（食品科学专业论文）芝麻饼粕发酵产生抗氧化物质的研究.pdf

v 、 _ t 喀“ 独创性声明 l u liii ll1 111 11 11 11u i 18 0 9 8 9 5 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：却砖 日期：m 飞年月f 中日 芝麻饼粕发酵产生抗氧化物质的研究 s t u d yo n an t i o x i d a n ts u b s t a n c e o f s e s a m ec a k e 姓 2 0 0 7 年5 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 我国是芝麻生产大国，仅芝麻饼粕的年产量就在5 0 万吨以上，资 源十分丰富。目前，在我国主要直接作为肥料或饲料，但是对芝麻饼 粕中一些生理活性物质却利用不足。 木脂素是植物中含有的一类具有抗氧化功能的物质，可分为游离 的脂溶性木脂素( 1 i g n a n ) 和水溶性木脂素( 1 i g n a ng l u c o s i d e s ) 。芝麻 木脂素不仅具有优越的抗氧化活性，而且还有促进乙醇代谢和肝脏解 毒功能、调节血脂代谢以及抗癌等活性。本研究旨在通过酱油曲霉z 发酵芝麻饼粕提高抗氧化物的含量和活性。 论文主要研究内容如下： 1 利用紫外线诱变酱油曲霉2 1 2 8 获得高产蛋白酶的菌株，命名为 酱油曲霉z 。 2 比较了酱油曲霉z 、酱油曲霉2 1 2 8 、黑曲霉和宇佐美曲霉发酵 芝麻饼粕提取物以及未发酵提取物对d p p h 清除率，同时发现酱油曲 霉z 蛋白酶酶活的高低与发酵提取物的抗氧化活性成正比。经初步研 究得到酱油曲霉z 产蛋白酶的较佳条件为培养时间4 d ，培养基中含水 量1 0 0 ，培养温度2 8 。c ，p h 值为7 。 3 通过单因素和正交试验，优化了酱油曲霉z 发酵芝麻饼粕的提 取工艺：发酵时间为4 d ，接种量为3 m l ，甲醇浓度为7 0 ，提取物的 d p p h 清除率为9 5 2 1 ；并研究了提取物的抗氧化稳定性，发酵提取 物在冷藏条件下抗氧化活性稳定。 4 分别测定和比较了酱油曲霉z 发酵提取物和未发酵提取物对 d p p h 、0 2 一、o h 的清除作用、还原能力、总的抗氧化能力以及对小 鼠肝脏白发性脂质过氧化的抑制能力，结果表明发酵提取物在体内、 江苏大学硕士学位论文 体外抗氧化活性比未发酵提取物都有不同程度的提高。 5 通过紫外全波长扫描、高效液相色谱等分析方法，探讨了酱油 曲霉z 发酵提取物抗氧化活性提高的机制。分析显示，经过酱油曲霉z 发酵，部分芝麻素转化为抗氧化活性更强的2 ，6 一二儿茶酚体芝麻素； 同时，发酵后的芝麻饼粕提取物中蛋白及肽类物质的含量为2 8 4 ，这 些抗氧化肽对提取物总抗氧化活性的提高也有一定的贡献。 关键词：芝麻饼粕，酱油曲霉z ，提取工艺，抗氧化活性 l 一 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t c h i n ai sal a r g ep r o d u c i n gc o u n t r yo fs e s a m e ，a n di t sy i e l do fs e s a m e c a k em e a l si sm o r et h a n5 0 0 ，0 0 0t o n s ，s ot h er e s o u r c e sa r ev e r ya b u n d a n t c u r r e n t l y , s e s a m ec a k em e a l si sm a i n l yu s e da sf e r t i l i z e r o ra n i m a lf e e d d i r e c t l yi no u rc o u n t r y , b u tw e d o n tm a k eb e s tu s eo fs e s a m ec a k em e a l s l i g n a n si sas o r to fb i o l o g i c a lm o d i f i e ri nt h ep l a n t l i g n a n si n c l u d i n g f a t s o l u b l el i g n a n sa n dw a t e r - s o l u b l el i g n a ng l u c o s i d e sa r em a j o ra c t i v i t y m a t e r i a