（食品科学专业论文）中国对虾（Penaeus+chinensis）主要过敏原的鉴定及性质研究.pdf

中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 摘要 虾味道鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱，但其同时也是联合国粮农组织 公布的8 种常见的高过敏活性食物之一。本论文以原产于我国的中国对虾 ( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 为研究对象，旨在获得有关中国对虾过敏原的基础数据， 为海产品过敏原的控制提供依据。首先，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对中国对虾过 敏原组分进行分析，经免疫印迹鉴定其主要过敏原p e nc1 ；然后利用高效液相 色谱纯化p e nc1 ：经苯酚硫酸法、肽质量指纹图谱和红外光谱分析等方法对其 性质进行初步研究。结果表明p e nc1 为分子量3 6 k d 的糖蛋白；糖含量为4 4 ； 检索出了1 7 条吻合肽段；其二级结构存在0 c 一螺旋。 为研究p e nc1 的分子生物学特征，我们根据已报道的其它品种虾过敏原的 核苷酸序列设计引物，应用p c r 方法克隆p e ncl 的基因并进行测序，结果显示 p e nc1 开放阅读框长8 2 5 b p ，编码2 7 4 个氨基酸。一从g e n b a n k 数据库中检索不 同种属海产品的过敏原，运用生物信息学软件进行分析，研究氨基酸同源性并构 建系统进化树，结果表明不同海产品过敏原的氨基酸存在较高的同源性，并且其 亲缘关系越近其同源性也越高。分析免疫球蛋白e 结合区域的9 个肽段的抗原 表位，发现这些海产品过敏原中存在相同的抗原表位。除此之外，利用在线软件， 推测p e nc1 的二硫键，等电点，疏水性，二级结构以及o 一糖基化位点等。 利用气相色谱分析p e nc1 的单糖组成；根据p 消去分析其糖苷键类型：通过 表示扫描热量仪分析糖链对过敏原热稳定性的影响；以质谱为主要研究手段，确 定p e nc1 的糖基化位点。结果表明：p e nc1 单糖组成有两种，它们分别是d 甘露 糖和d 葡萄糖；p e nc1 中存在o 糖苷键；糖链能增强p e ncl 的热稳定性；1 2 2 位 天冬酰胺为p e nc1 的n 一糖基化位点，第1 0 1 苏氨酸为潜在的o 一糖基化位点。利用 n 肽糖苷酶f 专一酶切n 糖链；通过美拉德反应合成多糖与蛋白复合物：根据实 验建立起来的e l i s a 体系，测定糖链酶切前后、美拉德反应前后p e nc1 的过敏活 性变化。结果表明：n 一糖基化位点以及潜在的o 糖基化位点均不在9 个肽段的抗 原表位上，糖链对p e ncl 的过敏活性影响不大。 通过胰蛋白酶水解降低p e ncl 的过敏活性，采用三因素二次旋转正交回归设 计对水解反应的工艺参数p h 值、水解温度( t ) 、酶和底物比( e ：s ) 进行了优化。 建立了以反应过敏活性的o d 值为响应值的二次旋转正交回归模型。方程通过f 检验、t 检验和应用验证，表明模型能较好地反映胰蛋白酶水解p e ncl 反应体系的 运行规律，优化出水解条件为：p h 值为8 1 2 ，水解温度为4 3 3 。c ，e ：s 为4 3u g 。 关键词：虾；过敏原；鉴定；性质 i d e n t i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e so fm a j o r a l l e r g e nf r o m c h i n e s e s h r i m p ，p e n a e u sc h i n e n s i s a b s t r a c t s h r i m pi sd e e p l yp o p u l a rw i t hc o n s u m e r sb e c a u s eo ff l a v o ra n df l i m e n m t i o n b u t , i ti sa l s oo n eo fe i g h tk i n d so fh i g h l ya l l e r g e n i cf o o d sp u b l i c i z e db yf o o da n d a g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o n p e n a e u sc h i n e n s i s ，ak i n do fs e a f o o df r o mc h i n a , i s r e s e a r c h e di nt h i sp a p e r i no r d e rt oo b t a i nr e l e v a n td a t ao fc h i n e s es h r i m pa l l e r g e n ， a n dl a yt h e o r e t i c a lb a s ef o rt h es e a f o o