（食品科学专业论文）高产低色素普鲁兰生产菌株的复合筛选和发酵条件研究.pdf

甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 普鲁兰是由出芽短梗霉在发酵过程中利用糖代谢产生的胞外多糖，其分子为 聚麦芽三糖，即由a - 1 ，4 糖苷键连接三个葡萄糖形成麦芽三糖，再通过a - 1 ，6 糖苷 键将麦芽三糖连接，形成高分子量的中性线性多糖，其a 1 ，4 糖苷键与a - 1 ，6 糖苷 键的比例为2 ：1 。普鲁兰多糖具有极佳的成膜性、可塑性，粘弹性，无色、无味、 抗油脂，气密性强，易生物降解，对人体和环境无毒害等优点。因此，被广泛应 用于医药、食品、化妆品、烟草等行业。 本文首先对出发菌株普鲁兰g s 0 1 进行了初步研究，主要包括菌株形态特征 及生产性能研究，为下一步的诱变育种作好充分的准备。 采用载玻片培养观察法对菌株g s 0 1 进行形态观察：菌株g s 0 1 发酵结果的研 究表明，当g s 0 1 的发酵以生产多糖为目的时，其发酵周期应选择6 天，同时取 得了g s 0 1 菌种的生长曲线。 采用紫外线和亚硝酸对出发菌株g s 0 1 进行诱变和筛选各2 轮，获得变异菌 株g s 2 2 8 ，多糖产量提高了2 倍，而且无色素产生或色素淡化。通过比较菌落特 征，变异菌株g s 2 2 8 菌落大小、质地和颜色明显优于出发菌株g s 0 1 。诱变菌株 g s 2 2 8 的遗传稳定性试验，连续培养1 0 代：发酵液最终颜色为白色j 最终p h 值 为3 4 3 6 ，发酵液吸光值为0 1 8 5 一o 2 0 9 ，多糖产量为3 0 1 1 - - 3 1 0 9 9 l ，表明 变异菌株g s 2 2 8 是稳定的，可应用于实际生产中。 对诱变菌株g s ：2 8 进行研究：先做诱变菌株g s 。2 8 的发酵状态曲线，对其发 酵特征进行了研究；培养基的营养条件对诱变菌株g s 。2 8 的影响；诱变菌株g s ：2 8 的培养条件试验；诱变菌株g s ：2 8 的发酵条件的优化；并分别对诱变菌株g s ：2 8 的培养基和培养条件进行了正交试验，从中选择出最佳的条件。 初步优化了变异菌株g s 。2 8 的培养基和培养条件，最终确定了最佳发酵条件 为：市售砂糖6 0g l ，酵母浸膏粉o 4g l ，( n h 。) ：s o 。0 6g l ，n i t 。p 0 。8g l ， m g s o j h 。00 2g l ，n a c l4g l ；温度3 0 c ，初始p h 值7 0 ，种龄3 6h ，装液 量8 0m l 5 0 0m l ，接种量5 ，转速1 8 0r m i n ，发酵5 天。 本课题着眼于普鲁兰的工业化发酵生产，利用微生物诱变育种技术，选育适 应于工业化生产的高产低色素普鲁兰生产菌株。通过对变异菌株的培养基和培养 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 条件的优化试验进一步提高普鲁兰的产量。本课题为工业化发酵生产普鲁兰提供 基础研究资料和可借鉴的方法和经验。 关键词：普鲁兰菌株复合诱变发酵 i i 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 a b s t r a c t p u l l u l a nw a sm a d eb ya u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n si nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s g l u c o s em e t a b o l i s mi nt h eu s eo ft h ee x o p o l y s a c c h a r i d e ，t h ee l e m e n t s f o rt h e t h r e e - m a l ts u g a r ，t h a ti s ，f r o ma - 1 ，4g l u c o s i d eb o n dc o n n e c t i n gt h et h r e eg l u c o s et o f o r mt h r e em a l ts u g a r ，a n dt h e nt h r o u g ha - 1 ，6g l u c o s i d et h r e ek e ym a l ts u g a rw i l lb e c o n n e c t e dt of o r man e u t r a ll i n e a rh i g hm o l e c u l a rw e i g h tp o l y s a c c h a r i d e s t h er a t i oo f a - 1 ，4g l u c o s i d eb o n da n da - 1 ，6g l u c o s i d eb o n dr a t i oi s2 ：1 f o rt h i sf e a t u r e ，p u l l u l a n p o l y s a c c h a r i d eh a sa d v a n t a g e so fg o o df i l m ，p l a s t i c i t y ，v i s c o e l a s t i c ，c o l o r l e s s ， t a s t e l e s s ，a n t i - o i l ，g a s t i g h ta n ds t r o n g ，e a s i l yb i o d e g r a d a b l e ，a n dn o n h a z a r d o u st ot h e h u m a n sa n dt h ee n v i r o n m e n t i tw a sw i d e l yu s e di nm e d i c i n e ，f o o d ，c o s m e t i c s ， t o b a c c oa n do t h e ri n d u s t r i e s i nt h i sp a p e r , p r e l i m i n a r ys t u d yo nt h eo r i g i n a ls t r a i np u l l u l a ng s 0 1w a s c o n d u c t e d ，m a i n l yi n c l u d i n gs t r a i n sm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp r o d u c t i v e s t u d i e s ，i no r d e r t oh a v ea d e q u a t ep r e p a r a t i o n sf o rt h en e x ts t e pm u t a t i o nb r e e d i n g as l i d ec u l t u r eo ft h eg s 01s t r a i n sw a so b s e r v a t e d f o rt h ep u r p o s eo f p o l y s a c c h a r i d e ，t h es t a t eo ff e r m e n t a t i o na n dg r o w t hc u r v e o fg s 01s t r a i n ss h o w e di t s f e r m e n t a t i o np e r i o dw a ss i xd a y s t h eu l t r a v i o l e tr a d i a t i o na n dn i t r i t ew e r eu s e dt o t r e a tp a r e n t a lp u l l u l a n ss t r a i ng s o1t w ot i m e s ，a n dt h e nam u t a n ts t r a i ng s 2 2 8 ，w h i c h w a sp u l l u l a ny i e l dh i g h e ro n et i m et h a ng s o 1a n dp i g m e n t - f r e eo rr e d u c e dp i g m e n t s ， w a so b t a i n e d c o m p a r e dt h ec o l o n yc h a r a c t e r i s t i c s e sb e t w e e ng s 2 2 8a n dg s 01 ，t h e c o l o n ys i z e ，t e x t u r ea n dc o l o ro fg s 2 2 8w e r eo b v i o u s l yb e t t e rt h a ng s 0 1 g e n e t i c s t a b i l i t yt e s to fg s 2 2 8w a ss u b c u l t u r e d10g e n e r a t i o n s ：f e r m e n t a t i o nf l u i df i n a lc o l o r w h i t e ，p hv a l u e3 4 3 6 ，a b s o r b e n c yo 18 5 一o 2 0 9a n dp o l y s a c c h a r i d ey i e l d3 0 1 l 一 3 1 0 9 9 l ，i n d i c a t e d t h a tm u t a n ts t r a i ng s 2 2 8w a ss t a b l e ，m a ya p p l yi nt h ea c t u a l p r o d u c t i o n m u t a t i o no ft h es t r a i ng s 2 2 8s t u d y ：t h es t a r to fm u t a t i o no ft h es t r a i ng s 2 2 8s t a t e o ff e r m e n t a t i o n ，i t sf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h es t u d yo fn u t r i t i o nc o n d i t i o n so n t h em e d i u mm u t a t i o no ft h es