（食品科学专业论文）短双歧杆菌（Bifidobacterium+breve+A04）菌株的高密度培养.pdf

捅要 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 是人畜等温血动物肠道内重要的生理性细菌之一，它在肠道菌 群中所占比例直接影响着宿主的健康状况。我国乃至世界范闱内，优良双歧杆菌资源的开发和利 用已成为食品和医药等领域研究的热点。针对国内仍没有双歧杆菌高密度培养的发酵研究的现 状，本课题采用几种不同发酵培养方式，包括分批培养、补料分批培养、重复分批培养和细胞循 环培养等方法，比较了短双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u mb r e v ea 0 4 ) 在发酵过程中菌体生长的比生长 速率大小，设计了补料膜过滤两者耦合的细胞循环培养连续发酵系统，最终实现双歧杆菌高密度 发酵的目的。这是国内外首次利用这种耦合方式进行双歧杆菌的高密度培养。本研究主要以短双 歧杆菌a 0 4 为出发菌株，对它的高密度发酵方式进行了较为系统的研究，得到了以下主要结论： ( 1 ) 采用响应曲面法对t p y 培养基的营养组分进行了优化，获得最佳培养基配方( l ) ：葡萄 糖5 1 9 4 9 ，酵母膏2 8 2 9 9 ，低聚果糖2 9 ，西红柿汁5 0 r a l ，肝浸液5 9 ，t w e e n 8 0i m l ，半胱氨酸 盐酸盐0 3 9 ，p n6 5 。发酵最终获得菌体干重4 4 6 2 4 - 0 0 1 2 9 l ，是优化前的1 4 3 1 倍。对双歧杆 菌的环境条件进行了优化，得出b b r e r e a 0 4 菌株最佳生长温度为3 7 c ，最适接种量为8 。 ( 2 ) 短双歧杆菌发酵过程中，h + 不是抑制菌体生长的主要影响因子；乙酸根和乳酸根离子是影 响菌体生长的主要因素。 ( 3 ) 采用三种不同流加反馈方式的单一补料分批培养和重复分批培养对丑b r e v ea 0 4 进行发酵， 结果表明：重复分批培养获得了较高的菌体干重1 0 2 3 0 4 - 0 0 l l g l ，恒p h - 指数流加培养方式次之， 获得了较高的菌体干重9 5 5 14 - 0 0 1 5 9 l 。然而，通过比较两者的比生长速率和原料利用率，选择 恒p h 一指数流加培养方式作为细胞循环耦合培养的基础。 ( 4 ) 采用补料一膜过滤系统细胞循环培养体系发酵最b r e v ea 0 4 菌体，菌体干重达到了6 3 2 1 8 4 - o 0 2 1 9 l ( 1 3 x1 0 1 3 c f u m l ) ，说明了错流过滤对代谢产物的排除是非常快速和有效的。所得菌体 干重是分批发酵的6 倍，是恒p h 一指数补料分批培养的3 4 倍，是重复分批培养的3 倍。这表明了此 培养方式是非常有效的高密度发酵方式。 关键词：双歧杆菌，高密度培养，补料分批培养，细胞循环培养 a b s t r a c t b i f i d o b a c t e r i u mh a sb e n e f i c i a le f f e c t so ni n t e s t i n a lb a l a n c ea si m p o r t a n ti n h a b i t a n t si ni n t e s t i n a l t r a c t so fm e na n da n i m a l s b i f i d o b a c t e r i aa r eg a i n i n gc o m m e r c i a ls i g n i f i c a n c ed u et ot h e i rp r o b i o t i c p r o p e r t i e s l i a l ei ss t i l lk n o w na b o u tt h ep r o d u c t i o no f b i f i d o b a c t e r i aa n dt h e i rb e h a v i o ri nb i o r e a c t o r s i nt h i sp a p e r , s e v e r a ld i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nm e t h o d s ，i n c l u d i n gb a t c hf e r m e n t a t i o n ，f e d - b a t c h f e r m e n t a t i o n r e p e a t e db a t c hf e r m e n t a t i o na n dc r o s s - f i l t r a t i o nf e r m e n t a t i o n ，w e r eu s e da n dc o m p a r e d f i n a l l y , an o v e lf e r m e n t a t i o nm e t h o dw a