da l l e r g e nc o n t r o l ，h e r et h ep r o p e r t i e so f c h i n e s es h r i m pa r e i n v e s t i g a t e d i t sa n t i g e n i cc o m p o n e n t s a r e a n a l y z e db y s d s p a g e t h e nw e s t e r n b l o t t i n gi su s e dt od e t e r m i n et h em a j o ra l l e r g e no fi t a n e ws h r i m pa l l e r g e nw a so b t m n e dw i t l lm g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，a n di t sp r o p e r t i e sp r e l i m i n a r i l ya r es t u d i e db yp h e n o l - s u l f u r i ca c i dr e a c t i o n ， p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ( p m f ) a n di n f r a - r e d ( 承) s p e c t r u m t h er e s u l t sr e v e a l et h a t t h em a j o ra l l e r g e no fc h i n e s es h r i m pi sm o l e c u l e s - 3 6 k dp r o t e i n i tw a sak i n do f g l y c o p r o t e i na n dt h et o t a lc a r b o h y d r a t ec o n t e n tw a s4 4 17s e g m e n t so fi d e n t i c a l p e p t i d ea r er e t r i e v e db ym a s c o t ，a n d0 【一h e l i xi so n eo fs e c o n d a r ys t r u c t u r eo np e nc 1 i no r d e rt os t u d yt h em o l e c u l a rb i o l o g yc h a r a c t e ro fp e nc1 ，w ed e s i g np r i m e r s a c c o r d i n gt og e n eo fo t h e rs h r i m pa l l e r g e n s e m p l o y i n gt h em e t h o dp c r c l o n e sp e nc 1g e n e ，a n ds e q u e n c i n g i t so p e nr e a d i n gf r a m ec o n s i s t so f8 2 5b pn u c l e i ca c i d s ， w h i c he n c o d i n g2 7 4a m i n oa c i d s w ed o w n l o a do t h e ra l t l i n oa c i ds e q u e n c e so f s e a f o o da l l e r g e nf r o mg e n b a n k ，t h e nd r a wh o m o l o g ya n dc o n s t r u c tp h y l o g e n e t i ct r e e f o r mb yb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e t h er e s u l t ss h o wt h a td i f f e r e n ts e a f o o da l l e r g e n s s h a r eah i g h e ra m i n oa c i dh o m o l o g y , a n dt h e i rr e l a t i o n s h i pm o r en e a ri t sh o m o l o g y a l s oh i g h e r a n a l y z i n gm a j o ri g e b i n d i n gr e g i o n sh a v eb e e ni d e n t i f i e di ns h r i m p t r o p o m y o s i nc o n t a i n i n gn i n e p e p t i d ee p i t o p e s ，f i n dt h a td i f f e r e n ts e a f o o da l l e r g e n s s h a r eh o m o l o g ye p i t o p e s b e s i d e s ，w ec o n c l u d ed i s u l p h i d e b o n d ，i s o e l e c t r i cp o i n t ( p 1 3 ， h y d r o p h o b i c i t y , s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，o g l y c o s y l a t i o ns i t e sb yb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e o n l i n e 。 