（食品科学专业论文）酪蛋白质量分数作为乳品掺假鉴定指标的研究.pdf

i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n tf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n 2 t h e s i ss u p e r v i s o r s ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rliheslso c l a t e1 - r o i e s s 0 rl 1h o n g 1 1 n g：h 0 n g g m a y ，2 0 1 0 酪蛋白质量分数作为乳品掺假鉴定指标的研究 摘要 酪蛋白是牛乳中的特征性蛋白质，占乳蛋白的质量比例( 即酪蛋白质量 分数) 一般都稳定在7 7 8 0 左右，因此，可以将酪蛋白质量分数作为判 定原料乳中是否掺假的一个重要指标。当今国家乳品安全标准中缺乏检验乳 品掺假的正确指标和检验方法，即使检验合格的产品，也并不能排除是否进 行了非奶源物质掺假。为了为乳品安全检测建立一套正确可行的方法，本课 题主要做了以下五个方面的研究： 1 等电点沉淀法分离粗品酪蛋白的研究。实验结果表明，牛乳中酪蛋 白分离的最佳工艺条件为，采用磁力搅拌的方法，用1 0 的乙酸溶液作为酪 蛋白等电点的酸度调节剂，将牛乳p h 值调到4 4 4 8 ，在3 0 0 0 r m i n 条件下 离心1 5 m i n 。 2 纯品酪蛋白制备条件的研究。本实验主要对粗品酪蛋白提纯过程中 所用的洗涤剂、洗涤次数以及洗涤后的分离方式作了研究。实验结果表明， 粗品酪蛋白洗涤提纯的最佳工艺条件为：用乙醚作为洗涤剂，分别洗涤2 次，用乙醚冲洗离心管后进行抽滤，最后采用1 0 0 - j ：2 下烘干。 3 纯品酪蛋白理化性质的测定。本实验主要对纯品酪蛋白干物质的水 分含量、灰分含量、蛋白质含量、脂肪含量、最大紫外吸收波长、空气中的 吸湿性以及在水中的溶解性作了测定，并与酪蛋白标准试剂的测定结果作了 比较。测定结果为：水分含量6 3 、灰分含量3 o 、蛋白质含量8 6 、脂 肪含量0 3 5 、最大紫外吸收波长5 4 8 n m 、空气中最大吸水量7 5 左右， 在提纯干燥后2 4 h 内吸湿能力最大。当p h 值为4 - 5 时，其溶解度最低，当 p h 值大于5 或小于4 时，其溶解度增大。 4 酪蛋白质量分数的测定。本实验在等电点沉淀法分离牛乳酪蛋白的 基础上，采用双缩脲法和凯氏定氮法分别直接测定牛乳中的酪蛋白质量分 数，并通过洗涤、干燥等步骤制得牛乳中纯品酪蛋白干物质，并用凯氏定氮 法对纯品酪蛋白的蛋白质含量进行了测定，结果表明：双缩脲法测得的酪蛋 白质量分数比凯氏定氮法的结果高约8 8 9 ，但比纯品酪蛋白干基换算的结 果低约6 3 7 ，所得纯品酪蛋白的蛋白质含量约为8 6 。然后用等电点沉淀 法对不同试样进行了酪蛋白质量分数的测定。实验结果表明，用酪蛋白沉淀 检测法完全能够鉴别出乳清粉、食用明胶和三聚氰胺的假乳蛋白掺假行为， 但不能鉴别出大豆分离蛋白粉的掺假。 5 酪蛋白与大豆分离蛋白粉的定性鉴别。本实验在结合感官评价和颜 色测定的基础上，采用紫外扫描的方法定性鉴别了牛乳中大豆分离蛋白粉的 掺假。实验结果表明，在牛乳中掺入1 的大豆分离蛋白粉后，产品具有明 显的豆腥味，且所得到的假酪蛋白色泽偏暗。紫外扫描的测定结果为：纯品 酪蛋白在5 4 8 n m 波长处有最大吸收峰，掺入大豆分离蛋白粉后，在5 0 8 、5 2 6 、 5 3 6 、5 5 4 、6 2 8 、6 5 4 、6 7 4 n m 波长处有7 个吸收峰，且在5 5 4 n m 波长处， 随着大豆分离蛋白粉添加量的增加，其吸光度值逐渐减小，在6 5 4 n m 波长 处，随着大豆分离蛋白粉添加量的增加，其吸光度值逐渐增大。 