sd e s i g n e da n da p p l i e dt oc u l t u r eb i f i d o b a c t e r i u mb r e v ei n h i g l l d e n s i t y ( 1 )r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e dt oo p t i m i z em e d i u mc o m p o n e n t s t h eo p t i m u m m e d i u mc o m p o s r i o n sw e r ea sf o l l o w s ( ，l ) ：g l u c o s e5 1 9 4 9 ，y e a s te x t r a c t2 8 2 9 9 ，f o s2 9 ， t o m a t o j u i c e5 0 m l ，l i v e ri n f u s i o n5 9 ，t w i n 8 0l m l ，c y s t e i n e - h c lo 3 9 ，p h6 4 6 3 t h ef m a l b a c t e r i ad r yw e i g h tw a s4 4 6 2 - 1 - 0 0 1 2 9 l ，w h i c hw a s1 4 3 - f o l dt h a nb e f o r eo p t i m i z a t i o n t h e o p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：t e m p e r a t u r e3 7 c ，i n o e u l u m8 ( 2 ) t h em e t a l i s mr e s u l t ss h o w e d ，mw a sn o tc r u c i a lf o rt h eg r o w t hi n h i b i t i o no nb i f i d o b a c t e r i a d u r i n gf e r m e n t a t i o nw h i l el a c t i ca c i da n da c e t i ca c i di r o nw a s ( 3 )b i f i d o b a c t e r i u mb r e v es t r a i nw a si n v e s t i g a t e di nd i f f e r e n tf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o n sa n dr e p e a t e d b a t c hc u l t u r eu n d e ra n e r o b i cg r o w t hc o n d i t i o n s ( n 2g a s e sa d d e da n da g t i t a i o ns p e e d10 0m a p ) t h ep h - s t a tf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o nw a sa ne f f e c t i v es t r a t e g y , t h r o u g hw h i c hb a c t e r i ad r y w e i g h to b t a i n e d9 5 5 1 o 0 1 5 9 n 一t h ec e l ld r yw e i g h to b t a i n e d1 0 2 3 0 - t - 0 o l l g li nr e p e a t e d b a t c hc u l t u r ei tm i g h tb eb e c a u s eo f t h ee x c h a n g eo f t h em e t a l i t e s ( 4 ) t h en e w l yc u l t u r et e c h n i q u eo ff e d - b a t c ha n dc r o s s - f i l t r a t i o ns y s t e m sw a sd e v e l o p e da n d f i r s t l ya p p l i e di nt h ef e r m e n t a t i o no fb i f i d o b a c t e r i a u s i n gt h i sf e r m e n t a t i o ns y s t e m ，t h ef i n a l m a x i m u mc e l lc o n c e n t r a t i o no b t a i n e d1 3x10 1 3 c f u m l ，d r yc e l lw e i g h t6 3 218 0 0 21g l k e yw o r d s ：b i f i d o b a c t e r i u mb r