（食品科学专业论文）自然发酵肉制品中干酪乳杆菌的分离、筛选与应用.pdf

摘要 本研究在前人研究的基础上，从自然发酵香肠和自制腌肉中分离、筛选适用于肉制品发酵的 乳酸菌菌株，并进行了初步的鉴定，分析了这些菌株的微生物学特性、产酸产酶特性并对它们 在发酵香肠和发酵肉中的应用进行了初步的研究，试验结果表明： 依据适用于发酵肉制品的乳酸菌菌株的筛选标准，从自然发酵香肠和自制腌肉中分离筛选出 两株性能优良的乳酸菌菌株c 6 7 和r 6 ，它们不产气不产生粘液，产酸及耐盐耐亚硝性能良好。 经过初步鉴定。皆为干酪乳杆菌。 菌株c 6 7 在液体m r s 培养基中培养l o 小时时菌体密度达到最大，r 6 培养1 2 小时时菌体 密度达到最大，是苗体的最佳收获时期。c 6 7 和r 6 在2 4 小时内最低p h 值分别为4 0 0 ，3 9 7 在2 5 4 0 范围内可较好的生长。 两株菌具有微弱的蛋白酶活性，都没有脂酶活性，不能降解组氨酸和赖氨酸生成相应的组胺 和尸胺。 本试验在发酵香肠的生产过程中检攫g - ) - 产品的理化和微生物指标，并进行了感官评价。发酵 组产品的p h 、a w 和水分含量比对照组下降的速度快，最终的结果低，蛋白水解指数大，p o v 值低，a v 无明显区别。发酵组中的乳酸菌一直是优势菌，最大值为1 0 3 c f u g ，而对照组中的乳酸 菌逐渐增加到1 0 7 e f u g 。发酵组比对照组在感官上具有更浓郁的发酵滋气味，酸味柔和适合中 国人的口味，但美中不足的是表面颜色比对照组差。这是由于单菌发酵的缺陷所致。 本试验还对发酵肉的生产工艺进行了初探。在发酵肉的生产过程中检测了产品的理化和微生 物指标，并进行了感官评价。发酵组产品的p h 、a w 、水分含量较对照组低。发酵组中乳酸菌一 直是优势菌，最大值为1 0 8e f u g ，对照组中的乳酸菌是逐渐增加到1 0 6 e f u g 。发酵组比对照组在 感官上具有明显的发酵特性，酸味可以接受。 关键词：千酪乳杆菌，分离发酵肉制品 a b s t r a c t i nt h i sr e s e a r c h s t r a i n sw e r ei s o l a t e da n ds c r e e n e df r o mn a t u r a lf e r m e n t e ds a u s a g e sa n dc u r e d m e a t t h e i rc a p a c i t yo fa c i da n de n z y m ep r o d u c t i o n ，t h e i ra p p l i c a t i o ni nf e r m e n t e ds a u s a g e sa n d f e r m e n t e dm e a t sw e r ea n a l y s e d t h er e s u l t sw e r e ： b a s e do nt h es t a n d a r d so fs c r e e n i n gl a c t i ca c i db a c t e r i a lf o rf e r m e n t e dm e a tp r o d u c t s ，t w o s t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i aw i t he x c e l l e n tc h a r a c t e rw e r ei s o l a t e da n d s c r e e n e df r o mn a t u r a l f e r m e n t e ds a u s a g e sa n dc u r e dm e a t , r e s p e c t i v e l yn a m e da sc 6 7a n dr 6 1 1 1 e yd i dn o tp r o d u c eg a sa n d s l i m e ，s h o w e dh i g h a c i d i f i c a t i o nr a t ea n da c i d i f i c a t i o nc a p a c i t y b o t ho ft h e ma l s os h o w e dh i g h r e s i s t a n c et on i t r i t ea n d n a c l t h e yw e r ei d e n t i f i e d l a c t o b a c i l l u se a s e l t h e o p t i m u m h a r v e s t t i m e o f m a x i m u m b a c t e r i a c o 蛐t s o f c 6 7 i n m r sb r o t h w a s t o h t h a t t i m e o fr 6w a s1 2 h t h ei o w e s tp hw i t h