关键词：牛乳，酪蛋白，大豆蛋白，等电点沉淀，掺假，紫外扫描 i i 7 7 - - - 8 0 t h e r e f o r e ，w ec a nu s et h em a s sf r a c t i o no fc a s e i na sa ni m p o r t a n t i n d i c a t o rt od e t e r m i n ew h e t h e ri th a sa d u l t e r a t e d i no u rc o u n t r y ，s a f e t ys t a n d a r d s f o rm i l ka n dm i l kp r o d u c t sl a c ko fr i g h ti n d i c a t o ra n dt e s t i n gm e t h o d so fm i l k a d u l t e r a t i o nd e t e c t i o n ，t e s t i n gq u a l i f i e dp r o d u c t sc a nn o tr u l eo u tw h e t h e rh a v e n o n - m i l ka d u l t e r a t e ds u b s t a n c e s t h ef o l l o w i n gf i v ea s p e c t sw e r ei n v o l v e di n t h i ss t u d y f i r s t l y ，t h e r e s e a r c ho fc r u d ec a s e i nw e r es e p a r a t e db yi s o e l e c t r i c p r e c i p i t a t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o c e s sc o n d i t i o nr e s p e c t i v e l yw e r e m a g n e t i cs t i r ，10 a c e t i ca c i ds o l u t i o n ，p h4 4 - - - 4 8 ，15 r a i nc e n t r i f u g a t e da t 3 0 0 0r m i n s e c o n d l y ，t h e r e s e a r c ho fp r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so fp u r ec a s e i n t h e d e t e r g e n t ，w a s h i n gt i m e sa n ds e p a r a t i o nm o d ea f t e rw a s h i n gw e r er e s p e c t i v e l y i n s p e c t e di nt h i ss t u d y t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h em o s ts u i t a b l ec o n d i t i o n so f t h ep u r i f i c a t i o np r o c e s sw e r ee t h e ra sad e t e r g e n t ，t w ot i m e s ，r i n s e dc e n t r i f u g e t u b ew i t he t h e r ，l e a c h e d ，d i r e c td r y i n ga tl0 2 t h i r d l y ，t h ed e t e r m i n a t i o no fp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s o fp u r e c a s e i n t h em o i s t u r e c o n t e n t ，a s h ，p r o t e i n ，f a t ，m a x i m u mu va b s o r p t i o n w a v e l e n g t h ，m o i s t u r ea b s o r p t i o ni n t h ea i ra n dt h es o l u b i l i t yi nw a t e rw e r e d e t e r m i n a t e di nt h i ss t u d y t h er e s u l t sw e r ec o m p a r e dw i t ht h ec a s e i ns t a n d a r d r e a g e n t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o i s t u r ec o n t e n tw a s6 3 ，t h ea s hc o n t e n t w a s3 o ，t h ep r o t e i nc o n t e n tw a s8 6 ，t h ef a tc o n t e n tw a s0 3 5 ，i th a dt h e m a x i m u mu va b s o r p t i o np e a ki n5 4 8 n m ，t h em a x i m u mw a t e ra b s o r p t i o ni nt h e a i rw a sa b o u t7 5 t h ep u r ed r i e dc a s e i n sh a dt h el a r g e s tw a t e ra b s o r p t i o n c a p a c i t yw i t h i n2 4 h a f t e rd r y i n g w h e nt h ep hw a si n4 5 ，i th a dt h em i n i m u m s o l u b i l i t y ，w h e nt h ep hw a sh i g h e rt h a n5 o rl o w e rt h a ng ，i t s s o l u b i l i t y i l l p r o t e i np o w d e ri n c r e a s e d ，t h e a b s o r b a n c ew a si n c r e a s e da tt h e6 5 4 n m w a v e l e n g t h k e yw o r d s ：m i l k ，c a s e i n ，s o yp r o t e i n ，i s o e l e c t r i cp r e c i p i t a t i o n ，a d u l t e r a t i o n ， u n s c a n i v 目录 摘要“i a b s t r a c t i i i 目蜀之“i 第一章绪论l 1 1 课题研究背景l 1 1 1 乳的成分及营养价值”1 1 1 2 我国乳品行业现状2 1 1 3 酪蛋白是牛乳中的特征性组分”4 1 1 4 酪蛋白的种类及理化性质”5 1 1 5 掺假鉴定的最有效方法”6 1 2 国内外酪蛋白检测方法的研究现状7 1 3 酪蛋白等电点沉淀法的研究现状8 1 4 本课题研究的主要内容9 第二章等电点沉淀法制备粗品酪蛋白的研究一1 l 2 1 引言”1 1 2 1 1 等电点沉淀法应用于乳品检测的研究现状：1 1 2 1 2 酪蛋白分离制备的原理1 1 2 1 3 影响牛乳酪蛋白分离制备的因素1 1 2 2 实验材料及设备- 1 1 2 2 1 实验材料1 1 2 2 2 实验仪器及设备1 1 2 3 实验方法”1 2 2 3 1 酪蛋白的分离步骤1 2 2 3 2 酪蛋白等电点酸度调节剂的选择1 2 2 3 3 酪蛋白等电点最适搅拌方法的选择1 2 2 3 4 酪蛋白等电点最适p h 值的选择1 2 2 3 5 酪蛋白等电离心分离最适转速的选择1 3 2 3 6 酪蛋白等电离心分离最适时间的选择1 3 2 4 结果与讨论1 3 2 4 1 酪蛋白等电点酸度调节剂的确定”1 3 2 4 2 酪蛋白等电点最适搅拌方法的确定1 3 2 4 3 酪蛋白等电点最适p h 值的确定1 4 2 4 4 酪蛋白等电离心分离最适转速的确定1 4 2 4 5 酪蛋白等电离心分离最适时间的确定1 5 2 5 小结l5 第三章纯品酪蛋白制备工艺的研究1 6 3 1 引言1 6 3 1 1 几种有机溶剂的性质1 6 3 2 实验材料及设备”1 6 3 2 1 实验材料1 6 3 2 2 实验仪器及设备1 7 3 3 实验方法“17 3 3 1 粗品酪蛋白洗涤提纯的工艺流程1 7 3 3 2 粗品酪蛋白洗涤提纯工艺中洗涤剂的选择1 8 3 3 3 粗品酪蛋白洗涤提纯工艺中洗涤次数的选择1 8 3 3 4 粗品酪蛋白洗涤提纯工艺中抽滤方式的选择1 8 3 4 结果与讨论一1 8 3 4 1 粗品酪蛋白洗涤提纯工艺中洗涤剂的确定1 8 3 4 2 粗品酪蛋白洗涤提纯工艺中洗涤次数的确定1 9 3 4 3 粗品酪蛋白洗涤提纯工艺中抽滤方式的确定2 0 3 5 小结2 1 第四章纯品酪蛋白理化性质的鉴定2 2 4 1 引言2 2 4 2 实验材料与设备”2 2 4 2 1 实验材料2 2 4 2 2 实验仪器与设备：2 2 4 3 实验方法2 3 4 