（食品科学专业论文）麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究.pdf

麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究 摘要 小麦在我国是重要的粮食作物，在深加工方面的重要途径是生产小麦淀粉和谷 朊粉等。近年来，由于谷朊粉的产量不断增加，传统的市场趋于饱和。从普通小麦 中提取麦醇溶蛋白和麦谷蛋白，应用于食品及非食品方面的深加工，在世界范围引 起极大的关注。根据谷朊粉及麦谷蛋白有着特殊的氨基酸组成即高谷氨酰胺含量， 所以本文以提取的麦谷蛋白为酶解底物生产谷氨酰胺肽并进行动物实验验证其营 养效果。 1 以谷朊粉为原料，运用正交组合设计对麦谷蛋白的提取工艺进行了优化研 究。经单因素及正交试验得出提取麦谷蛋白的最佳条件为p h 值1 2 ，料液比1 ：2 0 ， 时间1 h 。并且经柱层析及d s c 分析证明了提取的麦谷蛋白产品具有很高的纯度， 并分析了麦谷蛋白的变性温度为6 7 4 1 2 以麦谷蛋白为酶解底物，以酶解物谷氨酰胺肽的含量为指标，从三种商业蛋 白酶中筛选出胰蛋白酶和碱性蛋白酶进行双酶分步酶解，制备谷氨酰胺肽。确定了 g i n 活性肽的水解用酶为胰蛋白酶和碱性蛋白酶。通过两次酶解工艺制备g i n 活性 肽，最佳的酶解组合是先用胰蛋白酶提高蛋白的溶解度，然后碱性蛋白短时间内酶 解从而达到最佳的酶解效果，结合s a s 软件分析结果表明胰蛋白酶酶解条件温度 4 7 6 ，底物浓度2 7 9 ，酶与底物质量比1 3 m g g 。碱性蛋白酶的条件温度6 8 、 底物浓度3 、酶与底物质量比3 0 i _ d g 、p h 8 0 、和反应时间1 5 h 。酶解液通过透析 ( 1 0 0 0 0 以下) 后产品有效g i n 为2 1 3 5 m g g 。 3 经凝胶层析的方法对谷氨酰胺肽进行了分离和纯化，通过g p c 分析了各组分 的分子量的分布，通过高效液相和质谱分析表明：经凝胶柱分离的单一组分仍然是 由分子量不同的许多肽组成的混合物，其分子量主要分布在1 0 0 0 8 0 0 d 左右。质谱 分析组分得到一级和二级质谱图，并根据一级和二级质谱图分析多肽的氨基酸组 成。 4 用氨甲蝶呤诱发小肠炎后，分别饲喂g i n 含量不等的氨基酸营养液，结果表明， 氨甲蝶呤诱发的小肠炎是一种较严重的应激状态，在7 2 h 内，空白组大鼠的死亡率为 4 2 9 9 6 ，对照组的死亡率为1 6 7 ，其它测定指标也相对低于低剂量和高剂量组，并且 低剂量和高剂量组死亡率为零，酶活、d n a 和r n a 含量增加，这说明，谷胺酰胺活 性肽营养液对小肠具有明显的营养作用。 关键词 麦谷蛋白；谷氨酰胺肽；酶解；免疫活性 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 a b s t r a c t e x t r a c t i o np r o c e s so fg l u t e n i nf r o mw h e a tg l u t e nw a so p t i m i z e db ym e a n so ft h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g ni nt h i sp a p e r m o n i t o r e db yy i e l d so fg l n ，t h ea l k a l ip r o t e i n a s e w a ss e l e c t e df r o mt h r e ec o m m e r c i a lp r o t e i n a s e sa n du s e df o re n z y m o l y s i st op r o d u c et h e a c t i v eg l u t a m i n ep e p t i d e sm a d ef r o mg l u t e n i nb yt w ot i m e so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s ； t h eg e lc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dw a su s e df o rt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，t h eg p c w a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t s ，h p l c - m sw a su s e dt o p r e l i m i n a r i l ya n a l y z et h ep r o d u c ts t r u c t u r e ，a n dt h es m a l li n t e s t i n eo fr a t sw a ss e l e c t e d t ot e s ta c t i v i t yi na n i m a li nv i v o t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fg