e v e , h i g hd e n s i t yc u l t u r e ，f e d b a t c hc u l t u r e ，c e l l - c y c l ec u l t u r e l i 缩略词表 i v 独创性声明 y - 9 3 9 5 3 7 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间：州年石月彦日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签轹岁琦 剔磁轹务多 f， 时间：刀嘭、年占月，押 嘲闻：沙9g 每彳具f 铲 中国农业大学硕士学位论文 绪论 第一章绪论 双歧杆菌是人和动物肠道内重要的生理性细菌之一，它与其它生理性细菌成员构成一个微生 物群落，并与宿主构成微生态系统。双歧杆菌具有维持微生态平衡、生物拮抗、免疫调：i 了、营养 等多方面的生理功能，双歧杆菌制备微生态制剂已广泛应用于医疗、保健、食品等行业( p o u p m d ， e ta i 。1 9 7 3 ；徐营等，2 0 0 1 ) 。随着大规模工业化生产的要求，微生物的高密度发酵应邀崛起，它 受诸多因素和条件的影响和制约，在传统发酵基础上建立发展起来。现代发酵技术经过几十年的 深入研究，结合反应器的合理设计、配置、操作和控制，基本实现了高密度发酵。 1 1 双歧杆菌 1 1 1 双歧杆菌的发现及生物学特性 1 8 9 9 年，法国巴斯德研究院的t i s s e r 教授首次从健康母亲喂养的婴儿粪便中发现了占绝对优 势的革兰氏阳性杆菌，他发现天然营养儿和人工营养儿的大便内均有一种革兰氏阳性的多形态的 杆菌，天然营养儿较人工营养儿多，甚至处于纯种状态。再者，不论那种营养方式的婴儿在患腹 泻的时候，这种杆菌就会减少或消失( t i s s e r , 1 9 0 0 ) 。然而，由于当时认识有限，直到1 9 7 4 年这 种菌才被正式命名为双歧杆菌。 双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 是革兰氏阳性、多形态杆菌。菌体形状呈y 字形、v 字形、弯 曲状、刮勺状、棒状等。双歧杆菌不形成芽孢，亚甲基兰染色菌体着色不规则，无运动性，专性 厌氧，过氧化氢酶阴性，不还原硝酸盐，吲哚反应阴性，明胶液化阴性，联苯胺反应阴性。经多 次传代后可变成微需氧( 康白，1 9 9 8 ；r a s i ce t 口，1 9 8 3 ；n o v i k , 1 9 9 8 ) 。 双歧杆菌最适生长温度3 7 - 4 1 ，最适发酵温度3 5 - 4 0 ，最低生长温度2 5 2 8 ，最高生长 温度4 3 - 4 5 c ；起始生长p h 值为6 7 7 0 ，p h 值4 5 5 0 以下或p h 值8 0 - 8 5 以上的环境中一般 不生长。菌落为圆形凸起、光滑，边缘整齐；在血平板上，菌落白色或乳白色( b i a v a t ie t a l 1 9 8 4 ： f u l l e r , 1 9 8 9 ；孟祥成，2 0 0 2 ；郭本恒，2 0 0 3 ) 。 目前，根据d n a 同源性，自从1 9 8 6 年版的伯杰氏细菌学鉴定手册将双歧乳杆菌属分为2 4 个种以来，近1 0 年来又陆续发表了8 个新种。其中分离自人体的有1 2 个种，除3 个种来自人齿 外，其余均来自人的肠道粪便( 凌代文，1 9 9 8 ) 。存在于人体中的有：两歧双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u m b i f i d u m ) 、青春双歧杆菌( 丑l e s c e n t i s ) 、婴儿双歧杆菌组i n f a n t ) 、短双歧杆菌( 且b r e l ；e ) 和长 双歧杆菌( 曩l o n g u m ) 。通常在婴儿肠道内以婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌占优势；在成人肠道中 缺少这两种双歧杆菌，主要是青春双歧杆菌和长双歧杆菌，当然有时有少量的两歧双歧杆菌 ( b i a v a t ie ta 1 ，1 9 8 4 ；f u l l e r ，1 9 9 1 ) 。 1 1 2 双歧杆菌的代谢途径 由于缺乏醛酶和葡萄糖辱磷酸脱氢酶而含有果糖- 6 磷酸盐磷酸酮酶( f 6 p p k ) ( g o t t s c h a l k 。 1 9 8 5 ；c h e v a l i e re ta 1 ，1 9 9 0 ) ，双歧杆菌具有特殊的双歧支路代谢途径，其中果糖6 磷酸盐磷酸酮 中国农业大学硕士学位论文绪论 酶( f 6 p p k ) 是双岐代谢途径中特征性的关键酶。葡萄糖代谢是按果糖6 磷酸盐磷酸酮酶途径水解， 最后生成乙酸和乳酸，二者摩尔比儿乎为1 5 ：l ，不生成c 0 2 、。j 酸、丙酸，所产乳酸皆为“l ”型， 易消化吸收：d n a 碱基组成摩尔百分比为5 7 6 8 。