（食品科学专业论文）红曲色素的固态发酵法制取技术及其稳定性研究.pdf

中文摘要 红曲色素是优良的着色剂。固态发酵制取红曲米仍是国内红曲生产的主要 方式。如何优化固态发酵制取红曲米工艺，如何提取高色价低桔霉素含量红曲 色素，如何保持红曲色素的稳定；都是目前环境下，固态发酵制取优质红曲色 素亟待解决的问题。本论文包括以下方面的内容： 1 不同菌种固态发酵制取红曲米，以高色价低桔霉素含量为指标，筛选出 能制取优质红曲米的红曲霉菌株m 8 # 。采用固态发酵制取高色价低桔霉素含量 且外观优良的红曲米的关键控制点为：保持原料接种前含水量为5 0 ；红曲菌 种活化用水比例为1 ：9 ；在接种后第三天开始第一次加水；红曲菌种ph 值调节 为3 0 左右；蒸煮工序后发酵底物p h 值为6 0 左右；接种培养温度调整为4 5 ，发酵温度保持为3 8 。 2 以色价和桔霉素含量为指标，采用溶剂乙醇在不同提取浓度、提取配比、 时间、温度、p h 值上进行单因素实验。考察溶剂甲醇和乙醇多因素作用提取对 红曲色素的提取效果获得提取参数为：甲醇提取时，采用6 5 甲醇在p h 值为1 2 ， 提取温度为3 0 ，提取时间为1 h 条件下对红曲米进行提取；乙醇提取时，采用 7 5 乙醇在p h 值为1 2 ，提取温度为3 0 ，提取时间为1 h 条件下对红曲米进行 提取。采用超临界c 0 2 提取法对红曲色素进行提取，结果发现，超临界c 0 2 提 取法对红曲中桔霉素提取率很低。 3 对比不同光照条件对红曲色素样品色价的影响，考察红曲色素的光稳定 性。结果表明：有利于保持红曲样品的色价的光照条件顺序为，避光条件 紫 外线 漫射光 日光；各种光照条件对红曲色素样品中桔霉素含量影响不明 显。 4 采用温度、金属离子、螯合剂、抗氧化剂对红曲样品进行稳定性的正交 实验。以色价和桔霉素含量为指标，研究在综合作用下，温度、金属离子、螯合 剂、抗氧化剂对红曲色素样品的稳定性影响。 关键词：固态发酵；红曲提取；色价；桔霉素；稳定性 a bs t r a c t m o n a s c u sp i g m e n ti sa i le x c e l l e n ts t a i n e r t h ep r o d u c t i o no fm o n a s c u sp i g m e n t e x t r a c t e df r o ms o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o nd e ei ss t i l lt h em a i nm e t h o do fm o s td o m e s t i c m o n a s c u sp i g m e n tm a n u f a c t u r e r s h o wt oo p t i m i z ee x t r a c tt e c h n o l o g yo fm o n a s c u s p i g m e n tf r o ms o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，h o wt oe x t r a c tm o n a s c u sp i g m e n t o fh i g h e r r e dc o l o rv a l u e sa n dl o w e rc i t r i n i n ，h o wt om a i n t a i nt h es t a b i l i t yo fm o n a s c u s p i g m e n t ，a l lt h e s ea r ep e n d i n gi s s u e sc o n c e r n i n gm o n a s c u sp i g m e n te x t r a c t e df r o m s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o nu n d e re x i s t i n gc o n d i t i o n s t h i ss t u d yp a p e ri n c l u d e st h ef o l l o w i n gc o n t e n t s ： 1 t h ep r o d u c t i o no fm o n a s c u sp i g m e n tr i c eb ys o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o no f d i f f e r e n tb a c t e r i as e e d s ，t ou s et h ec o n t e n to fh i g h e rr e dc o l o rv a l u e sa n dl o w e r c i t r i n i na si n d i c a t o r , t os e l e c tm o n a s c u sp i g m e n tm 8 # w h i c hi sa b l et op r o d u c e e x c