t r a i ng s 2 2 8 ；m u t a t i o no ft h es t r a i ng s 2 2 8c u l t u r et e s t ； l u r ev a r i a b l es t r a i ng s 2 2 8o p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，a n dw e r eo n t h em u t a t i o no ft h es t r a i ng s 2 2 8c u l t u r em e d i u ma n do r t h o g o n a lt e s tc o n d i t i o n s ，t o c h o o s et h eb e s tc o n d i t i o n s f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fm u t a n ts t r a i ng s 2 2 8i n c l u d i n gc u l t u r em e d i u ma n d l i i 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 c u l t u r ec o n d i t i o n sw a si n v e s t i g a t e d f i n a l l yt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u m o fg s 2 2 8w e r e ：g r a n u l a t e ds u g a r6 0g l ，y e a s te x t r a c t0 4g l ，( n h 4 ) 2 8 0 40 6 g l ， k h 2 p 0 48g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 2g l ，n a c l4g l mo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc u l t u r e c o n d i t i o n sw e r e ：c u l t u r et e m p e r a t u r e3 0 c ，i n i t i a lp h7 0 ，s e e da g e3 6h ，l i q u i dm e d i u m v o l u m e s8 0 m l 5 0 0 m l ，i n o c u l a t e dv o l u m e s5 ，r o t a t es p e e d18 0r p m ，f e r m e n t a t i o nt i m e 5 d t h et h e s i ss c r e e n i n go f h i g h - y i e l da n dl o w - p i g m e n tp u l l u l a ns t r a i n ；u s i n gm o d e m m i c r o b i o l o g ym u t a t i o nb r e e d i n gt e c h n i q u e s ，i no r d e rt oa d a p tt h ep u l l u l a ni n d u s t r i a l f e r m e n t a l p r o d u c t i o n t h r o u g ht h eo p t i m i z a t i o no fc u l t u r em e d i u ma n dc u l t u r e c o n d i t i o n so fm u t a n ts t r a i n s ，p u l l u l a ny i e l dw a sf u r t h e ri m p r o v e d ，w h i c hh a st h e o r e t i c a n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e k e yw o r d s ：p u l l u l a n ；s t r a i n ；c o m p o u n dm u t a t i o n ；f e r m e n t a t i o n i v 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业大学或其他教育机构 的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：经红杪签字日期：峙月日 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 _ _ - 刖吾 出芽短梗霉为半知菌类短梗霉属，是一种具有酵母型和菌丝型形态的多型真 菌。广泛存在于植物材料和土壤中，可作为单细胞蛋白，细胞壁多糖，胞外多糖， 果胶酶，色素等的生产菌株。其主要多糖产物为茁霉多糖，茁霉多糖又名短梗霉 多糖，普鲁兰，胞外粘多糖等，是一类含有三个a 1 ，4 糖苷键的葡萄糖分子按a - 1 ，6 糖苷键连接而成的a 葡聚糖大分子，其分子式为( c 5 h l 0 0 5 ) nh i o 。