（食品科学专业论文）抗幽门螺杆菌蛋黄里免疫球蛋白IgY的初步研究.pdf

原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。除 了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表或撰 写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了i 身十意。 签名：日期 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公 布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：导师签名：日期 上海大学硕士学位论义 中文摘要 幽门螺杆菌( h e l i c o b a c t e r p y l o r i 简称h p ) 是引起肠胃病的主要病原菌，如 胃炎、十二指肠炎等。虽然h p 能被许多抗生素药物所抑制，但是抗生素治疗目 前治愈成功率还比较低。以前治疗这种肠胃病主要采用抗生素和质子抑制剂相结 合的治疗方法成功率比较高，但是随着h p 耐药菌株的出现，目前治愈率越来越 底，大量使用抗生素又引起了副作用，产生了许多治疗弊端。而鸡蛋晕有许多生 物活性物质，鸡蛋的蛋黄里含有大约3 的免疫球蛋白( 简称i g y ) ， g y 对口腔及 消化道细菌和病毒性感染有预防和治疗作用。用人工科学免疫方法对生蛋母鸡进 行免疫，在母鸡生蛋里获得抗h p 的1 9 y ，然后用这个i g y 去预防和治疗由h p 引起的肠胃病搀是个没有副作用的预防治疗方法。本研究目的就是提取一种抗 h p 的免疫球蛋白1 9 y 然后月i g y 预钫和治疗h p 弓 起的肠胃病，同时也为进一 步制备抗h p 的免疫功能性食品奠定研究基础；本研究也为开发其他的免疫功能 食品奠定初步的研究基础。而我国禽蛋总产量连续1 0 多年位届世界首位，有良好 的生产特异性蛋白的来源基础。 本研究先将h p 制成疫苗，用疫苗对生蛋鸡进行免疫，用水稀释法提取蛋黄 中的特异性蛋白( i g y ) ，在提取过程中，研究表明水稀释1 0 倍，p h 值在5 5 得到 最高蛋白回收率，5 0 硫酸铵就能得到最高蛋白质的回收率，盐析过程与p h 值 无关；间接e l i s a 检测表明l g y 在注射疫苗后两个月后一直保持很高的抗体含 量， i g y 的表达水平高达l ，6 x 1 0 3 。对l g y 用盐析、超滤浓缩、s e p h a d xg 2 0 0 层析等方法进行分离纯化后，i g y 回收率6 4 4 ，纯度9 0 9 5 以上。s d s p a g e 电泳分析表明i g y 提取纯度很高，测定i g y 的分子量在i9 0 k d 左右；l g y 与h p 的凝集反应均为阳性，表明i g y 为h p 的特异性抗体。 关键词：蛋黄；免疫球蛋白；幽门螺杆菌； 上海大学硕士学位论文 a b s t r a c t i n f e c t i o nw i t hh e l i c o b a c t e rp y l o r i ( h p ) h a sb e e nr e c o g n i z e da sm a j o rc a u s eo f g a s t r o d u o d e n a ld i s e a s es u c ha sg a s t r i ca n dd u o d e n a lu l c e r sa n d a sac a u s eo fg a s t r i c m a l i g n a n c y a l t h o u g h h pi s s u s c e p t i b l e t o m a n ya n t i m i c r o b i a ld r u g s i n v i v o , e r a d i c a t i o ni nv i v oi sd i f f i c u l t ，e r a d i c a t i o nt h e r a p i e sw h i c hc o m m o n l ye m p l o ya c o m m b i n a t i o no fp r o t o np u m pi r d a i b i t o r sa n da n t i b i o t i c sh a v es h o w nc o n s i d e r a b e s u c c e s si nt h ep a s t ；h o w e v e r , t h i sa p p r o a c hi sn o to n l yb e c o m i n gl e s ss u c c e s s f u ld u e t ot h ei n c r e a s i n ga n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo fh ps t r a i n s ，b u ta l s og i v e sr i s et oh a r m f u ls i d e e f f e c t st h e r ea r ea b u n d a n tb i o