e l l e n tm o n a s c u sp i g m e n tr i c e ，w h i l et o o p t i m i z ep r o d u c t i o nc o n d i t i o n s o f m o n a s c u sp i g m e n te x t r a c t e df r o ms o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n 2 t ou s ec o l o rv a l u e sa n dc i t r i n i nc o n t e n ta si n d i c a t o r s ，t oc a r r yo u ts i n g l e f a c t o rt r i a la td i f f e r e n te x t r a c td e n s i t y , e x t r a c tr a t i o ，e x t r a c tt i m e ，e x t r a c tt e m p e r a t u r e ， e x t r a c tp hv a l u e sw h i l eu s i n gs o l v e n te t h a n o l ，t os t u d yt h ee x t r a c te f f e c to f m o n a s c u sp i g m e n tu n d e rs i n g l ef a c t o ro fe t h a n o l ，t ou s es o l v e n tc a r b i n o la n de t h a n o l a n dc a r r yo u to r t h o g o n a lt r i a lo ff i v ef a c t o r sa n df o u rh o r i z o n s ，t oo b t a i nt h eb e s t c a r b i n o la n de t h a n o le x t r a c t e dd e s i g n so fm o n a s c u sp i g m e n t ，t ou s es u p e r c r i t i c a lc 0 2 e x t r a c t i o nt oe x t r a c tm o n a s c u sp i g m e n t ，t h er e s u l ti n d i c a t e st h ee x t r e m e l yl o w c o n t e n to fc i t r i n i no fm o n a s c u sp i g m e n tb ys u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o n 3 t oc o m p a r et h ee f f e c to fc o l o rv a l u e so fm o n a s c u sp i g m e n tu n d e rd i f f e r e n t l i g h tc o n d i t i o n s ，t os t u d yt h el i g h ts t a b i l i t yo fm o n a s c u sp i g m e n t ，t h er e s u l ti n d i c a t e s t h ed e s c e n d i n go r d e ro ff a v o r a b l el i g h tc o n d i t i o n st om a i n t a i nc o l o rv a l u e so f m o n a s c u sp i g m e n ti s ，d a r kc o n d i t i o n u l t r a v i o l e tr a d i a t i o nc o n d i t i o n n a t u r a ll i g h t c o n d i t i o n s u n s h i n ec o n d i t i o n ，t h e r ei sl i t t l ed i f f e r e n c eo fc i t r i n i nc o n t e n ta m o n g m o n a s c u sp i g m e n ts a m p l e su n d e ra l lk i n d so fl i g h tc o n d i t i o n s l f 譬 4 t ou s et e m p e r a t u r e ，m e t a li o n ，c h e l a t o ra n da n t i o x i d a n tt oc a r r yo u tt h e s t a b i l i t yo r t h o g o n a lt r i a lo fm o n a s c u sp i g m e n ts a m p l e s t ou s ec o l o