值为1 0 卜 5 0 0 0 ，其大小随培养条件而定。 普鲁兰是一种线状多糖，属同多糖。普鲁兰是出芽短梗霉在液体培养基中分 泌到菌体外的一种多糖，可以被葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，半乳糖， 甘油，乙酸盐等诱导，其中蔗糖为碳源的茁霉多糖产率达5 0 。工业上多用淀粉 水解物，葡萄糖当量为5 0 时，茁霉多糖产率可达7 0 ，过多过少都会影响多糖 及色素的产率。 普鲁兰是一种无色，无臭，无味，无毒的高分子物质，难于消化，具有极好 的耐热性，溶解性，吸潮性，耐酸碱性，胶粘性，可塑性，广泛用于食品，医药， 饲料，化工，建筑，纺织，造纸，涂料，影印，生物化学，微生物学以及农业等 领域，为众多科学家所关注，是一种极具开发价值和应用前景的多功能性的新型 生物制品。 现代发酵工业之所以如此迅猛发展，除了发酵工艺改进和发酵设备更新之 外，更重要的是由于进行了菌种的选育及改良，为发酵工艺提供了人类需要的各 种类型的突变菌株。到目前为止国内外发酵工业中所使用的生产菌株绝大部分是 人工诱变选育出来的。对于微生物发酵工业来说，高产菌株的获得尤为重要。一 般野生型菌株的发酵代谢产物的产量较低，不能满足大规模工业生产的需要。因 此，我们必须对野生型菌株的出发菌株进行选育和改良。 微生物育种技术的发展大致经历了自然选育，诱变选育，杂交选育，代谢控 制育种，基因工程育种五个阶段。从发酵工业微生物育种史可以看出，经典的诱 变选育是最重要的育种手段，也是最有效的育种手段。 在进行诱变育种之前，首先要对出发菌株进行大致了解，主要包括形态特征 及生产性能研究，为下一步的诱变育种作为作好充分的准备。 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 诱变处理包括单因子处理和复合因子处理两种。单因子处理是采用单一诱变 剂处理，但是单因子连续使用的代数过多将出现“钝化现象。而复合因子处 理可以取长补短，改变d n a 分子上多种基因的遗传稳定性，容易得到更多的突 变类型。一般认为复合因子处理比单因子处理的效果好。 本课题的研究内容： 本研究首先对出发菌株普鲁兰g s 0 1 进行了初步研究，主要包括菌株形态特 征及生产性能研究，为下一步的诱变育种作好充分的准备。在对普鲁兰菌株g s 0 1 进行细胞形态鉴别的基础上，进行了发酵状态曲线的测定。 先采用紫外线诱变处理，再用亚硝酸处理，经初筛和复筛获得普鲁兰产量较 高且无色素产生或色素淡化的变异菌株。通过对菌株g s 0 1 的诱变处理，一方面 使普鲁兰的产量明显提高，改善菌种特性且产量质量提高，另一方面简化了提取 纯化工艺。 对变异菌株进行发酵条件研究和优化，进一步提高其多糖产量。同时使色素 的生成明显降低。这对普鲁兰的工业化生产提供了高产优良的适用菌株，并利用 正交设计法确定了其最佳培养配方和最优化的发酵条件，为普鲁兰的工业化生产 奠定了基础。因此，探索特定菌种的发酵条件是至关重要的。 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 文献综述 1 1 普鲁兰多糖概况 1 1 1 普鲁兰多糖的性质与特点 普鲁兰是由出芽短梗霉( a u r e o b s i d i u mp u l l u l a n ) 在糖质培养基生长，代谢产 生的一种胞外同多糖，其生物合成机制目前还不十分清楚。它是在胞内合成再分 泌到胞外的。研究认为合成中u d p 葡萄糖参与了反应，需要a t p ，有脂中间物， c a t l e ya n dm c d o w e l l ( 1 9 8 2 ) 发现a p u l l u l a n s 把c 1 4 标记的葡萄糖转变成与脂 连接的葡萄糖、异麦芽糖、潘糖、异潘糖，所以认为出芽短梗霉是通过潘糖及异 潘糖的聚合而形成的，但还没有分离到与短梗霉多糖合成有关的酶【l 】。 普鲁兰在化学结构上，应当称为聚麦芽三糖，即由a 1 ，4 糖苷键连接三个葡 萄糖形成麦芽三糖，再通过a - 1 ，6 糖苷键将麦芽三糖连接，形成高分子量的中性 线性多糖。其a - 1 ，4 糖苷键与a - 1 ，6 糖苷键的比例为2 ：1 。聚合度在1 0 0 - - 5 0 0 0 ， 平均分子量为4 2 0 0 万，产物的分子量与菌种和发酵条件有关【2 】。也曾发现在 普鲁兰分子中有少量的麦芽三糖。其结构见下图1 1 。 翰。 o 崾鲫n h 日h 图卜i 酱鲁兰的分子结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo fa u r e o b a s i c l i u mp u i l u l a n sm o l e c u l e 出芽短梗霉细胞形态多种多样，具有酵母状、菌丝体、厚垣孢子、膨胀细胞 等多种形态。在发酵过程中由于发酵条件和底物的不同，一般有酵母状( y 相) 和菌丝体( m 相) 两种状态相互转变。大量研究表明酵母状细胞最有利于普鲁兰 多糖的形成。出芽短梗霉在发酵的过程中，伴有深绿色和黑色的色素产生，使发 酵液颜色变深，俗称“黑酵母”，色素的产生对普鲁兰多糖的提取纯化造成困难， 降低其品质，因此在发酵过程中要控制色素的产生；然而色素也不是一无是处， 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 国外研究表明，产黑色素的短梗霉，在含有重金属的发酵液中可以生产，而不产 色素菌株则比较难存活，说明黑色素对重金属有吸附和降低其毒性的作用，因而 产色素水平高的菌株可用于工业废液处理1 3 j 。 