此外，双歧杆菌中还有0 【、1 3 - 半乳糖苷酶，伍、 b 葡萄糖营酶及人体不能消化的寡糖的酶类、肽酶、磷蛋白磷酸酶、胆酸代谢酶、结合胆酸水解 酶、降解n - 亚硝酸的酶等许多种酶类，这些酶类参与人体的代谢活动，对人体健康生理功能有积 极的作用( c h e v a l i e re ta l 。1 9 9 0 ；k a n d l e r , 1 9 8 3 ) 。 2 葡莓糖 果十p 粟一e - p 赤藓麓_ i _ p 乙醚磷酸 1 8 ) j 篇 厂 扣了 0 0 5 ) ；d n s 方法与另外两种方法相比则差异性较为显 著( 尸 | t l t fp r f 回归方程的方差分析结果表明，回归方程的相关系数r 2 达到o 9 5 以上，该模型适用于双歧杆 菌a 0 4 菌株产量的理论预测。c o e f f i c i e n to f v a r i a t i o n 模型预测与实际结果相对误差在士5 0 以内。 模型的校正系数也进一步解释了双歧杆菌菌体干重响应值的变化。同时，分析结果也表明，除x 。 以外，各因素对菌体干重在p o 0 5 ) ，因此，这表明了h + 不是抑制最厶措阳a 0 4 生长的主要影响因子。值得考虑的是，乙 酸根和乳酸根离子可能是影响菌体生长的主要因素。 3 3 5 乳酸盐和乙酸盐对& b r e v ea 0 4 菌株发酵过程的影响 为了进一步证实和研究乙酸根和乳酸根离子对菌体生长的影响，进行了乙酸根和乳酸根离子 的反馈抑制试验，结果见图3 - 5 。 口 、 _ 小 拉 盯 5 d 5 051 01 52 0 2 53 03 54 0 潦加量f f ，d 圈3 - 5 发酵过程中乙酸盐和乳酸盐对最b r e v ea 0 4 誓体产量的影响 f i g 3 - se f f e c to fm e t a b o l i cp r o d u c to n 晟b r e v ea 0 4 5 5 5 2 5 l 5 o 5 2 l o 中国农业大学硕士学位论文 第三章置b r e v ea 0 4 菌株主要代谢产物变化的研究 从图3 5 可看出，随着乙酸盐和乳酸盐浓度的增加，双歧杆菌生长越来越受到限制，其中乳 酸根离子对菌体的抑制效果比乙酸根明显。乳酸盐浓度为2 0 m g m l 时，短双歧杆菌生长发生了明 显的改变；当乳酸盐浓度增至3 0 m g m l 以_ = 时，双歧杆菌所受影响最大。乙酸盐浓度达至0 3 0 m g m l 时对双歧杆菌的生长有较人的影响。因此，选择单一培养或设计混合培养提高菌体含鼙的培养方 式时，不仅要考虑n i l + 对菌体生长的影响，也要考虑酸根离子对双歧杆菌菌体生长的作用。 3 4 本章小结 短双歧杆菌a 0 4 发酵过程中，h + 不是抑制菌体生长的主要影响因子：乙酸根和乳酸根离子是 影响菌体生长的主要因素。 中国农业大学硕士学位论文第四章补料分批培养b i f i d o b a c t e i r u mb r e v ea 0 4 菌株的研究 第四章补料分批培养b i f i d o b a c t e i r u mb r e v ea 0 4 菌株的研究 4 1 前言 革兰氏阳性、不运动厌氧菌双歧杆菌，一直是人类和温血动物肠道内的自然宿主体。它们通 过乳酸和乙酸的释放调节控制大肠和小肠肠道内酸性环境，抑制致病菌和腐败菌的生长( r o u b o s 甜a ，1 9 9 9 ) 。由于其具有一定的保健和医疗功能，因而被广泛地应用在奶制品、饮料、乳酪产品、 蛋糕以及保健品中。为了更广泛、更有效地发挥双歧杆菌的益生功能，人们采用高效的发酵手段 来获得高密度的双歧杆菌菌体。 补料分批培养技术是细胞的高密度发酵方式之一，因为补料分批培养策略能够避免乙酸之类 的代谢抑制物的积累而获得较高的细胞密度，能够通过补料自由地控制营养物浓度，延长传统的 分批发酵过程。因此，本研究在上述代谢变化的基础上，以新鲜培养基溶液作为流加补料液，采 用恒速补料流加、指数流加、恒p h 指数流加和重复分批四种不同的策略来发酵菌体细胞。 4 2 材料与方法 4 2 1 材料 两株 置b r e v ea 0 4 为筛选出的耐消化道逆环境菌株，来源于广西巴马百岁以上长寿老人粪便。 培养基 同上章。 主要仪器 7 2 2 s 分光光度计( 上海棱光有限公司) ；超挣工作台( 北京赛伯乐试验仪器有限公司) ；高压 灭菌锅( 江阴滨江医疗设备厂) ；电热恒温培养箱( 上海精宏试验设备有限公司) ；发酵罐( b b r a u n c ，上海精宏试验设备有限公司) ；水浴锅( 北京长安科学仪器厂) ；离心机；光学显微镜；厌氧 管；厌氧瓶；氮气瓶等。 4 2 2 试验与分析方法 补料分批培养 以8 的接种量( 大约1 0 8 个m l ) ，将最b r e v ea 0 4 菌株接种至m r s 液体培养基中，3 7 * ( 2 厌 氧培养2 4 h 。在i ：作体积6 0 0 m l 的l l 厌氧瓶( 充有高纯n 2 ) 中发酵培养。分批培养8 h 后，打 开蠕动泵，分别采用三种不同的补料流加方式( 分别为恒速流加，指数流加和恒p h 值指数流加) 培养双歧杆菌，具体方法见表4 一l 。发酵温度3 7 1 2 ，p h 值6 0 。