l u t e n i nf r o mw h e a tg l u t e na n dp h y s i c c h e m i c a l p r o p e r t i e sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o r s e p a r a t i n gg l u t e n i nf r o mt h ew h e a tg l u t e nw e r ea sf o l l o w s ：p i l l2 ，m a t e r i a l s o l v e n tr a t i o 1 ：2 0a n de x t r a c t i o nt i m el h t h es e q u e n c eo fi m p o r t a n c ef o rt h ep r o d u c ty i e l d sw a s g l u t e na n de x t r a c t i o nt i m e ，g l u t e n s o l v e n tr a t i oa n dp h ，a n dt h ey i e l do f2 5 5 c a nb e o b t a i n e du n d e rs u c hc o n d i t i o n s d s ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ep e a kd e n a t u r a t i o n t e m p e r a t u r ew a s6 7 41 2 t h ep a p e rc o n f i r m se n z y m ef o rg i na c t i v ep e p t i d eh y d r o l i z a t i o n ，t r y p s i n a s e ， a l k a l i n ep r o t e i n a s e ，a n do p t i m i z a t i o ne n z y m o l y s i sc o n d i t i o ni nt h ed u r a t i o n g i na c t i v e p e p t i d ew a sp r e p a r e dt h r o u g ht w ot i m e se n z y m o l y s i st e c h n o l o g y t r y p s i n a s ew a ss e l e c t e d f o re n z y m o l y s i sb yt h em e t h o do fr e s p o n s es u r f a c et op r o d u c eg i na c t i v ep e p t i d e s t h e r e q u i r e m e n to f 时p s i n a s e i st h a tc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ei s 2 7 9 ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o ni s7 3 m g ，p h 8 0 ，t e m p e r a t u r ei s4 7 6 c ，a n dr e a c t i o nt i m ei s2h o u r s t h e r e q u i r e m e n to fa l k a l i n ep r o t e i n a s ei st h a tc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ei s3 ，e n z y m e c o n c e n t r a t i o ni s3 ，p h 8 0 ，t e m p e r a t u r ei s6 8 ( 2 ，a n dr e a c t i o nt i m ei s1 5h o u r s t h e c o n c e n t r a t i o no fe f f e c t i v eg i ni s2 13 5 m g ga f t e re n z y m o l y s i ss o l u t i o n 3 g l u t a m i n e p e p t i d e s w e r e s e p a r a t e d a n dp u r i f i e d b y t h em e t h o do f g e l c h r o m a t o g r a p h y , a n dt h ed i s t r i b u t i o n so fm o l e c u l a rw e i g h t so fd i f f e r e n tc o m p o n e n t sw e r e a n a l y z e db yg p c c o m p o n e n ti vw e r ea n a l y z e db yh p l c - m sa n dt