普鲁兰是线性高分子材料，在水中膨胀，溶解，溶解度无限，溶解速度比羧 甲基纤维素，海藻酸钠，聚乙烯醇等快两倍以上。溶液为中性，不离子化，不凝 胶化，不结晶。但是大多数高级烷酸酯化产物易溶于有机溶剂。l d s o = 1 5g m g ， 无“三致作用，在生物体内可缓慢降解，可被微生物产生的普鲁兰酶水解， 并进一步分解。因此，普鲁兰是“绿色产品。普鲁兰在7 0 相对湿度以下， 含平衡水分1 0 一1 5 。它不吸潮，不胶凝。在金属离子存在下不凝胶化，粘度 不仅不下降，且有升高，任何浓度的食盐均不影响普鲁兰溶液粘度1 4 l 。 普鲁兰溶液粘度在常温下受p h 的影响较小，只有在p h3 以下和p h1 1 以上 时才不稳定，慢慢水解。粉末状的普鲁兰对热的反应与淀粉相同，加热不融化， 1 0 0 失去平衡水，2 5 0 以上迅速分解炭化，颜色由白变淡黄，褐至黑色，但与 其它高分子不同，不产生有毒气体。普鲁兰的水溶液粘度远低于其它多糖，普鲁 兰溶液的表面张力随其浓度的增加变化较小。低分子量的普鲁兰溶液的粘度在加 热时的变化也较小，与其它分子材料有很好的共溶性，与淀粉和动物胶有很好的 共溶性【5 1 。 普鲁兰的可塑性强，可制膜，纺丝，任意造型。普鲁兰水溶液经干燥热压制 成薄膜，该薄膜透明，无色，无味，无毒，抗油，抗氧气渗透，且一般不用增塑 剂，其理化性能如光泽，强度，耐热性与常用的聚氯乙烯薄膜接近。也可直接在 物体表面涂抹或喷雾涂层干燥成膜，普鲁兰对具有一定的亲水性的物体均有较好 的附着能力。普鲁兰膜具有玻璃纸一样的光泽及透明度和硬度，膜对温度的变化 稳定，在o 以下仍柔软，具有耐油性，耐热性。普鲁兰膜和成形物的表面硬度 高，弹性强，表面摩擦系数小，但伸展率在平衡水分3 一1 5 时低。为增强普鲁 兰膜的柔软性，在制膜时可添加糖醇。普鲁兰膜最特殊的性质是比其它高分子膜 的透气性能低，氧，氮，二氧化碳和香气等气体几乎不能通过【6 1 。 组成普鲁兰的糖基含有大量羟基，其容易进行酰化，烷基化，胺基化，磺酸 化等，制成各种衍生物；糖链可交联，乃发生接枝共聚反应，进行改性和修饰， 获得下表所列各种性能的材料【7 1 。普鲁兰和衍生物及改性材料易着色。 4 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 表1 - 1 普鲁兰的衍生物及性质 ! 璺垒! 旦：! 二! ! 坠曼翌璺! 望! 曼q ! ! 塾! 卫旦! ! 坚! 璺旦璺璺旦坚! ! i ! 璺! ! ! 普鲁兰衍生物性质普鲁兰衍生物性质 1 1 2 普鲁兰的分类 在自然界中有些真菌与酵母经常栖息在一起，或者在某些形态学或生理学的 特征上与酵母菌外表上有其相似之处，或者在鉴定时采用与酵母菌相同的鉴定方 法，因而这类真菌与酵母关系密切，一般通称为类酵母真菌【引。短梗霉属 似u r e o b a s i d i u mv i a l a e t b o y ) 就属于这一类，本属真菌常存在于植物材料上及土壤 中，能用分离酵母的方法分离到短梗霉属。多数学者认为此属仅一个种，即出芽 短梗霉 , 4 u r o b a c i d i u m p u l l u l a n s ( d e b a r y ) a r n 。由于遗传上的不稳定性，形成许多变 种，菌落最初粘稠，白色，很快转变为淡绿色，最终为黑色。菌落质地由粘稠状到 坚硬和革状，菌落边缘呈明显的根状。无性繁殖方式多样，主要表现类似于酵母 菌的多边芽殖形式到形成明显的真菌丝常具有节孢子，厚垣孢子，芽分生孢子。 幼龄营养细胞椭圆形至柠檬形，代谢为氧化型 9 1 。普鲁兰生产菌种主要有：出芽 短梗霉( a u r e o b s i d i u mp u l l u l a n ) ，出芽茁霉( p u l l u l a r i ap u l l u l a n s ) ，发酵茁霉 ( p f e r m e n t a n s ) ，发酵茁霉暗色变种( p f e r m e n t a n sv a r , f u s c a ) ，出芽暗色孢霉 ( d e m a t i u mp u l l u l a n s ) ，产气杆霉( a e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) ，黄金银耳( t r e r n e l l o r n e s e t t i c o ) 等。另外，z h e n m i n gc h i 等筛选到一株产普鲁兰的酵母菌株，初步鉴 定属于红酵母( r h o d o t o r u l ab a c a r u m ) 。这些菌种在普通条件下培养，能大量分 泌多种色素而呈暗墨绿色【l o l 。鞠宝等指出：经菌种选育后，不同二价离子会影响 短梗霉菌发酵过程中的色素的产生。谷才恩从广西桂林马尾松针叶中分离到产胞 外多糖的短梗霉【l 。那淑敏从加拿大切蜂虫茧上分离到了产无色胞外多糖的菌株 a 2 2 ，按照h e r m a n i d e s 2 n i j h o f 分类系统，与出芽短梗霉茁霉变种 似u r e o b a s i d u m p u l l u l a n s a m v a r p u l l u l a n s ) 市h 似1 2 1 。 