i n2 4 h o u r si nm r sb r o t ho f c 6 7a n dr 6w e r e r e s p e c t i v e l y4 0 0 a n d 3 9 7 n l e yg r e ww e l la t2 5 - 4 0 c t h e yd i dn o tp r o d u c el i p a s e a n dh a dw e a kp r o t e o l y t i ca c t i v i t y t h c yc o u l dn o tp r o d u c et h e b i o g e n i ca m i n e sf r o mh i s t i d i n ea n dl y s i n e p h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t i e s a n d m i c r o b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c sw e r es t u d i e d d u r i n g t h e p r o c e s s i n g o ff e r m e n t e ds a u s a g e ，s e n s o r y a n a l y s i sw a sa l s od o n e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p h ，a w , m o i s t u r ec o n t e n td r o p p e dm o r er a p i d l y a n dw i t hh i g h e rp r o t e o l y s i si n d e xi nt h eg r o u p s a d d e ds t r a i n st h a nt h o s ei nt h ec o n t r o l g r o u p t h e r e w e r en od i f f e r e n c e si n a c i d i t y v a l u ea n d p e r o x i d ev a l u e b e t w e e nt h r e e g r o u p s p o vo ft w of e r m e n t e dg r o u p sw a sl o w e rt h a nc o n t r o l g r o u p s t h e l a c t i ca c i db a c t e r i ao ff e r m e n t e dg r o u p sw a sd o m i n a n tf l o r a d u r i n gt h ew h o l e p r o c e s s i n gw i t ht h em a x i m u mb a c t e r i ac o u n t s1 0 5 c f u g ，w h i l e + t h a to ft h ec o n t r o lg r o u pi n c r e a s e d g r a d u a l yw i t ht h em a x i m u m b a c t e r i ac o u n t s l 0 c f u g t h ef e r m e n t e dg r o u p sh a dm o r ew e l c o m ef l a v o r a n ds o u r t h e ya r es u i t a b l ef o rc h i n e s ep e o p l e b u tt h es u r f a c ec o l o u ro ft h ef e r m e n t e dg r o u p sw e r e w o r et h a nt h ec o n t r o lg r o u p t h e r ew e r ef a u l t si ns i n g l es a a i nf e r m e n t a t i o n p h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dm i c r o b i o l o g i c a lc h a r a c t e rw e r es t u d i e dd u r i n gt h ep r o c e s s i n g o ff e r m e n t e dm e a t ，s e n s o r ya n a l y s i sw a sa l s od o n e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep h ，a mm o i s t u r e c o n t e n td r o p p e dm o r er a p i d l yt h a nt h ec o