l si nt h es e s a m e r e c e n t l y , t h er e s e a r c hr e s u l t ss h o wt h a ts e s a m e l i g n a n sh a v eal o to ff u n c t i o n s ，s u c ha sr e g u l a t i n gm e t a b o l i s mo fl i p i d s ， s u p p r e s s i n gd e s a t u r a t e de n z y m e ，r e d u c i n gc h o l e s t e r o l ，p r o t e c t i n g l i v e r , s u p p r e s s i n gb r e a s tc a n c e r , a c t i v a t ei m m u n i t ye f f i c i e n t l y b u t t h ed a t a i n d i c a t e st h a tt h ea n t i o x i d a n to ft h es e s a m ec o m p a r e dw i t ht h es y n t h e s i s a n t i o x i d a n t ( b h a 、b h t ) i s l o w e r t h i se x p e r i m e n ts h o w st h a tt h e a n t i o x i d a n to ft h es e s a m ec a k ei m p r o v e sg r e a t l ya st h er e s u l to fi t sc h a n g e d i n s t r u c t i o nw h i c hi sa l t e r e db yt h e a s p e r g i l l u ss o j a e z t h i st h e s i sm a i n l ys t u d i e sar e s u l ta sf o l l o w s 1 t h eb a c t e r i a ls t r a i no fs a u c ea s p e r g i l l u ss o j a e2 1 2 8i sh a n d l e db y t h eu l t r a v i o l e t ，t h e nw ec a nc h a l ku pt h eb a c t e r i a ls t r a i no f s a u c e a s p e r g i l l u ss o j a ez w h o s ee n z y m ea c t i v i t yi sm u c hh i g h e r 。 2 b yc o m p a r i s o no fd p p hc l e a r a n c er a t ew h i c h i sm e a s u r e dw h e nt h e s e s a m ec a k ei sf e r m e n t e db yt h es a u c ea s p e r g i l l u ss o j a ez ，a s p e r g i l l u s s o j a e2 1 2 8 、t h ea s p e r g i l l u sn i g e ra n dt h eu s a n i ca s p e r g i l l u s ，w ec a nl e a r n t h a tt h es a u c ea s p e r g i l l u szi sb e s ti nt h ef e r m e n t a t i o ne f f e c tw h i c ha l o n g w i t ht h ea n t i o x i d a n to ft h ef e r m e n t a t i o ne x t r a c t i o n w ec a r r yo nar e s e a r c h o nt h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t so ft h es a u c ea s p e r g i l l u ss o j a ez o b t a i n s p r o d u c et h e p r o t e i n a s eab e t t e rc o n d i t i o nf