3 1 纯品酪蛋白干物质中水分含量的测定2 3 4 3 2 纯品酪蛋白干物质中灰分的测定2 3 4 3 3 纯品酪蛋白干物质中蛋白质含量的测定2 4 4 3 4 纯品酪蛋白干物质中脂肪含量的测定2 4 4 3 5 纯品酪蛋白干物质吸湿性的测定2 5 4 3 6 纯品酪蛋白干物质溶解性的测定2 5 4 3 7 纯品酪蛋白干物质紫外吸收的测定2 6 4 4 结果与讨论”2 6 i l 2 6 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 0 5 1 1 双缩脲检测法原理3 0 5 1 2 凯氏定氮法检测原理3 0 5 2 实验材料及设备3 0 5 2 1 实验材料3 0 5 2 2 实验仪器与设备31 5 3 实验方法一31 5 3 1 双缩脲法的检测方法3 1 5 3 2 凯氏定氮法的检测方法3 2 5 3 3 不同试样酪蛋白质量分数的测定方法3 2 5 4 结果与讨论3 2 5 4 1 标准曲线绘制的结果与讨论3 2 5 4 2 不同牛乳样品的对比实验结果与讨论3 3 5 4 3 不同试样酪蛋白质量分数的测定结果与讨论3 4 5 5 小结3 4 第六章酪蛋白与大豆分离蛋白的定性鉴别3 6 6 1 引言3 6 。 6 1 1 乳品中大豆分离蛋白粉掺假鉴别的研究现状3 6 6 2 实验材料及设备一3 6 6 2 1 实验材料3 6 6 2 2 实验仪器与设备3 7 6 3 实验方法”3 7 6 3 1 感官鉴定3 7 6 3 2 紫外扫描法3 7 6 4 结果与讨论3 8 6 4 1 感官鉴定的实验结果与讨论3 8 6 4 2 紫外扫描的结果与讨论3 8 i i i 6 5d 、结4 1 第七章结论与展望4 3 7 1 本实验的主要研究结果4 3 7 1 1 粗品酪蛋白的提取工艺4 3 7 1 2 纯品酪蛋白的制备工艺4 3 7 1 3 纯品酪蛋白理化性质4 3 7 1 4 酪蛋白质量分数的测定4 3 7 1 5 酪蛋白质量分数的测定4 4 7 2 本课题的创新点”4 5 7 3 本课题展望4 5 参考文献4 6 j 致谢”5l 目录5 2 用授权的声明5 5 i v 酪蛋白质量分数作为乳品掺假鉴定指标的研究 第一章绪论 1 1 课题研究背景 1 1 1 乳的成分及营养价值 乳是哺乳动物为哺育幼儿从乳腺分泌的一种白色或稍带黄色的不透明液体。它含有 幼小动物生长发育所需要的全部营养成分，是哺乳动物出生后最适于消化吸收的全价食 物。其中含有水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、无机盐、磷脂类、维生素、酶、色素、 气体及多种微量成分。乳的主要组成和含量如表1 1 所示【1 】。因此，牛奶和牛奶制品是大 自然赐予人类最理想的、最接近于人奶的完善天然食品【2 】。 表1 - 1 乳中主要成分及含量 t a b 1 - 1t h em a i nc o m p o n e n t sa n dc o n t e n ti nm i l k 牛乳中的蛋白质是乳中的主要含氮物质，含量为2 8 - - 3 7 ，其中9 5 是乳蛋白质， 5 为非蛋白氮。乳中蛋白质大约8 0 是酪蛋白，酪蛋白至少由1 0 种不同蛋白质组成， 其余主要是乳清蛋白，另外还有少量脂肪球膜蛋白和酶。乳清蛋白的主要成分是a 一乳白 蛋白、d 一乳球蛋白、牛血清蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白以及由酪蛋白水解衍生的肽等。 乳中还有少量的非蛋白态含氮物，如氨、游离氨基酸、尿素、嘌呤碱等。此外，还有少 量的维生素氮。牛乳中主要蛋白质的含量见表1 2 t 1 。 陕西科技大学硕士学位论文 表1 2 牛乳中主要蛋白质的含量 t a b 1 - 2 1 1 h ec o n t e n to ft h em a i nm i l kp r o t e i n 乳中含量( g l ) 占总蛋白的百分率 总蛋白3 2 51 0 0 酪蛋白 2 6 o8 0 o l - 酪蛋白 1 0 o3 0 8 2 一酪蛋白 2 68 0 p 酪蛋白 9 32 8 6 k 酪蛋白 3 31 0 1 y 酪蛋白 0 8 2 5 乳清蛋白6 52 0 0 洳乳白蛋白1 23 7 b - 乳球蛋白 3 29 8 牛血清白蛋白o 30 9 免疫球蛋白 o 72 1 脂肪球膜蛋白04 1 2 其他 0 82 5 乳蛋白质中含有人体生长发育和维持健康的一切必需氨基酸和其它氨基酸，是一种 全价蛋白质。