h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h es i n g l ec o m p o n e n ts e p a r a t e df r o mg e lc o l u m nw a st h em i x t u r eo fp e p t i d e so f 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究 d i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t s ，a n di t sm o l e c u l a rw e i g h t sw e r em a i n l yd i s t r i b u t e di nt h e 4 a d m i n i s t r a t i o no fm e t h o t r e x a t et 0r a t sc a u s e ds e v e r ee n t e r o c o l i t i sw i t h4 2 9 a n d 16 7 m o r t a l i t i e sw i t hi n7 2h o u r si nt h ef i r s tg r o u p ( b l a n kg r o u p ) a n dt h es e c o n dg r o u p r e s p e c t i v e l y ( c o n t r o lg r o u p ) b u tt h es u c r a s ea n da m i n o p e p t i d a s ea c t i v i t i e s ，d n aa n d r n ac o n t e n t so fs m a l li n t e s t i n ei nr a t so fl o w - d o s eg r o u pa n dh i g hd o s eg r o u pw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo fg r o u p1 a n dg r o u p2 t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a t g l u t a m i n e b i o a c t i v ep e p t i d ee n h a n c e dd i g e s t i o np r o c e s s e s k e yw o r d s g l u t e n i n ；g l u t a m i n ep e p t i d e ；e n z y m o l y s i s ；i m m u n o c o m p e t e n c e i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 奄。 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 毗妊刁丧嵌 帆川年月，7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者始可左秀(锄始勿锄吐 签名日期山艿孑年月- 签名日期留年6 月l 孑日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制各和肠道营养效果研究 第一部分前言 小麦( t r y t i c u ma e s t i v u m ) 白花授粉禾本科小麦属的重要栽培谷物。一年生 或越年生草本，主要分布于亚洲西部和欧洲南部。小麦是一种温带长日照植物，适 应范围较广，自北纬1 8 0 - 5 0 0 ，从平原到海拔4 0 0 0 米的高度( 如中国西藏) 均有 栽培，且居于栽培谷物的首位。普通小麦种植最广，占全世界小麦总面积的9 0 以 上；硬粒小麦的播种面积约为总面积的6 - - 7 。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿 物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸及维生素a 等。因品种和环境条件不同，营 养成分的差别较大。从蛋白质的含量看，生长在大陆性干旱气候区的麦粒质硬而透 明，含蛋白质较高，达1 4 - - - 2 0 ，面筋强而有弹性，适宜烤面包；生于潮湿条件下 的麦粒含蛋白质8 1 0 ，麦粒软，面筋差。小麦面粉除供人类食用外，还用来生 产淀粉、酒精、面筋等。我国在小麦深；b n - r 方面的重要途径是生产小麦淀粉和谷朊 粉等。近年来，由于谷朊粉的产量不断增加，传统的市场趋于饱和，面筋独特的粘 弹性、延伸性和吸脂乳化性和薄膜成型性等性质。并且其可降解、可再生的环境保 护方面的优点，从普通小麦中提取醇溶蛋白和谷蛋白，在食品和非食品方面的深加 工也在世界范围内引起极大的关注。 谷朊粉的主要的成分依照o b o m e 的命名和分类，小麦的储藏蛋白主要分为麦醇 溶蛋白和麦谷蛋白，约占总蛋白的8 0 。两者的氨基酸组成相近，都是富含谷氨酸 和脯氨酸的蛋白质。从小麦氨基酸的组成来看，小麦蛋白中g l x 约占氨基酸总含量 的3 5 ，其次是脯氨酸，约占1 6 。