n t r 0 1 1 飞el a c t i ca c i db a c t e r i ao f f e r m e n t e dg r o u p sw a s d o m i n a n tf l o r ad u r i n gt h ew h o l e p r o c e s s i n gw i t ht h em a x i m u m b a c t e r i a ln u m b e r1 0 8 c f u g , w h i l et h a t o f t h ec o n t r o lg r o u pi n c r e a s e d g r a d u a l yw i t ht h em a x i m u m b a c t e r i a lc o u n t s l 0 f u g t h ef e r m e n t e d g r o u p sh a d o b v i o u sf e r m e n t a t i o nf l a v o ra n d a c c e p t a b l e s o u r k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sc a s e i ，i s o l a t i o n ，f e r m e n t e dm e a t s i l 独创性声明 r ；5 9 7 8 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：徐静 时间： - p o 。妒年莎月，7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：徐静 跏躲g 佛 时间：硎伊年占, e lt 7 日 时间：渺年彳月吵日 中田农业大学硕士学位论文第一章前言 _ i 一 第一章前言 1 1 我国肉类生产和加工发展现状 我国是当今世界的畜牧大国，肉类生产总量1 0 几年来一直居世界首位。改革开放以来我 国肉类生产进入持续快速增长阶段。在过去的2 0 年间( 1 9 8 0 - 2 0 0 0 ) 中国的肉类产量持续以平均每 年8 7 递增，1 9 9 0 年达到2 8 5 7 万吨，居世界第一位：1 9 9 3 年全国肉类总产量达3 8 4 9 万吨 比1 9 8 0 年增加了2 0 1 ；1 9 9 4 年肉类总产量达到4 3 0 0 万吨比1 9 9 3 年增长li 9 ，人均拥有 量为3 5 8 3 k g 首次超过世界人均占有量3 3 5 k g 的水平；1 9 9 5 1 9 9 7 年间，肉类总产量持续快 速增长，1 9 9 7 年肉类总产量约5 9 0 0 万吨创历史最高水平人均年占有量约5 0 k g 高出世界 人均占有量1 6 5 k g l l 2 , 3 1 ；2 0 0 0 年达到6 1 2 5 4 万吨，占世界肉类总产量的2 6 3 ：2 0 0 1 年内类总 产量比2 0 0 0 年又上升了3 5 达到6 3 4 0 万吨。 肉类生产的迅速发展，大大促进了我国肉类加工业的发展壮大。目前我国现有肉类加工企 业3 7 0 0 多家，拥有资产5 0 0 亿元，从业人员1 4 8 万左右。有冷库4 0 0 0 多座冷库容量达4 5 0 万吨l l t 3 4 l 。自2 0 世纪8 0 年代起我国从欧美及日本引进大量先进的肉制品加工机械和生产技 术，仅火腿肠生产线就引进6 0 0 0 余条形成了像春都、双汇、金锣等一批大型肉类企业，西式 肉制品一时占据了市场主流：中式肉制品也在继承传统工艺的基础上，不断创新，由手工作坊 向工厂化转化。肉类产品已不再仅仅是鲜冻白条肉，分割肉、冷却肉、速冻包装以及各种中、 西式肉制品应有尽有，极大的丰富了市场，满足了人们的营养需求i - - i 。 尽管我国肉类加工业发展形成了一定的规模，但与欧美发达国家相比差距依然很大。1 9 9 7 年，我国肉类制品年产量约2 0 0 2 2 0 万吨。占肉类总量的3 5 4 ，人均年占有量不足2 k g 仅灌肠制品就占了5 0 产品种类仅1 0 0 种左右。而欧美国家肉类制品占肉类总量的4 0 5 0 ， 甚至更高达7 0 ，肉类制品种类上千种。据报道，德国肉制品品种有1 5 0 0 种。法国有7 5 0 种， 瑞士仅色拉米香肠就达7 5 0 种。而我国一些传统的风味营养肉制品均未形成规模化、多档次、 系列化生产肉类加工仍主要是初级加工即屠宰后的生鲜肉类1 6 3 1 。 依据历史渊源，我们可以把中国的肉制品分为中式肉制品和西式肉制品两大类。习惯上， 按照民族的工艺加工生产的肉制品称为中式肉制品，按照西方引入的工艺生产的肉制品称为西 式肉制品。中式肉制品包括腌腊类制品、肉类干制品和酱制品三类产品为主：西式肉制品以灌 肠、火腿、培根三类产品为主限”。西式肉制品加工技术完全建立在物理学、化学和其它相关科 学的基础上，工艺参数可以做到完全量化，从而保证产品质量的稳定。同时，拥有完善的a i m 设备便于实现工业化生产：而中式肉制品加工工艺尽管暗合科学道理。