（制糖工程专业论文）微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究.pdf

微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 摘要 低聚木糖是功能性低聚糖的一种，具有很强的促双歧杆菌增值能力， 对人体健康有重要作用。本实验研究了一种高效率、无污染、低成本的以 甘蔗渣为原料酶法生产低聚木糖的预处理方法。本文以酶解效果作为评判 标准，以还原糖含量为响应值作响应面分析，依据回归方差分析确定各工 艺条件的影响因子，研究了低聚木糖生产工艺中甘蔗渣的预处理方法：酸 法、碱法、双氧水法。同时采用微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖。结果 表明： 1 微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的最佳工艺条件为：微波消解压 力0 9 m p a ，微波消解时间1 7 m i n ，木聚糖酶用量o 7 ( 相对于原料甘蔗渣) ， 在此条件下酶解液中还原糖含量可达9 2 1 m g m l 。 2 t l c 结果显示：微波处理甘蔗渣酶解液主要成分是木二糖、木三糖 和木四糖，还有很少量的木糖。 3 x r d 显示：微波处理后的甘蔗渣没有破坏甘蔗渣中纤维素结晶结构。 在微波处理后甘蔗渣的衍射峰强度比原料甘蔗渣的衍射峰强度更强，说明 有大量木聚糖溶出。 4 低聚木糖糖液纯化：以活性炭柱层析、乙醇溶液为洗脱液、分离纯 化低聚木糖的方法，可以去除糖液中的大部分色素，脱色率达至1 j 9 4 3 。洗 脱液成分的t l c 显示：水洗脱液的主要成分是色素和高聚糖，乙醇洗脱液的 主要成分是木二糖、木三糖和木四糖，还有很少量的木糖。 5 采用高效液相色谱( h p l c ) 法测定低聚木糖的含量，结果表明：低 聚木糖溶液中低聚木糖含量为5 0 9 ，木二糖至木四糖含量为4 8 9 ，单 糖的含量为9 7 。 关键词：微波甘蔗渣低聚木糖木聚糖响应面活性炭柱层析纯 化 n t h er e s e a r c ho np r o d u c t l 0 n0 f x y l o o l i g o s a c c h a r i d e sb ye n z y m a t i c h y d r o l y s i sf r o mb a g a s s e sw i t hm i c r 0 硷v e a bs t r a c t x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s ，a s o n ek i n do fm o s t e f f e c t i v e l y f u n c t i o n a l o l i g o s a c c h a r i d e s ，c o u l db eu s e dt op r o m o t et h ep r o l i f e r a t i o no fb i f i d o b a c t e r i u m i nt h ei n t e s t i n u m t h i sp a p e rp r e s e n t e da na p p l i c a t i o no fr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g i e sf o rp r o d u c t i o no fx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sf r o mb a g a s s eb ys u l f u r i c a c i d ，s o d i u mh y d r o x i d ea n dh y d r o g e np e r o x i d ew i t hm i c r o w a v e t h er e s u l t s w e r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s w e r ep r e p a r e df r o mb a g a s s ew i t he n z y m a t i c h y d r o l y s i sb ym i c r o w a v e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tw h e nt h eb a g a s s ew e r eh e a t e d b ym i c r o w a v ea t0 9 m p af o r17 m i na n ds u b s e q u e n th y d r o l y s e db y0 7 x y l a n a s e sf o r2 4 h ，t h ec o n t e n to f r e d u c i n gs u g a rr e a c h e d9 2 1 m g m l 2 t h et l cd e m o n s t r a t e dt h a tx y l o b i o s e ，x y l o t r i o s ea n dx y l o t e t r o s ew e r e t h em a i nc o m p o s i t i o n si