o rt h er a i s et i m ei s4 d ，e x p e c t s t h e f l u i dr a t i oi s1 ：1 ，r a i s e st h et e m p e r a t u r ei s2 8 ，t h ep hv a l u ei s 7 ，2 m 江苏大学硕士学位论文 n a c l 3 b yt h eo d df a c t o r i a le x p e r i m e n ta n dt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，w e c a no b t a i nt h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n t h ef e r m e n t a t i o nt i m ei s4 d ，s e e d v o l u mi s 3 m l , t h e m e t h y la l c o h o ld e n s i t yi s7 0 ，w i t h d r a w i n gd p p h c l e a r a n c er a t ei s9 5 2 1 ；w ec a l ld r a wac o n c l u s i o nt h a tt h ea c t i v i t yo ft h e e x t r a c t i o ni si m m o b i l ea n di sc o n v e n i e n tf o rp r e s e r v a t i o ni nt h ec r y o g e n i c c o n d i t i o n 4 b yd e t e r m i n a t i o na n dc o m p a r i s o no ft h ee x t r a c t i o nb e t w e e nt h e s a u c ea s p e r g i l l u ss o j a eza n dt h em e t h a n o la b o u tt h es c a v e n g i n gr a t e so n d p p hf r e e r a d i c a l s ，0 2 一f r e er a d i c a l s ，o hf r e er a d i c a l s r e d u c i b i l i t y , a n t i o x i d a n ta b i l i t ya n de f f e c to nl i v e rl i p i dp e r o x i d a t i o ni nr a t s t h er e s u l t i n d i c a t e dt h ef e r m e n t a t i o nw i t h d r a w st h et h i n gi nv i v o ，i n v i t r oh a sn o t w i t h d r a w nt h et h i n gc o m p a r e dt ot h ef e r m e n t a t i o nt ot h e t ob ed i f f e r e n tf r e e r a d i c a lc l e a r a n c er a t ea l lt oh a v et h ev a r y i n g d e g r e e t h ee n h a n c e m e n t 5 t h ea n a l y s i sb yu va n dh p l ct e l lu st h a tt h em e c h a n i s ma b o u t h o wt oi m p r o v et h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h ef e r m e n t a t i o ne x t r a c t i o n t h e a n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a t ，a f t e rf e r m e n t ss e s a m i nt r a n s f o r m sa st h ea n t i o x i d i z e d a c t i v e n e s ss t r o n g e rs e s a m i n2 , 6 一d i c a t e c h o l ；a tt