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醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 摘要 醋蛋是广泛流传于我国民间的一种传统保健饮品，利用鸡蛋和食醋泡 制而成，常用来预防及治疗高血压、高血脂等疾病。自古以来，都是根据 经验泡制，并没有形成较为系统的工艺方法，而且针对对其中有效成分所 做研究的较少，其保健机理也没有得到较为充分、合理的论证。 本文借鉴传统的醋蛋泡制方法，在其基础上研究更科学的制作工艺， 结果表明：醋蛋比为3 0m l g ，浸泡温度在2 0 2 5 间，时间不少于3 6h 的条件下，泡制效果比较好。利用葡聚糖凝胶树脂对泡制好的醋蛋进行分 离纯化，得到了具有较高a c e 抑制活性的组分，且具有较好的稳定性，并 研究了其抑制机制，为混合型抑制作用。 在醋蛋泡制的基础上，用微波处理。考察了微波功率、作用时间、反 应温度等因素对产品a c e 抑制活性的影响，并利用响应面设计优化了反应 条件。结果表明，微波作用时间和微波功率对产物的a c e 抑制活性影响较 大，温度对产物活性几乎无影响。得到的最佳条件为：温度为7 0 ，微波 功率2 6 9w ，作用时间3 5 5m i n ，在该条件下微波处理醋蛋，产物的a c e 抑 制率为8 0 1 3 。 用5 种蛋白酶酶解泡制好的醋蛋，结果表明：碱性蛋白酶水解产物对 a c e 的抑制活性最高。考察了各因素对碱性蛋白酶酶解效果的影响，得到 该酶解反应的最佳条件为：反应温度5 0 。c ，底物浓度为8 ，蛋白酶添加量 0 0 0 2g m l ，反应时间4h ，该条件下酶解产物的a c e 抑制率达到5 3 8 7 。 在此基础上，建立了该酶解反应的动力学模型，得到其动力学方程为 删= 7 6 2 5 1 n 1 + ( 4 7 5 8 8 晶e o + 1 0 5 2 ) 小且计算值与实际测定值较吻合。 关键词：醋蛋a c e 抑制肽微波酶解动力学模型 i i p r e p a r t i o no fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e f r o mv i n e g a r e g ga n d i t sb i o l o g i c a la c t i v i t y a bs t r a c t t h ev i n e g a r - e g gi sak i n do fc h i n e s eh e a l t h f u lb e v e r a g ew h i c ha l r e a d y s p r e a dt oc h i n as i n c el o n gt i m e sa g o i ti sm a d ef r o mv i n e g a ra n de g g s ，w h i c h h a sr i c ha n dr e a s o n a b l en u t r i t i o n ，a n di th a sr e m a r k a b l ef u n c t i o no fl o w e r h y p e r l i p o i d e m i aa n db l o o dp r e s s u r e b u ti ti su s u a l l ym a d ea c c o r d i n ge x p e r i e n c e ， s ot h es y s t e mm a r i n a t i n gt e c h n o l o g yh a sn o tf o r m e d t h ea c t i v ec o m p o n e n ta n d m e c h a n i s ma r en o ts t u d i e de n o u g h ，t o o t h ei m m e r s i n gp r o c e s sw a ss t u d i e do nt h eb a s i so ft r a d i t i o n a lt e c h n o l o g y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m a lp a r a m e t e rv a l u e sw e r ea sf o l l o w s ：v i n e g a r v o l u m ew a s3 0m l g 1 ；t e m p e r a t u r ew a s2 0 2 5 ；a n dt i m ew a sn o tl e s st h a n 36 h t h ea c t i v ec o m p o n e n t so fm a r i n a t e dv i n e g a r - e g gw a si s o l a t e dt h r o u g h d e x t r a ng e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h t h ea c t i v ec o m p o n e n t sw i t hh i g ha c e i n h i b