nt h eh y d r o l y s i so fm i c r o w a v e t h e r ew a sa l s oal i t t l eo f x y l o s e i l i 3 t h ex r di n d i c a t e dt h a tc e l l u l o s ec r y s t a l l i z a t i o no f b a g a s s eh a dn o tb e e n d e s t r o y e d x r a yd i f f r a c t i o nm o u n t a i ni n t e n s i t yo fb a g a s s ea f t e rm i c r o w a v e d i g e s t i o nw a ss t r o n g e rt h a nb a g a s s es a m p l e s t h e r ew a sm o r ex y l a nb e i n g d i s s o l v e d 4 t h ep u r i f i c a t i o no fx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sw a ss t u d i e d t h ed e c o l o r i z e d x y l o o l i g o s a c c h a r i d e sl i q u i dw i t hx y l o b i o s e ，x y l o t r i o s ea n dx y l o t e t r o s ea sm a j o r c o m p o n e n tw a so b t a i n e dw i t ht h r e es t e p s ：s e p a r a t i n gt h eh y d r o l y s i ss o l u t i o n w i t ha na c t i v a t e dc h a r c o a lc o l u m n e l u t i o nw i t hw a t e ra n d30 e t h a n 0 1 9 4 3 o fp i g m e n tw a sr e m o v e d t h ee l u t i o nl i q u i do fw a t e rt l cd e m o n s t r a t e dt h a t p i g m e n t a n dh i g h p o l y m e rb o i l i n g s w e r et h em a i n c o m p o s i t i o n si n t h e h y d r o l y s i so fm i c r o w a v e t h ee l u t i o nl i q u i do fe t h a n o lt l cd e m o n s t r a t e dt h a t x y l o b i o s e ，x y l o t r i o s e a n d x y l o t e t r o s e w e r et h em a i nc o m p o s i t i o n si nt h e h y d r o l y s i so f m i c r o w a v e t h e r ew a sa l s oal i t t l eo f x y l o s e 5 m e n s u r a t i n gt h ec o n t e n to fx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sb yh p l c t h er e s u l t s w e r el i s t e da sf o l l o w s ：t h ec o n t e n to f x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s i nt h e x y l o - o l i g o s a c c h a r i d e ss o l u t i o nw a s5 0 9 ，t h ec o n t e n to fx y l o b i o s e ，x y l o t r i o s e a n dx y l o t e t r o s ew e r e4 8 9 ，t h ec o n t e n to fm o n o s a c c h a r i d e sw e r e9 7 k e yw o r d s ：m i c r o w a v e ；b a g a s s e ；x y l o o l i g o s a c c h a r i d e s ；x y l a n ；r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ；a c t i v ec a r b o na d s o r p t i o nc o l u m n a d s o r p t i o n ；p u r i f i c a t i o n 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除己注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：张强博 澎醇年月心日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 回即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：罗疑鼍十荨导师签名f 约，钐芬多p 厅年j 弓i d 日 广西大学硕士掌位论文 微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 1 1 研究的目的和意义 第一章前言 功能性食品是目前受到普遍关注的一类食品。