发酵过程中均以对数生长期进行 补料，平衡期补料结束。 根据菌体的生长曲线，补料分批培养设计为三个阶段：0 - - 8 h 分批培养；8 一1 6 h 补料分批培 3 0 中国农业大学硕士学位论文第四章补料分批培养b i f i d o b a c t e i r u mb r e v ea 0 4 菌株的研究 养，1 6 h 2 4 h 分批培养。恒p h 流加时控制p h6 o 。 裹4 - 1 兰种不目的补料漉加方法 t a b l e4 - 1t h r e ed i f f e r e n tf e d - b a t c hm e t h o d s 重复分批培养 重复分批发酵第一阶段同分批发酵相同。当p h 值下降至恒定时，流出3 4 发酵液，然后泵入 同样体积的新鲜培养基，每4 5 h 一个循环，连续循环6 次。培养温度3 7 c ，p h 6 0 。 分析方法 o d 值；菌体干重 4 3 结果与分析 4 3 1 分批培养 厌氧瓶发酵培养 图4 - 1 厌曩瓶象件下最b r e v ea 0 4 菌株的发酵曲线 f i g4 - 1f e r m e n t a t i o nc u r v eo f & b r e v ea 0 4i ni la n e r o b i cf e r m e n t o r 在分批培养过程中，及b r e v ea 0 4 菌株接种发酵8 h 后，p h 值降至4 3 ，此后基本维持不变。菌 体细胞浓度达到8 8 x1 0 9 c f u m l ，菌体干重达到了5 1 84 - 0 0 1 2 9 l 。 3 l o 口口口o 8 6 4 2 8 6 4 2 2 l l l：吼仉吼队d 2 0 8 6 4 2 0 甚一in葛=一摄锄燧 5 l 自动发酵罐分批培养 135 791 3 时瞅h ) 图4 - - 25 l 自动发酵罐中& b r e v ea 0 4 麓株的发酵蕾线 f i g 4 2f e r m e n t a t i o nc u r v eo f & b r e v e a 0 4i n5 lf e r m e n t o r 5 l 自动发酵罐分批培养过程中，ab r e v ea 0 4 菌株发酵过程与ll 厌氧瓶中基本一致。最大菌体 细胞浓度达到9 5 1 0 9 c f u m l ，菌体干重达到5 2 3 j ：0 0 8 9 l 。 由图4 1 和4 2 可看出，双岐杆菌在ll 厌氧瓶和5 l 发酵罐发酵过程中发酵曲线基本一样，延滞 期很短，很快进入对数生长期，分别在8 h 和l o h 比生长速率达到最大。此后至2 4 h 为稳定期，菌体 浓度几乎维持不变。通过s a s 统计学分析结果表明，两者结果并无显著性差异( p o 0 5 ) 。 4 3 2 单一补料分批培养 薹墨8 譬 6 5 4 3 翟 2 1 0 481 01 2 1 41 61 82 02 2 2 4 时阅阻) 图j i - 3 懂遗流加方式下& b 愆l , ea 0 4 葺株的发酵曲线 f i g 4 - 3f e r m e n t a t i o nc u r v eo f & b r e v ea 的u n d e rt h ec o n d i t i o n so fc o n s t a n ts p e e d 3 2 o 口心q o 8 7 6 5 4 3 2 ， 0 2 0 8 6 4 2 o hd善3ku兽壤翻挈f 由图4 3 可看出，恒速流加过程中，随着发酵时间的延长，菌体浓度早不断增长的趋势，1 6 h 后达到稳定期。发酵过程中最大菌体细胞浓度达到7 6 1 0 加c f u m l ，菌体干重达到7 4 7 9 - 士0 0 0 9 9 几。 指数流加方式 481 0 1 21 4 1 6 1 82 0 2 22 4 时闻( h ) 图4 - - 4 指数流加象件下最b r e v ea 0 4 蕾株的发酵曲线 f i g 4 - 4f e r m e n t a t i o nc u r v eo f b b r a ea 0 4u n d e rt h ec o n d i t i o n so fe x p o n e n t i a ls p e e d 从图4 - 4 可看出，指数流加过程中，随着营养物质的流加，菌体浓度呈上升趋势，这表明了营 养物质明显地促进了菌体细胞的生长。发酵过程中，最大菌体浓度达到了3 5 x1 0 c f u m l ，最大 菌体干重9 3 4 0 i - 0 0 31g l 。 恒p h - 指数流加方式 1 一7 q = ： 。一。 