t h ec o m p o n e n to fm o n o s a c c h a r i d ei s a n a l y z e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y g l y c o p e p t i d e sl i n k a g ei sa n a l y z e d b y1 3 - e l i m i n a t i o n u s i n gd i f f e r e n t i a ls c a n n i n g c a l o r i m e t e r s ( d c s ) t oa n a l y z et h e r m a ls t a b i l i t y t h eg l y c o s y l a t i o ns i t e so fp e nc1a r e d e t e r m i n d e du s i n gb i o l o g i c a lm a s ss p e c t r o m e t r y t h er e s u l t sr e v e a lt h a tp e nc1 m a i n l yc o n s i s t so fg l u c o s ea n ds e m i n o s e s u g a rc h a i nl i n kp r o t e i nb yo t y p e g l y c o p e p t i d e sa n db o o s tu ph e a t s t a b i l i t y o fp e nc1 a s nl o c a t e d101 i s n g l y c o s y l a t i o n ，t h rl o c a t e d10 1i sp o t e n t i a ln - g l y c o s y l a t i o n a c c o r d i n gt oe l i s a s y s t e me s t a b l i s h e d ，r e s e a r c h i n f e c t i o no fs u g a rc h a i nr e l e a s ea n dm a i l l a r dt o a n t i g e n i c i t y t h e r e s u l t s r e v e a l t h a t n g l y e o s y l a t i o n s i t e sa n dp o t e n t i a l o g l y c o s y l a t i o ns i t e sa r en o ti nt h en i n e p e p t i d ee p i t o p e s ，s u g a rc h a i no fp e nc1l i t t l e e f f e c to nt h ea l l e r g i ca c t i v i t y w et r yt or e d u c ea n t i g e n i c i t yo fp e nc1b yt r y p s i nh y d r o l y s i s t h er e g r e s s i o n m o d e lo ft h r e ef a c t o r st w i c er o t a t i o np e r p e n d i c u l a rr e g r e s s i v ed e s i g nw a sa d o p t e d t h ee f f e c t so fp h ，t e m p e r a t u r ea n de n z y m et os u b s t r a t er a t i o ( e ：s ) o nt h ea n t i g e n i c a c t i v i t i e so fp e nc1a l eo ns t u d y b yf i n s p e c t i o n ，t - i n s p e c t i o na n da p p l i e d i n s p e c t i o n ，t h em o d e lw a s v e r i f i e dt h a ti tr e f l e c t e dt h e o r e t i c a l l yt h ei n t r i