但工艺参数模糊，全 凭经验，缺乏科学依据，造成产品质量不稳定。2 0 世纪8 0 年代以后，西式肉制品长期主导我 国肉制品生产产量逐年增大，消费量日益增加。而传统中式制品则每况愈下，产量、销量大 幅度下降。据中国食品工业年鉴记载。1 9 8 6 年全国西式肉制品的产量已占肉制品总量的5 0 ， 1 9 8 7 年迅速上升到6 4 6 0 0 。但自9 0 年代开始，由于不少西式肉制晶生产厂家借助于先进的乳 中田农业大学硕士学位论文 第一章前言 化技术和腌制技术过量使用低价填充料和保水剂使西式肉翻品的品质下降。消费者重新怀念色 香味俱佳的中式肉制品从而使这一趋势发生逆转。进入2 0 世纪9 0 年代食品科技工作者借 鉴西式肉制品的研究方法、技术、材料来研究中国传统风味肉制品，使中式阿制品生产逐步科 学化、工业化除有效的保留了产品的色、香、味、形等传统品质外，还具有营养、卫生和方 便等现代食品的特色中式肉制品夺回部分市场 4 1 0 , 1 1 , 1 2 , 1 3 , 1 “。 根据热处理程度和贮存、流通温度的不同西式肉制品包括高温肉制品和低温肉制品两类。 一般认为高温肉制品是采用高温长时间热处理，使产品的中心温度达到1 0 0 1 2 1 c 并维持一 定时间，最终产品可以在常温下贮存流通的肉制品。低温肉制品是仅仅采用低温巴氏杀菌热处 理( 产品中心温度在6 8 7 5 c ) ，最终产品需要在冷链条件下贮存流通的肉制品。 我国目前的肉制品大都为高温肉制品，尤其是现在约占加工肉制品市场总量3 0 的火腿肠 产品。高温肉制品由于经过较高的加热温度灭菌效果较好，货架期较长，可以在高温下存放 半年之久，故可不依赖冷藏链而进行储藏、运输和销售，尤其是广大农村地区和尚不具备冷链的 中小城市。但经高温加热后的产品其风味、口感，营养等品质方面会有较多的损失因而并不 是我们今后崇尚的一类产品。低温加热肉制品是相对于p v d c 薄膜作肠衣、经1 2 1 高温杀菌 的火腿肠而言的一大类产品，其加热温度一般在巴氏消毒温范围内，克服了高温造成的缺陷，产 品具有鲜嫩、艟软、可口、风味好的特点，世界各冒现有的加热肉制品中几乎都是一类产品， 在我国大中城市现在也相对较受欢迎。但是，0 - 7 c 贮存、流通、销售的冷链条件需要消耗大量 的能源，而且，原料肉的品质和产品加工、流通过程中品质控制原因，也限制了低温肉制品的 保质蝌1 ”。 中国是一个拥有1 3 亿人口的发展中国家正向小康水平过渡肉类消费水平总体上还要进 一步提高。预计今后5 到i 0 年中国肉类消费年增长率在1 0 以上。特别是农村人口多，生活 水平提高很快肉类消费潜力大，需求总量就不断增长，城镇人口在保持肉类消费需求继续增 长的同时。结构已经变化，质量也将迸一步提高。这些情况说明中国肉类市场前景广阔，潜力 巨大。而这对于肉制品的发展来说绝对是一次不可多得的良机。随着人们经济状况和生活水平 的更进一步提高，经济条件的改善会为消费者在消费水平和消费观念上带来新的变化。消费者 出于对自身健康的关心将对肉制品提出更高的要求：如供应充足、品种繁多、档次齐全、品质 优良、营养健康、安全无害等。发酵肉制品由于其特殊的风味、口感和营养功效受到欧美发达 国家消费者的喜爱，成为他们餐桌上必备的肉类食品。我国的发酵肉制品行业发展相对迟缓 从肉食营养和安全的角度考虑国内业内专家普遍认为发酵肉制品在未来会逐渐成为我国肉制 品行业发展的一个方向。 1 2 国内外发酵肉制品的研究概况 1 2 1 发酵肉制品概述 发酵肉制品是采用微生物发酵技术。将原料肉经特定的微生物作用，产酸使p h 值下降。 并经过低温失水使产品的a w 降低：从而增加产品的保藏性能的一大类肉制品1 1 6 l 。发酵肉制品 不需要冷藏是利用低p h 、低水分活度来达到保藏目的一类产品，在国外具有悠久的历史。 2 中墨农业大学碗士学位论文第一章前言 肉的发酵本是一种原始的肉类贮藏手段，随着人们对其独特风味和良好贮藏特性的认识， 逐步演化为一种肉制品的加工方法发酵肉制品的种类较多传统的中式肉制品中的腊肠、腊 肉、火腿都伴随着自身微生物的自然发酵，这些产品通常被称为腌肉制品，具有悠久的生产历 史，它的肉质紧密坚实，色泽红白分明。滋味成鲜可口，风味独特，便于携运而且耐储藏，因 而受到广大群众喜爱又如在我国的南方地区及台湾省有食用酸“肉醒”的习惯。它们是将肉( 猪、 鱼、虾) 切成薄片后，用高浓度盐腌溃或预腌后再加入米饭等在密闭条件下发酵而成的即食 性肉制品l l7 1 起源于欧洲的干式或半干式发酵香肠属于高档次的西式肉制品，是发酵肉制品的典型代 表，已经完成了从传统的自然发酵向定向接种培育的工业化生产的转变【l6 1 其他的发酵肉类还 包括不绞碎的块状产品如生火腿发酵肉制品在美国、德国、意大利等嗣家已成为一种传统 的发酵食品。它具有工艺考究、色香浓郁、风味独特的特点深受消费者的喜爱。 其特点主要有下述几点”d j ： i ) 色泽美观由于微生物和酶的作用，使得肉制品发色充分具有鲜亮的玫瑰红色。 2 ) 味美且易于消化吸收由于蛋白质、脂肪、糖类等大分子物质被微生物或其生长产生的 酶所降解。