1 1 3 出芽短梗霉的两态性及其影响因素 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 出芽短梗霉在其生活史中具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，这两种形态的 形成受培养基成分，培养条件等各种因素的影响，它们可以相互转变，由于两种 形态合成有用代谢产物的能力不同，因而对两种形态相互转变的研究较多【l 引。 在限制性培养基连续培养出芽短梗霉时，其酵母样菌丝体两态性受z n 2 + 的 流入浓度控制。在恒定的稀释率( o 0 8h 1 ) 下，随着z n 2 + 的流入浓度增加( 从0 增加 到7 6m o l l ) ，培养物从z n 限制状态转变为碳限制状态。在此期间，培养物逐渐 经过以形态，胞外多聚糖浓度和生物量为基础的三个生长阶段：当z n 2 + 浓度保持 0 4 5lm o l l 以下时，培养物处于第一个生长阶段，这个阶段的生长是z n 2 + 限制 状态，超过9 0 的生物量是酵母样生长形态，z n 2 + 流入浓度的增加导致生物量和 胞外多聚糖浓度呈比例增加；当z n 2 + 流入浓度在o 4 5l m o l l 到o 8 0l m o l l 时， 发现培养物处于第二个生长阶段，在此阶段，碳源和氮源同时受到限制，虽然碳 源( 葡萄糖) 被耗尽，但是z n 2 + 流入浓度的增加导致稳定态的生物量呈比例增加， 生物量的增加以消耗胞外多聚糖产量为代价，使多聚糖产量逐渐降低，培养物仍 然保持酵母生长状态；在第三个生长阶段( z n 2 + 流入浓度高于o 8 0lm o v e ) ，当 增加z n 2 + 流入浓度时，稳定态生物量没有增加，培养基的p h 值影响出芽短梗霉 两种形态的转变，即当将出芽短梗霉培养在限制氮源，缓冲能力低的葡萄糖培养 基中时，原来的酵母样细胞会转变为厚坦孢子，而在最佳条件下，发生形态转变 的初始p h 值必须在6 左右，在上述的培养基中，p h 值在前两天内下降到2 以下； 如果向培养基中添加缓冲溶液或反复调整p h 值到它原来的值，则不会形成厚垣 孢子。培养基中的碳源和氮源也有影响，将出芽短梗霉培养在含有葡萄糖限制氮 源和低缓冲能力的培养基可诱导酵母样细胞向厚垣孢子的转变；当用葡萄糖作为 碳源时，浓度必须高于3 才能诱导形态转变。另一方面，氮源( 硫酸铵) 的生长 限制浓度并非必须，较高浓度实际会刺激厚垣孢子的出现，而其它氮源，如谷氨 酸或磷酸铵，不能诱导酵母样细胞向厚垣孢子的转变【1 4 1 。 出芽短梗霉在从酵母样到菌丝体的形态转变过程中，细胞中的物质也会发生 变化，其中蛋白质和r n a 的含量明显下降。菌丝体的蛋白质含量为酵母样的 7 6 ，r n a 的含量仅为3 8 ，而d n a 则是唯一含量增加的成分。在几种抑制大 分子合成的化合物中，只有羟基脲对出芽短梗霉的形态有明显的影响，对培养物 中的大分子成分也随时间而改变，变化方式类似于在乙醇吐温8 0 氨培养基和没 6 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 有乙醇或葡萄糖的饥饿培养基中的培养物；脂肪的组成和比例也会发生变化，前 三天培养符合对数生长期，葡萄糖和铵被快速消耗，直到后者耗尽为止，同时 p h 值下降到2 左右，这个时期不饱和脂肪酸含量下降，同时长链醛类的比例增 加。第三天到第六天这个时期“巨细胞”占优势，它们积累了大量的三酰甘油脂， 磷脂和游离固醇也在这个时期合成，表明膜正在合成；从第六天开始可以看到厚垣 孢子，同时磷脂和游离固醇开始下降，而饱和三酰甘油脂产量继续增加，厚垣孢 子的脂肪组成暗示了它们是抗性形态，这种形态由对数生长期末培养基不利的环 境条件所诱导。在菌丝体和酵母样形态中6 磷酸葡萄糖脱氢酶活性高于磷酸果糖 激酶；在形态转变过程中，最突出的变化发生在较大的细胞d 0 ( 3d ) ，尤其是柠檬酸 合成酶，苹果酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶活性的变化。但是，在不含葡萄糖或乙 醇的培养物( 没有发生形态转变) 中也发现有类似的变化。因而，观察到的酶活性 变化可能是因为缺乏葡萄糖，说明在形态和所研究的几种酶之间没有明显的联系 【1 5 】 o 1 2 普鲁兰的研究进展 1 2 1 国内外研究进展 1 9 5 8 年原东德人b e r n i e r 首先在出芽短梗霉( p u l l u l a r i ap u l l u l a n s ，现名 a u r e o b s i d i u mp u l l u l a n ) 的发酵液中发现一种胞外多糖，之后1 9 5 9 年b e m i e r 等对 这种多糖进行了性质分析，并将其命名普鲁兰( p u l l u l a n ) 。国外从1 9 6 0 年开始进 行研究，1 9 7 6 1 9 8 0 年为第一个研究高峰，1 9 8 4 1 9 9 6 年为第二个研究高峰， 主要集中在对其产生机理和应用研究。目前已进入应用研究高峰，包括普鲁兰衍 生物的结构鉴定，性质，应用的研究以及普鲁兰改善食品品质方面的研究。由于 普鲁兰具有巨大的应用价值，所以在研究普鲁兰的文献中，专利占了文献总数的 5 6 多，其中应用的专利又占了专利总数的7 8 。