n s i cp r i n c i p l e o np e nc1h y d r o l y s i sb yt r y p s i n t h eo p t i m u mh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fp e nc1a l e a sf o l l o w s ：p h = 8 1 2 ，t = 4 3 3 c ，e ：s = 4 3u gf o ro d k e yw o r d s ：s h r i m p ，a l l e r g e n ，i d e n t i f i c a t i o n ，p r o p e r t i e s 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ! 壁! 麴逡查墓丝孟塞挂别座明的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：毒晦鼓 签字目期： 万年霸辫日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：3 砘殳 签字日期： 0 辟s 月w 日 字：林芎 签字日期：毋年r 碉乏鹭 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 o 引言 o 1 食物过敏原的概况 0 1 1 食物过敏的流行病学 随着社会进步和全球化进程的不断发展，过敏疾病的发病率越来越高，全 世界约有3 0 - - 4 0 的人们患有各种各样的过敏疾病，且发病率和死亡率呈逐年 上升趋势【1 1 ，过敏疾病被世界卫生组织( w h o ) 认定为当今世界性的重大卫生问题 之一。流行病学的调查资料显示，在西方发达国家，有2 5 的成年人和6 8 的儿童会对某些食物过敏【2 】。美国有6 0 0 万- - , 7 0 0 万的过敏患者，每年平均有 1 0 0 , - - 1 2 5 例因食物过敏而致死的病例，在这些引起过敏的食物中，海产品是其中 重要的一类【3 4 l ，近十年来，英国过敏疾病的发病率成倍地增长，而其中主要是食 物过敏1 5 1 。中国疾病控制中心营养与食品安全所的调查数据显示，在1 5 2 4 岁年 龄段的健康人群中，约有6 的人曾患有食物过敏疾病 6 1 。小范围调查表明，在北 京、广州及胜利油田，居民食物过敏的发生率为3 4 5 0 1 7 1 。有关食用或加工 海产品导致过敏的报道层出不穷隆1 3 1 。 近年来，人们生活方式的改变、饮食环境的极度拓宽、特别是食品种类的增 多，致使与食物过敏直接相关的过敏疾病发病率日益增高，而且过敏疾病的症状 亦趋于多样化、复杂化和严重化f 。世界范围内的调查显示，食物过敏日益严重 地威胁着人类的健康，甚至对人类生命安全造成极大的危害【1 5 7 1 。食物过敏已 经成为严重的食品安全问题之一，食物潜在的过敏活性已经成为急需研究的新课 题【1 8 】。 o 1 2 食物过敏原 联合国粮农组织第2 3 次会议公布了常见过敏食物的清单，包括8 种常见的和 1 6 0 种不常见的过敏食物。临床数据显示，9 0 以上的过敏反应由这8 类高过敏活 性的食物引起，这些食物包括：蛋类及其制品、鱼及其制品、甲壳类( 主要是虾、 蟹、龙虾等) 、奶制品、花生及其制品、大豆及其制品、坚果( 杏、板栗、腰果 等) 和小麦及其制品【1 9 之1 1 。表0 1 列出了8 种常见的过敏食物及过敏原，可以看出 这些食物的过敏原均为蛋白质。 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s 括) 主要过敏原的鉴定及性质研究 表0 1 常见八大类食物过敏原1 2 2 l t a b l e o - 1a l l e r g e n sf r o mc o m m o nf o o d s 过敏原的权威命名l z 3 j 规则是，过敏原名称根据来源物的分类学名来命名。由 这几部分依次构成：属名的前3 个字母，空格；种名的第1 个字母，空格；阿拉伯 数字，这个数字是根据被鉴定的顺序而定。例如p e nal 表示p e n a e u sa z t e c u s 虾的 过敏原，是第一个被鉴定出的过敏原。若某一过敏原存在同源过敏原，同源过敏 原存在变种时，则要对阿拉伯数字进行扩展。另外，有几种过敏原的来源物的 名称相近，在命名的时候为了加以区分，属名和种名分别用了不止3 个或1 个字母。 这些食物过敏原存在以下几个特点： 2 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 ( 1 ) 食物过敏原一般都是食物中的糖蛋白，分子量在1 0 - - 7 0k d 范围内，其等电 点大多小于7 。 一 ( 2 ) 食物中的成分多种多样，但能引起患者过敏反应的通常只有一种或几种蛋 白质，其中能与5 0 以上的过敏患者血清发生明显反应的食物过敏原为主要过敏 原，除此之外的都是次要过敏原f 2 4 1 。 ( 3 ) 大多数食物都可引起过敏疾病，过敏食物会因年龄的不同而有较大的差异。 儿童常见的过敏食物有牛奶、鸡蛋、大豆等，而海产品是诱发成人过敏疾病的主 要过敏食物2 卯。 ( 4 ) 食物过敏原具有可变性，适当的理化及生物学方法可以使得一些食物过敏 原的过敏活性降低。 ( 5 ) 食物过敏原之间存在交叉反应，许多过敏原有共同的抗原表位，导致过敏 时存在强烈的交叉反应的现象【2 6 1 。 。 o 1 3 食物过敏的致病机理 根据过敏反应发生的速度、发病机制和临床特征可将过敏反应可分为i ，i i ， h i 和i v 型。i 型是免疫球蛋白e 介导的超敏反应；i i 型即细胞毒性超敏反应； i 型即免疫复合型超敏反应；型即t 细胞介导的迟发性超敏反应。目前从广 义的角度，食物过敏可分为i g e 介导和非i 班介导两大类【2 7 1 。食物过敏是一个 非常复杂的反应过程【2 8 1 ，临床数据表明，9 0 以上的食物过敏属于i 型过敏反应 【2 9 】，图o 1 详细说明了i 型过敏反应的过程。 。 食物过敏原第一次进入人体 、 县 。蹶附础二、嗜凛蝴脓面舭肝嫩糨 i g e 吸附在肥大细胞、嗜碱性粒细脓面机雄处于致敏状态 罗 艄瞵献 | n 组肢、缓激肽、5 鑫麓搜、自三烯，慢反应物质等血管活性物质 日 ， 8弋 图o 1 过敏反应的机理 f i g 0 1i n d u c t i o na n dp r o v o c a t i o no fa n a l l e r g i cr e a c t i o n 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 i 型超敏反应包括致敏和发敏两个阶段，一定量的过敏原可诱导易感个体产 生足够量的i g e ，i g e 通过血循环分布全身，并与肥大细胞( m a s tc e l l ，m c ) 、嗜碱 性粒细胞( b a s o p h i l ，b a s ) 膜表面特定的受体结合，从而使机体处于致敏状态。当再 次接触含相同或相似过敏原成分的食品时，过敏原分子特异性识别致敏细胞膜表 面的i g e ，诱导细胞脱颗粒释放组胺、前列腺素和白三烯、5 羟色胺和缓激肽等 炎症介质【3 0 川。这些介质导致的生物效应是平滑肌痉挛，毛细血管扩张及通透性 增加，腺体分泌亢进等，进而出现一些我们常见的食物过敏症状【3 2 3 4 】。 0 1 4 食物过敏原的鉴定 要判断种食物中的蛋白质是否为过敏原有多种方法，按体内外来分，体内 实验包括双盲对照食物激发实验( d o u b l e b l i n d e d ，p l a c e b o c o n t r o l l e df o o d c h a l l e n g e s ，d b p c f c ) 和皮肤试验( s k i np r i c kt e s t i n g ，s p t ) 。利用体外实验鉴定和 评价食品过敏原活性，比体内实验更安全且符合伦理。目前，体外实验主要应用 组胺释放( h i s t m a i n er e l e a s i n ge t s t ，h r t ) 实验和i 啦测定两种方法。 0 1 4 1 双盲对照食物激发实验 m a y 等最早报道了 d b p c f c 方法1 3 5 1 ，欧洲变态反应和临床免疫学会评定 d b p c f c 为食物过敏反应诊断的标准方法f 3 6 】。d b p c f c 实验中最重要的是控制双 盲、实验剂量和安慰剂，要求媒介物能掩盖被检食物的味道、质地及气味，并尽 可能消除被检食物与安慰剂的细微差别，这样可能限制了食物的实验剂量，通过 分离提取食物过敏原中的有效成份作为激发物可弥补这一缺点，d a u l 等【3 7 1 将相当 - ：5 0 0 9 虾中的1 2 8 种被检测等价物成功进行了伪装。 双盲实验被称为食品致敏原鉴定的“金标准 ，但其结果受众多因素影响， 甚至包括心理反应而出现自发性症状。并且实践中也不易操作，实验剂量、安慰 剂及双盲控制等环节还有待完善。 o 1 4 2 皮肤试验 s p t 是将抗原点入过敏患者的真皮，若是过敏原，则抗原与组织中肥大细胞 表面相应的i g e 结合，在短时间内，可引起组织胺等活性物质的释放，使受试部 位皮肤产生风团、红晕反应及骚痒感。s p t 在过敏诊断中的应用极为普遍，也是 食物过敏原鉴定的一个较为合理方法【3 8 1 。s p t 的合理性在于小量过敏原经皮诱导 产生典型的皮肤反应如水泡和红斑，在一定浓度范围内，测量红斑或水泡面积来 4 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 定量过敏原活性f 3 9 , 4 0 l ，结果可用终点滴度( 即产生阴性反应的最大浓度) 或标准组 胺相当活性表示。m o n t ig 等【4 l 】研究 s p t 在遗传性过敏性皮炎婴幼儿对鸡蛋过 敏的诊断价值，发现s p t 阳性率达1 0 0 ，经口激发过敏症状的阳性率为6 7 3 。 s p t 虽然简便易行，但往往需要多达数十点针刺，对试验者造成创伤和极大 痛苦。此外，病人必须在严格苛刻的条件下进行实验，如：皮肤完整、未使用对 皮肤反应有极大影响的药物，实验物质必须保证除了过敏原特性外而不具传染性 及毒性。皮试结果有时与病史并不完全一致，皮试阳性可能不出现症状；相反， 一些阴性结果却出现过敏症状。