产生大量的肽、氨基酸和挥发性的脂肪酸等小分子化合物，增加了肉制品的风味， 同时也使肉制品易于消化吸收。另外。由于徼生物的作用，除去肉本来的腥、膻等不良风味， 使消费者容易接受。 3 1 发酵肉制品中弧硝盐残留量大大降低，提高了食用安全性。 4 ) 经过发酵的肉制品质构变好肉质嫩化这是由于微生物及酶的作用形成的。 5 ) 产品的安全性提高。现在的肉食安全已经成为很大的问题，发酵肉制品一方面通过乳酸 菌的生长、降低p h 值有效抑制致病菌和腐败菌的生长和繁殖，并且一些有害的寄生虫在产品 生产过程中被杀死，另一方面，通过微生物的分解，很大程度降低产品中亚硝的含量，使得发 酵肉制品安全性得到有效的保障。 1 2 2 国内外发酵香肠的发展概况 发酵香肠( f e r m e n t e ds a u s a g e ) 亦称生香肠。是指将绞碎的肉( 常指猪肉或牛肉) 和动物脂 肪同糖、盐、发酵剂和香辛料等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有稳定的微生物 特性和典型的发酵香味的肉制品i l w 。传统发酵香肠是欧洲最古老、最原始的肉制品之一。据考 证，发酵香肠起源于地中海地区，那里气候温和、湿度高，有利于香肠发酵和成熟。 早在2 0 0 0 多年前，罗马人就知道用碎肉加盐、糖和香辛料能够制成美味可口的香肠而且 这类产品具有较长的储藏期。不过当时的产品主要是通过自然发酵和成熟干燥制成的干香肠。 这类产品至今在欧洲的一些国家仍很普遍。近几十年来随着肉品加工技术的不断改进和冷藏 工艺的出现，欧美一些国家相继生产出不经过干燥的不干香肠或只经过部分干燥的半干香肠， 但总的来说，干发酵香肠因其具有独特的风味和较长的储藏期仍然受到人们的喜爱。由于加工 条件、产品组成以及添加剂的不同。发酵香肠出现了很多种类。但通常人们按照产品在加工过程中 失去水分的多少，将其分成千肠、半干肠、不干肠和熏肠等”r 埘( 如表1 ) 。 发酵香肠通常在常温条件下贮存、运输，并且不经过熟制处理直接食用。在发酵过程中。 3 中国农业大学硬士学位论文第一章前言 乳酸菌发酵碳水化合物形成乳酸，使香肠的最终p h 值降低到4 5 - 5 3 。这一较低的p h 值使得 肉中的盐溶性蛋白质变性，形成具有切片性的凝胶结构。较低的p h 值与由添加的食盐和干燥 过程降低的水分活度共同作用，保证了产品的稳定性和安全性。贮存、流通过程不需要冷链条 件，节约能源，适合中国国情。发酵香肠的色泽美观具有适宜、纯正的酸味和发酵香味味 道鲜美且易于消化吸收接种的微生物一般为乳酸菌、微球菌等益生菌，具有保健作用可以 防止心血管疾病和维持肠道健康。由于乳酸菌产酸，发酵香肠的p h 值一般在5 3 以下。可抑铜 不良微生物的生长繁殖及毒素的产生田田刀l 。在欧美等发达嚣家，发酵香肠成熟的生产工艺， 大规模的工业化生产使其成为肉制品的重要组成部分，受到人们的青睐有资料显示，1 9 9 5 年欧盟范围内香肠的产量估计约为7 5 0 0 0 0 t ，如德国，每年人均消费发酵香肠约为4 5 k g ，约占 肉类总消费量的7a a r z “。 裹i 西式发酵番肠的分类 t a b l ei c a t e g o r i o f f e r m e n t e d m a g c s 我国传统的腊肠广义上也属于发酵肠。由于地理环境和口味( 消费习惯) 的差异，其生产 工艺和风味等不同于添加纯微生物发酵剂生产的西式发酵肠。西式发酵香肠是通过微生物( 主 要是乳酸菌) 发酵风干，降低原料肉的p h ，a w 制成成品，而我国的腊肠仅降低a w ，不要 求发酵产酸m j 。与西式发酵香肠相比，我国的腊肠生产存在一定的缺陷。首先表现在发酵菌种 上我国传统腊肠制作时，其菌种是由外部环境偶然混入的“野生菌”，菌系较复杂，有益菌和 有害菌共存。由于随机性大，无法保证发酵的正常进行造成产品质量不稳定，同时，生产周 期较长。而西式发酵香肠添加纯微生物发酵剂，可人为地控制发酵进程，抑制有害菌生长。保 证产品质量稳定，并缩短了生产周期。其次，在生产工艺上。我国传统腊肠生产过程几乎暴露 于外部环境，无论发酵成熟及风干均在大气环境中进行。生产受气候、季节限制。不能确保产 品的最终质量。而西式发酵香肠发酵后熟及干燥均在固定的、能调节控制温度和湿度的室内进 行，可随时终止发酵成熟或干燥。并能准确预测最终产品的质量 2 6 , 2 7 i 。 1 2 3 发酵肉制品中发酵菌种的研究进展 发酵香肠中的微生物种类包括乳酸菌、微球菌、霉菌、酵母，它们在发酵香肠的风味形成 和安全性中都发挥了各自独特的作用。为获得有益的微生物群体传统的方法是添加5 4 的母 料于下一批物料中这就是所谓的b a c k - s l o p p i n g 。但是，用这种方法制各的接种物，主导菌易 发生变动腐败菌和致病菌适应加工过程后，数量会增加一旦出现这种情况，将很难排除有 害蔼1 9 4 0 年美国人l b j e m e n 和l s p a d o c k 在专利中第一次描述了乳酸菌在发酵香肠中的 应用，从而开创了使用纯培养的微生物发酵剂生产发酵香肠的先河。