而碱性氨基酸含量较少。而谷氨酰胺是动物血 浆和组织中含量最丰富的游离氨基酸，约占总游离氨基酸的4 0 - - - , 6 0 。谷氨酰胺 是一种十分重要的具有特殊营养作用的条件性必需氨基酸及肠道必须氨基酸。由于 g i n 在水中的溶解度低，在水溶液中不稳定，对酸敏感，在加热灭菌的条件下会生 成有毒的焦谷氨酸和氨等原因，使g i n 在肠内、肠外或经口营养的营养生理功能不 能得到全面的体现。而蛋白质经水解制得的肽有比蛋白质更好的营养性能，实验证 实肽的吸收率比氨基酸高，更容易、更快通过小肠黏膜被人体吸收利用。 1 1 谷朊粉的研究进展 谷朊粉的研究进展：谷朊粉含有较多疏水性氨基酸，分子内疏水作用区域较大， 小麦蛋白的特殊氨基酸即还有较多的疏水性氨基酸和不带电荷的氨基酸，使得分子 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 内疏水作用大，溶解过程上为墒减的过程，致使谷朊粉溶解度降低，在乳化性、起 泡性等特性上并不能满足加工的需求。并且从我国小麦的实际情况和专用粉的生产 要求来看，国产小麦很难加工出达到专用粉要求的高质量面粉，难以生产出符合要 求的各种专用粉和高质量的面制品。因此使用化学( 化学试剂) ，物理( 湿热、微 波、高速剪切) 以及生物( 酶制剂) 的方法引起蛋白分子一级结构或者空间构象发 生变化，从而获得优良的加工特性和营养特性。 d r a g 等( 2 0 0 0 年) 采用真菌蛋白酶水解热处理过谷朊粉时发现，谷朊粉溶解 度随着水解度( d h ) 增加而增大，但起泡性在超出一定d h 范围时将被破坏。当水解 度适q b ( d h l 4 ) 时，不仅可使谷肮粉溶解度增大，且在p h 9 和p h 6 5 时，可获得较 高起泡性，从而扩大谷朊粉应用范围。 苏佩等( 1 9 9 3 年) 在小麦蛋白质组分的连续提取分离法及提取时间的选择研究中 按照清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的提取顺序。用0 5 的k o h 溶液提取谷 蛋白的得率3 2 3 4 。荣建华等( 2 0 0 6 年) 以中筋小麦粉为原料，对小麦中的醇溶 蛋白的提取条件研究的结果表明小麦醇溶蛋白的最佳的提取条件为：乙醇的质量分 数为6 5 ，搅拌1 h ，p h 值为6 2 ，得率为1 2 9 6 。司学芝等( 2 0 0 4 年) 对谷朊粉麦 醇溶蛋白和麦谷蛋白提取条件的研究中表明，摘要：以谷朊粉为原料，提取了麦谷 蛋白和麦醇溶蛋白结果表明，分离麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的最佳条件为：6 5 的乙 醇，液固比( 液体：谷朊粉) = 3 0 ：1 ，提取时间3 h ，影响产率的主次因素依次为：乙醇浓 度、液固比、提取时间。 随着蛋白质生物化学、生理学、营养学的发展，人们发现摄食蛋白质经消化酶 消化后，大多以小分子肽的形式吸收。并且研究发现食物蛋白质中蕴藏许多生物活 性肽，通过体内或体外蛋白酶水解的方式释放出来后除了提供所需的营养物质之外 能发挥如阵痛、具有免疫活性、调节激素或本身为激素肽、抗氧化以及呈味等生理 功能，并且活性肽具有良好的加工性能。其溶解度增大、粘度降低、凝胶性降低、 发泡性降低。小麦是人们获得蛋白质的重要来源之一。使用小麦蛋白作为原料提取 生物活性肽成为近年来研究的热点。小麦蛋白中g l u 、g i n 含量丰富，l e u 和t v r 含 量也较多，其中是快速分裂增殖细胞的主要能量来源，可促进淋巴细胞增殖，具有免 疫调节作用。 潘丽军等( 2 0 0 6 年) 采用中性蛋白酶在p h 6 5 和温度4 0 c 条件下对小麦面筋 蛋白的水解动力学机制进行了研究。结果表明：酶催化水解速率随水解进程呈指数 2 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道话养效果研究 递减。根据水解度及酶活力的变化规律，建立起描述中性蛋白酶催化水解小麦蛋白 的动力学方程。张锐昌等( 2 0 0 6 年) 以谷朊粉原料，采用胃蛋白酶对其水解并优化 得到最佳水解条件为温度3 7 c 底物浓度1 和加酶量1 5 0 0 u g ，此时水解度为7 8 ， 小麦肽的得率为5 5 9 5 。王金水等( 2 0 0 5 年) 的胰蛋白酶水解谷朊粉的酶解产物抗氧 化研究中发现小麦面筋蛋白经过胰蛋白酶水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能 力，并且在单因素试验的基础上运用响应面探讨了酶解产物抗氧化活性最高的最佳 水解条件，其重要性因素依次p h 酶解时间 酶浓度 反应温度。最佳的实验条件 为谷朊粉浓度5 、酶浓度 e s 2 9 m g g 、p i l l 0 5 、反应温度4 5 c 、反应时间2 7 h 。 张亚飞等( 2 0 0 6 年) 在小麦蛋白a l c a l a s e 水解物免疫活性肽的研究中发现所得 小麦肽混合物用离子交换树脂依据电荷进行初步分离获得4 个组分，经过小鼠体外 脾淋巴细胞增殖反应鉴定其免疫活性，结果表明p h 8 和p i l l 0 洗脱得到的组分对小 鼠脾细胞增殖具有较强的刺激作用，组分中可能含有对小鼠体外淋巴细胞增殖具有 刺激作用的活性肽，并且g i n 二肽克服了g i n 的缺点，并可被机体有效分解为氨基酸 而被利用且没有任何毒副作用和不良反应( 徐琪寿，1 9 9 7 ) 。 