a c t i v em a t e r i a l si ne g g ，s u c ha si g y 、l y s o z y m e 、a n d p h o s p h o l i d se t ct h e r e a r ea p p r o x i m a t e l y3p e rc e n to f e g g y o l ki m m u n o g l o u l i n e ( i g y ) i nt h ee g gy o l ko f h e n s ，i g y c a nb eu s e dt ot r e a td e n t a lc a r i e s ，d i a r r h e a 、d y s e n t e r y e t c ，c a u s e db yp a t h o g e n i cb a c t e r i ao rv i r u s t h ea v i a ne g gp r o d u c t i o nh a sb e e nt h e f i r s ti nt h ew o r df o r10m o r ey e a r s ，w h i c hh a st h eb a s eo ft h ep r o d u c to fs p e c i a l i m m u n o g l o u l i n e s i nm ys t u d yh pb yf r o z e n t h a wa n du l t r a s o n i cw a sm a d et o b a c t e r i nw i t ht h e f r e u n d 、s i n c o m p l e t ea 由u v a n t a n df r e u n d 、s c o m p l e t ea d j u v a n t c h i c k e n sw e r e p r o c e d u r a l l yi m m u n i z e dw i t ht h eb a c t e r i n a s p e c i a li m m u n o g l o b u l i na g a i n s tt h eh p w a sp r e p a r e df r o mi m m u n i z e de g gy o l kw i t hs a l t i n g o u t ，c o l u m nc h r o m a t g r a p h ya n d u l t r a f i l t r a t i o np u r i f i e di m m u n o g l o b u l i n s ( i g y ) w a si d e n t i f i e df o rs d s - p a g ew i t h t h eh e l i c o b a c t e rp y l o r i h i g ht i t e r e g gy o l ki m m u n o g l o b u l i n sw e r ep r o d u c e db y m e a n so f p r o c e d u r a li m m u n i z a t i o nw i t h t h eh r t h ee l i s at i t e rw a sm e a s u r e da t1 6 xl0 3a n dr e v e a l e dt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep u r i f i e di m m u n o g l o b u l i na g a i n s tt h e h pi s18 0 k d a g g l u t i n a t i o nt e s tr e v e a l e dt h a tp r e p a r a e dl g yc o u l de f f f e c t i v e l yr e a c t w i t h t h e h e k e yw o r d s e g gy o l k ；i m m u n o g l o b u l i n ；h e l i c o b a c t e r p y l o r i 2 上海大学硕士学位论文 一前言 1 幽门螺杆菌的简介 ( 1 ) 幽门螺杆菌的生物学特性 幽门螺杆菌( h e l i c o b e c t e r p y l o r i ，简称h p ) 是一种弯曲，s 行或波形，稍 微螺旋的革兰氏阴性细菌，空气中或延长培养成球形。在活体组织上的h p 的 菌体多呈3 个弯曲的螺旋体，在体外培养基上生长的菌体为稍弯曲的杆状，在 较老的培养基中菌体为短杆状或类球状。有1 5 根端生带鞘鞭毛，末端有终 球，且菌体表明附着一层厚而密集的细丝状物质。这些结构特点使h p 具有运 动性，可粘附于胃粘膜上皮，避开胃酸的损伤，从而能在酸性环境中生长。 h p 在s k r r o w 选择性培养基平板上，微需氧环境下培养4 8 h 后，出现针尖 大小，无色透明菌落，7 2 h 后，发展成为d = l m m 左右的灰白色，扁平菌落，可 扩散生长如水滴，也可以凸起成独立的菌落。