一蒽体干重 481 0 1 2 1 41 61 82 02 2 2 4 时阅( h ) t 6 5 4 翟 3 2 l 0 圈4 - 5 恒p h 指数漉加方式下& b r e v ea 0 4 曹株的发酵曲线 f i g 4 - 5f e r m e n t a t i o nc n f v eo f 晟加研崾a 0 4u n d e rt h ec o n d i t i o n so fp h - s t a ta n de x p o n e n t i a ls p e e d 3 3 6 5 哇 3 2 1 o 2 0 8 6 4 2 0 一玄n葛一哺【豢滴挈5 一3嘲似埝豫 4 2 0 8 6 4 2 0 一言n葛v-【鞭橱挈 一一、v懈*肇袒 中国农业大学硕士学位论文 第四章补料分批培养b i f i d o b a c t e i r u mb r e v ea 0 4 菌株的研究 从图4 5 可看出，恒p h 指数流加过程中，随着发酵时间的延长，菌体浓度早上升趋势，这是 由于代谢产物中营养物质的流加，在一定程度上促进了菌体细胞的快速生长。发酵过程中，最高 点的菌体浓度达到了6 2 1 0 c f u m l ，最人菌体干重达到了9 3 8 9 士0 0 3 0 9 l 。与指数流加方式相比， 统计分析表明了两者之间井无显著的差异( p o 0 5 ) 。这可能是由于代谢物的中和作刚并没有在 很人程度上刺激了菌体的生k 。 5 l 自动发酵罐条件下恒p h - 指数流加发酵 1 4 1 2 l o 481 01 21 41 61 82 02 22 4 时问( h ) 圈4 咱5 l 自动发酵罐中恒洲指数漉加方式下丘b r o v oa 0 4 菌株的发酵曲线 f i g 4 - 6f e r m e n t a t i o nc u r v eo f b b r e v ea 0 4u n d e rt h ec o n d i t i o n so f p h - s t n ta n de x p o n e n t i a ls p e e di n5 lf e r m e n t o r 从图4 - 6 可看出，5 l 自动发酵罐、恒p h 指数流加发酵丑b r e v ea 0 4 菌株过程与厌氧瓶中发酵过 程类似。结果表明，1 6 h 达到最大菌体浓度8 7 x1 0 c f u m l ，菌体干重达至e t 9 5 5 9 _ _ _ 0 0 0 9 9 l 。与 厌氧瓶发酵相比，统计分析表明了两者之间并无显著差异( p 苫v等簌圈蜓-11 v 幡巾埝扭 。“：。2 蚤2 譬皇兰2 ：斜焉器善器；磊霸瞬嚣高拿 嗍 b 1 4 - 7 重复分批培养& 6 ，譬坨a 0 4 曹株的发酵曲线 f i g 4 - 7f e r m e n t a t i o n c u r v eo f b b r e p ea 0 4u s i n gr e p e a t e db a c t c hf e r m e u t i o n 从图4 7 可看出，重复分批培养连续六次循环后，获得最大菌体产量l o 。2 3 - 1 - 0 0 l l g l 显著高于 分批发酵和补料分批发酵，活菌数达到了1 6 x1 0 1 2 c f u m l 。这可能是由于大量新鲜培养基的泵入 明显降低了发酵液中的氧化还原电势，削弱了酸根离子的浓度，从而使得菌体细胞连续增长。 4 3 4 不同培养方式条件下最b r e v ea 0 4 菌株发酵结果的比较 根据微生物生长规律，对数生长期微生物的生长可用数学模型表示： 坐： 破 。 其中，n ，细胞数量m l u ，比生长速率，每单位数量的细菌在单位时间内的增加量 t ，培养时间 该式最后变换为： l g n l g n o 。志( f - t o ) 比生长速率i l 是准确地描述单细胞菌体生长情况的有效参数。它能帮助我们深刻地了解不同 生长条件下菌体的生理状态和繁殖能力，与茵体浓度( o d 咖) 和菌体干重比较而言，比生长速率 更能从本质上反映菌体密度增加的速度。 5 l 自动发酵罐中的分批培养、补料分批培养和过滤耦合培养的比生长速率具体见表4 - 2 。 3 5 i 2 0 8 6 4 2 0 一巾草捆 中国农业大学硕士学位论文第四章补料分批培养b i f i d o b a c t e i r u mb r e v ea 0 4 菌株的研究 表4 - 2 兰种培养方式比生长速率的比较 t a b l e4 - 2s p e c i f 靠cg r o w t hr a t ei nf o u rd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 表4 2 为三种不同培养方式比生长速率的分析。可以看出，重复分批培养获得了较高的菌体干 重1 0 2 3 + 0 0 1 1 9 l 。分批培养过程中，由于培养基中乳酸和乙酸等代谢产物的不断积累，对菌体 细胞产生了一定的毒害，一定程度上抑制了菌体细胞的生长。恒p h 指数流加补料分批培养中，由 于对数生长期内不断地流加一定量的补料液和p h 的调节和控制，给菌体生长提供了足够的营养物 质和发酵环境，为菌体提供了有利的生长条件。同时，恒p h 指数流加补料分批培养比生长速率的 下降速度明显低于分批培养过程，但乳酸等代谢阻遏物的不断积累仍对比生长速率有一定的负面 影响。 4 4 讨论 本研究通过对p h 值的监控成功地研究了补料分批培养中ab r e v ea 0 4 菌体细胞的生长情况。 通过5 l 自动发酵罐与厌氧瓶不同发酵容量的比较表明5 l 自动发酵罐获得了更高的菌体浓度。