乳蛋白消化率很高，比肉类、米饭、面包等食品的消化率都要高很多。牛 乳的生物价为8 5 ，是大米的1 0 倍，比面粉高3 3 1 牛乳的氨基酸评分为9 5 分，比大米高 2 8 分，是面类的2 倍f 2 】。乳脂为短链和中链脂肪酸，脂肪颗粒小，呈高度乳化状态，极 易消化吸收。乳脂中还含有人类必需的脂肪酸和磷脂，营养价值很高。乳糖是乳中唯一 的碳水化合物，只存在于乳中。一分子乳糖消化时可产生一分子半乳糖，半乳糖能促进 脑苷脂类粘多糖类的生存，对幼儿智力发育十分重要。乳中含钙量特别多，能够保证人 体骨骼、牙齿等器官的生长发育，防止缺钙。牛乳中还含有多种维生素，因此，牛奶是 补充维生素的重要来源 4 1 。 牛乳中具有超氧化物歧化酶s o d ，能消除体内有害物质，增强免疫力。牛乳有降低 胆固醇的作用，因此，经常饮用牛奶可以防治动脉硬化以及心血管系统类疾病。此外， 牛乳还有很好的镇静和催眠作用，能有效缓解神经衰弱、失眠等症状【s 】。总之，牛乳被 人们誉为是“最接近完善的食品，更有“白色血液 之称。 1 1 2 我国乳品行业现状 近年来，随着人们生活水平不断提高和饮食质量的提升，乳品渐渐走入了寻常百姓 2 酪蛋白质量分数作为乳品掺假攀定指标的研究 的日常生活，牛奶的消费量呈现大幅度增长的趋势。特别是1 9 9 8 年以后，中国奶业消费 经历了一个“爆发性增长期 ，牛奶的普及率大幅度提升，北京、上海等很多大中城市 的消费者每周饮用一次以上纯鲜牛奶的比例已达到7 0 以上。但由于我国人口基数大， 且受消费习惯影响，至今还有相当一部分人尤其是农村居民从不或很少消费乳品。中国 作为拥有1 3 亿人口的大国，目前年人均乳品消费量仅为1 1 公斤，不到全球年人均乳品 消费量的1 2 。因此，从整体来说，中国人对乳品的消费量还是很有限的，消费水平较 低，与世界平均水平差距很大。随着国家学生饮用奶计划方案的实施，我国乳品的消费 空间将非常巨大，预计每年至少可以增加乳品的消费需求1 5 3 9 万吨，2 0 1 5 年乳品消费 总量将达到2 5 0 1 4 万吨，人均消费量将达到1 7 8 3 千克。据统计，2 0 0 6 年全年中国液体 乳及乳制品制造行业实现累计工业总产值1 0 7 ，4 2 2 ，5 9 6 千元，比上年同期增长2 1 9 4 ； 全年实现累计产品销售收入1 0 4 ，1 4 1 ，6 3 5 千元，比上年同期增长2 2 5 ；全年实现累计利 润总额5 , 5 0 1 ，6 0 2 千元，比上年同期增长1 4 5 4 。2 0 0 7 年1 2 月，中国液体乳及乳制品 制造行业实现累计工业总产值1 7 ，9 6 8 ，5 9 0 千元，比上年同期增长2 3 1 5 ；实现累计产品 销售收入1 8 ，0 0 0 ，0 2 4 千元，比上年同期增长2 5 9 8 ；实现累计利润总额8 9 1 ，5 1 5 干元， 比上年同期增长5 4 4 。 但是近年来乳品行业质量安全事故接连发生也让我们对乳品行业的前景很是担心。 2 0 0 4 年4 月安徽阜阳“大头娃娃”事件；2 0 0 4 年7 月佛山市查获的低蛋白质含量的劣质 奶粉事件；2 0 0 4 年1 1 月广州市工商局查获大肠菌超标1 5 6 的毒奶粉事件；2 0 0 5 年5 月雀巢金牌婴幼儿奶粉碘含量超标事件；2 0 0 5 年6 月光明乳业使用过期牛奶返厂加工再 销售事件删。2 0 0 7 年4 月陕西省杨凌部分奶站在原奶中掺杂掺假，将水、蛋白粉、植物 e 油、麦芽糊精等物质加入鲜奶中，个别奶站还擅自在鲜奶中添加抗生素、双氧水等，此 事件被中央电视台“焦点访谈 栏目报道，在社会上产生了极大的反响；2 0 0 8 年9 月， 石家庄爆发了三鹿毒奶粉重大食品安全事件，究其原因是由于不法分子非法添加工业原 料三聚氰胺造成的，这些知名品牌的乳品存在质量问题被曝光后，引发了消费者对乳品 行业的信任危机，直接导致居民对乳品消费量的下降。 乳品质量安全是人命关天的大事。乳与乳制品已经是人们日常膳食的重要组成部分， 乳品质量安全直接关系到人民群众的身体健康和生命安全。然而，由于利益的驱动，原 料乳掺假现象日益严重，从单一的兑水、加入水解植物蛋白或增稠剂转向多重掺假，掺 假技术不断“提高 。原料乳中掺入杂质，不仅会使乳及乳制品质量下降，给乳制品生 产加工造成困难，而且会酿成重大的生产事故，因食用乳制品中毒事件屡有发生，直接 危害到消费者生命安全【9 】，如“三鹿毒奶粉 事件就是一个沉痛的教训。 乳中蛋白质检测的传统方法是凯氏定氮法。