在厌氧罐内微量氧的气相条件下， 在心脑浸液或p y g 琼脂平板上3 7 。c 培养4 6 d 的菌落，d = l m m 左右，圆形， 凸起，表明光滑，边缘整齐，豆汁黄，半透明。 ( 2 ) 幽门螺旋杆菌与肠胃病的关系 已知h p 有许多适应于在人胃中生存的特殊的生物学特征，鞘的端生鞭毛， 不仅使它能够避开胃酸的损伤，以及其它微生物和局部免疫的排斥，且使它能 在胃粘液中灵活地运动，从而获得适应的生长繁殖条件。还有h p 的多形性可 以保护它免受环境中脱水作用的影响，从而对抗生素有更强的抵抗力，使治疗 后还能反复感染。 迄今为止对h p 如何损伤胃粘膜进而导致溃疡的机理进行了大量研究，具 体机理目前还不十分清楚，但是研究表明h p 定居在胃上皮细胞表面，通过产 生大量的各种园子造成定居部位的病变。大量研究表明，从感染引起的疾病可 以归纳出一些致病因子，这些因子如表l l 上海大学硕士学位论文 表】一l ，引起胃病的致病因子 致病因子性质致病原因 m r = 5 0 0 + 6 9 9 x 1 0 3 的蛋自质，氨对真核哺乳动物细胞有 有高基质亲和性，可能集中 毒能降低胄粘膜电位差， 在细菌外膜和周质区。它水阻滞h 由粘膜向胄腔内分 脲酶解尿素，产物可提高环境中泌，促进h + 逆向扩散，使胃 的酸碱度上皮组织变形，促进细菌的 粘附。脲酶可激活单核吞噬 细胞，诱发炎症。 磷脂酶能降解粘液，趋化炎 细胞和降低膜的疏水性，破 坏臀粘液层的保护作用，h p 产生的胞外蛋白酶能裂解糖 蛋白的聚台结构也能破坏 磷脂酶和蛋白酶 臀粘液屏障，使胃上皮细胞 直接与宵腔内的酶，胆汁， 药物等接触，从而形成了廉 烂和溃疡。 m f l 2 0 x l 的蛋白质，是一 感染了c , a g a + 蔼株患者表现 种细胞毒素，由c a g a 编码，出更为严重的胃炎，并且更 表达炎症 可能发展为溃疡或胃癌有 细胞毒素的h p 菌株还产生一种可使 患者多人上皮细胞空泡化的 细胞毒索，在胃炎，胃溃疡 的形成中起着重要的作用。 机体产生由于h p 感染引起细胞免疫产生的因子与粘液 特异的体液免疫和细胞免功能的改变有关 疫，体液免疫将产生一些特 异性i g gi g a 抗体，细胞免疫 则是t 淋巴细胞产生 免疫学因子 1 i 2 1 1 4 t n f o ，i i 6 及可溶 性c d 8 等因子，这些因子的 释放，可激活嗜中性细胞， 与h p 引起的炎症相联系。 h p 合成m r 略小于3000 ， 能产生p a f , 导致细胞趋化，血 热稳定，耐酸，在h p 感染引管通透性增加，对胃的损伤 趋化因子 起的炎症反应中起重要作用有重要作用 据报道1 3 亿中国人中大约有4 亿人在不同程度上患有胃病，其中8 0 以上是 由h p 引起的。 1 9 9 4 年，h p 被国际癌症研究所定为1 类致癌物。 ( 3 ) 目前由于h p 引起肠胃病采取的对策和难点 初次或多次幽门螺杆菌根除失败或根除后复发病人的再治疗问题，是抗t i p 治疗研究中尚未解决的一个难点。 上海大学硕j ：学位论文 h p 感染难治愈主要有两个因素，一是h p 有种种特性：在胃里有快而好的分 散性，其大小与所带电荷适合于允许粘液渗透，能够通过胃粘膜的吸收或分泌， 很好的抗性，如不活跃的球形，及其本身具有的和获得的对抗菌剂的抗性等；二 是药物在酸性环境下是否失去活性，能否穿透粘液层在局部达到有效的杀菌浓 度，药物的理化特性如p k a ，脂溶性以及在胃内p h 范围的活性和稳定性。 h p 体外对多种抗生素敏感，所以临床上主要用抗生素来治疗。一般的治疗 是使用两种或两种以上的抗生素来进行治疗。 现在根除胃内h p ，用铋剂，多种抗生素，h + 受体拮抗剂和质子泵抑制剂的不 同治疗的三联或四联治疗方案，可以获得不同根除率。 目前由于抗生素的广泛使用不仅导致了肠道菌群失调，而且还造成耐药性 h p 菌株的产生，导致顽固性h p 感染或反复感染，难以彻底治愈和康复。抗生素本 身可能还会有其他副作用及引起过敏等问题，成为h p 感染治愈后易复发的主要 原因之一。 2 免疫球蛋白的简介 免疫球蛋白( i g ) 在1 9 世纪末就被发现。此后人们进行了广泛的研究，其结 构、性质已基本清楚。i g 是y 型结构如图1 1 所示，由两条重链( h c ) 和两条 轻链( l c ) 构成，分子量单体为1 5 0 0 0 0 - - 1 7 0 0 0 0 d a 。至今为止，共发现5 种类 型的i g ，即i g g 、i g a 、i g d ，l g e 和i g m 。各类l g 均是糖蛋白哆其中以i g g 含糖量最少，为2 - - 3 ，i g a 为8 ，其它各型为7 1 5 。在体内起主要 作用的是i g g 。l g g 是再次体液免疫反应的主要免疫球蛋白，在血清中含量最高， 占血清i g 的7 5 - 8 0 ，平均含量为1 2 4 0 m g m l 。i g g 分布很广，它较其它i g 容易透过毛细管，弥散到组织间隙之中，故身体的大部分组织乃至脑髓中都有 i g g 的存在。由于i g 分布很广，含量高，因而有很强的防御功能，能抗感染中 和毒素，保护机体免受不良因素的干扰。i g g 是唯一能通过胎盘的免疫球蛋白， 胎盘内i g g 含量远高于血清中，对新生儿抗感染起着很大的作用。