h es a m et i m e ， a f t e rt h ef e r m e n t a t i o ni r i ss e s a m es e e dc a k er i c e d r e g sw i t h d r a w si nt h e t h i n gt h ep r o t e i nc o n t e n ti s2 8 4 ，t h ea n t i o x i d i z e dp e p t i d eh a st h ec e r t a i n c o n t r i b u t i o nt ot h et o t a la n t i o x i d i z e da c t i v ee n h a n c e m e n t k e yw o r d s ：s e s a m ec a k em e a l s ，a s p e r g i l l u ss o j a e z ，t e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n s ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t y 1 ， 心 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 第二章 2 1 2 2 2 3 2 4 第三章 3 1 3 2 目录 1 芝麻概述”1 1 1 1 芝麻的历史“1 1 1 2 芝麻的成分1 1 1 3 芝麻的用途1 1 1 4 芝麻饼粕概述2 芝麻木脂素概述3 1 2 1 芝麻木脂素分布3 1 2 2 芝麻木脂素结构4 1 2 3 芝麻素性质5 1 2 4 芝麻木脂素生理功能5 1 2 5 芝麻木脂素应用8 木脂素的生物转化8 芝麻蛋白9 立题背景及意义9 1 5 1国内外研究现状9 1 5 2 立题意义9 课题研究主要内容1 0 菌种选育一一一”一一一一一一”一一一一”一一”一一一一一一一”“一1 1 弓f 言1 1 材料与方法1 1 2 2 1 试验材料1 1 2 2 2 试验方法”1 2 结果与讨论1 4 2 3 1 标准曲线的绘制1 4 2 3 2 蛋白酶高产株的选育”1 5 ，j 、结1 5 发酵菌种的筛选及最适酶活条件的探索一一一”一一一一一一一”一1 6 弓i 言1 6 材料和方法”1 6 3 2 1 试验材料1 6 v 江苏大学硕士学位论文 3 3 3 4 第四章 4 1 4 2 4 3 4 4 第五章 3 2 2 试验方法”1 7 结果与讨论2 0 3 3 1 菌种对提取物抗氧化活性的影响2 0 3 3 2 培养时间对酶活的影响2 1 3 3 3 培养基中含水量对酶活的影响2 1 3 3 4 温度对酶活的影响2 2 3 3 5 起适p h 对酶活的影响2 2 3 3 6 浸提液中n a c l 浓度对酶活的影响2 3 3 3 7 发酵供氧条件对酶活的影响“2 3 d 、结：弭 芝麻饼粕发酵与提取工艺优化一”一”一一一一”一一”2 5 前言2 5日i j 吾2 5 材料与方法”2 5 4 2 1 试验材料2 5 4 2 2 试验仪器2 6 4 2 3 试验方法”2 6 结果与讨论2 8 4 3 1 发酵提取物与未发酵提取物d p p h 清除率的比较2 8 4 3 2 接种量对提取物抗氧化活性的影响2 8 4 3 3 发酵时间对提取物抗氧化活性的影响”2 9 4 3 4甲醇浓度对提取物抗氧化活性的影响2 9 4 3 5 正交试验分析3 0 4 3 6 确证试验分析3 1 4 3 7 抗氧化物质的稳定性3 1 d 、结3 2 芝麻饼粕发酵提取物和未发酵提取物抗氧化活性的比较”一3 3 5 1 引言3 3 5 2 试验材料3 3 5 2 1 试验材料3 3 5 2 2 试验仪器3 4 5 3 试验方法3 4 5 3 1芝麻饼粕发酵提取物和未发酵提取物的制各3 4 5 3 2 芝麻饼粕发酵提取物清除d p p h 活性的测定3 5 5 3 3 提取物清除0 2 一活性的测定”3 5 ， i 一 q 江苏大学硕士学位论文 5 4 5 5 第六章 5 3 4 提取物清除o h 活性的测定3 6 5 3 5 还原能力的测定”3 6 5 3 6 提取物总的抗氧化能力的测定3 7 5 3 7 对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的抑制作用3 7 结果与讨论3 8 5 4 1 提取物清除d p p h 的活性3 8 5 4 2 提取物清除0 2 一活性3 9 5 4 3 对羟基自由基的清除作用3 9 5 4 4 