rv a l u e sa n d c i t r i n i nc o n t e n ta si n d i c a t o r s ，t os t u d yt h es t a b i l i t ye f f e c to ft e m p e r a t u r e ，m e t a li o n ， c h e l a t o ra n da n t i o x i d a n tt om o n a s c u sp i g m e n ts a m p l e su n d e rc o m b i n e dc o n d i t i o n s k e y w o r d s ： s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ； m o n a s c u sp i g m e n te x t r a c t i n g ； c o l o rv a l u e s ；c i t r i n i nc o n t e n t ； s t a b i l i t y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名引凝时间：加6 年占月，2 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，e p ：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 1 疑 时间：枷z 年 6 月，年日 导师签名：樱孝毒 帆妒6 年f 月圹日 第一章绪论弟一早珀下匕 1 引言 红曲( 亦名红曲米) 古代称丹曲，是以大米为原料，经红曲霉( m o n a s c u s ) 发酵 而成的一种紫红色米曲，故又称赤曲。起源于中国，是我国先人的一大发明。早 在宋朝就有将红曲应用于食品中的记载。北宋时期，陶谷所作的清导录就有 “红曲煮肉”的记录；苏轼的诗词中有“夜倾闽酒赤如单”的诗句。后来人们逐渐发 现红曲具有防腐、保健、医学等方面的作用。明代李时珍在本草纲目中记载 道：“红曲气温味甘，无毒。主治扑伤损”，“治女人血气痛及产后恶露不尽，擂 酒饮之良”；清代王如鉴在本草药编中记载到“气味甘温曲是红，亦能消食与 调中，健脾燥胃和营血，产后伤科并建功”，红曲“作酒则带热辛，能动痰疾，脚 气之疴并发痔瘘肠风之患”；廖希雍认为“红曲霉治脾胃营血之功，有同气相求之 理。消食健脾胃，与神曲相同，而活血和营，维红曲为能”。近代中医药理论把 红曲的药用功能主要概括为“除湿痰，活血化淤，健脾消食”，“治赤白痢，下水 谷”等几点。随着时代进步，国内外学者对红曲色素的深入研究证实了红曲色素 除了感观上的美感还具有多种药理保健功效，因而日益受到人们的关注【l 弓】。 红曲色素作为一种现代工业常用的食品添加剂，不仅广泛用于食品工业中， 如酿酒、造醋、制酱油、肉制品、奶制品、豆制品、调味品等，还有强效抑菌、 增强免疫力、抗疲劳、降血脂、降血压、降血糖的作用1 4 - 9 。红曲霉是制造红曲 的主要微生物，以其能产生大量天然红曲色素而著称。红曲霉用作酿酒和生产天 然红色素在中国已有悠久历史。红曲霉也是目前世界上唯一生产食用色素的微生 物。因此，以红曲作为食用色素不但可以改善食品色泽，具有功能性和营养价值， 而且也是安全的。食用色素通常分为食用合成色素和食用天然色素两类【l o 】。合 成色素由于有着色力强、色泽鲜艳、稳定性好、易于溶解和拼色，以及成本低廉 等一系列优点，曾一度被广泛应用。但近年来随着人们对合成食品添加剂和化学 药物对人体毒副作用的认识，世界各国掀起了食用绿色食品和使用天然药物的热 潮，天然食用色素日益被消费者青睐。红曲及其红曲色素己成为具有保健功效的 食品配料和添加剂。在日本，已把红曲中发现的m o n a c o l i n 物质制成降血脂药物 等投放到市场，年销售额达1 0 亿美元【1 l 】；中国庄桂和苏富贵等研制出红曲西瓜 发酵乳酸、红曲清蛋糕、大曲酒以及红曲饮料等，活性功能强，味道鲜美1 2 。1 5 1 。 随着水溶性红曲红色素的问世，使其在肉制品中的应用范围越来越广。尤其在通 脊烤肉、圆火腿、午餐肠、火腿肠等西式肉制品中的应用1 6 1 羽。在目前肉制品加 工中，为了满足产品的出品率及品质的要求，需要添加一定数量的蛋白和添加剂， 这些添加剂会对产品的颜色产生不好的影响，因此需通过添加色素来弥补，而可 溶性红曲红色素在腌制液及注射液中分散性好，颜色与天然肉色相适，易于调配， 且对热稳定，因而达到了预期目标1 9 。2 1 】。另外，用红曲红色素作发酵香肠的发色 剂，可部分替代亚硝酸盐的用量，不仅能达到用亚硝酸钠制作的颜色，对肉毒核 状芽孢杆菌还有抑制作用【2 2 , 2 3 】。 以天然色素取代人工合成色素是色素生产的必然趋势，因此食用天然色素的 研制就显得尤为重要。众所周知，中国、日本、朝鲜等都在进行工厂化生产红曲 色素。但是由于消费市场对红曲色素的大量需求，以及现阶段红曲色素生产技术 条件的制约，红曲色素的大量生产和应用还远远达不到应用的理想程度2 4 , 2 5 】。主 要症结在于红曲色素生产效能低，生产出来的红曲色素的稳定性和色价难以保证 2 1 , 2 2 。