l g g 主要由脾 脏和淋巴结中的b 细胞转换发展成浆细胞产生，特点是半衰期长( 约2 3 天) ， 在人体内i g g 主要有以下功能：与抗原特异性结合，从而在体内引起免疫反应； 激活补体：通过免疫球蛋白上的下f c 段与多种细胞表面的f c 受体结合：通过膜 上海大学硕士学位论文 传递的作用。 图1 - 1 ，l g 的结构示意图 3 鸡蛋蛋黄的简介 1 ) 蛋黄组成 鸡蛋组要由蛋壳、蛋清和蛋黄三部分组成。蛋黄是鸡蛋的重要的组成部分。 蛋黄 表l 一2 ，蛋黄的组成成分 水：5 0 脂质：3 0 _ 磷脂： 广中性脂肪 q 旦固酵： 蛋白质：2 0 6 2 3 3 5 3 6 2 2 1 2 6 9 1 5 其中y 球蛋白即为免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n o f y o l k ，简称i g y ) 。鸡 卵黄免疫球蛋白( i g y ) 是鸡卵黄中存在主要免疫球蛋白，当用某种抗原免疫母鸡 时，c c x - 鸟产生免疫反应，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白i g g 选择性的转移 到卵黄中，称卵黄免疫球蛋白l gy ，i g y 在仔鸡孵育过程中和孵育后列仔鸡起保护 舢州 链呵疽 l i 茹 链黼 一 叫艚 一，( 趴 。、 一黼奄x 篱， 卞尊 一y 一夕 、 口白 ： 蛋蛋白白白脂脂白蛋蛋蛋 度度蛋球球球 密密磷一 一 一 高低高d p v r，、l 上海大学颁j 学位论文 作用。 2 ) 鸡卵黄兔疫球蛋白( i g y ) 的生物特性简介 鸡卵黄免疫球蛋白( i g y ) 分子量约为1 8 0 k d a ，台两条6 7 k d a - - 7 0 k d a 的重 键和两条2 2 k d a - - 3 0 k d a 的轻链1 ，等电点接近5 2 。台氮量为1 4 g 。 鸡卵黄免疫球蛋白其性质类似于哺乳动物的i g g 。鸡经免疫后，蛋黄中产生 l g y ，其含量超过鸡血清4 1 ，而蛋白中仅发现较少量的i g m 和i g a 。在相同免疫 时间内，从一只母鸡所生的鸡蛋中提取的抗体远远超过一只兔血清提取的抗体 量，鸡卵黄中i g y 滴度的变化与鸡血清抗体滴度水平相似并呈正相关系；一般变 化较血清抗体晚3 6 天。 a ) 鸡蛋黄免疫球蛋白i g y 和i g g 的组成和结构差异 蛋黄免疫球蛋白i g y 氨基酸组成及含糖量与各动物的免疫球蛋白有显著差异 1 7 1 。组成差异如表l 一3 氨基酸种类普通母鸡免疫母鸡 鸡血清i g g止i g g i g yi g y a s u6 ，96 8578 1 t h r8 38 38599 s e r1 2 31 241 2 71 4 4 g l u939 28 89 2 p r o757 17 16 8 g 1 v9 89 99 07 7 a i a8 08 08 454 c y s 2329252 2 v a 】7 57 5788 4 m e l3o1o3 00 ，0 l i e313 13 12 6 l e u8 2 8 28 25 9 t y r 3 23 2334 0 p h e2 82 82 82 7 l y s 3 ，53 5325 5 h i s48 474 73 7 与哺乳类动物( 例如牛) i g g 的氨基酸组成相比，牛1 9 g 的a s x 、t h r 和s e t 的含量较l g y 的高，而g l y 、a l a 和l e u 含量较i g ye p 的低t8 1 。i g y 和i g g 结构 差异如图l 一2 和1 3 上海大学硕士学位论文 v 图1 - 2 ，i g y 结构 v i 图1 3 ，i g g 的结构 i g y 如图i - - 2 所示。i g y 呈y 字形结构，其重链有4 个稳定区，而哺乳动 物i g g 含有3 个稳定区，并且l g y 不具有铰链区，l g y 的沉降系数为7 s 【引。i g y 的c u l 和c u 2 以及吼2 和c 1 ) 3 之间有一个“转换区”，此含有脯氨酸和甘氨 酸残基，使i g y 分子具有一定灵活性，i g y 的c u 2 区可能“浓缩”形成了l g g 的铰链区，i g y 的c u 3 和c u 4 与l g g 的c 1 ) 2 和c u 3 密切相关。i g y 的重链分了 量比哺乳类i g gy 链大1 0 k d 左右，对i g ye d n a 分析表明，在重链结构上存在 与哺乳类i g gy 链显著不同的特点，即存在与l g e 链和l g m 链相似的4 个 重链恒定区结构( c h l c h 4 ) i v l 。在c h i 与c h 4 之间也缺少反映铰链区的高度 可动性结构特征。此外，在c h 2 与c h 3 之问存在两个重链f i j _ - 硫键，在l g y 一 门冬酰胺结合型糖链中，2 7 1 的糖链末端是葡萄糖键，这利，特殊糖链结构在哺 乳类l g g 中也是不存在的。相对重链而占，两者轻链结构上差异较小，氨基酸组 成的相似性较大。尽管l g y 具有与l g e 和i g m 相似的结构，但从抗体产生特性 及数量来看，i g y 与哺乳类l g g 十分相似，l g y 是鸡血清中的主要免疫球蛋包再 次免疫产t 卜的效价高于初次免疫，粘液内不存在i g y ，在输卯管分泌物中也不存 上海大学硕1 学位论文 在i g y 。 