i t o r yr a t i oa n dg o o ds t a b i l i t y t h ei n h i b i t i o ne f f e c tw a ss t u d i e d ，a n dt h e r e s u l ts h o wt h a tt h ei n h i b i t o rc a nb em o d e l e da st h em i x e do n e t h em a r i n a t e d v i n e g a r - e g gw a sr e t r e a t d e db ym i c r o w a v e c h a n g e so f a c e i n h i b i t o r yr a t i oo ft h ep r o d u c tw i t hm i c r o w a v ep o w e r , r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n d i i i t i m ew e r es t u d i e d ，a n dt h ec o m b i n e de f f e c t sw e r ea n a l y z e db y r e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s ( r s a ) t h et e s ts h o w e dt h a tt h er e a c t i o nw a sm a i n l yi n f l u e n c e db yt h e r e a c t i o nt i m ea n dt h em i c r o w a v ep o w e r , b u tf e wc o n n e c t i o nw i t hr e a c t i o nt i m e t h eo p t i m a lp a r a m e t e rv a l u e sw e r ea sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r ew a s7 0 ； m i c r o w a v ep o w e rw a s2 6 9w ；a n dt i m ew a s3 55m i n t h er e s u l ti nt h i s c o n d i t i o nw a s8 0 13 5t y p e so f p r o t e a s ew e r eu s e dt oh y d r o l y z et h em a r i n a t e dv i n e g a r - e g g r e s p e c t i v e l y t h eh y d r o l y t eo b t a i n e db ya l c a l a s es h o w e dt h eh i g h e s ta c e i n h i b i t o r ya c t i v i t y t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a sa l s eo p t i m i z e dv i as i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，a n dt h eo p t i m a lt e c h n o l o g i cc o n d i t i o n sw e r e a sf o l l o w s ：h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e50 ，t h ec o n c e n t r a t eo fs u b s t r a t e8 ， 0 0 0 2g m l 1a l c a l a s ew a sa d d e da n dt h er e a c t i o nt i m ew a s4h , a n dt h er e s u l ti n t h i sc o n d i t i o nw a s5 3 8 7 t h ek i n e t i cm o d e lf o rt h eh y d r o l y s i sr e a c t i o nw a s s t u d i e da n dt h ee q u a t i o no fh y d r o l y s i sd e g r e ew a sc o n c l u d e da s ： d h = 7 6 2 5 1 n 1 + ( 4 7 5 8 8a = 0 + 1 0 5 2 ) t ，w h i c hw a sf i t t e df o rt h ee x p e r i m e n t a l 3 n r e s u l t k e y w o r d s ：v i n e g a r - e g g ；a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e ；m i c r o w a v e ；e n z y m a t i c h y d r o l