因此，对红曲色素的提取工艺和其稳定性的研究势在必行。 2 红曲米及红曲色素 2 1 红曲米 红曲米即红曲，其发明至今已有一千多年的历史，它是以稻米蒸熟后接种红 曲霉( m o n a s c u s ) 发酵制成的：大米蒸熟成米饭后，接种红曲霉菌种，在适宜条件 下，菌种在米饭中扩散、传布、发酵、繁殖，红曲霉分泌红色素，终止发酵后， 采用日光晒干，或低温真空干燥成呈紫红色至棕红色干米粒。 成品红曲米外表呈深红色至棕紫红色，质轻脆，断面为粉红色；微有酸气、 味淡；红曲米颗粒易溶于氯仿，呈红色，还易溶于乙醇、乙酸等有机溶剂，微溶 于石油醚呈黄色，溶于苯中呈桔黄色；不溶于冷水。红曲有库曲、轻曲、色曲三 个品种。库曲主要用于酿制黄酒、果酒、药酒；轻曲主要用于酿制腐乳、酱菜、 果酒、药酒、食品着色；色曲主要用于食品着色。它们生产的不同之处主要是菌 种、发酵周期等的区别。红曲昧甘、性温、无毒，是深受我国人民喜欢的天然红 色色素和功能性食品的原料，是具有降血压等功能的中药2 6 2 8 】。 2 2 红曲色素 红曲色素是一种优质食品天然色素，由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成，是 红曲霉的次级代谢产物【2 9 1 。红曲色素，商品名叫红g x _ ( m o n a s c u sr e d ) ；是以红 曲米为原料，经萃取、浓缩、精制而成，及以大米、大豆( 粕) 为主料，经红曲霉 菌液体发醇培养制得的天然红色色素【3 0 1 。作为天然色素，其对p h 值、温度、金 属离子氧化还原剂等较其它天然色素稳定2 9 3 2 1 ，尤其是红曲色素除作为安全食用 着色剂外还含有降低血脂降血压等有效的生理活性物质、防腐、保鲜物质 3 3 , 3 4 ， 因此红曲色素具有“天然、营养、多功能”的多重优点。 红曲色素是多种色素成份的混合物 3 5 - 3 8 】。对红曲色素采用有机溶剂提取和两 次柱层析分离，可得到红色针状、黄色和紫色片状晶体，其结构性质不同。早期 已经测定出的红曲色素结构式的有6 种，具体情况见表1 - 1 。 表1 1红曲色素的主要组分 t a b l el im a i ne l e m e n t so fm o n a s c u sp i 盯n e n t 注：表1 1 摘取于文献 3 9 】 七十年代以来，学者们对红曲色素衍生物，色素代谢等方面又开展了一系列 的研究，但总的说来在红曲菌色素结构及其性质研究方面进展不大4 0 1 。1 9 9 3 年， 郭东川【4 l 】等从分离得到高产色素的红曲菌菌株出发，进行色素的分离和纯化， 得到两种色素，经鉴定为新发现的红曲菌色素。分子量分别为4 2 5 和3 9 7 ，可能 的分子式为c 2 5 h 3 1 0 5 n 和c 2 3 h 2 7 0 5 n 。1 9 9 4 年，e j b 1 a n c l 4 2 1 也测得了新的一种色 素结构。这与日本羲部明彦，广井忠夫等预测的还有5 6 种色素成份存在于红曲 色素之中有待证实的结论相对应。 2 3 红曲色素的理化性质 相对合成的色素而言，天然的红曲色素在其理化性质上有其特殊之处，深刻 了解其理化性状及其变化，可以更好地掌握红曲色素生产和品质维持的机理，对 其开发应用大有好处。据报道，红曲色素在有机溶液中的溶解度从甲醇、丙二醇、 乙醇、醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酯等依次降低，就常用溶剂乙醇而言， 乙醇体积分数8 2 时，对红曲色素的溶解性最好【4 3 】。而红曲色素在水中的溶解 性与水溶液的p h 值有关，在中性和碱性条件下，溶解性较好。红曲色素的稳定 性等品质能够受到光、热、p h 值、溶剂种类和浓度等的影响，如：溶剂的极性 与红曲色素的褪色呈正相关，氧和光都会加速红曲色素的褪色，红曲色素在高浓 度溶液较低浓度溶液稳定等。另外，红曲色素具有较强的抑菌抗菌能力，部分霉 菌株产的红曲霉红色色素还能产生具有较高酶活的多种酶类，如：淀粉酶、糖化 酶、糊精化酶、蛋白酶等 7 , 3 1 , 3 2 。 2 4 红曲色素的安全性争议 自古以来红曲在中国一直用于食品着色，特别是肉类的着色。随着认识到合 成色素有可能诱发癌症而被禁用后，红曲色素作为天然产物，消费在逐年增加。 我国红曲广泛用于食品、饮料、冷食着色、食品发酵、制取药物等，产品除销于 国内市场外、还远销日本、德国、俄罗斯、东南亚等国家和地区，深受欢迎。如 今，其他国家都在加速研究和进行红曲生产开发应用。 然而近几年来，随着人们对其研究程度日渐深入，出现了关于红曲食用安全 性的各种论述。我国科学家在1 9 9 5 年用高剂量紫红曲( m p u r p u r e n s ) 提取色素 在白鼠和兔子身体上所做的动物试验证实红曲产品没有毒性，其急性和慢性毒理 反应均呈阴性。日本学者在1 9 9 7 年也有类似的结论。但是西方许多国家，对红 曲的合法地位尚无定论m 】。其主要焦点在于红曲产品中是否含有桔霉素。1 9 7 7 年，x i n g c h u nw o n g 等人通过菌种诱变而从红曲霉的发酵产物中分离出一种黄色 的抑菌物质，并将其命名为m o n a s c i d i na 。