1 9 5 7 年，美国首次研制出 4 中田农业大学颈士学位论文 第一章前言 一m l _ _ l _ 一 了商业用香肠发酵剂吼发酵香肠发酵几种常用的微生物种类见表2 ”1 。 1 。2 。3 1 酵母菌 用酵母菌作为发酵剂适合于干的发酵香肠。汉逊氏酵母是常用的菌种。这种菌耐高盐、好 气及有较弱的发酵性，一般生长在肠表面。通过添加此菌，可提高肠的风味，但它没有硝酸盐 还原作用，通过与乳酸菌、小球菌合用获得较好的产品品质。近年研究表明金华火腿中也 存在酵母( 1 0 3 0 1 0 c f u g ) p l l 。但尚未进行具体的分类研究翔】。今后应加强这方面的研究和应 用工作，筛选出适宜的酵母新菌株，应用于内翻晶发酵荆生产中。 襄2发酵番肠发醇荆中常用的徽生物种类 t a b l e 2s t a r t e r c u l “i r c si n 惫唧锄t 。ds 叫s b 圆e 微生物种类 菌株 酵母( y e a s t ) 汉避氏德巴利酵母 牡b 口口o h 明e sh a n a f , w i i ) 法马塔假丝酵母( c a n d i d a f a m a t a ) 霉菌( f u n g i ) 产黄青w l ( p e n c i l i u mc l u y s e n u m ) 纳地青霉n o l g i o v e m e ) 1 2 - 3 2 霉菌 我国传统的发酵食品中霉菌起着重要的作用。这主要是由于霉菌的酶系发达，代谢能力强。 常见的传统霉菌发酵食品有酱类、腐乳、霉千张、金华火腿等其中只有金华火腿属于霉菌发 酵肉制品。而在欧美这类食品主要是动物性的，如青纹千酪，烟熏香肠，干香肠等。在发酵肉 制品中霉菌的作用主要是：形成独特的外观，并通过霉菌蛋白酶、脂酶的作用产生特殊的风 味霉菌是好氧蓖，可在生长中消耗掉0 2 ，抑制其它好氧腐败菡的生长充分隔氧。防止制品酸 败、褪色有利于产品干燥的更均匀”w 。传统发酵肉制品表面的霉菌并非人为接种的而是直接 来自于环境，为了适应规模化工业生产的需要。应研究、制备肉品发酵用霉菌发酵荆。但是由 于某些霉菌产生真菌毒素危害人体健康，如8 0 的青霉产生真菌毒素，毒素种类达l o 种以上p ”。 因此在研究制备时需特别慎重，首先必须确保安全性其次对在表面生长的腐败菌有抑制作用， 此外还要具有平衡的蛋白水解、脂肪水解活性m ”i 。 国外对用于干香肠的霉菌发酵剂的制作进行了研究，将肉制品中分离出的1 6 6 种霉菌进行 中固农业大学硕士学位论文第一章靛言 形态学和毒理学的研究筛选出7 种产黄青霉和2 种纳地青霉。初步结论可作为发酵利用于工 业化干香肠生产中其中用产黄青霉制作的菌种表现出较佳的抑制其它微生物的性能和较强的 抗擦性能，对香肠感观质量的改善作用也较大。如果与白色晕霉菌混合应用则效果更佳，但其 卫生安全性有待进一步确认m 刀l 。 i 2 3 3 细菌 1 ) 乳酸菌 欧嗣最先用植物乳杆蔺与小球菌结合作为发酵卉蛩。后来又加入了弯曲乳杆菌和清酒乳杆菌。 这两种苗有很高的竞争性和适应环境的能力这点非常重要。发酵香肠与发酵乳不同不象发 酵乳那样在接种前进行巴氏杀菌若那样会明显地改变肉的性状发酵香肠是借魏于有益菌的 高度竞争性来抑制其它菌的生长。这些发酵剂在从接种至消费的整个过程中占统治地位 清酒乳杆菌和弯曲乳杆菌有产生细菌素的能力。细菌素是由细菌代谢产生的具有蛋白质组 成的抗性物质，对产生细菌素的免疫。而作用其它的特定菌，因而提高了产生菌的竞争性。 f o e g e d i n g 等人证明在试验条件下。乳酸片球菌产生的细菌素能够抑制食品中病原菌的生长。 通过对细菌的进一步研究证实它是天然防腐剂，可以添加到非发酵食品中起防腐作用。由乳 链球菌产生的细菌素n i s i n 广泛地用在食品中作为食品的防腐剂抑制腐败微生物及病原菌的生 长p 8 棚。 有些发酵剂有产生胺的能力，如乳酸杆菌可以脱羧特定的氨基酸生成酪胺、苯基乙胺、组 胺。这些化合物对人类的健康不利。尸胺和腐胺也可以形成，并且加强前砸几神胺的不利作用。 在发酵物质中，低p h 值和较低的水分活性也加速了胺的形成，再加上氮基酸和一些肽类物质 更会如此。因此，筛选没有脱羧氨基酸能力的发酵微生物。卫生方面的危险就会降低1 4 0 , 4 ”。 利用诱变育种筛选最佳发酵剂不仅费时，而且有时并不能增加菌种的新性状，因为他们不 含特殊种或株的基因。然而，在其它微生物中可以发现有用的基因。这些基因可以通过现代的 基因工程技术引入到发酵剂中，提高发酵剂的竞争性，也就是说，现代的基因工程技术可以构建 和支持想要的特性菌种。如将溶葡萄球菌葡萄球菌的溶葡萄球菌素基因转移到作为肉发酵剂的 乳杆菌及纳地青霉中。通过这样的基因修饰，可以防止致病的金黄色葡萄球菌的生长，食品的 卫生状况就大大改善t t “j 。 2 ) 葡萄球菌和微球菌 用作发酵荆的主要微球菌和葡萄球菌。主要包括变异微球菌、肉色葡萄球菌和木糖葡萄球 菌。它们在香肠中的主要作用是还原亚硝以及产生过氧化氢酶，从而利于肉馅发色及分解过氧 化物，改善产品色泽、延缓酸败，此外也可通过分解蛋白质和脂肪而改善产品风味。