蛋黄i g y 还有其自身的一些特点【7 1 ( 1 1 与哺乳动物i g g 相比，i g y 的等电点偏低； ( 2 ) l g y 与哺乳动物的补体、葡萄球菌a 蛋白或链球菌蛋白没有 结台能力； ( 3 ) i g y 不与类风湿因于( r h e u m a t o i d f a c t o r ) 结合。 b ) 鸡蛋黄免疫球蛋白i g y 的理化特性 i g y 在分类上仍属于l g g 型免疫球蛋白，分子量比哺乳动物l g g 的大，其 对燕、酸、碱、变性剂以及蛋白酶的稳定性均较哺乳动物的i g g 差异4 5 1 见下表 i g y兔血清l g g 热稳定性7 0 。c ，15 r a i n 全部失活 7 5 8 09 c ，1 5 r a i n 全部失活 热变性温度 7 3 9 7 7 9 耐酸能力 p h 3 0 全部失活p h 2 0 活性下降2 0 35 m 盐酸胍溶液完全变性几乎不变性 被胃蛋白酶分解速度快慢 上海大学硕士学位论文 热稳定性较好，l a n s s o n 等【lu j 将l g y 制 剂贮存于室温下6 个月后经免疫扩散法 检测，抗体活性没有降低。将l g y 溶解 在9 9 ln a c i ( 台n a n 3 0 1 ) 溶液中， 热稳定性 贮存于4 。c6 7 年，用试管沉淀试验 测定，抗体活性降低不超过5 。哺乳 类i g g 有着大致相同的热稳定性，研究 表明 g y 的热变性温度是7 3 9 。c ，7 0 c 加热9 m i n 后活性开始下降 比较耐酸、耐碱；在p h 4 ，o 1 1 0 时 稳定，在酸性条件下不同来源l g g 和 酸稳定性 i g y 的抗原结合活性实验表明i g y 的活 性下降的更快，通过色氨酸自然荧光变 化，跟踪酸性环境对抗体立体结构变 化，i g y 更容易引起立体结构变化。 能抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠中 胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶的消化。马培 松，刘岩松等u 纠在p h 2 8 、温度3 7 、 对胃蛋白酶的敏感性 低浓度胃蛋白酶存在下，处理1 5 小时 后用酶联免疫吸附法检测i g y ，结果 i g y 活性仅损失1 4 i g y 溶液在4 0 0 m p a 高压下和温度低于 抗高压性能 6 0 。c 时处理3 0 m i n ，仍保持有活性 根据变性剂引起的抗体自然荧光光谱 对变性剂的稳定性 变化，l g y 在3 m o l l 赫酸胍溶液中即可 产生快速的结构变化 通过分析水解后重链残存率，研究胃蛋 白酶、胰蛋白酶对i g y 和不同来源的 对蛋白水解酶的稳定性 i g g 的水解速度，i g yb l n 孚l 动物类l g g 更易被水解 曲鸡蛋蛋黄免疫球蛋白i g y 的分离方法 鸡蛋中脂质与蛋白质之比约为2 ：1 ，其中大部分脂类和蛋白质相结合以脂 蛋白的形式存在。这些脂蛋白多数存在于蛋黄颗粒中，一部分与卵黄球蛋白( 包 括i g y ) n t l 存在于蛋黄浆状液中 2 1 ，n 止l ，i g y 的提纯极重要的一步是去除脂和脂 蛋白。早期分离方法初步脱脂分离常用一些有机试剂，如氯仿，丙酮、丙烷一2 一醇等3 0 3 叭；试剂用量大，成本昂贵。八十年代后随服被动免疫的同益受消费 者重视，需要大规模生产i g y , 于是些新的分离方法被开发出来。各种分离技 术的方法如下： 上海大学硕士学位论文 表1 6 各种蛋黄球蛋白初步分离方法对比 分离方式分离方法优点缺点 用事先预冷至2 0 的有 所制l g y 有机溶剂用 有机溶剂脱脂法 机溶剂，如乙醇等与蛋黄的纯度量大，成本高， 液混匀，反复多次浸提其高，回收抗体活性有 中脂类物质率高部分损失， 不适于规模 化 在低离子强度和中性p h 条件下，将蛋黄水溶液反 重复冻融脱脂法 复进行冷冻和解冻，之后 较经济回收率不高 进行离心分离 用乙醇将蛋黄粉中大邻分 乙醇一c 0 2 超临界脱脂 磷脂质除去，然后用超f 每i g y 活性 法 界c 0 2 将中性脂肪和残留 没有损失 的乙醇等同时提出除去 用脂蛋白凝聚剂沉集蛋黄能有效分需要进行超 脂蛋白凝聚剂法 中脂与脂蛋白离脂_ 芊口脂速离心 蛋白 将蛋黄液稀释一定倍数，生产成本l g y 被稀释， 调节溶液p h 值，混匀静 低，适合规给后期提纯 水稀释法 置后离心分离或长时间静模化生产增加了一定 置分离困难 鸡蛋黄经初步脱脂分离后，可得到一个基本上是水溶性蛋白的混合溶液和一 个主要由脂和脂蛋白组成的沉淀物。耍得到纯度较高的i g y ，则需要进一步纯化 除去蛋白溶液中的杂蛋白。常见的蛋白质纯化方法有盐析、乙醇沉淀、凝胶过滤、 阴离子交换柱分离和超滤等方法 4 9 - 5 2 】。通常将其中几种方法结合使用 4 8 , 5 3 , 5 4 ，也 有用同一种方法而使用不同分离条件进行分离 4 8 , 5 5 j 。 d ) l g y 稳定性的保护措施 1 9 y 对热、酸以及胃蛋白酶的稳定性差是其在食品和医药等方面广泛应用的 一个限制性因素。