y z a t i o n ；k i n e t i cm o d e l i v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：蜀午里 2 0 0 q 年多月彩日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 一口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 敝储签名：骈星剔币 刖7l 红 r 师 广西大掌硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 第一章绪论 1 1 引言 血管紧张素转换酶( a n g i o t e s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) ，又称二肽羧基肽酶，是一 种结合于细胞膜上含z n 2 + 的蛋白酶【1 】，为肾素一血管紧张素一醛固酮系统的限速酶，在 血管张力的调节和血管平滑肌细胞的增生中起重要作用，直接影响动脉粥样硬化过程， 在心脑血管病发病中起着重要的作用 2 , 3 1 。 高血压是一种严重影响人民健康和生活质量的常见病、多发病，其特点可用“三高” ( 发病率高、致残率高、死亡率高) 、“三低 ( 知晓率低、治疗率低、控制率低) 、“三 多 ( 致病原因多、多种代谢紊乱、多脏器损害) 和“一复杂 ( 发病机理复杂) 概括， 是全球范围内最重大的公共卫生问题之一，又是引起冠心病、脑卒中、肾功能衰竭的最 危险因素附】。值得注意的是在高血压病的早期和中期，症状往往不明显，容易被人们忽 视，因而，常被人们称为“无声的杀手”。而长期的血压升高，一旦出现肾、心、脑、血 管并发症，就难以纠正和控制，其后果是相当严重的。近年来，随着人民生活水平的提 高、饮食结构的变化、工作节奏的加快以及生活方式的改变，高血压患病率呈逐年增加 的趋势，患病主体越来越年轻化，并逐渐由城市波及到农村。现阶段全世界大约有2 0 的成年人受此威胁。因此，抗高血压的研究越来越引起国内外学者的重视。 醋蛋是流传于我国民间的一种验方，用鸡蛋和食醋来制作，常用来预防及治疗高血 压、高血脂等疾病。但是目前醋蛋仍然作为一种民间的食疗产品，尚无大规模的工业化 生产。虽然有不少学者对醋蛋的功能进行了初步的研究，但其作用机理尚不明确，功效 成分不清楚，还不能从理论上充分地证实其疗效【6 ，7 1 。另外，传统方法制备的醋蛋液一般 味道不太理想，有很大的腥味，适口性较差。这些原因造成了醋蛋尚未被开发这一现状。 1 2a c e 托i 】韦i j 齐l j 的作用机带i j l ，2 1a c e 对血压的调节机制 血管紧张素转化酶是种含锌二肽羧基肽酶，分子量在1 2 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 范围内，广 泛存在人体组织及血浆中，在肺部毛细血管细胞中含量最为丰富。a c e 在人体血压调节 过程中起重要的生理作用。一方面，它能使无活性的血管紧张素i ( a n g i ) 转化为升压 物质一血管紧张素i i ( a n g i i ) ，而另一方面它能使降压物质一舒缓激肽分解成失活片段， 从而使血压升高。 广西大掌硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制各及其生物活性研究 在人的生理过程中，血压调节主要是受到肾素一血管紧张素系统( r a s ) 和激肽一激 肽生成酶系统( k k s ) 这一对拮抗体系相互作用控制的【8 】。r a s 是升压系统，由血管紧张 素原( a g t ) 、肾素、a c e 及血管紧张素酶原( a t r ) 组成。肾素进入血液，作用于血管紧张 素i ，从其c 末端去掉h i s l e u 从而生成血管紧张素i i ，血管紧张素i i 是已知的肾素一血管 紧张素系统中最强的血管收缩剂，作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效 应；同时血管紧张素i i 通过刺激醛固酮分泌和直接对肾脏作用，减少肾血流量及促进k + 、 n a + 离子的重吸收，引起钠贮量和血容量的增加，也能使血压升高。与此相反，k k s 是 降压系统，又称抗高压因子，其中激肽是降压物质，主要作用是扩张毛细血管和增加其 通透性，达到舒张血管的目的，使血压下降。a c e 具有催激肽酶的作用，能作用于舒缓 激肽，使其失去c 末端的s e r - p r o 或p h e a r g 基团，从而使舒缓激肽降解为失活片段，引起 血压升高。