这可 能是由于前者参数控制更为精准，尤其是p h 值的调控，为双歧杆菌提供了良好的、严格的厌氧发 酵条件。同时，也表明了双歧杆菌对环境的变化是非常敏感的，精确地控制发酵的环境条件对高 效发酵双歧杆菌是非常重要的。 4 5 本章小结 ( 1 ) 厌氧瓶发酵中，恒速流加过程中，菌体细胞浓度达到7 6 1 0 加c f u m l ，菌体干重达到 7 4 7 9 a ：0 0 0 9 9 l ：指数流加过程中，菌体浓度达到了3 5 1 0 c f u m l ，最人茵体干重9 3 4 0 - j = 0 0 3 1g ，l ； 恒p h - 指数流加过程中，菌体浓度达到了8 2 1 0 c f u m l ，最人菌体干重达到了9 3 8 9 士0 0 3 0 9 l 。 5 l 自动发酵罐发酵过程中，恒p h 指数流加发酵菌体浓度达到了8 7 1 0 c f u m l ，茵体干重 达到了9 5 5 9 _ _ _ 0 。0 0 9 9 l 。重复分批补料发酵菌体浓度达到1 6 1 0 1 2 c f u m l ，菌体干重达到了1 0 2 3 4 - 0 o li g l 。 中国农业大学硕士学位论文 第四章补料分批培养b i f i d o b a c t e i r u 小b r e v e a 0 4 菌株的研究 ( 2 ) 比较不同补料分批发酵方式的比生长速率，结果表明，恒p h 一指数分批补料发酵优于其他 培养方式。重复分批补料培养说明了代谢产物的排除对双歧杆菌菌体的生长起到了一定的促进作 用。 3 7 中国农业大学硕士学位论文 第五章b i f w l o b a c t e v i u mb r e v ea 0 4 菌株的细胞循环培养 第五章b i f i d o b a c t e r i u mb r e v ea 0 4 菌株的细胞循环培养 5 1 前言 自双歧杆菌发现以来，人们一直认为它不仅可以平衡健康人体内的微生物菌群，而且能对宿 主体产生有益影响。许多国家的研究均表明，益生菌产品中的菌体含量过少( h a m i l t o na n ds h a h s 。 1 9 9 9 ) 。为了弥补这个缺陷，研究者不仅采用了补料分批培养来提高菌体含量，同时，也利用过 滤和连续发酵相结合的细胞循环培养扩大目的菌体的产量。然而，最终所获菌体产量仍达不到：】 = 业化生产的要求。顺应这一趋势，人们设计并开发出具有每种培养方式优势的耦合发酵技术以满 足工业化生产的需求。m a s a y u l dt 等人( 1 9 8 7 ) 曾设计了连续培养和错流过滤的细胞循环培养方 式，获得了较大的成功，最终乳酸产量是分批培养的6 倍以上。p r i g e a tc ( 1 9 8 8 ) 也采用细胞循环 反应发酵s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s 菌株，取得了一定的成功。 随着发酵工程领域中发酵设备和调控手段的进一步完善，人们在此基础上开发和设计出补料 分批培养和细胞循环培养两者耦合的有效发酵方式。w o os a 等人( 2 0 01 ) 采用细胞循环补料分 批培养重组大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i ，证实了它是更为有效的一种发酵方式。本研究参照此方法， 对短双歧杆菌a 0 4 菌株进行两种高效发酵手段的细胞循环发酵，为进一步的：【业化生产提供一定 的理论依据。 5 2 材料与方法 5 2 1 材料 试验菌株 及b r e v e a 0 4 菌株，来源于广西巴马百岁以上长寿老人粪便。 培养基 同第二章。 主要仪器 5 l 全自动发酵罐( b b r a u t 系列) 过滤膜具( 北京金峡过滤膜具有限公司) 7 2 2 s 分光光度计( 上海棱光有限公司) 超净：一【：作台( 北京赛伯乐试验仪器有限公司) 高压灭菌锅( 江阴滨江医疗设备厂) 电热恒温培养箱( 上海精宏试验设备有限公司) 水浴锅( 北京长安科学仪器厂) ：离心机；光学显微镜；厌氧管；氮气瓶等。 3 8 中国农业大学硕士学位论文 第五章b i f i d o b a c t e r i u mb r e v ea 0 4 菌株的细胞循环培养 5 2 2 试验方法 细胞循环培养 细胞循环培养过程中，采刚聚砜过滤膜，截留分子量5 0 0 0 0 d a 。发酵前，整个膜过滤系统采 用5 m g m l 双氧水灭菌2 h 并川无菌蒸馏水清洗。 整个发酵过程是恒p h 补料分批培养耦合膜过滤细胞循环系统。两个蠕动泵和一套错流过滤 膜具被同时使用，错流过滤膜截留分子量的大小为5 0 0 0 0 道尔顿。两只蠕动泵，一支用来重复循 环发酵罐和外膜之间，另一个则连接内膜用作流速控制。 随着补料液的加入，不含细胞的发酵液被排除，同样体积的补料液被泵入。主要分为四个阶 段：o - 8 h 分批培养，8 一 1 6 h 补料分批培养，1 6 , - 2 4 h 细胞循环培养，2 4 3 2 h 补料分批培养， 3 2 - 4 8 h 细胞循环培养，4 8 - 5 6 h 分批培养。培养温度3 7 c ，p h 值为6 0 。