提取物还原能力的测定4 0 5 4 5 提取物总的抗氧化能力的测定4 0 5 4 6 对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的抑制4 1 ，j 、结4 1 芝麻饼粕发酵提取物的分离与分析”一一一一o o 0 0 9 0 0 ”一“”一4 2 6 1 前言4 2 6 2 材料与方法4 2 6 2 1 试验材料“4 2 6 2 2 试验仪器4 2 6 2 3 色谱条件4 3 6 2 4试验方法一4 3 6 3 结果与讨论4 5 6 3 1 蛋白质含量标准曲线的绘制”4 5 6 3 2 紫外分光光度法对未发酵提取物与酱油曲霉z 发酵提取物的分析4 6 6 3 3 薄层层析法对酱油曲霉z 发酵提取物分析4 7 6 3 4 标准曲线的绘制4 8 6 3 5h p l c 法分析未发酵提取物与酱油曲霉z 发酵提取物4 9 6 4 发酵产物抗氧化活性提高的机制分析5 0 6 5 ，j 、结5 1 第七章结论与展望m 一一”一m ”5 2 7 1 主要结论5 2 7 2 展望5 2 差参考文南定”“一一一”一”一“一”一“”0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 b o o 一”5 3 致谢- 一”一”“一0 0 0 0 0 0 ”一”一”“”一“5 8 攻读硕士期间发表的论文一一一一”一一”一一。一0 0 0 0 0 0 0 q 0 0 0 0 0 0 0 05 9 v 一- 曩 q 江苏大学硕士学位论文 1 1 芝麻概述 1 1 1 芝麻的历史 第一章绪论 芝麻( s e s a m e ) 可能是迄今所知被人类用作食品资源的最古老的油籽，也是最 早使用的调味品，为人类利用已有6 0 0 0 年的历史。在中国，日本以及其他东方国 家，它不仅被认为有很高的营养价值，而且还具有很多医疗调节效果。中药大辞 典记载：“补肝胃，调五脏，增气力、活力以及筋力，消炎，止痛，生发等”。芝麻 在亚洲和非洲的发展中国家广泛种植【1 1 。我国是世界上最大的芝麻生产国之一。 1 1 2 芝麻的成分 芝麻的主要成分为油脂，约含5 0 ，其次为蛋白质，约占2 0 ，另外还含有 各种维生素、碳水化合物、钙、磷等矿物质、食物纤维以及最近引人注目的芝麻 特征成分木脂素化合物( 1 i g n a n s ) 等，因此芝麻具有较高的食用价值 2 1 。芝麻中各 组分的含量因芝麻品种和生长条件的不同而有一定变化，表1 - 1 概括了不同类型芝 麻籽的组成【3 】。芝麻中富含亚油酸，维生素e ，维生素a ，维生素b 1 ，维生素b 2 。 芝麻籽中的木酚素化合物的含量约为0 5 1 0 ，芝麻的最主要木脂素化合物为 芝麻素( s e s a m i n ) ，也称为芝麻明，约占芝麻木脂素总量的5 0 以上。 1 1 3 芝麻的用途 芝麻的用途十分广泛，可以用于糖果、点心的生产，也可用作小甜饼、面包 等的配料。而最广泛的用途就是用来生产芝麻油，可以当作餐桌的佐料，并且具 有保健的功能。 芝麻向来被传统中药学视为滋补品。芝麻有护肝、补肾、润肠、软化皮肤、 滋补养血、调经、润滑、利尿、缓泻、安神的功效，被用于辅助治疗慢性便秘、 耳鸣、脱发、口角溃疡和齿龈炎、贫血、头昏眼花、偏头痛、视力减退、骨质疏 松、烧伤烫伤等，尤其是对于改善老年人的许多一般性的健康问题大有裨益，被 称为有益健康和营养的微胶囊【4 】。 江苏大学硕士学位论文 苏丹白 芝麻 印度黑 芝麻 印度白 芝麻 全籽 5 3 32 5 0 脱皮籽5 7 52 9 9 全籽 5 4 32 0 0 脱皮籽6 3 42 3 4 全籽5 3 12 0 9 脱皮籽5 7 72 2 5 9 5 5 7 1 2 4 8 2 1 5 7 1 5 7 4 1 3 0 4 5 2 5 3 4 1 5 5 4 3 5 6 2 2 4 5 1 2 5 2 7 0 4 2 5 0 1 1 8 0 2 1 1 4 芝麻饼粕概述 1 1 4 1 芝麻饼粕介绍 芝麻饼粕是生产芝麻油后剩下的副产物。由于芝麻饼粕的粗蛋白质含量平均 在4 0 4 6 ，氨基酸种类齐全而且含量也很丰富，还含有一定量的油脂成分， 可以不经过任何处理或稍加处理就可用在饲料中，供牲畜食用。我国蛋白质饲料 资源紧缺的国情来讲，是一个很好的补充。 1 1 4 2 芝麻饼粕分类 芝麻籽实取油后的副产物是芝麻饼粕，由于取油工艺不同，产生的副产物也 不同。用机压或榨的方法取油后的副产物称为芝麻饼，生产工艺如图1 1 所示。用 预压浸出法取油后出产的副产物称为芝麻粕。 