但是这种方法耗时长，灵敏度低，操作 复杂，在操作中还会产生大量的有害气体，影响操作人员身体健康，且样品中的含氮化 陕西科技大学硕士学位论文 合物会影响蛋白质含量的测定，无法检测掺入的非蛋白质物质。为此，建立一种适应新 掺假情况的快速、准确的检测方法，是目前乳品安全检测急需解决的问题。 1 1 3 酪蛋白是牛乳中的特征性组分 牛乳最主要的成分是水( 约为8 7 5 ) ，其余的主要成分还有乳脂肪、乳蛋白和乳糖， 以及微量的无机盐、非蛋白氮化合物和维生素，乳及相关制品的平均组分如表1 3 所示f l o 】。 尽管牛乳的组分会因饲养方式、乳牛品种、泌乳期及气温等因素的影响而发生一定的变 化，但由于绝大部分商品乳是来自不同乳牛的混合牛乳，各种因素平均后差异就会减少， 因此牛乳的平均组分变化不大 i o a h 。由表1 3 可以看出，在四种乳品中酪蛋白占乳蛋白的 质量分数稳定在7 7 7 8 左右。 表1 3 乳及相关制品的平均组分 t a b i 一3t h ea v e r a g ec o m p o n e n t so fm i l ka n dr e l a t e dp r o d u c t s 乳蛋白主要分为酪蛋白和乳清蛋白两大类，通常的定义是：在p h 值为4 6 时从牛乳中 沉淀的蛋白质称为酪蛋白；在同样条件下不沉淀的称为乳清蛋白。牛乳所含有的蛋白总 量大约为3 3 ，其中2 5 左右是酪蛋白，0 6 是乳清蛋白，剩余的0 2 为一些含氮化合 物，属于非蛋白射埘。 酪蛋白是一类磷酸蛋白，占牛乳真蛋白的8 0 左右，它主要以5 种形式存在：1 酪 蛋白、( z s 2 酪蛋白、3 - 酪蛋白、k 酪蛋白和y 一酪蛋白，它们分别占酪蛋白总量的3 8 ， 1 0 ，3 6 ，1 3 和3 1 o j 。酪蛋白通过酸化和凝乳作用会沉淀或凝固。乳中主要的乳清 蛋白有p 哥l 球蛋白、仅乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和际胨，它们分别占乳清蛋 白总量的5 0 ，2 0 ，6 ，1 2 和1 2 m 。乳清蛋白不会因为酸化和凝乳作用而沉淀。牛 乳蛋白质包括6 种特异性蛋白，其中有4 种酪蛋白：1 酪蛋白、2 酪蛋白、d 酪蛋白和 k 酪蛋白；两种乳清蛋白：b 乳球蛋白和0 【乳球蛋白【坨】。 4 酪蛋白质量分数作为乳品掺假鉴定指标的研究 按照人类所需的营养，乳中最有价值的成分是蛋白质，乳蛋白提供的氨基酸比例相 当平衡，在评价食物蛋白质质量时，酪蛋白通常被作为参照蛋白质来对照。乳和乳制品 提供的蛋白质占世界人口蛋白消费总量的2 0 左右【l o l 。 综上所述，酪蛋白可以作为牛乳中特征性组分进行检测。 1 1 4 酪蛋白的种类及理化性质 酪蛋白是指将牛乳加酸处理，在室温下调节其p h 至4 6 时沉淀出来的一类蛋白质。 酪蛋白是一类磷酸蛋白，占牛乳真蛋白的8 0 左右，它主要以五种形式存在：1 、2 、 p 、b 和丫酪蛋白，分别占酪蛋白总量的3 8 、1 0 、3 6 、1 3 和3 ，它们各自都有 相对分子质量和等电点不同的变异体【- 】。 魄酪蛋白是酪蛋白胶粒结构中的基本组成部分，主要由1 酪蛋白和啦酪蛋白组 成。0 【s 1 _ 酪蛋白含有1 9 9 个氨基酸残基，含量占总酪蛋白的3 6 。以1 c n b 一8 p 为主要 成分。1 酪蛋白含磷约为1 1 ，每摩尔分子中磷酸基团数为8 个或9 个。魄2 酪蛋白含 有2 0 7 个氨基酸残基，含量占总酪蛋白的1 0 。啦酪蛋白富含赖氨酸，可与缺乏赖氨 酸的植物蛋白很好地互补。 d 酪蛋白由2 0 9 个氨基酸组成，含量占总酪蛋白的3 4 ，主要成分为 3 - c n a 2 5 p 。 丫酪蛋白在酪蛋白中含量很少，其各种成分与p 酪蛋白相似。丫酪蛋白是由乳汁分 泌后由内源性的蛋白酶对b 酪蛋白的部分降解产生的。 佟酪蛋白含有1 6 9 个氨基酸残基，含量占总酪蛋白的1 2 。大部分k 酪蛋白含有糖 基，糖含量约为5 。在p h 为6 6 时，静酪蛋白可以结合2 个c a 2 + ，其溶解度不受c a 2 + 影响。 表1 4 酪蛋白复合物的组成 t a b 1 4t h ec o m p o s i t i o no ft h ec a s e i nc o m p l e x 酪蛋白是具有柔性和热稳定性的蛋白质，大部分以酪蛋白胶束状态存在，另外再与 磷酸钙形成复合体，称作“酪蛋白酸钙一磷酸钙复合体 。其组成如表1 4 所示。