因此s p t 在实际应用中，受到很大的限制且阳性 率偏高。 0 1 4 3 组胺释放实验 过敏原激发致敏的靶细胞，引起细胞释放组胺，组胺含量可应用荧光测定、 放射免疫等方法测定，与适宜参照进行比较，确定组胺释放率阳性标准，从而进 行过敏原活性测定及鉴定的一类方法。通常用抗i g e 抗体作阳性参照，以样品介 质为阴性参照，以排除实验过程中组胺的非特异性释放。此外，某些待测过敏原 或提取物本身含有组胺，并且待检过敏原或其共存物可能具有靶细胞毒性，引起 组胺非特异释放，因此，必须设样品对照及非致敏靶细胞对照。为了排除生物胺 如尸胺、腐胺对荧光法测定组胺的干扰，有报道利用玻璃纤维包被的微量滴定板 ( g l a s s f i b r e c o a t e d m i c r o t i t e 叩l a t e ) 来分离组胺与干扰成分【4 2 ，4 3 1 。 由于组胺测定必须在抽血后2 4 h 内测定，造成该技术应用于食物过敏原检测 与评价有一定局限性。与此同时，体外细胞组胺释放的影响因素较为复杂，且组 胺测定方法也较为繁琐，因此该方法仍未推广应用。 o 1 4 4i g e 检测 过敏原与i g e 结合是过敏原发挥生物活性的中心环节，因此测定过敏原特异 性i g e 在过敏症诊断及过敏原评价中具有重要地位。其中最为常用方法就是免疫 印迹实验( w e s t e r nb l o t t i n g ) 和酶联免疫吸附实验( e l i s a ) 。 免疫印迹实验是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项 食物过敏原的鉴定技术。它将s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反 应的特异性相结合，典型的印迹实验包括三个步骤：过敏食物总蛋白的电泳分离； 将电泳后凝胶上的蛋白质条带经电转移，移至硝酸纤维素膜上：将印有蛋白质条 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 带的硝酸纤维素膜( 相当于包被了抗原的固相载体) 依次与i g e 抗体和酶标第二 抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使过敏原的区带染色。深 圳大学的李荔等通过免疫印迹鉴定得出缢蛏主要过敏原为5 8k d 的蛋白【4 4 1 。这种 方法灵敏度很高、结果直观而且使用成本较低，因此别广泛应用于各种食物过敏 原的鉴定。 2 0 世纪9 0 年代末期e l i s a 技术发展迅速，加以全自动酶标分析仪的应用，使 e l i s a 的特异性和灵敏度有了很大的提高。e l i s a 的特点是抗原或抗体的固相 化和酶标记，在目前最常用的e l i s a 中，抗体要结合在固相载体的表面与过敏 原( 抗原) 反应。抗体和过敏原反应后用另外一种用酶标记的抗体( - - 抗) 来检测已 经通过抗原抗体反应结合在固相载体表面的过敏原。e l i s a 已经成为一种系列化 的快速鉴定方法，是目前应用广泛的过敏原鉴定技术之一。 此外，p c r 分析、过敏原指纹图谱以及生物信息学评价技术也开始应用 于食物过敏原的初步鉴定。 o 2 过敏原的| 生质研究 0 2 1 过敏原糖链的研究 0 2 1 1 糖链的类型及分析 食物中尤其是海产品中的过敏原大多都是糖蛋白，糖蛋白( g l y c o p r o t e i n ) 是指 由比较短，往往带分支的寡糖与多肽链某些特殊部位的羟基或酰氨基共价连接而 成的一类结合蛋白质。研究者们发现糖链结构有很多共同形状，图0 - 2 表明了o 连接和n 一连接的糖链结构。 n 糖链( n g l y c a n ) 1 4 6 1 ，是以n 一乙酰萄葡糖胺与多肽链q b a s n - x s e r 门阻共有序 列( s e g u o n ，称为天冬酰胺顺序子) ，处于顺序子中的a s n 更容易发生糖基化，这可 能是因为顺序子中t h r 和s e r 的轻基与a s n 俱l j 链的拨基形成氢键，从而产生有利于 糖基化的构象，天冬酰胺顺序子不仅与糖基化有关，可能对糖链的组成与长短也 有控制作用。顺序子中的x 为极性氨基酸时，常生成复杂型寡糖链；x 为非极性 氨基酸时常形成单纯型寡糖链。o 一糖链( o - g l y c a n ) ，是通过n 一乙酰半乳糖胺 ( g a l n a c ) 与肽链的s e r t h r h y l ( 羟赖氨酸) g l y ( 羟脯氨酸) + h d 残基相联接。这类糖 类结构共同点是由一种或少数几种单糖与某些含羟基氨基酸连接，不存在共有的 核心结构。 6 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 l 连接的艳链： 卜l 缸 a s 日( i l c n c g l c n a c m a n ：m a n - - m ；，a i m a n - ( i i c n a c x 。 