图1 1 机榨法的生产工艺 f i g1 1 t h ep r o c e s s e so fe x p e l l i n ge x t r a c t i o n 芝麻除上述取油方法外，还有一种传统的取油方法。其工艺如图1 2 所示： 2 江苏大学硕士学位论文 图1 2 传统取油的工艺流程 f i g1 2 t h ep r o c e s s e so fa q u e o u se x t r a c t i o n 用此法取出的油传统上称为小磨香油，所剩副产物称为麻渣( 或称为油渣，也 叫做芝麻饼1 。 1 1 4 3 芝麻饼粕的营养成分 芝麻饼粕中，蛋白质平均含量在4 2 5 - - 4 7 9 ，粗脂肪含量在3 4 - 1 0 3 ，粗纤维含量在2 6 5 6 ，还含有少量的钙、磷等矿物质。在氨基酸含量 方面，芝麻饼不但具有多样的氨基酸种类，并且含量丰富，尤其是几种主要的必 需氨基酸如蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和精氨酸含量都高于其他饼粕，如豆饼、棉 籽饼和菜籽饼等【习。 由于芝麻饼粕营养价值高，因此应合理利用。添加到家畜的饲料中，将会提 供很多营养，特别是可以作为蛋白质的来源。而在本试验中，我们讨论的是芝麻 饼的另一种用途。 1 2 芝麻木脂素概述 1 2 1 芝麻木脂素分布 自然界中存在一类木脂素类化合物o i g n a n s ) ，它们具有2 ，6 一二芳基一3 ，7 一二 氧杂二环辛烷的结构。这类化合物有数十个之多，苯环上常见的取代基多为羟基 或甲氧基等醚化基团旧。芝麻素( s e s 锄i n ) 就是木脂素( 1 i g i l a i l s 也叫木酚素) 类化合物 中的一种，是一种脂溶性苯酚类有机物【7 】o 芝麻素是一种重要的木脂素类化合物。芝麻素主要存在于芝麻中，马兜铃科 细辛属植物中的北细辛f 8 】、芸香科花椒属植物两面针【9 】、巴山花椒【i o 】、中药南方菟 丝子【l l 】、紫珠叶【1 2 】等中草药中也先后发现含有芝麻素。相对于芝麻中芝麻素的含 量，其他植物中芝麻素的含量都是非常低的。 3 江苏大学硕士学位论文 1 2 2 芝麻木脂素结构 芝麻中的主要活性成分为木脂素类【1 3 1 4 1 ，木脂素是植物中含有的一类生物调节 物质。两个亚甲基二氧基苯基基团与中央的四氢康基呋喃核相连，分子式为 c 2 0 h 1 8 0 6 ，可分为游离的脂溶性的木脂素( 1 i g n a n s ) 和含配糖体的水溶性的木脂素 o i g n a ng l u c o s i d e s ) 。脂溶性的木脂素有芝麻素( s e s a m i n ) 、芝麻酚( s e s a m 0 1 ) 、芝麻 素酚( s e s a m i n 0 1 ) 、芝麻林素( s e s a m o l i n ) 、芝麻林素酚( s e s a m o l i n 0 1 ) 、松脂醇 ( p i n o r e s i n 0 1 ) 。它们的具体结构如图1 3 所示1 1 5 】。而水溶性的木脂素( 1 i g n a n g l u c o s i d e s ) 则是和1 3 个葡萄糖相连形成的极性较强的糖苷，因而易溶于水。 0 h 芝麻素( s e s a m i n ) 芝麻林素( s c s a m o l i n ) 0 接种量 提取剂浓度。可见，发酵时间是主要因素，应以其作为主要条件。甲醇浓度的影 响相对较小，可以次要考虑。综合以上分析，最佳提取条件为：发酵时间为4 d ， 接种量为3 m l ，甲醇浓度为7 0 。 4 3 6 确证试验分析 结果显示：d p p h 咱由基清除率为9 5 2 1 ，说明在此条件下，提取物的抗氧 化活性大大的提高了。从而确证了试验的准确性。 4 3 7 抗氧化物质的稳定性 将抗氧化物质在4 下放置0 d 、2 d 、4 d 、6 d 、8 d 、1 0 d ，再测抗氧化物的活性， 得到如下结果： 3 1 江苏大学硕士学位论文 术 v 糌 篮 埏 024 68l o 放置天数( d ) + 发酵一未发酵 图4 5 发酵提取物放置不同时间对清除率的影响 f i g4 5 e f f e c to fd i f f e r e n c ep l a c e m e n tf a t e so l ls c a v e n g i n gr a d i c a l s 从图4 5 可以看出，随着放置时间的延长，d p p h 清除率略微有所下降，但基 本上保持一定，由此可知，发酵提取物具有一定的稳定性，不容易丧其活性。在 低温、密闭、避光，就能很好地保持其活性，不随贮藏时间的延长而显著降低， 因此可以作为抗氧化剂来防止食品氧化变质。 