成年人的胃环境p h 值约为2 0 而且含有大量胃蛋白酶，所以 l g y 通过成人胃时往往全部损失，而通过p h 约为4 0 的婴儿胃时活性也损失了 5 0 i5 。另外对热的不稳定性也不便于产品的加工，杀菌等。因此有必要采取措 施提高l g y 的稳定性。以下是几种保护措施的方法平u 特点： 上海大学硕士学位论文 表1 7 i g y 的各种保护方法的措施和特点 i g y 的稳定性保护方法使用措施特点 加3 0 5 0 蔗糖或转化糖， 能提高i g y 在7 5 8 0 保护剂法 加柠檬酸赫及磷酸种等 的抗热变性和在p h 3 0 抗 酸能力 将l g y 包裹起来以避免恶可有效地抵制胃环境，能 包埋法 劣环境损伤的方法，如微在肠道中迅速释放 胶囊等 对抗体进行多糖修饰或适合医药，不适于食品的 其它方法合成多聚物，如用聚乙烯加工 乙二醇 4 i g y 的应用 a ) l t y 的应用原理 利用某些抗体蛋白与某些病原菌生物的特异性免疫反应的原理通过口服 抗体蛋白来达到预防和治疗由于病原微生物引起的疾病，这是近年来抗体蛋白 研究应用发展的个方向。 在人类医学和动物医学领域，利用同种特异性血清( 或有时是异性动物的， 含免疫蛋白) 经肌肉或静脉注射的方式进行被动免疫保护已经是司空见惯的防 治方法了。如抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的特效疗法，高免卵黄控制鸡法氏囊 病和新城疫爆发等。 而免疫球蛋白对于某些或某种病原微生物的特异性和免疫反应效价的高 低主要取决于人和动物机体是否受到这种或这些病原微生物强毒株的攻击，或 者是否进行过系统的免疫预防注射( 即按照严格的免疫程序注射特异性疫苗) ， 人为的科学的系统免疫可以使动物机体进入高度免疫状态，从而我们可以获得 高价特异性初乳，卵黄和血液免疫球蛋白( 抗体) 。除了抗体之外，免疫乳，高免疫 卵黄和血液中还含有许多具有生物学功能的非抗体成分，也称免疫调节物，能调 节和增强机体免疫力。 b ) i g y 的应用研究 二十世纪八十年代后，口服被动免疫的丌发同益受到消费者关注和青睐， l g y 便丌始被当作功能性食品成分单独使用或添加到食品中。通过口服特异性 抗体i g y 作用于病原体，以达到口腔及消化道感染h - 疾病的预防与治疗。尤其 上海大学硕士学位论文 对那些不能产主动免疫应答( a c t i v ei r m u n er e s p o n s e ) 的个体，如新生儿、有获 得性免疫缺乏症的儿童，以及由于化学治疗，营养失调或老年化引起免疫功能下 降的儿童或老人等，在其食品中添加兔疫抗体显得尤为重要1 2 3 。 近年来，日本在口服特异性i g y 抗体防治人轮状病毒( h u m a n r o t a v i r u s ， h r v ) 和产汤毒素的埃希氏大肠杆菌感染引起的腹泻【2 5 ，2 7 1 、龋齿以及养殖鱼【2 8 1 和家畜消化道感染等方面进行了许多动物喂养实验。证实i g y 的防治效果是显 著的f 2 9 , 3 0 1 。 同时用l g y 来预防和治疗某些疾病有着不可比拟的优点，没有副作用。对 于病毒性胃肠炎，如轮状病毒细小病毒等导致的腹泻等，抗生素是不起作用的， 或只能防治继发的细菌感染。免疫球蛋白被动免疫保护作用无疑是防治上述病 毒感染的理想方式。 i g y 除了应用到食品以外还可以用于其他领域。如化妆品领域，将特异性 i g y 加入化妆品中，可以防治某些皮肤病；将特异性i g y 加入牙膏中，可以预防 某些口腔疾病。 c ) 鸡蛋蛋黄免疫球蛋白i g y 的应用 鸡蛋黄l g y 最初的应用领域主要包括免疫学诊断和医药两方面：一方面应 用于病毒的诊断、特定分子的测定、食品掺假及农药残留分析、测定复杂分子 的结构和功能等1 0 一川；另一方面作为医药制剂，被用于处理感染性腹泻、防止 龋齿等。7 7 ”。 随着生活水平的提高，人民对健康的重视程度也越来越高。人类对疾病的 斗争以前是以治疗为主，现在到了以预防为主。以抗体食品的功效原理来预防 人类疾病大有前途。 虽然通过转基因技术也可以在动物和植物上获得同样效果的抗体蛋白，但 是由于目前人们对转基因食品的疑虑，因此转基因食品近期难得在市场上获得 认同。而人为的科学的系统免疫技术获得抗体食品可以消除人们的疑虑，能被 大众接受。 综上所述，从免疫鸡卵黄中提取特异性i g y 抗体，是一种预防和治疗动物和 人类某些疾病的优质便利的好途径，在生物制品的7 i ：发和综合利用方面有广阔 上海大学硕士学位论文 的前景，随着对i g y 制备和纯化方法的不断改进，及研究的不断深入其应用将进 一步扩大。 而我国禽蛋总产量连续l o 多年位居世界首位，有良好的产生特异性蛋白的 来源基础。 5 国内外免疫球蛋白的研究现状 1 9 7 7 年，h i l p e r t 首先提出将牛初乳中的免疫球蛋白富集后用于婴儿配方乳 粉的设想，并对提取免疫球蛋白的种类、加工过程的活性保存、与肠道致病菌的 作用机制等问题进行了深入的研究。1 9 8 0 年，p o i s o n 最初曾以植物病毒免疫母鸡， 获得较高抗体滴度的特异性i g yn 8 1 ；1 9 9 0 - - 2 0 0 0 年，韩国，日本等人分别采用 产肠毒素大肠杆菌( e n t e r o x i g e n i ce c o l i ) ； l lh p 作为抗原对母鸡进行免疫注射， 此种蛋黄经分离提取的免疫球蛋白可预防或减缓胃炎、溃疡、胃癌等疾病的发生。 