g 1 c n c t 、j i n i 1 1 磁溜e r i 奄噶毒 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 o 2 1 2 糖链对过敏活性的影响 目前，对糖链在引发过敏反应中作用的结论还不完全一致。t r e t t e r 等人发现 菠萝蛋白酶和磷脂酶连接在天冬酰胺上的n 乙酰氨基葡萄糖是i g e 识别的重要表 位【4 9 】。s a n d r aw e s t p h a l 等人用两步f p l c ( 快蛋白液相色谱) 方法从番茄中提取出 一个糖基化的番茄过敏原l y ce2 ，将其两种异构体的e d n a 克隆并在细菌中表达。 重组蛋白和原蛋白的i g e 反应活性用对番茄过敏的患者的血清进行检验，发现 与天然l y ee2 结合的i 醇完全受到菠萝蛋白酶糖基肽m u x f 的抑制，相应地非 糖基化重组蛋白的异构体不能与番茄过敏的病人血清i g e 结合，这说明该天然蛋 白的过敏活性主要依赖多糖f 删。 并非含有糖基的过敏原其过敏活性就依赖糖链，大豆中的过敏原d 伴大豆球 蛋白糖蛋白，对p 伴大豆球蛋白水解后的肽段进行免疫印迹实验，却发现与i g e 结合的肽段并非糖肽，由此认为糖链不是与i g e 连接的必要条件。c a l a b o z o t 5 2 】 采用定性( 点印迹) 检测，无法区分糖链在过敏反应中的作用，因为i g e 也与脱糖基 的肽段反应。因此，认为糖链在过敏反应中的作用很小。 可见，目前对糖链在过敏原活性的重要性方面有着不同的结论和观点。由此， 研究者们将注意力集中到糖链对过敏活性的影响上。 0 2 2 生物信息学在过敏原研究中的应用 生物信息学是一门新兴的、并处于初级发展阶段的研究生物系统种信息现象 的科学，它是多学科的交叉的产物，涉及生物、数学、物理、计算机科学等多个 领域旧。 生物信息学针对蛋白质序列的分析，可以预测出蛋白质的许多理化特性，包 括等电点分子量、疏水性、修饰位点等以及蛋白质二级结构预测，三维结构预测 等。过敏原的基础理化性质的研究对过敏原性的评价具有主要的意义，例如过敏 原抗原决定簇就是以疏水性分析为基础。随着过敏原以及相关数据的快速增加， 生物信息学在过敏原研究中的重要性越发凸显。 0 2 2 1 过敏原同源性分析 生物信息学中的相似性分析是一种最简单快捷的过敏性预测方法，用来比较 基因的表达产物是否同已知的过敏原具有同源性，并且同源性越高就越易引起过 敏原之间的交叉反应。f a s t a 和b l a s t 是最常用序列相似性比较的工具，二者 8 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 都采用局部比对策略，功能基本相同。目前已知变应原的氨基酸序列都被变应原 数据库收录( 表o 一2 中列出了现有过敏原数据库以及网址) ，过敏原的同源性分析主 要是以这些数据库联合检索的过敏原序列为基础进行的。 表0 - 2 过敏原数据库1 table0 - 2a l l e r g e nd a t a b a s e 数据库网址 国际免疫学会联合会h t t p ：i w w w ，a l l e r g e n o r g a i l e r g o m e 变应原相关数据库 过敏相关基因数据库 食物变应原相关数据库 p r o t a l l 英国食品变应原数据库 食品安全相关数据库 蛋白质序列数据库的变应原数据 i n f o r m a l l 欧盟关于食品变应原的数据库 英国变应原数据库 a l l e r m a t c h 荷兰变应原数据库以及分析工具 国际免疫遗传学信息系统 a l l a i l e r g y 关于过敏( 变态) 反应数据库网站 h t t p ：i l w w w a l l e r g o m e o r g h t t p ：f e r m i u t m b e d u s d a p h t t p ：a l l e r g e n o n l i n e c o i n h t t p ：w w w i f r b b s r c a c u k p r o t a l l h t t p ：w w w i i t e d u - - 。s g e n d e l f a h t m h t t p ：w w w c a e x p a s y o r g s p r o t h t t p ：w w w f o o d a l l e r g e n s i n f o h t t p ：w w w c s l g o v u k a l l e r g e r g h t t p ：w w w a l l e r m a t c h o r g h t t p ：i m g t c i n e s f r h t t p ：a l l a l l e r g y n e t o 2 2 2 过敏原抗原表位的预测 抗原决定簇的预测自从8 0 年代就已经被提出，根据过敏原的免疫原性与结构 特性关系，主要根据下面几个条件：亲水特性、两亲性、分子运动性、表面可及 性、序列多变性、肽链的末端。预测过敏原抗原决定簇一般以上述多种方案综合 考虑，尤其以表面可及性、多变性、两亲性及两亲性预测为重要。