其作用途径如图1 1 所示1 9 j ： 争s o c o n s t r i c t i o na l d o s t e r o n eu c t i o n v m o d l l a t a t i o n i 血管o j l i d i c e 甾一薛分) i 【i t 管扩张) ll i n c r e v 叠s e dp e r i p h e r a li n c r e a s e dn a + a n dd e c r e a s e dp e r j p b e r s l v a s c u l a rr e s i s t a n c ew a t e r 代t e n t i o nv a s c u l a rr e ，i s t a l i c e ( 謦大井瞳血管收缩明力) ( 大+ 和承像曩)蕞小井匿血管收缩阻力) l i n c r 翻u r , e db l o o dp r e s s u r e ( 压丹d 憾r t 毫e db l o o dp r e s s u r e ( 丘压膏匠) 血管紧张素躁- p 硼哆r 骷圈b p r n 卜蚺l 睁“_ _ v 砖卜& “ 血臂鬃张素ig a n gd a s p - a r g - v s l - t y r - l b - m s - p r o - p h o - h b - l e s 血管鬃张羹i i ( a n gl i ) “p t f 垤哪e - h 珏n p p t 图1 1 血管紧张素转换酶及其抑制剂在肾素一血管紧张素和激肽释放酶一激肽系统中的作用 f i g 1 - lt h ee f f e r to f a c ea n da c e i i nt h es y s t e mo fr a sa n dt h es y s t e mo fk k s 1 2 2a c e 丰【9 韦0 齐0 的 印韦0 机制 血管紧张素转换酶是含有z n 2 + 辅基的羧二肽酶，它是内皮细胞浆膜的一个组分，由 2 广西大学硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制畚及其生物活性研究 单一肽链组成，含大量的低聚糖，z n 2 + 、c l 。是是维持其活性所必需的。它含有两个结合 z n 2 + 的位点，即所谓“必须结合位点”，此外，还有一个或几个“附加结合点”。z n 2 + 结合 位点是a c e 催化反应的活性基团所在部位，各种a c e 抑制剂的共同特点是与a c e 的活性 部位z n 2 + 结合，使之失活【姗。 降压肽是一类短链的功能肽，具有对a c e 活性区域亲和力较强的竞争性抑制作用。 它们对a c e 活性区域的亲和力大于血管紧张素i 以及舒缓激肽对a c e 的亲和力，并且降 压肽一旦和a c e 相结合，就难于释放出来，从而阻碍血管紧张素i 转化为血管紧张素i i 以及舒缓激肽分解为失活片段的两种生化反应过程，从而起到降血压的作用【1 1 】。 关于a c e 抑制剂的具体作用机制有多种假说，其中，c u s h m a n 实验室根据竞争性抑 制剂与a c e 活性的结合位点提出了模型假说广泛为科研工作者接受【1 2 】，该模型后来一直 被许多研究者用来解释降压肽的作用机理。 1 3a c e 抑制剂的发展历史 现阶段的血管紧张素转化酶抑制剂主要有人工合成和天然产物提取两大来源，但目 前作为医药使用的大都是人工合成的。天然的抑制剂主要来源蛇毒以及各种蛋白的降解 产物。通过对天然产物来抑制剂功能和结构的研究，可为人工合成药用的提供一定的思 路和理论基础，具有很大的现实意义。 1 3 1 天然a c e 抑制剂的发展 同大多数药物的发现途径一样，a c e 抑制剂最初也是从天然蛋白质中分离出来的。 上世纪6 0 年代，f e r r e i r r a 等人首次从一种蝮蛇( b o t h r o p s j a r a r a c a ) 的蛇毒中分离出a c e 抑 制肽【l3 1 ，进而开启了从天然物质中分离提取a c e 抑制剂的先河。其研究工作不仅在蛇毒 中展开，而且逐渐扩大至整个蛋白质领域。从首次分离出a c e 抑制肽至今，该领域的研 究工作不过四十多年的历史，但其发展势头却非常迅速。 在f e r r e i r r a 之后，陆续有人开展此方面的研究。1 9 7 9 年，o s h i m a 1 4 】等首次从明胶消 化产物中分离制备了六条降压肽，此后从其它食品蛋白质中分离的降压肽相继出现，现 已经证实上百种天然食物存在具有抑制a c e 活性的物质，其中包括豆类、茶类、鱼贝壳 类、水果、荞麦粉等。日本是研究降压肽较多的国家，目前研究最多的是从乳源蛋白中 制备和提取降压肽，m u g u e r z a 等【”】研究发现从未加工的鲜奶中分离出2 3 1 种微生物可使 乳蛋白产生降压肽；通过酶解乳源蛋白获得降压肽在最近2 0 年间也有了比较深入的研 究，这其中包括利用动、植物酶和微生物酶对不同乳源种类、不同来源的蛋白进行水解， 3 广西大掌硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制备及箕生物活性研究 并发现能够得到降压肽活性最高的是酪蛋白，如a s l 、u s 2 酪蛋白以及p 酪蛋白用胰蛋白酶 水解后可得到如o 3 0 州的降压肽；姜瞻梅1 7 1 等人利用蛋酶白水解牛乳酪蛋白制备降 压肽，通过对水解工艺参数的考察，摸索出最佳生产条件，制得了活性较高的降压肽， 其半抑制浓度为0 6 8m g m l 。 从鱼类蛋白中提取降压肽也有大量的研究，陈季旺等【l8 】使用酶解的方法以常见淡水 鱼类草鱼为原料制得降压肽，相对分子质量分布范围较窄，主要集中在1 2 4 - - - 1 0 6 2 之间， 溶解性较好，且不受至l j p h 值影响，有利于其在食品中的应用。王海英【l9 】等人对海洋经 济鱼种鳕鱼生产过程中的下脚料鱼皮进行了再加工，利用碱性蛋白酶进行酶解处理，可 以得到心。