随后，法国人b l a n c p j 通过实验证 实m o n a s c i d i na 即是桔霉素，并相继发表了红曲产品中的真菌毒素桔霉素的研 究报告，从而引起了各国对红曲产品应用的限制【4 5 j 。西方国家正在制订针对我 国出口的红曲新标准，严格限制红曲色素中桔霉素的含量，必须低于规定值，否 则将禁止我国红曲色素的进口及销售。我国红曲产品出口开始受到国际市场的压 力。德国要求从中国进口的红曲必须有安全生产菌种及不含桔霉素的证明 2 0 , 4 4 , 4 6 1 ，日本卫生部门也对红曲产品进行了严格检验，认定其红曲产品不含桔霉 素方可生产和出口。目前，虽然我们已经能够对红曲产品中是否含有桔霉素进行 检测，但我国红曲米及红曲红国家标准中尚未建立检测方法及控制指标阿5 0 1 。 4 2 5 红曲产品的相关安全性试验 2 5 1 毒性试验和致变性试验 1 9 9 5 年，法国人p j b l a n c 教授发表一系列论文，认为红曲霉菌中的两个重要 的种，m o n a s c u sp u r p u r e u s 和m o n a s c u sr u b b e r 会产生桔霉素( c i t r i n i n ) ，对肾脏有毒 害作用。p j b l a n c 同时也认为，并非所有的红曲霉菌种都会产生桔霉素，而且即 使使用某一能产桔霉素的菌种，若生产方法不同，桔霉素的含量也不同，有的甚 至检测不出桔霉素。日本学者布谷昭和广井忠夫对红曲和红曲色素进行了毒性和 致变性试验，结果( 见表1 2 ) 表明，红曲不含黄曲霉素和桔霉素，口服和注射 红曲的小白鼠l d 5 0 都在安全剂量标准以外，其各项毒性试验与对照没有差异，说 明其采用的红曲对产品的应用没有毒性，没有致变性，安全性很高【5 1 1 。另外， m a r t i n k o v a 对肝细胞进行了毒性实验，通过测量l d h ( 乎l 酸脱氢酶) 的漏损率，红 曲色素对细胞膜的完整性并无影响；g s h ( 还原型谷胱甘肽) 的含量以及丙醛的产 生与空白相比，也无明显的不同；结果发现在研究的任何一时间段，红曲色素在 一定浓度范围内，对肝细胞均无毒害作用。从上述对红曲相关的毒理性和致变性 试验来看，选用合适的红曲菌种，合理的生产工序和提取方法生产出的红曲安全 性是能够有保障的。 表卜2 红曲和红曲色素的毒性及致变性试验5 2 。5 4 】 t a b l e1 2t o x i na n d v a r i a b i l i t yt r i a lo fm o n a s c u sa n dm o n a s c u sp i g m e n t 2 5 2 红曲中桔霉素的定性检测 用薄层层析法检测红曲的提取液，将其与桔霉素和黄曲霉素的提取液比较， 比较它们的r f 值，结果证明，红曲的提取液中不含桔霉素和黄曲霉素。说明绝 大多数红曲产品中桔霉素和黄曲霉素没有或者含量很低，食用、药用安全程度高， 可以放心选用。 红曲一千多年应用于人民大众的生产生活实践更是表明，红曲是安全可信赖 的天然食品、药品；红曲色素是一种安全可信赖的天然色素。我们所要做的是尽 可能让红曲满足国际数字化标准，与世界经济接轨，将我国的红曲产品推向世界， 为人类造福。 事实上，科学数据表明，红曲中桔霉素含量的多少主要由红曲霉菌种本身决 定，并非所有的红曲菌都会产生桔霉素，如日本用毛红曲酶、红色红曲酶、紫色 红曲酶可以生产出不含桔霉素的产品；而且桔霉素的产生与生产方法有关，一般 在红曲酶发酵的晚期会产生桔霉素，生产工艺条件还决定桔霉素的含量。红曲产 桔霉素的生物途径为：1 个乙酰辅酶a 分子和4 个丙二酰辅酶a 分子缩合成戊 酮，再经甲基化、缩合、还原、烷基化、还原、氧化、脱水等步骤，最后生产桔 霉素。另有研究者认为，常规生产上不存在高效而又不产生桔霉素的红曲霉，真 正具毒理安全性而又符合生产工艺需要的是红曲霉的变异体。有必要对这些安全 而高效的菌种进行筛选、提纯，并开发利用，达到安全卫生生产，甚至可使之专 利化5 5 - 5 9 1 。 3 红曲色素的研究现状 3 1 红曲米的制取现状 8 0 年代以来，国外发达国家采用厚层通风制曲和液态发酵法结合生产红曲 技术的研究成功，实现了红曲生产的机械化、连续化和自动化。厚层通风制曲采 用大罐浸米，蒸饭机蒸饭，厚层通风制曲，微机控制温度等技术，能够保证产品 质量稳定，出曲率提高。与传统固态发酵法相比，液态发酵法具有规模大，自动 化程度高，生产过程中易控制杂菌污染等。但首期投入很大，技术要求高，在我 国国内普及的可操作性不强。目前国内的红曲米生产大多仍是采用传统的固态发 酵工艺，其主要缺点是：发酵周期较长，生产效率低，生产能力和产品质量不稳 定，杂菌易污染以及桔霉素的控制问题；但其优点也是显而易见：资本投入小， 6 技术易掌握，过程易操作等，适合广大农村生产，非常符合中国国情。 3 2 红曲色素提取工艺的研究现状 据报道，影响红曲色素产量和品质的主要因素很多，如培养基成分、p h 值、 培养温度、供氧情况及其他物理因素等。天然红曲色素产生于红曲霉接种发酵后 的产物，这一混合物质的提取工艺条件直接影响着红曲色素的产量和品质，其提 取工艺技术很大程度制约了红曲色素的规模化发展。