概括而言，作 为蛋白抗原的表位首先应位于或移动于过敏原表面，有利于与抗原受体或抗体结 合，另外要有一定柔韧性，因为抗原与抗原受体或抗体结合有一个嵌合的过程。 0 2 2 3 过敏原活性评价 生物信息学能快速对蛋白的过敏性做出评价，主要是通过对过敏原的同源 性进行预测。联合国粮农组织及世界卫生组织( f a o w h o ) 、国际生命科学研究 9 中国对虾( p e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 所( i l s i ) 制定了一系列关于蛋白致敏性评价的标准f 5 s ，5 6 1 。 ll 是l孬1 0 图0 3f a o w h o 食品过敏原评价树状结构 f i g 0 - 3e v a l u a t i o no f f o o da l l e r g e nf r o mf a o w h o 这个标准包括传统生物学以及生物信息学的测试。生物信息学部分过敏性 的判定标准包括以下两个标准：至少有6 个连续的氨基酸与已知变应原相同，或 者在长度为8 0 个氨基酸的窗口中同过敏蛋白的同源性在3 5 以_ l 1 5 7 5 9 1 。 生物信息学技术具有快速高效的特点，是更深入研究有过敏原的重要工具， 并且已在一些过敏评价中发挥重要作用。用生物信息学方法来评价过敏活性的缺 点是其仅为一种理论上的预测，因此还需要传统生物学的辅助，并同其它的免疫 学实验方法结合起来才能进一步给出准确的评价。 o 3 海产品过敏原研究现状 0 3 1 海产品过敏原 海产品及其制品是人们日常生活中重要的动物蛋白质来源，同时也是引起过 敏性反应的常见食物。中国预防医学科学院食品营养与安全中心的调查显示海产 品是我国最重要的食物过敏原之_ 1 6 0 l 。近年来，海产品过敏蛋白的识别和对这些 过敏原的性质研究取得了重大的进展。 1 0 中国对虾b o e n a e u sc h i n e n s i s ) 主要过敏原的鉴定及性质研究 0 3 1 1 虾过敏原 二十世纪八十年代，国外就有学者发现虾中存在过敏原。自1 9 8 1 年，h o f f r n a n 等人【6 1 j 最先报道了棕虾( p e n a e u sa z t e c u s ) 中分子量为3 6 k d 的蛋白质是引起过敏 反应的过敏原以来，免疫学、临床医学和食品生物化学方面的研究人员对虾过敏 蛋白进行了不懈努力的研究。 d a u l 等人【6 2 j 利用虾过敏患者血清中的i g e 抗体能够与过敏原相结合的特性， 研究了了虾蛋白质各种成分的抗原性，发现分子量为3 6 k d 的蛋白质是棕虾唯一 的主要过敏原。随着技术的进步，其它不同品种的虾过敏原也相继被鉴定， h a l m e p u r o l l 6 3 】等人首先报道了龙虾( p a n u l i r u ss t i m p s o n i ) 的主要过敏原并命名为 p a nsl ：s h a n t i 等人l 删鉴定了印度对虾( p e n a e u si n d i c u s ) 主要过敏原；l e u n g 等人 1 6 5 1 从刀额新对虾( m e t a p e n a e u se n s i s ) 中分离其主要过敏原；我国学者赖荷等人i 鲫 鉴定了中国罗氏虾( m a c r o b r a c h i u mr o s e n b e r g i i ) 的主要过敏原；中国海洋大学的李 振兴等人【6 7 】鉴定了凡纳滨x e i 虾( p e n a e u sv a n m a m e i ) 、克氏螯虾( p e n a e u sc l a r k i 0 和 口虾蛄( s q u i l l ao r a t o r i a ) 这三种虾的主要过敏原；暨南大学的张在军等人【6 8 】分离 纯化了河虾( m a c r o b r a c h i u mn i p p o n e n s i s ) 中的主要过敏原。 在深入研究不同品种的虾过敏原的性质时发现【6 9 1 ，不同品种的虾的主要过敏 原均为分子量3 6 k d 组分，其氨基酸的顺序、组成极其相似。进一步的研究发现， 这些主要过敏原为肌肉中的原肌球蛋白。这种蛋白质存在于肌原纤维中，和肌钙 蛋白一起，结合在f 肌动蛋白上，形成细丝。酸性糖蛋白，等电点在4 5 左右， 其糖基的含量约为4 0 ，在氨基酸的组成上欠缺色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸含量 少。后来人们发现了一种热稳定的过敏原，经检测发现为t r n a 7 0 1 ，但其他的研 究者没有得到重复的结果，还有待进一步证实。 与此同时，科研工作者们选取棕虾为研究对象，在其主要过敏原p e na1 抗原 表位的研究上做出了不懈的努力。s h a n t i 等人【7 l 】首先利用过敏患者的血清和对照 血清发现了两个棕虾主要过敏原的抗原表位，它们分别是9 个( 5 0 6 6 ) 和6 个 ( 1 5 3 1 6 1 ) 氨基酸残基片断，超过5 0 的虾过敏患者的血清能够与这两个肽段 发生反应。为了更好的了解棕虾过敏原的抗原表位，a y u s o 等人【7 2 ，7 3 j 用3 6 段有重 复序列的多肽，他