4 4 小结 ( 1 ) 通过单因素试验，正交试验，确定了酱油曲霉z 发酵芝麻饼粕的最佳提 取条件为：发酵时间为4 d ，接种量为3 m l ，甲醇浓度为7 0 。在上述试验条件下， 发酵提取物的d p p h 清除率为9 5 2 l 。 ( 3 ) 在低温的条件下，酱油曲霉z 发酵提取物的抗氧化活性很稳定，便于保 存，可以作为抗氧化剂来防止食品腐败变质。 3 2 舳加的们加o 江苏大学硕士学位论文 第五章芝麻饼粕发酵提取物和未发酵提取物 抗氧化活性的比较 5 1引言 当前天然抗氧化的研究吸引着众多的食品科学工作者，并且在美国、日本等经 济发达国家中已经取得了较多而有效的研究i s 7 5 8 5 吼6 0 l 。未精炼的芝麻油与其他植物 油相比之所以具有显著的稳定性就是因为含有内源性苯酚类抗氧化剂芝麻素、芝麻 酚、芝麻酚林、芝麻素酚等木酯素类化合物【6 1 】。在食品贮藏过程中，油脂的过氧化 作用是使食品变质的一个重要因素，这种过氧化作用形成的毒性物质还会导致一些 极为严重的后果，如癌症、诱导机体突变、加速衰老等【6 2 1 。抗氧化剂添加于食品中 有助于阻止油脂的氧化而被大量采用。出于安全的重要性，目前形成一种天然抗氧 化剂取代人工合成抗氧化剂的趋势。由植物自然产生的一些抗氧化物质作为安全的 抗氧化剂越来越多的受到人们的关注。有关芝麻木脂素的生理功能研究也取得较大 进展。如具有抗氧化活性，抑制5 不饱和酶，抗高血压，降低胆固醇等 6 3 6 4 鲫。但 也有研究表明，芝麻木脂素在体外的抗氧化活性并不显著，抗氧化效果和人工合成 的抗氧化剂相比，效果仍有很大差距。通过霉菌发酵芝麻饼粕可使芝麻木脂素的一 些组成成份的化学结构发生变化，从而表现出更强的抗氧化活性【6 q 。 本研究部分对芝麻饼粕发酵提取物和未发酵提取物( 芝麻木脂素) 清除d p p h 、 0 2 。、o h 自由基的清除能力以及两种方法提取物的还原能力、总的抗氧化能力和 对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的抑制作用进行了测定并做了比较。 5 2 试验材料 5 2 1试验材料 斜面培养基：5 。b 6 麦芽汁琼脂培养基。 发酵培养基： 芝麻饼1 0 9 ，水1 0 m l 。 芝麻饼粕镇江京友调味品有限公司 酱油曲霉z实验室自备 江苏大学硕士学位论文 d p p h ( 2 ，2 一d i p h e n y l - 2 一p i c r y l h y d r a z y l )美国s i g m a 公司 三吡啶三吖嗪c t r i p y r i d y l t r i a z i n e ，t p t z ) 美国s i g m a 公司 乙二胺四乙酸钠( e d t a )国药集团上海化学试剂有限公司 三羟基甲基甲烷( 嘶s )国药集团上海化学试剂有限公司 f e c l 3 6 h 2 0国药集团上海化学试剂有限公司 邻二氮菲国药集团上海化学试剂有限公司 三氯甲烷( a r )国药集团上海化学试剂有限公司 焦性没食子酸( 邻苯三酚)国药集团上海化学试剂有限公司 其余试剂均为国产分析纯国药集团上海化学试剂有限公司 5 2 2 试验仪器 肌一s 数显恒温水浴锅 s a r t o r i u s 万分之一电子天平 r e - - 5 2 a a 型旋转蒸发器 s 皿一i 循环水式多用真空泵 尤尼柯u v - - 2 1 0 0 型分光光度计 电热鼓风干燥箱 b r 4 i 离心机 5 3 试验方法 江苏金坛医疗仪器厂 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海亚荣生化仪器厂 郑州长城科工贸有限公司 上海尤尼柯仪器有限公司 上海一恒科技有限公司 法国j o u a n 公司 5 3 1芝麻饼粕发酵提取物和未发酵提取物的制备 5 3 1 1芝麻木脂素( 未发酵提取物) 的制备 将芝麻饼烘干后粉碎，将粉碎后的芝麻饼5 0 9 放入三角瓶中，加入1 5 0 m l 正 己烷，5 0 水浴搅拌3 h ，过滤得到滤渣，重复操作，再脱脂一次。放入烘箱中烘 干。准确称取1 0 9 脱脂芝麻饼粉末放在2 5 0 m l 三角瓶中，加入6 0 m l 无水甲醇， 5 0 、1 5 0 r p m 摇床提取2 h 。，将滤液离心2 0 m i n ，转速为4 0 0 0 r p m ，取上清液5 0 m l 置于三角瓶中，重复上述工作一次，合并提取液定容到1 0 0 m l ，滤液减压浓缩， 干燥得提取物。 5 3 1 2 酱油曲霉发酵提取物的制备 准确称取脱脂后的芝麻饼粉末1 0 9 放入2 5 0 m l 三角瓶中，加入7 m l 蒸馏水将 江苏大学硕士学位论文 粉末搅拌均匀，然后在1 2 1 。