为2 7 3m g m l 的a c e 抑制肽。y o s h i k a w a 等【2 0 】从鲣鱼干的嗜热菌蛋白酶水解物 中分离出8 条a c e 抑制肽，其中一种短肽l k p n m ，具有较高的a c e 抑制活性，该肽经a c e 作用后生成了一中新的三肽l k p ，后者对a c e 的抑制效果又比前者高8 倍，而且各种水 解物都对人体没有副作用。 此外，s u e t s u m a t 2 1 】利用离子交换和凝胶过滤的方法从从大蒜提取物中分离出7 条二 肽，经体外实验证实了其确实有较好的a c e 抑制效果，并通过饲喂高血压鼠进一步说明 其降血压作用。t a c h i 等【2 2 】利用商品酶对鸡蛋蛋黄进行水解，然后用半透膜分离水解物， 获得分子量在1k d a 以下的部分，发现这种水解物在体外能抑制a c e 的活性，做s h r 鼠 饲喂实验，发现经的饲喂s h r 鼠舒张压和收缩压比空白组都有明显的下降。k i m 等【2 3 】从 紫贻贝肉干的腌制产物( 添加质量比为2 5 食盐，2 0 条件下腌制6 个月) 中分离提取 出一条1 0 肽e a g n l y p g ，其i c 5 0 值为1 9 3 4p g m l ，而且口服该肽的s h r 鼠血压有明 显的降低。 我国有关天然降压肽的分离提取工作开展得比较晚，最初的研究从上个世纪末开 始，何子安【2 4 】等从浙江产蝮蛇( a g k i s t r o d o nh a 伽p a l l a s ) 的蛇毒中发现舒缓激肽增强肽， 并分离鉴定其中一种为1 l 肽，且n 端为环谷。利用外源酶水解天然产物制备降压肽的 研究相对更晚，现在刚刚处于起步的阶段。w u 等1 2 5 】采用a l c a l a s e2 4 l 酶解大豆蛋白， 通过超滤、离子交换层析、制备型高效液相色谱处理，得两条抑制肽，氨基酸序列为 a s p l e u p r o 和a s p g l y ，测得其妈。分别为4 8 和1 2 。3 “m 。辛志宏等【2 6 j 贝u 从酶解小麦 胚芽蛋白中分离纯化得到v a l t r p 和a l a m e t t y r 的两种降压肽，沈小琴【2 7 】等人以乳清蛋 白做底物酶解得到了较多的a c e 抑制肽，接着又通过离子交换及超滤等手段对酶解物 进行进一步纯化，可以富集酶解产物中的a c e 抑制肽。廖丹葵【2 8 】采用多种酶对鸡蛋蛋 4 广西大掌硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 黄进行处理，得到的酶解产物也都对a c e 有较好的抑制作用。黄文利 2 9 】等人采用自己 分离筛选的干酪乳杆菌l c 1 5 进行乳酸发酵，生产出具有降血压作用的酸奶。 1 3 2 人工合成a c e 抑制剂的发展 自从第一次分离出天然的a c e 抑制肽，马上就有科研工作者开始致力于人工合成 a c e 抑制剂。1 9 7 0 年，研制出首种a c e i 产品，并成功推向市场，命名为卡托普利。 1 9 7 6 年，日本药学家从酞嗪系列诱导体中，筛选出第2 代a c e i 产品依那普利。在此后 2 0 年中，有关a c e i 的研究迅速发展，上市新药近百种，用于临床达2 0 种，适应症状 也日趋扩大，除作为抗高血压药和治疗充血性心力衰竭外，也用于预防左心室肥大，减 少局部缺血对心肌的损害及减少糖尿病者的肾小球病变等。 目前临床上应用的a c e i 主要有卡托普利、依那普利、雷米普利、福辛普利、赖诺 普利、培哚普利、苯那普利、西拉普利等。通常情况下a c e i 都会含有一个2 一甲基萘氧丙 醇胺l 脯氨酸分子片段，但在一些药理学和结构特性方面是有所区别的，主要是与a c e 活性部位的锌配位体结合的配基不同。a c e i 一般会通过三种不同的基团与a c e 活性部 分结合：一种是巯基，如卡托普利；一种是磷酸基，代表的有福辛普利；还有一种是羧 基，常见的有依那普利。一般来说，含羧基的a c e i l l 含巯基或者磷酸基的a c e i 与a c e 中锌配位体结合得更牢固，故作用较强、较久。但是由于大多数的竞争性抑制剂与a c e 之间都是非共价结合的，即它们的抑制作用都是可逆的，因此药物作用的时间不持久， 停药后会产生血压反跳的症状，使血压升高。并且，这类药物在治疗的同时会对人体产 生很多副作用，如对肾功能有一定损害，易引起皮疹、蛋白尿、白细胞减少等。 1 4a c e 抑制肽的构效关系 现阶段对a c e 抑制肽结构与抑制活性关系的研究尚不太确切，但有些较为普遍的现 象已经被发现：如一般是由2 1 2 个氨基酸残基组成，通常认为c 末端是t y r 、p r o 、p h e 或 肽链中含有疏水性氨基酸结构，n 末端为芳香氨基酸是与a c e 结合的最有效的结构。如 z h o n g 3 0 】等人从大豆蛋白的碱性蛋白酶水解物中分离出具有高抑制活性的a c e 抑制肽， 测定其氨基酸序列为t r y g l y a l a p r o s e r - l e u ，其c 末端是以酪氨酸( t r y ) 开始，且含 有a l a p r o 序列。