值得注意 的是这些发酵菌在香肠发酵期增殖量并不是很大，但对产品质量的改善又极为重要，因此用于 香肠的发酵莉一般都含有上述微生物。葡萄球葡和徽球菌均具有过氧化氢酶活性，以及通过亚 硝酸还原酶将硝酸还原为亚硝酸的能力。前者对于过氧化氢的分解是极为重要的。过氧化氢是 几种乳酸菌在有氧条件下氧化产生的。它可破坏产品色泽、加速脂脏馥败。因此，葡萄球菌和 微球菌分解过氧化氢的特性对产品质量起到保护作用。葡萄球菌和微球菌之间的主要差别在于 需氧性的不同。微球菌只有在有氧条件下才具代谢势能发酵能力很弱，因此在香肠和火腿内 部不能生长，而大多葡萄球菌无论有氧无氧都能生长并发挥所需要的代谢作用，因此现在的发 酵剂中微球菌的应用都是与葡萄球菌结合。 6 中用农业大学硕士学位论文第一章前言 葡萄球菌和徽球菌发挥的最重要作用是其酶解活性( 解脂、解朊、解肽) 所赋予产品的特 有发酵风味，此机制至今仍未完全揭示。不同豹葡萄球菌和徽球菌在不同条件下。所发挥豹作 用也大不相同。特别是术糖葡萄球菌类在一定条件下( 添加酪蛋白、大豆蛋白、配方或工艺导 致较高蛋白质溶出量等) 其不利影响较大，特别是长期贮藏的产品呈现不利味道”。 3 ) 链霉菌 灰色链霉菌可以改进发酵香肠的风味。在自然生产的发酵香肠中链霉菌数量比较少t 4 2 1 。 4 ) 肠细菌 通常在原料肉中存在。发酵香肠的含菌量主要依据原料的菌数多少、肠的类型、成熟加工 中所处的阶段、亚硝酸发色腌制情况及使用的发酵荆种类而定在使用亚硝酸盐及添加发酵剂 的情况下。他们的数量恒定下降且病原菌如沙门氏菌、志贺氏杆菌和大肠埃希氏杆菌不存在气 单胞细菌没有任何致病性和产毒的能力，加入肠中对风味有好的影响婀l 。 1 2 4 乳酸菌的作用与筛选 1 2 4 i 乳酸菌在肉制品的作用 乳酸菌为一群可发酵碳水化合物生成大量乳酸的细菌的总称。乳酸菌的细胞为萃兰氏阳性， 形态为杆菌或球菌过氧化氢酶为阴性，消耗的葡萄糖5 0 以上产生乳酸不形成内生孢子， 无运动性，或很少有运动性。依菌体的形态，可分为球菌和杆菌。球菌包括链球菌属 ( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o s ) 和片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 。杆菌包括乳杆菌属 ( l a c t o b a c i l l u s ) 和双岐杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 。对糖类的发酵可分为同型发酵 ( h o m o f e r m e n t a t i o n ) 和异型发酵( h e t e r o f e r m e n t a t i o n ) 两种。同型发酵可将葡萄糖变成乳酸、 酒精和二氧化碳，如明串珠菌和部分乳杆菌。第二种是葡萄糖发酵后产生乳酸和醋酸，如双岐 杆菌【“j 5 j “。 1 ) 乳酸菌的生理功能 乳酸菌发酵过程中产生乳酸、醋酸等有规酸，赋予制品酸味，同时提高钙、磷、铁的利 用率，进一步降解产生乙酸、亦醛、酮等呈味物质，改善制品风味。乳酸菌分解乳糖产生的半 乳糖是婴儿大脑发育的重要物质：乳酸代谢过程还产生多种氨基酸、维生素和酶。提高了制品 的消化吸收性和营养价值。另外乳酸菌不但可以在人体肠道繁殖，促进肠道蠕动，而且可抑制 病原性微生物生长。预防便秘| 4 1 , 4 s , 4 9 , j o i ；乳酸菌具有抗肿瘤话性，s h a h n n e 等人( 1 9 9 5 ) 研究嗜 酸乳杆菌、保加乖j 亚乳杆菌时发现了抗肿瘤和抗白血病活性；另外研究者还发现5 “+ 铷，乳酸菌 本身及代谢产物可激活免疫细胞，增加机体的抗病能力：同时乳酸菌在体内和体外对胆固醇均 有降低作用。g i u i l a n d 等和r a s i c 等人提供并证明了嗜酸乳杆菌对胆固醇有同化作用，其降低胆 固醇的机理仍不清楚，有持于迸一步研究p 5 j 。 2 ) 乳酸菌在发酵香肠中的作用 $ 6 5 7 , 5 5 5 9 1 a ) 降低口h 值减少腐败，延长产品的保存期 原料肉在接种乳酸菌后乳酸菌利用碳水化合物如葡萄糖发酵产生乳酸使p h 值降至 4 g 一5 2 ，提供发酵香肠特有的发酵风味并抑制病原菌和腐败菌的生长，产品的货架期及安全 性会显著提高。 了 中田农业大学硕士学位论文第一章兢言 b ) 促迸发色 p h 值降低促进亚硝酸盐分解，产生n o ，n o 与肌红蛋白结合生成亚硝肌红蛋白。形成良 好的色泽。 c ) 减少亚硝胺的生成 肉制品中亚硝酸盐残存量是食用安全性的一个重要指标。亚硝酸盐可与肉中的二甲胺反应 生成二甲基亚硝胺这种物质具有致癌作用发酵香肠中由于乳酸菌的产酸作用，可促进亚硝 酸盐的还啜。减少了亚硝酸盐与二甲胺作用的机会。 d ) 抑制病原微生物的生长和产生毒素 据报道，接种乳酸营后。发酵第二天大脑杆菌数明显下降甚至消失。爽毒梭状芽孢杆蓖可 通过低p h 值，添加适宜浓度的亚硝和低温来控制。低p h 值还可抑制沙门氏菌和李斯特杆菌的 生长。 