每4 h 检测发酵样品。 过滤耦合培养系统图 细胞循环培养中，设计了一种过滤培养耦合发酵系统，具体见图5 1 。 圈5 _ 1 细胞g i l t s 壤养模型圈 f i g s - is c h e m a t i cv i e wo f t h ec o n t i n u o u sc u l t u r ea s s e m b l y w i t ht h ec e l l - r e c y c l i n ge q u i p m e n t 试验流程 在恒p h - 补料分批培养耦合膜过滤细胞循环反应系统中，5 l 全自动小型发酵罐中原始发酵液 体积为3 0 l 。以8 的接种量接种后，培养至对数生长期，开始进行第一次细胞循环培养，在压 力的作用下，用蠕动泵滤出发酵液2 0 l ，去除代谢阻遏物乙酸和乳酸等代谢产物，同时，菌体细 3 9 中国农业大学硕士学位论文 第五章b i f i d o b a c t e r i u mb r e v ea 0 4 菌株的细胞循环培养 胞被整体截留并泵同发酵罐中。随后，新鲜培养基被泵入发酵罐中维持发酵罐中体积不变。发酵 培养一定时间后，按照第五章的方法和参数进行补料分批培养直至体积达到4 l 。在细胞循环过 程中，过滤细胞的流速维持在6 8 0 m l m i n 。 5 3 结果与分析 5 3 1 最b r e v e 0 4 菌株的发酵动力曲线 细胞循环发酵过程中，由于代谢阻遏物的不断流出和新鲜培养基的不断泵入，为发酵罐内的 菌体细胞的生长创造了良好的生长环境。图5 2 显示的是过滤耦合培养最b r e v ea 0 4 菌株的发酵动 力曲线。 ；。r 。一| | 4il ：l 2 02 i2 1 2 ，i o 酎目c 罅 圈和2 过滤耦合培养最b r e v ea 0 4 曹株的发酵曲线 f i g 5 - 2f e r m e n t a t i o nc u l r v eo fb b r e v ea 0 4u s i n gt h ec o m b i n a t i o no ff e d - b a t c ha n dc r o s sf i l t r a t i o nf e r m e n t i o n 由上图可知，经过两次细胞循环培养和一次补料分批培养，活菌数达到了1 3 1 0 1 3 c f u m l ， 菌体千重达到了6 3 2 1 8 + 0 0 2 9 l 。然而，第二次细胞循环结束后，虽然菌体浓度大约成3 倍幅度 增长，但是由于菌体浓度过高产生了自溶现象，使得菌体密度开始有所下降。这点可以通过流加 新鲜发酵液的补料培养予以完善。 细胞循环培养达到了较高的平均比生长速率5 4 6 5 ，这表示细胞处于快速地生长繁殖状态。双 歧杆菌菌体的起始比生长速率明显高于其他三者，此后比生长速率的下降速度也低于其他三种发 酵方式。这表明了错流过滤一补料分批培养耦合系统的是非常有效的高效发酵手段之一。 通过恒p h 值补料流加方式与膜过滤培养的交义使用，给菌体的发酵环境提供了足够的营养物 质和生长环境，解除了基质浓度对菌体生长的限制：错流过滤聚砜膜的使用，滤过液体的排出， 解除了代谢阻遏物对菌体生长的抑制，为双歧杆菌菌体的生长提供了较适宜的内部环境和外部环 境，在较长时间内以较高的比生长速率增殖，最终达到了菌体的高密度培养。如果增加细胞过滤 的次数，菌体浓度可能仍会成倍增长。 2毒)l_攮露安 培 埔 坛 m l 6 2 中国农业大学硕士学位论文第五章b i f i d o b a c t e r i u mb r e v ea 0 4 菌株的细胞循环培养 量奠皇罾量量寞童曩置量量i 一一一 5 4 本章小结 采朋完全截留菌体细胞循环培养，成功地设计出了恒p h 一补料分批培养与膜过滤耦合培养系 统，最终获得最人菌体浓度分别达到了1 3 1 0 1 3 c f u m l ，达到了6 3 2 1 8 + 0 0 2 9 l 菌体干重。这表 明了包含恒p h 聿i 、料分批培养与膜过滤耦合的细胞循环培养是一种高效高密度发酵系统。 聚砜错流过滤膜的使用对代谢产物的排除和菌体的生长起到了一定的促进作用。这是国内外 首次利用这种耦合方式高密度发酵双歧杆菌。 4 l 中国农业大学硕士学位论文 第六章全文总结与展望 6 1 结论 第六章全文总结与展望 本研究主要以来源于广西巴马百岁长寿老人粪便的短双歧杆菌a 0 4 为出发菌株，对它的高密 度发酵方式进行了较为系统的研究，得到了以下主要结论： ( 1 ) 采用响应曲面法对t p y 培养基的营养组分进行了优化，获得最佳培养基配方( l ) ：葡萄 糖5 1 9 4 9 ，酵母膏2 8 2 9 9 ，低聚果糖2 9 ，西红柿汁5 0 m l ，肝浸液5 9 ，t w e e n 8 0l m l ，半胱氨酸 盐酸盐0 3 9 ，p h6 5 。发酵最终获得菌体干重4 4 6 2 + 0 0 1 2 9 l ，是优化前的1 4 3 l 倍。且b r e v e a 0 4 菌株以3 5 3 7 的生长温度为佳，其中以3 7 的生长温度为最佳。它的最适接种量以8 为佳。 ( 2 ) 短双歧