在牛乳 中，9 5 的酪蛋白是以近似于球状的颗粒存在的，即酪蛋白胶粒( c a s e i n m i c e l l e ) ，酪蛋白 胶粒直径约为4 0 3 0 0 n m 。每个胶粒平均由1 0 4 个酪蛋白分子组成，也含有一些无机物质， 陕西科技大学硕士学位论文 主要是磷酸钙，约为8 1 0 0 9 酪蛋白。酪蛋白胶粒也含有少量的其他蛋白质，如某些酶 类。酪蛋白胶粒结合了大量的水，它是一种多孔性物质，带有负电荷【l 】。 酪蛋白胶粒能结合不溶性的物质( 如磷酸钙) ，使之保持稳定，使乳腺能分泌高浓 度的钙和磷，这不但对哺乳动物的幼子有重要的营养作用，而且对乳腺泌乳功能也有重 要的保护作用。酪蛋白胶粒在胃中遇到酸和蛋白酶变得不稳定，易形成凝块，一方面提 供饱腹感，另一方面可连续向小肠供给营养，开始是可溶性乳糖和乳清蛋白等可溶物， 而后是经消化的酪蛋白水解物和易消化的凝块。这有利于乳汁营养成分在整个消化道内 的分布。1 9 7 9 年b r a n t l 等人通过豚鼠实验发现了具有类吗啡活性的短肽，使酪蛋白来源 的生物活性肽的研究进展迅速。研究发现，酪蛋白来源的多种生物活性肽是完成生理功 能所必不可少的重要成分【n 】。 牛乳酪蛋白多肽具有很多生理活性，类吗啡活性肽能起安神麻醉作用，此外还能止 泻、调节肠道氨基酸运输和吸收、影响代谢、刺激胰岛素和生长素的产生等多种生理功 能。免疫活性肽能刺激机体淋巴细胞增殖，提高机体对病源物质感染的抵抗能力。酪蛋 白磷酸肽是目前研究最多的矿质元素结合肽，它在体内能形成可溶性的有机磷酸盐，充 当钙离子在体内运输的载体，促进钙离子和其他矿质元素的吸收【协”】。 乳蛋白是乳中最有价值的组分，特别是酪蛋白，是牛乳中的特征性蛋白质，是无法 用其他蛋白质来补偿的。a s u m m e r 等人的研究发现，牦牛乳中k - 酪蛋白和魄酪蛋白的 含量相对稳定【6 】。因此，在测定原料奶的品质时，可以将牛奶中酪蛋白质量分数作为一 个质量指标来判断牛奶质量优劣和是否掺假等。所以我们选择酪蛋白等电点沉淀法来测 定牛乳中酪蛋白的质量分数，主要针对于在原料奶中掺杂尿素、水解蛋白粉等其他杂蛋 白的检测。 1 1 5 掺假鉴定的最有效方法 在乳品中掺入廉价的组分，也被称作经济掺假，通常不会对消费者的健康产生危害。 但是也有例外，如消费者有可能会对掺入绵羊乳或山羊乳的牛乳或乳清过敏，最可怕是 我国发生的三聚氰胺事件。因此，大多数国家都已制定了相应的法律条例来保护消费者 的利益和规范公平的市场交易行为m 。我国g b 7 7 1 8 预包装食品标签通则规定，食品 的包装标签必须能明确地告诉消费者产品的成分，对在食品标签上有欺骗性行为的生产 者，可以对其进行法律制裁。我国食品安全法明文规定，禁止生产经营“腐败变质、 油脂酸败、霉变生虫、污秽不洁、混有异物、掺假掺杂或者感官性状异常的食品 。通 常，乳品的掺假方式至少包括下列其中一类1 7 】： ( 1 ) 不符合法律要求的产品标准。特定乳产品( 乳油、干酪、酸乳等) 中最大最低 水分，非脂乳固体，脂肪含量地域差异。( 2 ) 错误地在乳中掺入其他乳成分或非乳成分， 如：掺水，掺入其他乳，掺入非乳蛋白，改变酪蛋白乳清蛋白比率，在乳粉中加入乳油 6 酪蛋白质量分数作为乳品掺假鉴定指标的研究 或乳清粉，在乳脂中加入植物油脂或动物脂肪，在液态乳中添加还原乳，添加不合标准 的防腐剂。( 3 ) 非标准工艺，如热处理、干酪成熟、膜技术【m 。 在乳品掺假过程中，如果产品进行了乳脂肪替代品掺假，为了使产品成分标准化， 相应必须要进行乳蛋白替代品掺假，反之亦然。因此，只要能够检测乳品是否存在乳蛋 白掺假问题，基本上就能判定乳品是否存在营养成分掺假问题。非乳成分掺假主要会使 以下3 种检验指标发生变化：脂肪蛋白质比率，蛋白质含量，酪蛋白质量分数，对于前 两个指标，常规的脂肪和蛋白质检验指标不能够保证产品的真实可靠性，由于酪蛋白是 特征性乳蛋白，价值大，掺假者进行酪蛋白掺假一般会得不偿失，因此只要进行酪蛋白 质量分数检测，就能判断是否存在非乳成分掺假。 针对现阶段我国乳品掺假的现状，可以将酪蛋白质量分数作为一项强制检验指标进 行掺假检验，可以通过测定大量的乳品，并根据测定结果建立一组样品数据库，根据被 测原料或产品的酪蛋白质量分数数据与样品数据库数据进行比较，判定原料或产品是否 存在掺假以及判定掺假的大小。乳是一种非常复杂的理化体系，每一种成分都很重要， 均需保证其未掺假。明确的划分掺假乳和未掺假乳在鉴定技术上是比较困难的，因此， 不能制定十分严格的标准来判定乳制品中是否掺假，不然就有可能出现误籼研。