美国s t o l li n t e m a t i o n 公司生产的一种含有免疫球蛋白的功能性奶粉，声称可以 抗人类常见的疾病。而我国对免疫抗体应用于食品的研究还刚刚起步，内蒙古农 业大学的张和平删吉林农业大学的王春风以及东北农业大学的郭本恒掣6 5 1 在 免疫牛乳和牛初乳免疫蛋白方面作了一些研究，并已有免疫乳粉等中试产品出 现。而对鸡蛋黄i g y 的应用，无锡轻工业大学的杨严俊、马培松 6 6 , 6 7 】平口东北农业 大学的刘玉芬1 6 8 1 对埃希氏大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌免疫蛋黄进行了研究，这 些研究都缺乏动物实验，需要进一步研究。在治疗由h p 的引起的肠胃病研究中， 兰州生物制品研究所已经用i g y 抗体蛋白进行的初步动物实验。 6 本实验研究的目的，内容和意义 1 目的：本实验用幽门螺杆菌全菌疫苗对生蛋草母鸡进行免疫， 在鸡蛋蛋黄里获得针对幽门螺杆菌的抗体。 2 内容：1 ) 将幽门螺杆菌菌液制成疫苗 2 】用疫苗对母鸡进行免疫 3 ) 蛋黄免疫球蛋白的分离提纯 4 ) 蛋黄免疫球蛋白的效价测定等 5 ) 抗h p 的球蛋白的电泳分析 3 ，意义：本研究的意义不仅在于能找到一条预防和治疗由h p 感染引起的肠 上海大学硕士学位论文 胃病的新途径，而且还为开发一种新的保健食品奠定基础研究。同时也为进 步对其他动物( 如奶牛等) 抗h p 免疫球蛋白的开发奠定基础。此外我国的禽蛋 产量居世界第一，本研究为提高我国禽蛋的附加值开辟了一条新的途径。因此 本研究不仅有重要的科学应用研究价值。而且还有重要的社会和经济价值。 上海大学硕士学位论文 1 、主要材料 2 1主要试剂 二材料和试剂 分离层析j ! j ! ( 2 c m x 4 0 c m ) 注射器 高速离心机( 上海安亭科学仪器厂) 7 5 2 紫外光栅分光光度计( 上海第三分析仪器厂) 部分收集器 超声波破碎仪( 宁波新芝科学仪器研究所) 垂直电泳仪( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s ( s f ) c o r p ) 低温冰箱( h a l e r ) 超滤器( 中科院原子核研究所) 超滤膜( 中科院原子核研究所) 普通光学显微镜 酶标仪 精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) 恒温水浴锅 手提式灭菌锅( 上海医疗仪器厂) 幽门螺旋杆菌( 上海大学生命科学技术学院提供) 兔抗鸡的i g g 二抗( 鼎国生物技术有限公司) 福氏完全佐剂( s i g m a a l d r i c hc o ，) 福氏不完全佐齐u ( s i g m a a l d r i c hc o ) 硫酸铵 磷酸盐缓冲液 生理盐水o 9 电泳所用试剂 溶菌酶( 上海伯奥生物科技有限公司) 上海大学硕士学位论文 葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 2 0 0 ( 上海化学试剂厂) 低分子量标准蛋白( 上海伯奥生物科技有限公司) 高分子量标准蛋白质( 上海伯奥生物科技有限公 司) 牛血清蛋白标准液( 上海伯奥生物科技有限公司) 3 )实验动物 生蛋草母鸡，在家禽市场上购买，分三组，每组只，试验组，a ，b 对照组c 。 上海大学硕士学位论文 三实验内容 1 幽门螺旋杆菌的洗涤 菌种经培养后用o 9 的灭菌生理盐水从培养皿上洗下，倒入锥形瓶 中低温2 0 度保存。 2 抗原的制备 m c f a r l a n d 比浊管法测h p 菌液的细菌总数，h p 菌液的总数为2 4 亿m l ，为了有效在制各抗原时要进行细胞壁破碎，采用反复融冻4 次， 加入溶菌酶1 0 0 ug ，在p h 8 00 0 1 m o l l 磷酸盐缓冲液3 7 c 保持1 0 分 钟，最后用超声波碎仪波碎，1 k o 至1 0 k o 频率下处理1 0 分钟；处理好 的抗原用三角瓶一2 0 c 保存。 3 疫苗的制备 将等体积的福氏完全佐剂和不完全福氏佐剂与等体积的抗原混合制 成疫苗，2 8 保存备用； 4 生蛋草母鸡的免疫 草母鸡饲养两周后观察健康良好后第一次用含福氏完全佐剂的疫苗注 射母鸡a ，b 组，每只剂量1 5 m l ，肢膀静脉注射；静脉注射；7 天后，第二次 用含福氏不完全佐荆的疫加注射，4 天后第三次用福氏不完全佐剂注射方 式与前两次一样。c 组作为对照组注射方式，剂量，时间与a ，b 一样，采 用灭菌生理盐水进行注射。 5 卵黄抗体的分离提纯 a 提纯方法和条件的设计 1 ) 水稀释法卵黄蛋白的初步分离采用晟经济实用的水稀释法，在分离 过程中，蛋白分离效果受四个因素的的影响：稀释倍数，p h 值，时间和离心 条件。由于本实验稀释法时间是4 下过夜；采用1 0 0 0 0 f f m i n 进行离心， i g y 有足够时间溶解到水里，蛋黄里的脂在1 0 0 0 0 r r a i n 下能有效分离，时 问和离心条件两个因素可以忽略。本实验着重研究稀释倍数和p h 值刑分 离提取卵黄蛋白质的影响，确定最佳的稀释倍数和p h 值。 