但也有例外的情况，j t l j a n g 3 1 】等从牛后臀股二头肌的酶解产物中分离得 到了一种降压肽v a l l e u a l a g i n t y r - l y s ，其c 末端就是以v a l 开头，且疏水性氨基酸含 量较低。这与原有的理论有很大的出入，因此很可能是通过另一条途径来抑制a c e 活性。 许多较长的肽只有降解为小肽链或游离氨基酸后才被人体吸收，而某些既不能被降 5 广西大掌硕士掌位论文 醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 解也不能被人体吸收，通常情况下，大部分寡肽可以被人体直接吸收，但仍有一些可被 机体内的蛋白酶水解。受人体内环境的影响，小肽的活性会有变化，这种影响可能是正 面的，也可能是负面的。如以降压肽p r o g l y g l y p r o 为例，当c 末端的p r o 失去后活力立 即丧失，而当受蛋白酶作用n 端失去p r o 后，3 肽结构的g l y g l y p r o 仍能维持一定的活性， 这说明c 末端的序列对维持此活性是十分重要的【3 2 】，而n 末端的序列对活性影响无特别 明显规律。近来有学者研究并建立了乳源蛋白中所含的降压肽序列结构与蛋白质组成关 系的模型【3 3 1 ，这为从蛋白质中预测和寻找新的高活性的降压肽结构指出了一个方向。 1 5 降压肽的制备研究 降压肽属于生物活性肽中的一类，国内外生产生物活性肽常用到的生产方法主要有 以下五种【3 4 , 3 5 1 ：( 1 ) 化学合成法，( 2 ) 重组d n a 技术，( 3 ) 微生物发酵法，( 4 ) 酶合成法，( 5 ) 酶解法。不同的制备方法针对不同目标的产物和原料，也各有其优缺点。化学合成法目 前广泛应用于生产高附加值的中长活性肽，但在合成的过程中可能会给环境和健康方面 带来问题。重组d n a 技术现阶段也有应用，但仅限于多肽的生产，合成短肽仍处于发展 初期，而且其表达效率较低、产品提取和回收困难。微生物发酵法的关键是菌种的筛选， 在发酵的过程中通过控制工艺调剂来获取目标产物，此法生产活性肽安全且易操作，但 生产周期相对较长，多用在乳制品行业【3 岳3 9 1 。酶合成法是以氨基酸衍生物为原料用各种 酶来合成活性肽的方法，可以在比较温和的条件下进行，所用化学品及操作上的危险性 相对较低，酶法合成肽是一种有效的、广泛适用的方法，但在对高度专一性生物催化剂 应用研究方面所做的工作相对较少，且目前酶合成肽的方法仍然很单一。酶解法生产生 物活性肽【4 0 4 2 1 有很多优点，此法生产安全性高，能在比较温和的条件下进行定位水解， 生成大量的短肽，且水解过程易控制，生产周期短，价廉易于推广，因此该法应用较为 普遍，目前生物活性肽的研究和生产主要采用酶解的方法进行。 酶解制备降压肽，要考虑以下几方面：( 1 ) 建立一种简单、可靠的降压肽体外活性评 价分析方法【4 3 1 ；( 2 ) 酶解制备降压肽并进行活性测试；( 3 ) 降压肽的分离纯化；( 4 ) 降压肽 的体外稳定性测试和结构鉴定：( 5 ) 动物实验检验降压肽的体内稳定性及降压效果。 酶法制备降压肽的关键技术是蛋白酶的选择，动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋 白酶在制备降压肽方面都有所应用。由于不同的蛋白酶其本身作用位点的特异性，导致 水解产物有所区别，即获取的降压肽在活性和数量上有较大的不同。例如，韩飞即j 等人 用4 种不同的蛋白酶对大豆蛋白进行水解，结果发现酶解产物都较酶解前有显著提高， 6 广西大学硕士学位论文 醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 但不同的酶解产物对a c e 抑制活性有很大差异，其中碱性蛋白酶的酶解产物显示较强的 a c e 抑制活性，而中性水解蛋白酶水解物的a c e 制活性较弱，这可能是由于酶解物组成 的复杂性和a c e 较宽的底物特异性所决定的。辛志宏等f 4 5 j 采用8 种蛋白酶水解麦胚蛋白 质制各降压肽时，不同的水解产物对a c e 的抑制活性最大相差4 倍以上。 降压肽生产过程中的另一大难题是活性成分的分离纯化。若要得到有实际应用价值 的降压肽，必须要对蛋白质水解液进行反复的分离提取。目前大多采用层析分离的手段 对多肽进行分离纯化，也有少量报道采用酶膜反应器的方式生产降压肽，可直接在反应 过程中同时进行分离操作，得到纯度较高的降压肽制品脚4 7 l 。目前膜分离技术被认为是 分离富集不同分子量级别水解物的最好的技术之一，而生产低活性的食用级的降压肽产 品由于分离手段较为简单，目前已有一定的实际应用。 降压肽的体外稳定性测试是其性质检测过程中必不可少的环节，也是动物实验之前 的必要准备。该过程中将降压肽在体外环境中分别与消化道中的各种酶作用，而反应条 件则模拟消化道内环境。比较反应前后降压肽对a c e 的抑制活性来判断其抗消化道酶系 降解的能力。如果降压肽经上述步实验步骤后不失活，在体内就会有明显的降压作用， 而食品来源的降压肽大多属于这一类。但也有报道称实际情况下降压肽对a c e 的抑制作 用会出现与体外模拟不一致的情况，有些降压肽在体外模拟消化过程实验中比较稳定， 且体外检测其对a c e 也具有强抑制作用，但在体内确没有明显的降压效果；反之，有些 降压肽在进行体外活性测试时并不表现较强的a c e 抑制效果，但在进入机体后反而有明 显的降压效果，其中原因可能是体外模拟条件不能完全与机体内环境相吻合。