这种研究趋势表明，普鲁兰的 生产和应用已经进入成熟期【1 6 1 。日本在普鲁兰的研究中做了大量工作，1 9 7 6 年 日本林原公司开始普鲁兰商业化生产，1 9 8 2 年开始生产普鲁兰膜，日本目前年 产量已达万吨，垄断国际市场，价格2 0 0 0 - - 3 0 0 0 日元k g t l 7 i 。 现在国外又开辟了以下三个方面：一、运用现代技术，如可视镜和计算机 自动控制系统，基于短梗霉细胞的多形态特点进行自动控制发酵，即可视化培养 技术的研究。二、探索可裁剪多糖( t a i l e r - m a d e ) 的培养技术，即通过控制发酵条件 7 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 和底物来得到不同分子量、不同组成单位和交联结构的多糖，运用于不同方面。 三、对多糖应用的拓展，与其它物质偶联制造新型生物塑料和用于离子交换的膜 材料他1 。 国内从1 9 8 0 年开始研究普鲁兰，已经2 0 多年了，普鲁兰研究是“七五八 五 攻关项目，在研究中筛选到了一些多糖产量高色素低的菌株，但国内生产技 术与先进国家相比还有差距，原料利用率还不高，后提取成本较高，目前尚未见 工业化生产报道。中科院微生物研究所孙万儒教授申请了两项相关专利，开发了 一条1 0 吨年的生产线，为工业化生产打下了基础f 1 9 i 。 现在国内研究主要有四个方面：( 一) 菌种的诱变筛选。目的一方面筛选出低 色素菌株：另一方面，筛选出多糖转化率高的菌株。诱变方法有物理法( 放射性 元素和紫外照射) 、化学法( a n 入化学诱变剂) 。但兼具低色素和多糖转化率高的 菌株极少，迄今未见有应用于工业生产的报道。( 二) 优化培养基组成，探索最适 发酵条件。几种底物的最佳配比和最适发酵条件基本达到共识，但针对不同菌株 略有不同。( - _ - ) t 业化生产中降低成本。主要是降低底物成本，选用淀粉、玉米 粉、糖浆等廉价糖源，进行发酵研究，在后续多糖纯化分离方法上也做低成本的 研究。( 1 8 ) 对多糖的结构和应用研究。包括作为包装材料和用于食品保鲜等的研 究i 2 0 i 。 近几十年的研究表明，普鲁兰目前虽未像酒精，抗生素及味精等那样批量生 产与广泛应用，但已进入实用技术的研究与开发时期。因此，今后若干年内的目 标将是实用技术的研究与开发及其相关理论问题的针对性探讨，焦点将集中在以 下几方面：首先是进一步弄清茁霉多糖分子的某些特性( 如电化学性质) 及改造 特性，以取得应用范围，实用技术与方法上的突破。其次是探索茁霉多糖生物合 成的分子机理，包括合成酶合成的生化机制与过程等，进行合成基因定位研究。 同时以提高产率和控制分子量为目标，进行诱变育种甚至利用基因工程手段对合 成基因进行重组，构建等遗传改造，开发有生产价值的工程菌。第三以工业化生 产为目标，进行系统的工艺研究，包括低成本原料生产的工艺方法的探索，专用 设备的设计制造，生产周期的合理安排及工艺的合理搭配等。第四在生产规模水 平进行具体的实用技术及其工艺路线的研究与设计，力争使茁霉多糖的推广应用 取得突破【2 1 i 。 8 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 2 2 普鲁兰菌株的选育 目前普鲁兰育种的研究主要集中在高产普鲁兰菌种的选育，主要希望解决普 鲁兰发酵中的两个问题：一是培养物在发酵4 8h 后开始分泌大量的黑色素，导 致产品在下游加工中必须脱色：二是具有两态性真菌的出芽短梗霉在发酵过程中 只有形态呈酵母样时，才能分泌出大量的普鲁兰【2 2 1 。 金其荣利用溴乙锭和紫外线为诱变剂，可筛选出不产黑色素并具有酵母样细 胞形态的普鲁兰生产菌种一出芽短梗霉s n 0 8 1 2 3 1 。出芽短梗霉的一个野生菌株在 试验条件下产生3 l 胞外多聚糖，且受黑色素污染，而紫外线照射使该菌株发 生诱变，得到一个产无色产物的无性系。对该无性系再一次进行紫外线照射，得 到一个高产普鲁兰( 在试验条件下产量为1 0g l ，在优化条件下为7 0g l ) 的新无 性系【2 4 i 。方宣钧，张英应用紫外( u v ) 随机诱变获得了两株多糖产量高，色素低的 普鲁兰突变株z y 0 4 7 和z y 0 7 3 ，其产量分别为1 5 1 5m g m l 和1 4 2 2m g m l 。而 且发酵状况大为改善，产生大量的膨大细胞和厚垣孢予。通过对普鲁兰培养基的 碳氮比和其它发酵条件进行优化，z y 0 4 7 突变株获得普鲁兰的产量为2 1 1 l m g m l ，转化率达5 4 1 ，原发酵条件作对照相比，多糖产量和转化率分别提高 5 1 和3 2 i 2 5 i 。 浓度o 2 到1 0m o l l 的亚硝基胍( n u m ) 对普鲁兰菌株具有诱变作用，影响葡 聚糖的产量。当诱变剂剂量为o 0 2 到8 9 时，细胞能够存活，微生物的形态变 异率较高，且有利于多聚糖的生产。0 5 的n u m 照射3 h ，细胞存活率约1 0 时，对诱导高产量的葡聚糖的变异最佳。在基础培养基中添加适宜浓度的秋水仙 素也可提高普鲁兰的变异频率。将3 的秋水仙素溶液作用时间从5 天延长到9 天时，所产生的活性变异株数目相对减少。某些变异株合成普鲁兰的能力较高， 但与普鲁兰染色体倍数提高无关【2 6 i 。 