1 2 麦谷蛋白的研究进展 麦谷蛋白( t g 叫面筋蛋白) 与面团的弹性( 抗延伸性) 密切相关，它赋予了小麦粉 面团的粘弹性，决定着面筋强度，而醇溶蛋白赋予面团的流动性，决定着面筋的延 展度。麦谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋，当它们以一定的比例相结合时，才能赋予 面团特有的性质。麦谷蛋白中谷氨酸含量很高，约占蛋白总量3 5 ，且谷氨酸残基 在蛋白质中存在形式是谷氨酞胺，因此可用来制备富含谷氨酞胺活性肽营养液。谷 氨酞胺活性肽是生物体有效谷氨酰胺补充形式，小肽可被迅速水解为它们组成氨基 酸并被有效利用，没有观察到它们负作用。谷氨酸胺小肽含有取代q 一氨基，在贮 藏或加热灭菌时稳定，且使肽溶解性增加。将谷氨酞胺活性肚应用于特殊营养食品， 如饥饿、创伤等病人食品和运动食品及饮品中已成为一种趋势。 1 2 1 麦谷蛋白理化性质研究 麦谷蛋白分子为纤维状，以分支状方式高度交叉连接在一起，结构不规则，分 子内含1 3 一折叠结构较多，富含谷氨酰胺( g i n ) 和脯氨酸( c y s ) ，是由多肽键通过分 子间二硫键连接而成聚合体蛋白，其程度主要依赖于亚基之间二硫键形成聚合力大 华中农业大学2 0 0 8 届硕十学位论文 小。p a y n e 等( 1 9 8 3 年) 利用s d s p a g e 聚丙烯凝胶电泳对麦谷蛋白亚基进行较为 详细的研究。 当用还原剂处理时，麦谷蛋白分子会解离成大小不同两种类型，即高分子量麦谷 蛋白亚基h m w - g s 和低分子量麦谷蛋白亚基l m w - g s 。h m w - g s 相对分子质量为 9 l o 1 4 7 1 0 4 ，占麦谷蛋白9 0 ；l m w - g s 相对分子质量为1 2 x1 0 4 6 x l o ，占麦 谷蛋白1 0 以上( v e r a v e r b e k e 2 0 0 2 ) 。l m w - g s 富含谷氨酸和脯氨酸，通过二硫键 的交联形成蛋白网络。h m w - g s 通过一硫键末端相连形成面筋络合物的主干结构。 h m w - g s 与小麦品质关系密切，是目前研究最为广泛和深入的一组蛋白质。一般含 有6 3 0 8 3 0 个氨基酸，分子量为6 7 5 0 0 8 8 0 0 0 ，其肽链可以分为三段：由n 端和c 端 较短的非重复区域夹着较长的有重复序列的中间区域。非重复区域含有大量甚至全 部的半肽氨酸残基，其中一部分用于形成分子间二硫键以稳定高分子麦谷蛋白多聚 体。氨基酸序列以重复的六肽( p g q g q q ) 和( g y y p t s p l q q )串连和分散的形式组 成，另外少数的h m w - g s 是以三肽( g q q ) 为主要重复序列。陈军营等( 2 0 0 7 年) 在一级结构序列上还发现有2 3 2 个保守的氨基酸位点( 5 6 个单个氨基酸和一些长短 不同的氨基酸片段) ，较大的保守性氨基酸片段主要为a e g e a s q l q c e r h e l ，g s f y p g s e t r p q q l q q ，y y p g q a s f p s q q r p s g q g r q q ，p g q g q q p g a y y p t - s q q 等：分别有6 组共1 3 个序列相似度均达到l o o ，推测这些高分子量谷蛋白亚基 在进化上具有较强的保守性。麦谷蛋白在未加热情况下聚集程度较小，表现出弹性 行为，而在较大聚集程度下，表现出胶体性行为。在高于4 0 c - - - 5 0 c 温度下，较易 形成聚集程度较小状态，从而表现出粘性行为，而无胶体性行为出现。高温加热能 导致麦谷蛋白失去形成多孔性结构能力，结果使其结构变得更有可塑性，因此麦谷 蛋白流变学特性与其亚组分之间聚集程度有关( t s i a me ta l ，1 9 9 7 ) 。 1 2 2 麦谷蛋白酶解产物的研究 食物蛋白质中蕴藏许多生物活性肽，通过体内或体外蛋白酶水解的方式释放出 来后能发挥特定的生理功能( r o c h ae ta i ，2 0 0 3 ) 。z i o u d r o u 等( 1 9 7 9 年) 发现酪蛋白和 麦谷蛋白的胃蛋白酶酶解产物，其阿片活性同吗啡一样能被纳洛酮( 一种阿片拮抗剂) 所逆转，并且根据其来自外源性食物所以称为外源性阿片肽，简称外啡肽 ( e x o r p h i n e ) 。其具有传统意义上的镇痛作用还与心血管功能、呼吸功能、胃肠道运 动、免疫、垂体激素分泌、睡眠、记忆等有重要的意义。虽然z i o u d r o u 在实验中提 4 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究 示到麦谷蛋白大分子中可能隐藏阿片肽的序列。然纯品的阿片肽直到1 9 9 2 年才由 f u k u d o m e 等纯化制备出。