通过从 经济和名誉两方面对非乳蛋白掺假结果进行权衡，不难发现低于5 的非乳蛋白掺假结 果是得不偿失的，又由于乳品中酪蛋白质量分数一般会稳定在7 7 8 0 左右，因此从理 论上讲，可以将酪蛋白质量分数7 3 ，作为乳品掺假检验的定量指标。 酪蛋白质量分数检验指标的设立，能够有效地鉴定并遏制乳品中添加水、蔗糖、葡 萄糖、麦芽糊精类物质、淀粉、豆浆、面粉类物质、棕榈油、油脂粉、植脂末类物质、 乳清粉、明胶、水解动物蛋白粉、尿、尿素等非乳成分，其缺陷是无法判定是否掺入其 它乳，以及为延长产品保质期，而加入原料中的碱、抗生素、双氧水、不合标准的防腐 剂等对人体健康有危害的物质。 针对巨大利益驱使下的乳品掺假，在复杂的乳品成分中设立酪蛋白质量分数检验指 标，用来指示乳品是否掺假，并建立一种易于掌握、能广为接受的快速定量检验方法， 无疑是乳品掺假鉴定的最有效方法。 1 2 国内外酪蛋白检测方法的研究现状 国外有关牛乳酪蛋白检测技术的报道很多，1 9 8 7 年d m b a r b a n o 等人用红外线测乳仪 检测牛乳中酪蛋白含量。he l b e r t z h a g e n 采用电泳与银染色相结合的技术，生产出具有抗 牛乳酪蛋白的兔血清，用来对羊乳制品中掺杂的牛乳进行检n t , , j 。jb e l l o q u e 等人运用 3 1 p n m r 技术，进一步对牛乳中的酪蛋白含量进行了测定【1 9 l 。1 9 9 7 年g a n g u i t a 用e l i s a 检测羊乳及羊乳制品中掺杂的牛乳【2 0 】。bv m i e j o 等用毛细管区带电泳技术分离和测定了 牛乳中的主要酪蛋白和乳清蛋白。1 9 8 9 年z k f e n g 等人制备出了k 酪蛋白的单克隆抗 7 陕西科技大学硕十学位论文 体。1 9 9 0 年k n o a r dm k u z m a n o 祥人制备出k 酪蛋白和2 酪蛋白的单克隆抗体【：- 】，运用 此抗体进行酪蛋白的定性以及定量的分析检测。m i c h a e l a v i t k o v , 4 , 等人于2 0 0 2 年期 间，通过间接竞争e l i s a 法来检测蛋白酶水解前后酪蛋白的变化及其热处理情况【托】，来 解决乳及乳制品在加工过程中所存在的质量问题。 国内研究酪蛋白检测技术的人比较少，起步也比较晚。程涛、孙艳波等人( 2 0 0 0 年) 采用双缩脲法测定牛乳中酪蛋白含量【冽，将其作为一种判定牛乳质量的指标。邵锦震等 根据蛋白质在等电点时溶解度最小的原理，将牛- 孚l p h 调到4 6 ，离心获得粗品酪蛋白，然 后用乙醚乙醇、乙醚溶液作为洗涤剂，对粗品酪蛋白进行洗涤提纯，最后在1 0 2 下烘 干，得到纯品酪蛋白干物质 2 4 1 。酪蛋白是牛乳中含量相对稳定的特征性蛋白质，牛乳中 一旦掺入其他杂蛋白，酪蛋白含量定会发生变化，基于以上原理，张东送等人在检测牛 乳中酪蛋白含量的研究中采用了毛细管电泳技术，通过检测巴氏乳、原料乳和超高温乳 的电泳图谱，计算乳中酪蛋白的含量，同时当牛乳中掺入其他杂蛋白时，毛细管电泳图 谱上便会出现新的蛋白吸收峰，从而断定出牛乳掺假。此方法快速、高效，且样品用量 少，但由于毛细管电泳仪设备昂贵复杂，操作人员需要专业的训练，所以使用受到了很 大的限带l j 2 5 1 。 1 3 酪蛋白等电点沉淀法的研究现状 杨丹毅等【矧研究了鉴别奶粉与乳清粉的方法：取约0 5 9 样品置烧杯中，加入1 0 m l 水， 搅拌溶解成均匀溶液，用吸管逐滴滴入盐酸溶液( 量取1 0 m l 盐酸，加水稀释至2 0 0 m l ) ， 边滴边摇匀，并用精密p h 试纸( p h 3 8 5 4 ) i 贝t j 其p h 值，当p h 值在4 6 或其附近( 如4 1 4 8 ) 时，观察有无白色絮状凝块生成。若有，即为奶粉，若溶液仍呈乳浊状，无凝块形成， 即为乳清粉。 程涛等【2 3 研究了双缩脲法测定乳中酪蛋白含量的方法：准确吸取1 0 m l 牛乳，然后加 入等量p h 值为4 6 的h a c - n a a c 缓冲液( o 2 m o l l ) ，混匀，沉淀酪蛋白。之后在3 0 0 0 - - 4 0 0 0 r m i n 下离一i , , 1 0 m i n ，弃去上清液收集沉淀。为防止酪蛋白沉淀物中混有脂肪球而影响测 定，沉淀再用l o m l 乙醚乙醇混合液( 体积比为1 ：1 ) 洗涤，并在上述条件下离心，收集沉 淀，用0 1 m o l l 的n a o h 溶解，并准确定容