e ) 提高营养价值 利用乳酸菌和葡萄球菌生产发酵香肠。可使肉中的蛋白质分解成肽及氨基酸并产生大量 的风味物质，提高产品的消化率。 l - 2 4 2 乳酸菌的筛选标准 并不是所有的乳酸蔼都能用于晦类发酵，肉类发酵的乳酸菌应具备以下特性l 。l ； 1 食盐耐受性，在6 的盐水仍能正常生长( 食盐w 水分x i o o ) ； 2 对亚硝酸盐有一定耐受力在8 0 ，1 0 0 p p m 的浓度下生长良好； 3 在2 6 7 - 4 3 温度范围内生长。最适生长温度为3 2 2 c ； 4 同型发酵，利用葡萄糖仅能产生乳酸； 5 一般不能分解蛋白质和脂肪； 6 发酵不会使产品产生异味： 7 为非致病菌 8 在5 7 - 6 0 c 温度范围内无活性。 1 3 研究目的、意义及内容 1 3 1 课题目的及意义 发酵作为一种古老的加工和保藏食品的手段。很早以前就被人们应用于肉类食品，发酵肉 制品是通过微生物发酵作用( 主要是乳酸菌发酵) 加工制成的肉制品。 我国的传统肉制品如腊肉、腊肠、火腿等在加工过程中都存在不同程度的微生物发酵作 用，晟具典型代表性的产品应属我国南方部分少数民族地区的“酸肉”类产品，这些产品经微生 物发酵和后期成熟后产生了独具特色的风味品质，同时也拥有了良好的耐贮藏性。可是到目前 为止，大多数的中式肉制品仍沿用几百年来流传下来的作坊式生产方式，生产工艺不规范，卫 生条件差在与西式肉制品的竞争中处于明显的劣势。 西式发酵香肠是国外发酵肉制品的代表性产品，过去这类产品在冒外也是采用传统方式生 产，可是现在基本上均添加发酵剂采用标准化工业生产模式，产品生产周期短，质量一致性好。 8 中国农业大学确士学位论文 第一章前言 发酵内制品因为风味独特耐贮藏。而且对人体具有一定的益生保健作用，符台当今消费 者的消费需求，所以其开发潜力被业内人士看好。实际上，国内从事肉制品加工的大型企业如 双汇集团、蓐润集团和唐人神集团等近几年都倾力进行发酵内制品的开发研究。不过目前国 内生产发酵肉制品所使用的微生物发酵剂均依赖进口从长远来看，这可能成为我国发酵肉制 品规模化生产的制约因素。另一方面，我国传统发酵肉制品的加工周期较长加工过程难以控 制，只有通过添加人工发酵剂才能实现缩短生产周期。控制产品质量的目的。 使用发酵剂生产发酵肉制品可以缩短生产周期，提高产品的质量稳定性。因此，微生物发 酵剂是发酵肉制品生产的关键因素之一。发酵剂中参与发酵的微生物主要是乳酸菌。乳酸菌能 将原料中的碳水化合物分解为乳酸，导致产品的p h 值下降，这一方面对病原菌及有害菌的生 长起到抑制作用i 1 j ：另一方面赋予产品特有的风味和坚实的质地。此外，乳酸的产生还会加速亚 硝酸盐向一氧化氮肌红蛋白的转化，减少产品中亚硝酸盐的残留董l “，同时促进了良好色泽的 形成。另据报道，某些乳酸菌在代谢过程中还会产生h 2 0 2 、细菌素等。会进一步抑制腐败及有 害微生物的生长繁殖州1 因此，乳酸菌的筛选研究对发酵肉制品的开发有着十分重要的意义。 在我国发酵香肠仍处在研究阶段。国内学者张红城等人研究了在模拟肉肠中筛选用于生产 发酵香肠的发酵剂嘲l ，罗红霞等人研究了不同配比的发酵剂的优选i 叫，王雪青等人研究了以干 酪乳杆菌和葡萄球菌为发酵剂生产发酵香肠发酵过程中的主要理化和微生物变化”。马汉军进 行了乳酸发酵中式香肠的菌种及工艺的研究i “。王海燕从发酵香肠混合发酵荆中分离、筛选菌 种。分析其微生物特性、产酸产酶能力以及在发酵香肠中应用，研究了发酵香肠在发酵成熟过 程中p h 值的变化与微生物生长的关系 6 7 j ，等等。发酵香肠的研究内容包括：具有自主知识产 权的发酵香肠发酵剂的菌种选育；发酵香肠生产工艺中最优参数的确定：发酵香肠发酵成熟过 程中的理化变化和微生物变化以及风味物质的组成。其中核心技术是发酵香肠生产发酵剂的菌 种选育。本研究正是立足于这一核心技术进行的。 目前，臀内学者对菡种的筛选主要集中在已有菌种的配比筛选，本试验拟扶天然发酵肉制 品中分离筛选适用于肉制品发酵的乳酸菌优良菌株，并初步在发酵香肠和发酵肉的生产中加以 应用，为开发新型发酵剂打下坚实的基础并对发酵肉的生产进行初步探索。 1 3 2 课题的主要内容 1 3 2 1 从天然发酵肉制品中分离筛选适用于肉制品发酵的乳酸菌优良菌株并进行鉴定。 1 3 2 2 测试筛选菌株的产酸能力。产蛋白酶和脂酶的活性以及是否具有氨基酸脱羧酶活性。 1 3 2 3 利用筛选出的优良菌株生产发酵香肠和发酵肉，并检测生产过程中产品的微生物、理化 变化，与空白对照组进行比较。 9 中田农业大学硕士学位论文第二章 菌棒的分离缔选与鉴定 2 1 材料与方法 2 1 1 试验材料 第二章菌株的分离筛选与鉴定 2 1 1 1 主要材料 菌株分离材料；1 ) 具有良好风味的自然发酵千香肠l2 ) 自制腌肉 2 1 1 2 主要试剂 0 8 生理盐水 m r s i 删+ o 5 c a c 0 3 固体培养基m r s 液体培养基 革兰氏染色用试剂3 5 过氧化氢 苯甲醇正丁醇0 0 4 的澳酚蓝酒精溶液 微量发酵管及硝酸盐还原试剂：购于杭州天和微生物试剂有限公司 展开剂：水、苯甲