杨得胜在对谷氨酰胺结合肽的高效制备，挑选对g l u 破坏 能力小的蛋白酶对谷朊粉进行类鸦片活性肽：源于小麦谷蛋白的胃蛋白酶及噬热菌 蛋白酶酶解物的肽序列有g l y - t y r t y r - p r o t h r 、g l y - t y r - t y r - p r o 、t y r - g l y g l y - p r o 、 t y r - g l y g l y p r o t r p 。 1 3 谷氨酰胺的研究进展 1 3 1 谷氨酰胺的生理作用 g i n 是组织间氮流动的重要载体；是蛋白质、氨基酸、核酸等生物大分子合成的 重要前体物质：是体内许多生化代谢途径的中间体，也是谷胱甘肽合成前体，并能 促进谷胱甘肽的合成从而调节内源性炎症的反应。在调解糖原解除氨毒，调节体内 酸碱平衡、维持体内环境稳定、防止代谢性酸中毒发挥重要作用。是快速增殖、分 化细胞如血管内皮细胞、淋巴细胞、肠黏膜上皮细胞、等主要能源物质( n e w s h o l m e e ta l ，2 0 0 3 ) 。在大脑中谷氨酰胺对谷氨酸和r 氨基丁酸平衡器重要作用，其含量与大 脑的兴奋与抑制态密切相关。在体内骨骼肌和肝脏为谷氨酰胺合成的重要场所，尤 其在酸中毒及饥饿的状态下向肾脏提供谷氨酰胺以缓冲酸的负荷。在机体受创时谷 氨酰胺起到节氮和促进机体恢复的作用，提高机体对感染的耐受性。 1 3 2 谷氨酰胺对肠道的作用 在正常生理状态下，肠道既不合成也不储存谷氨酰胺，肠粘膜细胞增生所需要 的大量谷氨酸胺来源于体内合成。谷氨酸胺是肠道黏膜上皮细胞的主要能源物质， 同时也是核酸合成的重要成分，因此谷氨酸胺更是维持肠道黏膜结构完整性所不可 缺少的特殊氨基酸( y o u n ge ta l ，2 0 0 3 ) 。 在严重创( 烧) 伤、放射损伤、器官移植、外科急重症等许多病理情况下，机体 对g i n 的需求增加，但由于合成不足，造成机体g i n 缺乏。肠腔中存在大量细菌及 内毒素可因此侵入肠系膜淋巴结、内脏器官及体循环，引起肠源性感染。其结果将 导致肠黏膜屏障受损，细菌、内毒素移位，进而引发肠源性感染和失控性炎症反应 ( 蒋朱明和曹金铎，2 0 0 2 ) ，严重影响肠粘膜的完整结构。同时机体长时间处于高 分解代谢状态，机体对谷氨酸胺的消耗大大增加，而体内的合成远远不能满足需要， 华中农业人学2 0 0 8 届硕士学位论文 出现谷氨酸胺的严重缺乏，需及时足量补充外源性谷氨酰胺( 张小平和夏萍，2 0 0 5 ) 。 因此，谷氨酸胺制剂对防治肠薪膜损伤、维护肠薪膜屏障的完整性以及防治肠源性 感染具有重要意义。大鼠腹腔内大剂量化疗后，应用含g i n 二肽的t p n 能明显改善 大鼠肝功能，减轻肝细胞超微结构的损害，并能维持小肠粘膜结构的完整性，这些作 用与g i n 促进g s h 的合成有一定的关系。研究结果对预防肿瘤病人的化疗并发症 有重要意义( 夏加增和吴肇汉，1 9 9 7 ) 。 1 4 蛋白酶的研究 碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶虽然执行着相同的反应一将蛋白水解分解成 分子量较小的多肽类，虽然在水解蛋白方面有着相同的作用机制，但来源及专一性 有着明显的不同，胰蛋白酶和胃蛋白酶为动物蛋白酶，诺维信公司出品的碱性蛋白 酶为微生物来源蛋白酶。胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类，裂解碱性氨基酸a r g 和l y s 羰基侧链；胃蛋白酶要求切点两端有芳香族氨基酸；枯草杆菌碱性蛋白酶要求切点 的竣基侧为疏水性芳香族氨基酸( 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 。酶法生产多肽成本 低，并且由于内切酶类作用位点专一性，可以定向获得特殊结构的多肽。从1 9 9 2 年至1 9 9 7 年f u k u d o m e 采用复合酶解的方法得到五种阿片肽产物： g l y - t y r t y r - p r o - t h r ( a 5 ) 、g l y t y r - t y r - p r o ( a 4 ) 、t y r - g l y g l y t r p l e u ( b 5 ) 、t y r - g l y g l y t r p ( b 4 ) 、t y r - p r o - i l e - s e r - l e u ( c ) 。现在的研究主要集中在a 5 、b 5 。a d a m s o n ( 1 9 9 6 年) 研究发现，a l c a l a s e 蛋白酶在碱性环境中具有较高活性，与胰蛋白酶释放的肽段 相比其肽段更短而产率更高，其要求水解位点羧基侧具有芳香族或者疏水性氨基酸 ( 色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸和丙氨酸) 。 但在蛋白酶解过程取得的酶解液为混合液，并且产生不必要的产物，需要进一步的 分离纯化，并且适用生产的蛋白酶的种类不多，并且价格高产率低。随着技术的进 步及蛋白酶的商业化生产，使得酶法生产多肽成为几年来主流的生物活性肽的途 径。 1 5 本课题研究的意义、目的和内容 1 5 1 本课题研究的意义和目的 ( 1 ) 提高谷朊粉利用的附加值 6 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制各和肠道营养效果研究 小麦是我国乃至全世界种植最广泛的农作物之，近年来我国小麦深加工主要 集中在生产小麦淀粉及谷朊粉。