由于机体 是一个完整系统，各个器官都是紧密联系的，消化系统的作用在体内会受到其它如神经 等系统、循环系统和内分泌系统等的影响，因而导致体外模拟结果与真实降血压作用不 相一致这一情况的出现j 。 1 6 食品来源降压肽的应用前景 以天然、健康为主题的今天，利用保健食品来调节生理状况的观点，已越来越为消 费者所接受。来自食品的a c e 抑制肽，安全性高、无毒副作用，长期服用可达到预防、 抑制、缓解和治疗高血压的目的，因此，开发具有调节血压作用的保健食品具有重要理 论意义和应用价值。而以健康和营养为出发点考虑降压肽的开发利用，是一个充满科学 性和技术性的挑战性问题。食品来源的降压肽产品同时拥有保健品和食物的双重身份， 因此可以考虑从药食两用方面展开探索行的研究。 7 广西大掌硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 对于食品来源的降压肽产品，其发展方向应当从以下几个方向来考虑：首先是要针 对性的发展一些新型分离技术，比如膜分离就是一种很好的分离手段，能够富集不同水 解液中具有活性的部分 4 6 , 4 7 , 4 9 】。另外，对于食品中的降压肽，其稳定性是十分值得考虑 的一个问题。食品的成分复杂，而降压肽的分子量相对来说较小，所以更容易受食品中 其他成分的影响，这也是以后应该重点考虑的内容之一。 1 7 醋蛋研究现状及存在的问题 表1 1 醋蛋中游离氨基酸的组成( m g 0 0 0 m l ) j ) t a b l e1 - 1f r e ea m i n oa c i d sc o n t e n to fv i n e g a r - e g g ( m g ( io o m l ) 1 ) 醋蛋做为一种传统的保健饮品，营养丰富，氨基酸组成合理【5 ，见表1 1 。近年来， 已经有科研工作者进行了醋蛋的开发研究，并且取得了一定的成果。陈黎斌 5 q 的研究课 题中对醋蛋的制备和后续的处理做了较为详细的研究，从醋蛋的制备、醋蛋液的酶解到 a c e 抑制活性物质的纯化都做了大量的工作，制备出来几种活性组分并对其结构进行分 析。李琴【5 2 】研究了在醋蛋中添加红枣、蜂蜜、枸杞等滋补品，发现其保健效果更好。陈 洁辉【5 3 】在研究蛋白的水解外，还分析了在醋蛋制备过程中活性钙的变化，这样得到的醋 全蛋饮料在降血压的同时还可以补充钙质。 但是，截至目前醋蛋还仍然是一种民间的食疗产品，进行产业化生产的企业很少， 而且其仍然是一种初级形态，如柳州市天成金芝生产的醋蛋保健食品，是一种醋蛋和中 8 广西大掌硕士学位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 草药提取物的混合物，其功能是提高免疫力。目前醋蛋的开发仍有许多问题亟待解决： 首先，传统方法制备的醋蛋液一般味道不太理想，有很大的腥味，适口性较差。其次， 醋蛋液的功效成分不清楚，其作用机理不明确，不能从理论上充分的证实其疗效。 1 8 立题背景和意义 高血压病是一种常见的多发病，严重地危害人们的健康，明显地降低患者的生活质 量。虽然食品来源的a c e i 疗效不如卡托普利等合成的a c e i ，但由于这些活性降血压物 质潜在于我们日常摄入的食物中，故其毒副作用小，安全性较高。 一种食品如果可以令人信服地证明对身体某种或多种机能有益处，有足够营养效果 改善健康状况或能减少患病，即可被称为功能性食品。醋蛋作为一种天然存在并且具有 降血压作用的物质，对一些疾病有防治效果，有病人群食用起到非药物治疗的作用，无 病人群食用亦有预防保健作用。但作为一种传统的民间保健品，醋蛋并没有得到很好的 推广，也缺乏作为功能性保健食品的理论基础，所以，对醋蛋进行深入的研究还是十分 有理论意义和社会效益的。 本课题旨在对醋蛋的制备工艺进行优化；阐明醋蛋中a c e 抑制肽的来源，即醋蛋中 的a c e 抑制肽是源于醋酸水解还是源于人体自身的消化；对醋蛋中的a c e 抑制肽进行分 离纯化及理化特性分析；此外，在泡制基础上，利用微波处理、酶解等手段对醋蛋进行 再次加工。该课题的实施对有效利用我国丰富的蛋品资源、提高其附加值，继承及弘扬 我国传统医药事业、开发具有市场价值的第三代功能性保健饮品具有重要的意义。 1 9 研究内容 本课题研究了一种流传于民间的传统保健食品一醋蛋。主要是对醋蛋中a c e 抑制肽 进行分离和性质分析，并对醋蛋做进一步的处理，制备活性更高的a c e 抑制肽。具体的 研究内容包括如下几个方面： ( 1 ) 醋蛋泡制工艺条件的优化，活性物质的分离及生化性质的分析； ( 2 ) 考察微波作用对醋蛋抑制效果的影响，并摸索较好的微波处理条件； ( 3 ) 醋蛋的酶解用酶的筛选，酶解过程的优化以及酶解动力学的研究。 9 广西大学硕士掌位论文 醋蛋中a c e 抑制肽的制畚及其生物活性研究 第二章醋蛋浸泡工艺的研究及活性成分的分离鉴定 2 1 引言 醋蛋是以醋和鸡蛋为主要原料泡制而成，具有预防、治疗、康复功效的一种民间保 健饮品。作为一种食物疗法，取材方便、制作简易、服用安全、疗效显著，因而深受 广大人民群众欢迎，流传甚广。 民间流传着多种多样的醋蛋泡制方法，各有特点。