近年来，随着对红曲色素提 取条件的进一步研究，工作者们取得了较为可喜的成绩。甘纯玑等以乙醇为溶剂， 设置不同条件从红曲中提取红曲色素，通过适当加大乙醇提取液用量比例，使得 红曲色素的提取率提高：乙醇浓度为7 0 一8 0 时，提取率达到最佳水平。陈家 文利用诱变育种选育高产菌株，采用较合理的中试工艺流程和工艺条件，用沉淀 浸提法提取工艺对水溶性红曲色素进行了中试生产，获得的红曲色素水平为 2 0 0 u m l ，平均提取率为5 5 5 的高水平。黄前美等试验表明，当乙醇体积分数 为7 0 时，色素浸出液最高；温度对红曲色素的抽提有影响；在乙醇体积分数 为7 0 时，4 0 时提取色素达到峰值，6 0 时均基本保持同一水平，但溶剂挥 发量大。红曲色素提取是一道重要的工序，提取工艺是否合理、溶剂选择是否恰 当、萃取温度是否合适直接关系到红曲色素的产量和质量。作为一种天然色素， 红曲色素虽有诸多良好物化特性但还是有部分固有缺陷。天然色素一般稳定性较 差，对光、热、霉菌等都很敏感，易分解、破坏等。因此提取过程中，应尽量避 免由这些因素而导致的分解、破坏6 0 , 6 1 】。 3 3 红曲色素稳定性研究现状 红曲色素生产应用过程中最引人关注的是红曲色素的产量和其高稳定性等 品质问题。目前，关于红曲稳定性主要报道的是红曲色素的光稳定性研究。谢林 吲6 1 】等在其对红曲色素产品光敏性实验中表示：红曲在漫射光照下，3 0 d 色素仍 保持5 0 左右；目光照射下，7 h 色素含量即下降到5 0 以下。谢珍珍【3 l 】等报道 红曲色素水溶液在p h 值为5 7 6 7 时，在漫射光照射下，1 4 h 色素的保存率降到 5 0 以下；日光直射( 3 1 8 ) 2 h ，色素即损失一半；色素乙醇溶液在紫外灯( 1 5 w ， 距离2 0 c m ) 下照射5 h ，吸光度未变。周洁1 2 9 等对醇溶性和水溶性红曲色素醇或 水溶液光稳定性研究表明，日光照射m ，所有红曲色素溶液的吸光度均降至5 0 以下，而醇溶性色素比水溶性色素降得更多。赖建平等报道在室内漫射光照下 红曲色素发酵液光照1 2 h 后，色素保存率仅余8 0 1 。陈家文报道江门生物技术 公司所生产的红曲色素的光稳定性，太阳光照射1 7 h ，色素保存率为7 1 4 ；紫 外线( 3 0 w ，距离3 0 c m ) 照射4 8 h ，色素保存率为8 1 7 ；室内漫射光照射9 0 h ， 色素保存率为5 8 9 。国外报道的结果类似，将红曲色素中的红色素和黄色素分 离，溶于液体中，漫射光下放置5 0 h 后，红色素仅剩余2 0 ，而黄色色素未变。 以上文献报道都表明红曲色素的对光照较为敏感，红曲色素产品在食品货架期 ( 一般为3 个月) 内颜色稳定性亟待研究6 2 6 3 1 。 3 4 红曲色素中色价和桔霉素含量研究现状 目前有关生产红曲的主要报道有，宁夏轻工所采用m 1 3 0 菌株液体发酵法在 大米及豆浆培养基中的发酵制取红曲，发酵色价为1 6 0 u m l 。华南理工大学轻工 食品学院筛选出红曲色素高产菌株w 1 0 7 ，对发酵特性进行的研究表明：红曲霉 在发酵过程中色素大量分泌至细胞外，胞内色素不足胞外色素的一半，5 6 天色 素大量积累，色价最高可达4 1 0 u m l 。翁照南等【5 9 】采用液体发酵培养的菌种，再 接入固体发酵制取红曲米，色价高达3 0 0 0 u g 。上海工业微生物研究所利用纯种 红曲霉液体发酵法制取红曲色素，以馅糖为原料进行中型试验( 5 0 0 l 发酵罐) ， 色价达9 5 0 0 1 0 0 0 0 u m l 。是国内报道色价的最高水平。 有报道称，目前英美等西方国家生产的红曲米或红曲色素中桔霉素含量为 0 2 - 1 7 1 p p m 6 4 1 。台湾的j y h j y ew a n g 等研究用红曲霉种m p u r p u r e u sn 3 01 进行 发酵，其产品中的桔霉素含量为0 2 2 p p m 6 5 】。周立平报道浙江大学红曲生产基地 生产的红曲中桔霉素含量为0 0 7 p p m 。而日本厚生省在1 9 9 9 年第7 版“日本食 品添加剂标准”中规定红曲色素中桔霉素的限制剂量是低于o 2 p p m 4 4 1 ，暂定为 国际通用桔霉素含量标准。 目前，如何使红曲在生产高色价色素的同时，含较低甚至不含桔霉素是红曲 研究的热点之一。h a j j a j ，h 【6 田和许杨湖等研究表明不同氨基酸和其它因子对桔霉 素的合成均有不同影响。郝常明 6 7 , 6 8 1 等以发酵红曲时，桔霉素的生物合成代谢途 径为着手点，对桔霉素合成支路中缩合、氧化、碱基化、环氧键的步骤加以研究， 找出了几种的抑制剂并证明其抑制桔霉素合成是有效的，但也证明其影响了色素 的形成。虞慧玲等采用不同碳源、氮源液态发酵红曲研究表明，不同碳源、氮源 对红曲色价、桔霉素含量影响较大。可能的原因是不同的碳源、氮源作培养基时， 直接影响到细胞膜的通透性，从而影响到桔霉素的分布；其液态发酵数据表明延 长发酵时间也是降低桔霉素的有效方法。桔霉素在发酵后期下降的原因可能是菌 体生长后期诱导产生了过氧化物酶系，产生了较多的过氧化氢，从而破坏了桔霉 素的合成【6 9 。7 2 1 。