近年来，由于谷朊粉的产量不断增加，传统的市场 趋于饱和，面筋独特的粘弹性、延伸性和吸脂乳化性和薄膜成型性等性质。并且其 可降解、可再生的环境保护方面的优点，是从普通小麦中提取醇溶蛋白和谷蛋白， 应用于食品和非食品方面的深加工。 ( 2 ) 优化蛋白提取和谷氨酰胺肽的制备工艺 采用碱提沉淀法，通过s a s 软件分析，运用数学的方法对提取工艺进行了优化， 找出最佳提取条件，从三种商业蛋白酶中筛选出能够生产具有较高谷氨酰胺肽的商 业蛋白酶。 ( 3 ) 谷氨酰胺肽肠道功能性食品 人体在严重创( 烧) 伤、放射损伤、器官移植、外科急重症等许多病理情况下， 机体长时间处于高分解代谢状态，机体对谷氨酸胺的消耗大大增加，而体内的合成 远远不能满足需要，出现谷氨酸胺的严重缺乏，因此需及时足量补充外源性谷氨酰 胺。以富含谷氨酰胺的麦谷蛋白作为原料酶解生产谷氨酰胺肽，制备肠道营养液能 够快速的补充人体所需谷氨酰胺。缓解谷氨酰胺缺乏带来的种种生理问题。 总之，使用谷朊粉提取麦谷蛋白，使用麦谷蛋白酶解生产谷氨酰胺肽，不仅可 以生产麦谷蛋白作为添加剂，改变面粉品级，还可以制备谷氨酰胺肽营养液，丰富 临床营养品市场，还可以通过机理以及其机构的深入研究为制备提取临床营养品的 途径。因此，开发高谷氨酰胺含量的肠道营养品具有重要理论意义和应用价值。 1 5 2 本课题的研究内容 ( 1 ) 根据单因素及正交试验优化蛋白提取温度、提取时间和料液比，确立了 最佳蛋白提取条件。 ( 2 ) 蛋白酶的筛选 从三种商业蛋白酶胰蛋白蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶中筛选出合适的酶进 行双酶分步酶解，制备谷氨酰胺肽。 ( 3 ) 谷氨酰胺肽制取方法的优化 研究了温度、底物浓度和加酶量对谷氨酰胺得率影响，采用响应面法分析，优 化了谷氨酰胺肽的制备。 ( 4 ) 谷氨酰胺肽的分离和结构初探 7 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 采用凝胶层析柱法进行分离，根据g p c 分析其分子量分布范围，采用氨基酸 分析仪进行了谷氨酰胺肽氨基酸成分的分析，采用高效液相和质谱联用进行了多肽 结构分析。 ( 5 ) 麦谷蛋白酶解液对大鼠小肠营养作用的研究 用氨甲蝶呤诱发小肠炎后，饲喂g i n 含量不等的养液，检测大鼠死亡率以及大 鼠体重、双糖酶活性、氨肽酶活性、d n a 和r n a 的含量变化，以检测g i n 活性肽营 养液对小肠营养作用。 8 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究 第二部分麦谷蛋白提取及工艺的优化 小麦是世界上栽培最早的粮食作物之，而且分布面积广。在全世界的粮食总 产量中，小麦的产量位居第一( 齐兵建，2 0 0 0 ) 。依照o b o m e 的命名和分类小麦的 储藏蛋白主要是麦谷蛋白和麦醇溶蛋白两种。约占总蛋白的8 5 ( 刘冬儿，1 9 9 9 ) ， 麦谷蛋白占全部面筋蛋白含量的3 5 ，小麦蛋白质中谷氨酸含量是所有植物蛋白中 含量最高的，约占蛋白总量的3 5 ，并且麦谷蛋白中谷氨酸的含量远超过醇溶蛋白 中的含量因此小麦中的麦谷蛋白是制备谷氨酞酰胺的最佳原料蛋白，并且9 0 年代， 日本首先从谷蛋白中开发出一种富含g i n 活性肽的营养液( t a n a b ee ta 1 1 9 9 3 ) ，并 获得专利。t a n a b e 等( 1 9 9 3 年) 酶解谷蛋白得到富含g l n 小肽的营养液。本试验研 究了麦谷蛋白的提取条件，确定麦谷蛋白的最佳提取条件。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 谷朊粉 2 1 2 主要仪器 仪器名称 精密p h 计 色谱柱 紫外检测仪 电脑定时恒流泵 数控计滴自动部分收集器 分光光度计 小型台式纪录仪 台式离心机 真空冷冻干燥机 高速分散均质机 2 1 3 方法 2 1 3 1 麦谷蛋白的提取方法 型号 p h s 一3 c g 1 0 0 h d 3 d h l b s b s 1 0 0 u v 二1 7 0 0 x w t - s d l 一5 a ： f j 2 0 0 9 广州市仟禾商贸有限公司提供 生产厂家 上海理达仪器厂 s e p h a d e x 公司 上海沪西仪器厂 上海沪西仪器厂 上海沪西仪器厂 s i g m a 公司，美国 上海自动化仪表公司 上海安亭科学仪器厂 l a b c o n c of r e e z o n e 潍坊三水检验设备有限公司 华中农业人学2 0 0 8 届硕士学位论文 称取一定量的麦谷蛋白加水后后用高速分散均质机匀浆，然后在恒温水浴锅中 ( 溶液温度1 8 c ) 浸提并不断搅拌的同时调整所需的p h 值。浸提所需的时间后离 心( 3 0 0 0 r m i n ) 1 0 m i n ，收集上清液，然后进行二次浸提( 6 5 酒精) ，并且调p h 值到7 0 ，然后4 。c 下静止l 小时，再离心( 4 0 0 0 r m i n ) 1 0 m i n ，取沉淀进行冷冻干 燥得到麦谷蛋白并称重，然后取一定量检测其蛋白质含量。 