采用普鲁兰为出发菌株，通过原生质体再生育种的方法获得了6 个遗传性状 稳定的菌株。研究了细胞和菌落的形态学变异，色素和多聚糖产量在相同的条件 下，测定了1 0 3 个再生菌株的多聚糖产量，总变异率为6 9 ，在这些再生变异株 中，r 4 在5 天的发酵中不产色素，它的多聚糖产量比亲株高5 0 【2 7 i 。 在普鲁兰的生产方面，菌种选育是目前国内研究的重点。诱变剂有紫外线、 射线、亚硝基胍、硫酸二乙酯等。与其它菌种的诱变筛选相比，低黑色素产量普 9 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕：t 学位论文 鲁兰的诱变在筛选上有独特优势，把经过诱变的菌悬液在平板上涂布培养，可以 直观地通过观察菌落颜色和形态就可以得到目的菌株，菌落表面湿、产胶量大的 多糖产量高瞄】。一些研究结果如下表。经过筛选和诱变，普鲁兰分泌黑色素明显 减少，但多糖产量也大多有不同程度降低。 表卜2 菌种诱变选育研究结果 t a b l e 1 2t h er e s u l to fm u t a n ts t r a i n 用经过诱变筛选得到的低色素菌株发酵，后续多糖提纯工艺大大简化，有些 白色和乳白色发酵液甚至没必要脱色；浅灰色与浅绿色的发酵液脱色比黑色发酵 液脱色要容易的多【2 9 1 。 1 2 3 培养基组分及发酵条件的影响 普鲁兰分泌黑色素的量和分泌多糖的量在不同培养条件下是不同的，并且 它们生产的最适条件是不同的，这就有优化培养条件使普鲁兰代谢途径以多糖生 产为主的可能。国内外许多研究者研究了碳源、氮源、p h 值、培养温度、通氧 强度、金属离子、培养时间等对普鲁兰产黑色素和多糖的影响【3 0 1 。 1 2 3 1 通氧强度 普鲁兰是高度好气性微生物，尤其在产多糖过程中需要充分供氧。在发酵 后期，多糖大量分泌积累，发酵液粘度增大，由牛顿型流体转变成非牛顿型流体， 供氧不足成为生产的限制因素。 振荡通气培养产黑色素明显大于静止三角瓶培养，更大于静止平皿培养。 这是由于酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，它催化使l 一酪氨酸加氧生 成h o p a ，再氧化成多巴醌，继而生成黑色素。但转速对多糖和黑色素的影 1 0 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 响是不同的，较低转速时，产黑色素要多于产多糖，较高转速时多糖和菌体都增 加，但转速太高，菌体产量将减少，而且多糖分子量降低。所以大多研究都采用 3 0 0m l 三角瓶装液量5 0m l ，转速2 0 0r m i n t 3 1 1 。 在发酵罐培养时，通气量与搅拌速度过大过小都是不利于多糖生产的，高 通气量是有利于多糖生产，但事实上，在发酵中搅拌速度不能太高，转速太高， 对菌体有损伤，多糖产量低。搅拌速度在3 0 0 - - 8 0 0r m i n 之间，通气量1 ：0 5 1 ：2 之间。增加溶氧一直是传统发酵罐发酵生产多糖类的难点，洪厚胜、詹晓北 等发明的新型气升环流反应器( a l l r ) 已l l 至在黄原胶发酵上成功应用，可以考虑 应用在普鲁兰发酣3 2 1 。 在连续发酵工艺中，为改善通氧，国外有专利通过调整补料成分和补料速 度或添加淀粉酶、糖化酶等，能控制发酵液粘度，但所得多糖分子量较低。 1 2 3 2p h 值 一个合适的初始p h 值是非常重要的，因为它不仅影响发酵开始时菌体生 长，而且也会影响发酵后期的p h 动态变化和菌体的多糖合成能力。与其它微生 物不同的是，p h 值还影响普鲁兰的菌体形态，在低p h 值时大部分菌体呈丝状 体，这种形态的菌体不产多糖但生物量增加很快，发酵液粘度也很高，较高p h 值 时呈酵母状，是产多糖的主要菌体，而在培养后期，菌体膨胀，转变成厚垣孢子。 c a r i n el a c r o i x t 利用普鲁兰这一特性，先在低p h 值( 3 5 ) 培养使生物量快速 达到一定值，再调p h 值到5 0 7 0 产多糖【”i 。 钱新雷的研究指出，当起始p h 值小于5 5 时生物量大，起始p h 值升高， 多糖产量增加，起始p h 值6 5 时多糖产量最高，但p h 值升高，黑色素也增加， 一般研究都得出最佳起始p h 值是6 0 t 3 4 1 。 在发酵过程中，发酵液的p h 在4 8h 内降低速度很快，然后保持稳定，p h 值的快速下降抑制杂菌的生长，所以普鲁兰发酵在发酵4 8h 后很少有杂菌污染 的危险。p h 值下降速度越快，多糖产量越低，在低p h 值( 4 0 ) 时普鲁兰多 糖酶活力上升，降解多糖，使生成的多糖分子量很低，提取难度增加，多糖的应 用性能也降低。 在分批补料发酵时，h e m r a j k ，g a i d h a n 用n a o h 和h 2 s 0 4 控制p h 值恒定在4 5 左右，效果非常好，多糖产量提高2 0 - - 4 0 。张汉波用c a c 0 3 和 甘肃农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 h c l 控制发酵液p h 值稳定在5 o ， p h 值对多糖分子量也有影响， 1 2 3 3 发酵时间 多糖产量从5 9g l 上升到3 1g l i 3 5 1 。 p h 值高，分子量低郾1 。 随着发酵时间延长，多糖增加，在