c 下，灭菌2 0 r a i n 。将在4 c 冰箱中保藏的酱油曲霉z 菌种接种到p d a 斜面培养基上，放于2 8 c 的恒温培养箱中培养。用2 0 m l 无菌蒸 馏水洗脱孢子，使孢子浓度达到2 5 x 1 0 6 个n 也。再向灭菌后的装有芝麻饼的三角 瓶中注入3 m l 酱油曲霉菌z 悬液，混匀。将接种后的三角瓶置于2 8 的恒温培养 箱中发酵五天。在三角瓶中加入6 0 m l 浓度为7 0 的甲醇，5 0 c 、1 5 0 r p m 摇床提 取2 h 。，将滤液离心2 0 m i n ，转速为4 0 0 0 r p m ，取上清液5 0 m l 置于三角瓶中，重 复上述工作一次，合并提取液定容到1 0 0 m l ，滤液减压浓缩，干燥得提取物。 5 3 2 芝麻饼粕发酵提取物清除d p p h 活性的测定阳7 。甑删 测定方法参照3 2 2 4 5 3 3 提取物清除0 2 一活性的测定m 7 1 1 邻苯三酚自氧化法是测定清除0 2 一活性的常用方法。邻苯三酚在碱性条件下发 生自氧化释放0 2 一，并生成有色中间产物，当有抑制剂存在时，可清除0 2 一，从而 阻止中间产物的积累，所以可通过比色法来检测有色中间产物的含量，以检测物 质清除0 2 一的能力。 按表5 _ 2 加样后迅速混匀，在3 2 0 m n 下每隔3 0 s 读取吸光度，反应4 5 m i n 结束，清除率的计算公式： a a 0 一 a 清除率i ( ) = x 1 0 0 ( 5 1 ) a a 0 其中a a 和a a 0 分别表示加入抑制物和双蒸水后的邻苯三酚的自氧化速率，即每 分钟吸收的平均变化率。 表5 10 2 - 试验加样表 t a b l e 5 1 e x p e r m e n ta d dk i n df o r mo fs c a v e n g i n go x y g e nr a d i c a l s 江苏大学硕士学位论文 5 3 4 提取物清除0 h 活性的测型7 2 捌 在研究羟基自由基时，反应体系可通过水的辐解、光解以及化学反应来产生 羟基自由基，f e n t o n 反应是最常见的化学反应，总反应可用下式表示： f e 2 + + i - 1 2 0 r i e 3 + + o h + o h 羟自由基的测定方法有电子瞬磁共振法、高效液相色谱法、化学发光法、比 色法等。考虑到电子瞬磁共振法、高效液相色谱法、化学发光法这些方法需要比 较昂贵的仪器，操作也比较复杂及自身实验室的条件，我们选择比色法测定f e n t o n 反应产生的自由基。该法在抗氧化研究中检测离体实验体系中羟基自由基的氧化 反应，特别对于抗氧化剂选择有重要的价值。h 2 0 2 f e 2 + 体系可通过f e n t o n 反应产 生羟自由基，邻二氮菲r 2 + 水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲r 3 + 后，其在 5 3 6 n m 最大吸收峰消失。根据上述原理，以a 5 3 6 变化反映羟自由基氧化作用的比 色测定法。 取l m l 0 7 5 m o l 1 邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中依次加入2 m l 0 2 m m o l 1 磷酸 盐缓冲溶液( p b s ，p h 7 4 0 ) 和l m l 蒸馏水，充分混匀后，加入l m l l 7 5 m m o l 1 硫 酸亚铁溶液混匀后，加入l m l 0 0 1 x 2 氧水( i - 1 2 0 2 ) ，于3 7 。c 水浴6 0 m i n 后，在5 3 6 n m 测其吸光值，所测的数据为损伤管的吸光值a ( 损) 。未损伤管的吸光值以l m l 蒸 馏水代替损伤管中l m l 0 0 1 的双氧水( h 2 0 2 ) ，操作方法同损伤管，可测得5 3 6 n m 未损伤管的吸光值n 未) 。样品管以l m l 样品代替损伤管中l m l 蒸馏水，操作方 法同损伤管，可测得5 3 6 n m 样品管的吸光值n 样) 清除率的计算公式： 舣样) 一杈损) 清除率i ( ) =1 0 0 ( 5 2 ) 钺未) 一赳损) 5 3 5 还原能力的测定m 碍1 原理：一个物质的能清除自由基的能力大小是跟其还原能力的大小是分不开 的，如芝麻木脂素类化合物可络合诱导氧化的过渡金属离子，女h f e 3 + ，c u 2 + 等。f e 3 + 离子可催化h a b e r w e i s s 反应使。0