2 1 3 2 蛋白质含量的测定 常量凯氏定氮法( 参照g b t 5 0 0 9 5 1 9 8 5 ) 2 1 3 3 水份含量的测定 1 0 5 干燥法( 参照g b t 1 0 3 5 8 1 9 8 9 ) 2 1 3 4 总灰分的测定 马福炉挥发恒重法( 参照g b t r 9 8 2 4 1 9 8 8 ) 2 1 3 5 粗脂肪的测定 索氏抽提法( 参照g b t 5 5 1 2 1 9 8 5 ) 2 1 3 6 蛋白质提取率的测定 蛋白质提取率( ) = 望兰蓦凳腊x 1 0 0 2 1 3 7 柱层析 层析介质：s e p h a d e x g 1 0 0 ；柱子尺寸1 0 0 1 2 c m ；洗脱液：0 0 5 m o l l l r i sh c i ， 0 i m o l l k c l ；p h 7 5 ；流速：9 m l _ h ；检测：2 8 0 n m 。 2 1 3 8 变性温度测定 差示扫描量热仪( d s c ) 分析变性温度 2 2 结果与讨论 2 2 1 麦谷蛋白的主要成分 表2 - 1 谷朊粉的主要成分 t a b l e2 - 1c o n t e n t so fm a i nc o m p o n e n t so fw h e a tg l u t e n 1 0 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营养效果研究 2 2 2 提取条件对蛋白质提取率的影响 2 2 2 1p h 对提取率的影响 准确称取1 0g 谷朊粉，在固液比为l ：3 0 ( m v ) 、提取时间为l h 的条件下按实验 的提取流程考查不同p h 值对提取效果的影响，结果见图1 ，如图2 1 麦谷蛋白的提 取率随着p h 的变化先增加后减小。在p h 为1 2 时，麦谷蛋白的提取率最高，因此 确定麦谷蛋白的最佳提取p h 为1 2 。 3 0 0 0 z 5 o o 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 o o 5 o o o o o l ol ll z1 3 p h 图2 1p h 对提取率的影响 f i g 2 1e f f e c to fp h o nt h ee x t r a c t i o nr a t e 2 2 2 2 提取时间对提取率的影响 从经济角度出发，提高原料的最大利用率，实验中固液比为1 ：3 0 。准确称取l o g 谷朊粉，在p h1 2 、固液比为l ：3 0 ，结果见图2 2 ，麦谷蛋白的提取率随着时间的延 长麦谷蛋白的提取率有先上升后下降的趋势。多数蛋白质的溶解度随着温度的升高 而增大，虽然温度高利于溶解，缩短提取时间。但温度升高会使蛋白失活。长时间 浸提不利于麦谷蛋白的提取。 时间1 1 图2 2 提取时间对提取率的影响 f i g 2 - 2e f f e c to fe x t r a c t i o nt i m eo nt h ee x t r a c t i o nr a t e 2 2 2 3 液固比对提取率的影响 准确称取l o g 谷朊粉，在p h1 2 、提取时间为1 h 的条件下考查不同料液比对提 华中农业人学2 0 0 8 届硕十学位论文 取率的影响，结果见图2 3 。如图2 3 麦谷蛋白的提取率随提取液的增大而增大。 一般来说，在一定的温度条件下，物质的溶解度是一定的。如图2 3 在1 ：5 0 的条件 下，提取率已达到3 4 ，而在1 ：2 0 的情况下不足2 0 。因为麦谷蛋白占全部面筋 蛋白含量的3 5 。1 ：5 0 的条件下谷朊粉中麦谷蛋白已接近全部提取，但这种情况造 成酒精的浪费，而在固液比为1 ：2 0 的条件下，虽溶质中的麦谷蛋白没有完全溶出， 但溶液中麦谷蛋白已趋近于饱和，没有充分利用原料，造成原料的浪费。考虑到溶 剂最大利用以及工艺流程第六步中酒精使用量等经济方面的问题，在正交分析中， 料液比的水平为1 ：2 0 ，1 ：3 0 ，l ：4 0 。 4 0 o o 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 o o 1 5 0 0 l o o o 5 o o o o o l ：2 0l ：3 01 ：4 0l ：5 0 固液比( n v y ) 图2 3 液固比对提取率的影响 f i g 2 - 3e 仃跚o fm a t e r i a l s o l v e n t r a t i oo nt h ee x t r a c t i o nr a t e 可 溶 性 蛋 白 浓 度 l ：z ul ：j ul ：4 0l ：o u 固液比( m n ) 图2 _ 4 液固比对浓度的影响 f i g 2 _ 4e f f e c to fm a t e r i a l s o l v e n t r a t i oo nt h ec o n c e n t r a t i o n 2 2 3 麦谷蛋白提取工艺的优化 单因素试验表明溶剂p h 值、料液比、提取时间对麦谷蛋白的提取率均有明显 的影响，为了优化工艺，故有必要对其进行正交实验。根据单因素试验设计的因素 水平表见表2 2 ，结果见表2 3 。 1 2 麦谷蛋白源谷氨酰胺肽的制备和肠道营