p j b l a n c 小组的研究显示，红曲霉在液态深层培养时，供氧量对 桔霉素的生成具有很大影响；随供氧量的减少，红曲色素生成量和桔霉素生成量 的比值越来越高。h a j j a j ，h 于2 0 0 0 年报道，添加六碳到十八碳的脂肪酸或甲基 酮类物质可以明显减少桔霉素的生成量，同时不会影响色素。赖卫华等研究也表 明桔霉素的生成量与菌种、培养基和培养条件密切相关。还有学者提出采用微生 物混合发酵法来解决桔霉素问题，具体办法是采用生长条件与红曲菌相近，但能 代谢桔霉素或能生成抑制其中间产物形成的真菌一同培养，从而在根本上防止桔 霉素的形成睁, 7 3 , 7 4 ，此法目前尚在试验阶段。 4 本项研究的意义与目标 4 1 本项研究的意义 红曲及红曲色素在我国生产和使用已有1 0 0 0 多年历史。时代的发展和科学 技术的进步，使得人们对红曲以及红曲色素的研究面，日渐广泛而又深入。红曲 色素提取条件的优化是高效率的从红曲中获得优质色素的重要保证；随着市场经 济商业化的国际轨道进程，红曲色素的稳定性对红曲产品货架期的影响亦突现出 来，成为广大食品工作者关注的焦点，对其稳定性的量化研究数据也必能在具体 生产中发挥重要的指导作用。 4 2 本项研究的目标和内容 本论文拟从不同菌种固态发酵制取红曲米研究出发，以分光光度法测定的红 曲色价、高效液相色谱法测定的桔霉素含量为指标，优化固态发酵制取高色价低 桔霉素含量红曲色素的技术；采用有机溶剂乙醇、甲醇对红曲色素进行提取；以 取得高效率提取工艺参数；对红曲色素在光照条件和几种因素联合作用条件下的 稳定性进行研究。内容主要从以下两个方面展开： 4 2 1 红曲色素的提取条件研究； 不同菌种固态发酵制取红曲米，采用溶剂乙醇和甲醇对比提取红曲色素，以 色价和桔霉素含量为指标，得到固态发酵红曲米产高色价低桔霉素含量的红曲色 9 素的提取条件；对比超临界c 0 2 法与溶剂法对红曲米色素的提取。 4 2 2 红曲色素稳定性的研究； 以色价和桔霉素含量为指标，研究不同光照条件( 漫射光、日光、紫外线、 避光条件) 下，红曲色素样品包括红曲米提取液、红曲红色素粉、红曲红液体( 分 别以4 0 、5 0 、6 0 乙醇v v 为溶剂) 的稳定性；以温度，金属离子，螯合剂， 抗氧化剂为因素作综合因素正交实验，研究红曲色素样品包括红曲米提取液、红 曲红色素粉、红曲红液体( 分别以4 0 、5 0 、6 0 乙醇v v 为溶剂) 的稳定性。 1 0 第二章红曲色素的固态发酵及提取方法 红曲色素是利用红曲霉发酵作用而得到的天然色素，因其具有较高的安全性 和稳定性能，易着色且色泽鲜艳，含有强效降血脂降血压等生理活性物质而在食 品工业中有着广泛的应用。红曲米的生产在我国已有上千年的历史。在特殊国情 的环境下，国内绝大多数红曲厂家到目前为止仍是采用固态发酵制取红曲米，再 从红曲米中提取红曲色素的生产方式。本文以色价和桔霉素含量为指标，采用优 良菌株固态发酵制取红曲米，对固态发酵制取高色价低桔霉素含量红曲的关键控 制参数进行研究确定；采用溶剂乙醇、甲醇提取法和超临界c 0 2 萃取法从红曲米 中提取红曲色素，各种提取效果可供生产实际参考。 1 实验材料与方法 1 1 主要材料与试剂 1 1 1 材料：籼米：购于农贸市场；红曲红色素：浙江温州某厂生产；红曲米： 湖南长沙某红曲米厂 1 1 2 菌种：红曲霉( m o n a s c u s ) m 错、红曲霉m 8 # 、红曲霉m 9 # ( 本课题组分 离得到) ，红曲霉菌种m x l ：湖南长沙某红曲米厂 1 1 3 主要试剂 甲醇分析纯 乙醇分析纯 氢氧化钠分析纯 盐酸分析纯 磷酸 分析纯 乙腈色谱纯 乙酸乙酯色谱纯 甲苯色谱纯 甲醇色谱纯 甲酸色谱纯 桔霉素标准品 长沙安泰化学试剂公司 长沙安泰化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 长沙安泰化学试剂公司 上海陆都化学试剂公司 上海陆都化学试剂公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 上海陆都化学试剂公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 s i g m a 公司 1 2 主要仪器 精密p h 计 旋转蒸发器 水浴恒温箱 分光光度计 电子天平 p h s 一3 c 型 r e 5 2 3 型 h h 一$ 2 1 7 2 2 型 1 0 c 3 0 c 电热恒温水浴锅d c 一$ 2 8 型 调温调湿箱 3 0 2 a 冷冻干燥机f d 一3 型 大容量高速离心机l x j 一1 1 1 3 超临界萃取设备h a 2 2 1 5 0 0 6 高效液相色谱仪 1 3 试验方法 1 3 1 固态发酵制取红曲米 1 3 1 1 固态发酵生产红曲米流程 上海雷磁仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海跃进医疗器械厂 上海棱光技术有限公司 s w i t z e r l a n d 上海仪表( 集团) 供销公司 上海实验仪器厂 北京博医康技术公司 上海安亭科学仪器厂 江苏南通华安超临界萃取有限公司 上海瓦里安实验仪器有限公司 测水分含量 3 籼米一浸泡一洗米一沥干一蒸煮一冷却一接种一培养一出曲一风干或晒干一成 f 品一检测色价和桔霉素红曲霉 菌种的处理将不同红曲菌种分别加水稀释，调整p h 值为3 o 。 