。傅立叶变换红外光谱仪，美国瓦里安公司；差示扫描量热仪，英国 m e t t l e r 公司；d 8a d v a n c e 型x 射线衍射仪，德国b r u k e r a x s 公司；c s p m 3 3 0 0 原 子力显微镜，广州本原公司；h 7 6 5 0 透射电镜，日本日立公司。 2 2 实验方法 2 2 1 酪蛋白葡聚糖复合物胶束的制备 2 21l 复合物的制备 采用干法美拉德反应制备复合物1 4 3 】。酪蛋白和葡聚糖( r n m = l 7 ，葡聚糖分子量 2 0 k d a ) 溶于1 1 5m o l l 的磷酸盐缓冲液中，搅拌，制成酪蛋白质量浓度为8m g m l 的 均匀溶液，冷冻干燥2 4h 。干燥后的样品磨细，过1 2 0 目筛，置于培养皿中，用刺孔 的铝箔封口后进行反应，反应温度为6 0o c ，相对湿度为7 8 ，p h 为7 0 。达到反应 时间后，冷却终止反应。 2 2 i 2 复合物胶束的制备 采用乙醇注入超高压均质法和乙醇注入超声法制备复合物胶束。将酪蛋白葡聚 糖复合物溶于5 5o c 水中，控制酪蛋白浓度为1m g m l ，搅拌以充分溶解。将c o q l 0 乙醇溶液快速注入复合物水溶液中，再次搅拌，旋转蒸发除去乙醇，迅速冷却，调整 p h 为4 6 ，冰浴超声处理4m i n ( 脉冲ls 1s ) 或超高压均质处理( 一级压力为1 0 5 0b a r 条件下，循环一次；然后压力为1 4 0 0b a r 条件下，循环两次) ，4o c 静置过夜，即得 负载了c o q l o 的复合物胶束。将复合物胶束进行预冷、真空冷冻干燥，得到前体胶束 】。前体胶束，按照干燥前的浓度溶于水中，即得复水后的胶束。 2 2 2 复合物胶束中c o q l o 总量的测定 2 2 2 1 基于蛋白质的酶解分析复合物胶束中c o q 6 - 量 7 江南人学硕十学1 1 i ) = 论文 取lm l 待测样品，加入5 0p l 已活化的酶液( 胃蛋白酶、a l c a l a s e 、n 酶) 孵育2 4h 后，按有机溶剂洗涤法将c o q l o 富集并供定量分析4 5 4 7 1 。于待测样中加入5m l 石油 醚，振荡充分混合后，2 0 0 0r m i n 离心5m i n ，移取上层有机相于另一试管中，加入5 m l 石油醚重复萃取一次，合并有机相，用氮气吹干，定容。采用相同方法处理空白 样品作为对照，测定处理液在2 7 5n l 1 处以n a b h 4 还原前后的吸光值之差。c o q l 0 在 乙醇溶液中的标准曲线为：鲋= 0 0 0 1 5 x c - o 0 0 7 9 ( 启- - 0 9 9 9 4 ) 。其中，c 为c o q l o 的浓度( p , g m l ) ，鲋为吸光值之差。 2 2 2 2 基于蛋白质的酸解分析胶束中c o q l o 总量 于待测样品中加入lm l 浓盐酸，8 0o c 孵育2h ，按照2 2 2 1 中的方法测定c o q l o 含量。 2 2 2 3 基于s d s 增溶分析胶束中c o q l 0 总量 透光率的测定：取0 5m l 待测样液于1 0m l 具塞刻度试管中，移入系列浓度的 s d s 水溶液，振摇，孵育，定容后使体系中s d s 浓度为0 , - 0 5 m o l l 。测定处理液在 6 0 0n l n 处的透光率。 内源荧光光谱分析：将0 5m l 空白胶束移入试管，加入系列浓度的s d s 水溶液， 孵育后在激发波长为2 9 5n l t l ，荧光发射和激发狭缝宽度均为2 5n n l 的条件下，分析 2 8 0 - 4 0 0n n l 范围内的荧光光谱1 4 引。 外源荧光光谱分析：移取1 0 0l , t l 储备液( 芘的浓度1 1 0 4m o l l ) 于试管中，用 氮气吹干。移入空白胶束，4 0o c 水浴中超声4 0m i n ，继续孵育2 4h 。加入系列浓度 的s d s 水溶液，孵育后测定。芘的最终浓度为1 0 一m o l l 。激发波长为3 3 5a m ，荧光 发射和激发狭缝宽度均为2 5n n l ，测定芘在3 5 0 - - 5 5 0n l i l 范围内的荧光光谱。第一发 射峰( 3 7 3n m ) 与第三发射峰( 3 8 4n m ) 的荧光强度比值i l 1 3 表征芘所处微环境的极 性【4 2 】。 2 2 2 4 还原剂用量及反应时间的确定 取o 5m l 待测样液于1 0m l 具塞刻度试管中，移入s d s 水溶液，振摇，孵育后 加入硼氢化钠，测定2 7 5n l t l 处的吸光值。 2 2 2 5s d s 增溶法的回收率 移取lm l 空白胶束，分别加入梯度c o q l o 乙醇标准溶液，以s d s 增溶后测定 c o q l o 含量计算方法的回收率。c o q l o 在s d s 溶液中的标准曲线为：a a = 0 0 0 1 4 c - o 0 0 9 3 ( r 2 = 0 9 9 9 ) 。其中鲋吸光值之差，c 为c o q i 0 的浓度( 1 t g m l ) 。 2 2 3 复合物胶束中游离c o q l o 含量的测定 参照2 2 2 1 测定游离c o q l o 的含量。 2 2 4 包封率、载量、产率、泄漏率的计算 包封取) = 丝蠼鳖篇麓篱筹塑型枷。 2 实验材料和方法 蝈，= 嚣糍枷。 产率c ，= 薹盖基妻主是淼- 。 泄确，= 餐鬻器川。 保酾，= 器孺嚣蓑嚣枷。 2 2 5 复合物中游离氨基的测定 将复合物溶于3 ( w v ) s d s 溶液制得样品溶液，取0 2 5m l 样品溶液，加入磷 酸盐缓冲液( 0 2m o l l ，p h8 2 ) ，1 0 m l0 1 ( m v ) t n b s 充分混合后，置于5 0 。c 的水浴加热6 0m i n ( 避光) ，加入4 0m lh c l ( 0 1m o l l ) 终止反应，室温下放置3 0 m i n 。在3 4 0