本章在传统醋蛋制作方法的基础 上对泡制工艺进行了研究，力求确定较好的醋蛋泡制的工艺条件参数，并对其有效成分 进行分离、分析。 2 2 试验材料 2 2 1 试验原料 鸡蛋：市售； 9 0 米醋：广东美味鲜调味食品有限公司。 2 2 2 主要仪器 试验过程中所用到的主要仪器设备见表2 1 。 表2 1 主要仪器 t a b l e2 - 1m a i ni n s t m m e n t su s e di nt h i sc h a p t e r 仪器名称 生产厂家 电脑全自动部分收集器d b s 1 0 0 h k 1 d 型恒温水槽 w f zu v 2 0 0 0 型紫外一可见分光光度计 台式离心机 智城z h w y 11 0 x 型恒温水浴摇床 r e 5 2 0 旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂 南京物化智能设备有限责任公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 上海手术器械厂 上海智城分析仪器公司 上海青浦沪西仪器厂 2 2 3 主要试剂 试验过程中所用到的主要试剂见表2 2 。 2 2 4 相关溶液 1 0 广西大学硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制畚及其生物活性研究 茚三酮显色剂【5 4 】：茚三酮o 5g ，果糖o 3g ，n a 2 h p 0 4 10 h 2 01 0g 及k h 2 p 0 46g ， 定容至1 0 0 m l 。 o p a 试剂闭：2 5m l1 0 0m m 硼砂溶液，加入2 5m l2 0 ( 质量比) 的十二烷基硫酸 钠，调p h 值至9 5 ；4 0m g 邻苯二甲醛，预先溶于1m l 甲醇；1 0 0 止p 一巯基乙醇。三 者定容至5 0m l 。 s e v a g 试剂：正丁醇和三氯甲烷以体积比1 ：4 混合。 n a c l 磷酸缓冲液：1 0m o l l 。( p h8 3 ) 。 表2 - 2 主要试剂 1 a b l e2 - 2m a r er e a g e n t su s e di nt h i sc h 印t e r 主要试剂 生产厂家 马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) 乙酸乙酯( a r ) 葡聚糖凝胶树脂s e p h a d e x g - 5 0 葡聚糖凝胶树脂s e p h a d e x g 一1 5 胰酪胨( b r ) 硼砂( a r ) 十二烷基硫酸钠( a r ) 胃蛋白酶 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 邻苯二甲醛( a r ) p - 巯基乙醇( a r ) d 果糖( a r ) 茚三酮( a r ) 甘氨酸( a r ) 三氯甲烷( a r ) 正丁醇( a r ) s i v a 公司 汕头西陇化工厂 g eh e a l t h c a r e 公司 g eh e a l n l c a r e 公司 上海楷洋生物技术公司 上海楷洋生物技术公司 国药集团化学试剂有限公司 上海楷洋生物技术公司 上海楷洋生物技术公司 上海楷洋生物技术公司 上海楷洋生物技术公司 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 汕头西陇化工厂 天津市科密欧化学试剂公司 广西大学硕士掌位论文醋蛋中a c e 抑制肽的制备及其生物活性研究 2 3 试验方法 2 3 1 醋蛋的泡制 取新鲜鸡蛋三个，洗去表面污垢，按一定的比例加入9 度米醋于不同温度下密封浸 泡。待蛋壳全部溶解后，用纱布过滤，挑破蛋膜，弃去蛋膜后搅拌均匀，得醋蛋待用。 2 3 2 醋蛋中蛋白质含量的测定 微量凯式定氮法【5 6 】。 2 3 3 水解度的测定 茚三酮显色法测定水解度【5 4 1 。 2 3 4a c e 抑制活性的测定 在前人研究5 7 , 5 8 】的基础上加以修改，具体方法如下： 吸取5 0p l 抑制剂，加入1 0 0l a l5m m o l l d 马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l ) q b ，) j a a 1 0 0p l 1 0m o l l 。的n a c l 硼酸缓冲液( p h 值8 3 ) ，3 7 恒温水浴5m i n ；立即加入5 0p l a c e 启动反应，3 7 恒温反应3 0r a i n 后，加入0 5m l 浓度lm o l l _ 1 的h c l 终止反应；再加入 1 5m l 冷的乙酸乙酯，漩涡混合均匀后，4 0 0 0r m i n 1 离心l om i n 后取出1 0m l 酯层转入 另一试管，充分烘干后，再将它重新溶于3 0m l 去离子水中，在2 2 8n m 波长下测光密度 值。 a c e i 按下式计算： a c e i ( ) = o d , , - o d b 1 0 0 o d a - o d c 式中：0 1 3 口为不存在抑制剂时的光密度5 0 1 3 6 为存在抑制剂与a c e 时的光密度； o d e 为抑制剂与a c e 都不存在时的光密度。 2 3 5 柱层析分离纯化活性组分 采用葡