籼米于清水中浸泡1 2 1 6 小时，使原料含水量在5 0 左右。 蒸煮通蒸汽1 0 1 5 分钟，籼米为成熟无白心，均匀一致无结块现象。 接种将蒸好的饭倒出，摊凉并过筛，于3 8 。c 接种，每1 0 0 k g 接种量为0 4 k g ， 拌匀，倒入大竹筐内。 培养将竹筐四周及上下以麻袋覆盖，约2 0 小时后倒出，此时温度为4 8 。c 左 右，上下翻动，温度降至4 3 时再积聚成堆，以麻袋覆盖，待升温至4 5 时再 翻动，如此三四次，直至饭粒表面出现白色的红曲菌丝，平摊，厚度为5 1 0 c m ， 视气温高低而定每5 小时翻动一次，培养1 8 小时。此时饭粒己呈粉红色；装筐 浸入水中1 5 m i n ，沥干，平铺，厚度8 c m 为佳。4 h 翻动一次，每培养2 4 h 后加 水，加水量以1 0 为宜，直至整个饭粒中没有白心全部红透，一般一周左右出曲。 1 2 1 3 1 2 水分含量的测定方法。 在己知重量的称量皿中，称取约3 0 0 0 4 0 0 0 9 红曲米，放入1 0 0 1 0 5 。c 烘箱 中烘l h ，取出放入干燥器内，3 0 r a i n 后称重，然后再烘1 h ，直至恒重为止。 水分= ( m 2 一m 3 ) 木1 0 0 ( m 2 一m 1 ) 式中 m l 一称量皿重量，g ； m 广称量皿加样品重量，g ； m 广烘至恒重后的称量皿加样品重量，g 。 1 3 2 红曲米色价的测定方法【7 5 】 称取红曲米样品0 5 0 0 9 ，放入带刻度的1 0 0 m l 。具磨口塞试管中，加入7 0 乙醇至5 0 m l ，摇匀后放入6 0 水浴保温萃取2 h ，取出冷却( 必要时补充定容) ， 用普通定性滤纸过滤入具塞试管或三角瓶中，约滤出1 0 m l 左右即可，吸取滤液 l m l 放入2 5 m l 试管或容量瓶中，加入7 0 乙醇稀释定容至2 5 m l 。用l c m 比色 皿以7 0 乙醇作空白，在分光光度计上取波长5 0 5 n m ，测定样品萃取稀释液的 吸光度，将测得的样品平均吸光度乘以2 5 0 0 ( 稀释倍数) ，即为红曲米的色价。 1 3 3 桔霉素高效液相色谱分析( h p l c ) 方法【7 6 习5 】 1 3 3 1 红曲米预处理方法 红曲米粒6 0 。c 恒温干燥2h 后，用微型高速万能粉碎机粉碎，过6 0 目处理， 即为红曲米粉。每次准确称取红曲米粉0 2 0 0 0 9 置于在5 0 蝴杯中，准确加入由 甲苯、乙酸乙醋、甲酸( 体积比7 ：3 ：1 ) 组成的混合萃取剂( 简称t e f ) 2 5m l ，称 重( 记录下连烧杯在内的重量) ，超声波处理5 m i n ( 强度4 0 ，5 s ，5 s ) ，自然澄清后， 用t e f j t , 足至原重量，用移液管将上清液移入5 0m l 具塞试管；再在残渣中加入 1 5m l ，t e f 萃取剂，第2 次称重( 记录) ，第2 次超声波处理5m i n ，自然澄清后， 再次补足至第2 次所称的重量，将上清液移入5 0m l 具塞试管；再在残渣中加入 1 5 m lt e f 萃取剂，第3 次称重，第3 次超声波处理5m i n ，补足至第3 次所称重量。 将上清液( 最后1 次尽可能收集清液) 移入具塞试管；3 次所得的上清液，离心。 用移液管取离心后的清液用孔径为0 4 5 1 t m 的偏氟微孔滤膜微滤后，用于h p l c 分 析。 1 3 3 2 高效液相色谱分析条件 色谱柱：k r o m a s i ls uc 1 8 ( 2 5 0m m x 4 6n l n l ，5 “m ) ；流动相：纯水：乙睛( v ： v = 5 0 ：5 0 ) ，用磷酸调p h 为2 5 ；检测器：荧光检测器；检测波长：e x = 3 3 1h i l l ， e m = 5 0 0n l n ；柱温：2 8 ；流速：1 0 m l _ m i n ；进样量：2 0 9 l 。 1 3 3 3 样品中桔霉素含量的计算 采用外标法，桔霉素的含量( 1 x g k g ) = ( a 样a 标) ：l ：c 标：i ：n ，其中，a 样表 示样品的峰面积；a 标表示标准品的峰面积；c 标表示标准品的稀释浓度，本实验 中c 标为1 0 9 9 m l ；n 表示样品的稀释倍数。 1 3 4 红曲色素的超临界c 0 ：提取方法 9 6 - 9 9 】 取红曲米样品放入烘箱中6 0 。c 恒温干燥2h ，然后用微型高速万能粉碎机粉 碎。过4 0 目，准确称取3 8 3 5 4 2g 装料密封于超临界c 0 2 提取设备的萃取罐中， 升温到5 0 。c ，升压到3 2m p a ，c 0 2 气体流量为3 2 5l h ，提取时间为2 h 。分离 罐i 的分离温度：5 0 。c 。分离压力：8m p a 。分离罐i i 的分离温度：3 5 ，分离 压力：4 2 m p a 。 2 结果与分析 2 1 固态发酵红曲米 2 1 1 不同菌种制取红曲米