上海大学硕士学位论文 2 ) 盐析盐析是蛋白质纯化常用的方法，常用的盐类是硫酸铵，本实 验也采用硫酸铵进行盐析。影响盐析的因素是硫酸铵的饱和度和p h 值。 本实验研究硫酸铵的饱和度和p h 值与纯化蛋白质之闻的关系。 3 ) 超滤超滤是大量纯化蛋白质中一种经济快速的方法。卵黄中的 i g y 分子量在1 8 0 k d 左右，所以本实验采用1 5 万标号的超滤膜。 4 ) 凝胶层析嗣理卵黄i g y 分子量在1 8 0 k d ，结合实验室材料选用 s e p h a d e x - g 2 0 0 葡聚糖凝胶来纯化i g y 。 5 ) 间接e l i s a 法间接e l i s a 法测定低含量的抗体能达到n g 水平， 而且还有独特的优势，所以选用间接e l i s a 法测抗体效价。 6 ) s d s p a g e 凝胶电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离技 术之一。本实验用s d s p a g e 凝胶电泳测抗体的纯度和相对分子量。 7 ) 紫外光吸收法测定蛋白质浓度蛋白质中含有芳香簇氨基酸，在紫 外光2 8 0 波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比， 故选用紫外分光光度计来测定蛋白质含量 8 ) i g y 凝集反应i g y 凝集反应是一种利用抗原与抗体的特异性反应 原理的反应，直观快速，相比抑菌实验本反应快，本实验选用它来检测l g y 与h p 的特异性反应。 9 ) 蛋白质回收率和浓度的测定 蛋白质回收率= 上清液蛋白质含l ( m g ) x 上清液体积( m 1 ) 1 0 m l 蛋黄 稀释液中蛋白质的量( m g ) x 1 0 0 紫外光吸收法测蛋白质浓度 c = i 4 5 a 2 8 0 - - 0 7 4 a 2 6 0 c ：蛋白质浓度( r a g m 1 ) a 2 8 0 ：蛋白质溶液在2 8 0 r u n 处测得的吸光度 a 2 6 0 ：蛋白质溶液在2 6 0 r i m 处测得的吸光度 b 卵黄蛋白质纯化步骤： ( 1 )鸡蛋去蛋清和蛋黄外膜，水稀释一定倍数，轻轻混均，调p h 值，4 c 过夜，将上清液1 0 0 0 0 r r a i n 离心去脂； 上海大学硕士学位论文 ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) ( 5 ) ( 6 ) 加入的硫酸铵到一定的饱和度。4 c 下静止2 小时，1 2 0 0 0 r m i n 离心2 0 分钟，沉淀物用用水溶解： 将抗体蛋白用氮气超虑浓缩，超虑膜标号l5 万，压力2 个大气 压，超滤浓缩到原来体积的01 倍； 葡聚糖凝胶层析，凝胶处理好后装柱，平衡，调整蛋白质浓度 2 5 m g m l ，柱体积3 0 x 4 0 0 m m ，上样10 m l ，用0 i m o l l p h 7 4 磷酸 盐缓冲液( e b s ) 洗脱，流速o 5 m l m i n ，每管4 m l ，紫外检测仪 2 8 0 n m 处检钡虹绘制洗脱曲线； s d s - - p a g e 凝胶电泳分析抗体纯度和相对分子量； 所有测蛋白质浓度步骤都用紫外分光光度计测蛋白质浓度，首 先将抗体蛋白样品用01 5 m o l lp b s 作适当稀释，然后测定他 的a 2 8 0 和a 2 6 0 值，并设稀释液作为对照。 ( 7 ) i g y 的凝集反应 c s d s p a g e 的电泳检测l g y 的纯度及分子量 步骤如下： i 按附录配置好各电泳所需溶液； 2 将两块干净干燥的玻璃板装在电泳架上；安装前玻璃板之间的橡胶 板和电泳架底面的橡胶要涂上少量1 的琼脂糖凝胶； 3 用滴管将配置好的分离胶加入玻璃夹层，不要产生气泡，直至离玻 璃顶部约3 c m 处，改加蒸馏水，分离胶凝固后，吸出水分，插入滤 纸吸干分离胶上面的残留水分； 4 用滴管加入配置好的浓缩胶，胶面离顶部i c m 时插入梳子，胶凝固 后拔去梳子，用蒸馏水冲洗加样孔； 5 将i g y 与样品液以l ：2 或1 ：l ( 视i g y 的浓度而定) 比例混合， 沸水中煮6 1 0 m i n ，冷却后使用； 6 每孔上样l s 2 5 u l ，多余孔加上样品缓冲液，电泳槽两极各加入电 极缓冲液； 7 接上电源，调整电压，使电流稳定在6 m a 赶右； 上海大学硕士学位论文 8 样品液指示剂离玻璃底部2 c m 左右时停止电泳，卸下分离胶用含有 考马斯亮蓝r 2 5 0 的染色液固定1 0 h 左右； 9 用含5 甲醇和7 5 乙酸混合液脱色，脱色直至脱色液无色。 d 酶联免疫吸附法( e l i s a ) 测定i g y 效价 步骤如下： 1 包被抗原：用包被缓冲液配制h p 悬液1 0 8 个m l 。将聚苯乙烯微量检 澳0 板( 酶标板) 每孔加入1 0 0 “ih p 悬液，于3 t c 温育3 h ，之后置4 v 过夜； 2 洗涤：取出酶标板，将孔内溶液甩出( 勿将各孔溶液混合) 每孔加入 p b s - - t w e e a 2 0 洗涤液2 0 0 山，浸泡3 r a i n 后甩出，反复洗涤三次。 3 封阻：每孔加入1 5 0 9 l