长期以来，西方国家一直将低热、低 脂、低胆固醇、低盐、低糖及高纤维食品视为有利于促进人们身体健康的食品。随着研 究工作的日益深入，已证实具有特殊保健功能的功能性因子越来越多，其中低聚糖就占 有重要的地位。 随着经济社会的高度发展，人们对食品的营养和功能的认识水平普遍提高，人们更 加重视通过改善膳食条件和发挥食品本身的生理调节功能来达到提高自身健康的目的， 因此研究和开发具有生理调节作用的功能性食品，已成为现代社会食品发展的新潮流。 低聚糖( o l i g o s a c e h a r i d e s ) ，又称寡糖，是由2 1 0 个单糖经糖苷键连接而成的直 链或支链低度聚合糖的总称，分子量约为3 0 0 - - 2 0 0 0 d a i l j ，它又分为功能性低聚糖和普 通低聚糖两大类。蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、环糊精及异麦芽糖等属于普通低聚糖， 可被机体消化吸收，产生能量。而功能性低聚糖，如低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木 糖、低聚半乳糖、低聚壳聚糖、大豆低聚糖等，是指具有特殊生物学功能，特别是能促 进肠道内双歧杆菌的增值，有益于肠道健康的一类低聚糖口j 。 回。回一 u h 6 h6 h 木二二辘( 简称x 2 ) o 仨h o 卜h o h 弓o h h 佣 术三糖绚称x ，) f i g 1 1m a i nc o m p o n e n t sa n dc h e m i c a ls t r u c t u r eo fx y l o o l i g o s a e c h a r i d e 低聚木糖亦称木寡糖( x y l o o l i g o s a c c h a r i d e ) ，是由2 - - 一7 个d 一木糖以b l ，4 一木糖苷 键结合而成，以二糖和三糖为主【3 】f 4 】，是功能性低聚木糖家族中的一个重要成员。它的 甜度比蔗糖和葡萄糖均低，与麦芽糖相当，约为蔗糖的4 0 。低聚木糖对酸碱及热的稳 广西大掌硕士掌位论文 微波处理甘蔗渣酶法制鲁低聚术糖的研究 定性较好，即使是在酸性条件( p h = 2 5 7 ) 加热也基本不分解，适合用于酸奶、乳酸 饮料和碳酸饮料等酸性饮料中5 1 。低聚木糖的主要成份及化学结构如图l 一1 所示【6 】： 目前业已研究确认的低聚木糖的生理功能主要包括以下几个方面： ( 1 ) 难消化性 与其他低聚糖相比，木二糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，且代谢不依赖 胰岛素，可以满足特殊人群如糖尿病、高血脂等患者的食品要求7 】【剐。另外，低聚木糖 的主要伴随成分为木糖，也是一种不被消化的单糖。与某些含有可消化单糖的低聚糖产 品相比，低聚木糖提供较低的能量，可作为肥胖病人的特殊食品【9 1 。 ( 2 ) 促进双歧杆菌增值、改善肠道菌群结构 低聚木糖的保健作用主要基于它对胃肠道菌群的不同影响。低聚木糖有明显的双歧 杆菌增值作用，而且除青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌外，大多数肠道细菌 对低聚木糖的利用都较差1 0 】【l i 】。低聚木糖是目前发现有效用量最少的低聚糖，其每日的 有效摄入量为0 7 1 4 9 ，而其他低聚糖如低聚果糖的有效摄入量为5 0 2 0 o g d 、低聚 半乳糖2 0 2 。5 9 、大豆低聚糖2 0 9 。而低聚木糖每天只需摄入少量就有明显的效果，并 且不会使血浆葡萄糖水平上升。经日本健康营养食品协会下属的保健食品学术委员会审 定和日本厚生省第6 4 号许可证认定低聚木糖为特定保健用食品添加剂。实验表明，每 天只需口服o 7 9 低聚木糖，2 周后大肠杆菌中的双歧杆菌的比例从8 5 增加到1 7 9 。 而拟杆菌( 可能的致病菌) 则从5 2 3 减少到4 4 4 ；3 周后，双歧杆菌的比例增至2 0 2 ，拟杆菌降至3 2 9 。其对肠道菌群有明显的改善作用【1 2 】。徐勇等研究表明：当低聚 木糖的浓度高于5 0 l 时，对双歧杆菌产生甥显的增殖效果，随着低聚木糖浓度的增加， 菌体浓度和增殖速度逐渐增大，且低聚木糖对双歧杆菌和青春双歧杆菌的混合培养效果 明显优于单株培养。 ( 3 ) 改善排便 低聚木糖具有改善大便的功能。摄入低聚木糖后能增加大便中的水分，可以改变大 便的形态，从而防止便秘【13 1 。 ( 4 ) 促进钙的吸收 当低聚木糖与钙同时摄入时，不但不会影响对钙的吸收，反而能起促进作用。摄入 低聚木糖后，大鼠对钙的消化吸收率提高了2 3 ，体内钙的保留率提高2 1 。因此低 聚木糖可作为孕妇、老年食品的理想原料【1 4 j 。 ( 5 ) 无龋齿性 广西大掌硕士掌位论文微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 龋齿是一种常发病，其发生是与口腔中的微生物有关，主要致病菌是突变链球菌。 低聚木糖不能被口腔内变异链球菌等细菌分解成黏着性的单糖如葡萄糖、果糖、半乳糖 等，与蔗糖并用时能阻止蔗糖被龋齿病原菌作用而生成水不溶性的高分子葡聚糖( 牙 垢) ，因此，低聚木糖无龋齿性并具有抗龋齿性，适合作为儿童食品的甜味添加剂1 7 。1 9 】。 ( 6 ) 其他功能 低聚木糖还具有降低血清胆固醇含量、降低血压、生成营养物质、增强机体免疫和 抗肿瘤能力、消除肠道内毒素等功能【1 6 】。 低聚木糖的应用现状和前景： ( 1 ) 低聚木糖稳定的理化性质及对双歧杆菌高效的增殖作用使其具有广阔的市场 前景。在食品中添加低聚木糖，不用担心食品在加工或储藏过程中导致有效成分分解， 使用起来十分方便，因而适用于各种食品体系，而且，低聚木糖对双歧杆菌高效的增殖 作用可以弥补其生产成本高的缺点。总之，和其它功能性低聚糖相比，作为双歧杆菌因 子，低聚木糖具有使用方便、安全、稳定、经济价值高等特点。例如，在酸性饮料中添 加低聚木糖，饮料的风昧与使用蔗糖无明显差别，若用蔗果低聚糖则容易分解。在生产 面包时使用低聚果糖取代1 5 5 0 的蔗糖，产品色泽比原来要淡一些，但芳香味要比原 来浓一些。 ( 2 ) 在日本和欧洲用功能性低聚糖开发的食品多达4 0 0 5 0 0 种，1 9 9 6 年世界各种 低聚糖的生产量约8 5 万吨，日本估计其市场规模约1 1 0 亿日元以上。到1 9 9 8 年5 月， 厚生省所批准的1 0 8 种特定保健食品中有4 3 种加有低聚糖。日本是世界上较早开发功 能性低聚糖的国家，1 9 9 9 年消耗具有双歧杆菌增殖效果的低聚糖达到3 力多吨。我国已 提出了对甜昧剂管理的新办法：糖精、甜蜜素等高倍甜昧剂的生产使用受到限制，对因 病不宜摄入食糖的病人，所用的食糖应提倡使用对健康有益的糖醇和低聚糖等替代品。 低聚糖独特的生理功能使得研究开发和生产新型低聚糖具有很好的市场需求。 ( 3 ) 低聚木糖在低聚糖中占有重要的地位，首先它的有效服用量为低聚异麦芽糖 的1 2 0 ，低聚果糖的1 1 0 ，低聚半乳糖的1 7 ，其次在经济效益方面，就日本市场而言， 它的售价是低聚异麦芽糖的1 7 8 5 倍。 ( 4 ) 低聚木糖的主要伴随成分为木糖。木糖也是不被消化的单糖，因此普通纯度 的低聚糖产品就能满足特殊人群如糖尿病和高血脂等患者的食品要求。而其它功能性低 聚糖，如低聚异麦芽糖和低聚果糖，只有高度纯化后才能应用于糖尿病和高血脂等患者 的食品中。 3 广西大学硕士学位论文微波处理甘蔗渣酶澍嘲i 畚低聚木糖的研究 ( 5 ) 由于低聚木糖具有表面活性部位，可吸附肠道有毒物质及病原菌，提高机体 抗病力，激活免疫系统，因此也可以应用于医药。含有低聚木糖的难消化性低聚糖可以 用于预防和治疗腹泻，降低幼儿耳炎发病率。 ( 6 ) 低聚木糖作为新一代生物制品在中国具有很大的市场，发展前景广阔。它可 最大限度的满足那些喜爱甜品又担心糖尿病和肥胖的人群需要，特别适宜肥胖症、糖尿 病、高血压、动脉硬化、龋齿患者食用。低聚木糖在低聚糖中以其服用量少这一优势而 具有极大的竞争力和市场开发前景。 表卜1 中国儿种作物部分组织的主要组成成分f 2 3 1 1 2 4 1 t a b l e l 1m a i nc o m p o n e n t so f s e v e r a lc h i n e s ec r o p s 从表1 - 1 中可以看出：甘蔗渣中半纤维素的含量高达2 3 以上。 低聚木糖一般是以富含木聚糖的植物资源，如木屑、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻 壳等为原料，通过内切型木聚糖酶水解后，再进行分离、精制丽制得1 2 0 2 2 】。对于低聚木 糖的制备而言，重要的一点是原料的选择。大量的科学研究成果证明，天然植物中的半 纤维素、木质素及纤维素是相互嵌合、紧密连接在一起1 2 3 2 5 1 。由于木质素的存在严重 阻碍低聚木糖制各过程中所用木聚糖酶的酶解效率，而半纤维素含量越高则低聚木糖产 品得率越高，因而原料中半纤维素和木质素含量的高低，对低聚木糖的制备起着至关重 4 广西大掌硕士掌位i 企- 文 微波处理甘蔗渣酶法制- i t 低聚木糖的研究 要的作用【2 6 1 。选择半纤维素含量高，而木质素含量相对较低的植物资源是制备低聚木糖 的首要问题。 低聚木糖一般是以富含木聚糖的植物资源，如木屑、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻 壳等为原料，通过内切型木聚糖酶水解后，再进行分离、精制而制得，其制备过程概述 幽1 - 2 低聚木糖制备工艺流程框图 f i g 1 2f l o wc h a r to fp r e p a r i n gx y l o o l i g o s a c c h a r i d e 图卜3 所示为甘蔗渣木聚糖组成结构2 3 1 。 一4 x p l 4 x p l 4 x 1 3 1 4 x 1 3 1 4 x 1 3 1 一 ：l：i l a f a ( m e o ) 4 g a a x 1 3 = 1 3 - d - 呋喃式木糖基 l - a f a = l j 失喃式阿拉伯糖基 ( m e o ) 4 g a i t = 4 ( 卜甲基一t l , d l 吡喃式葡萄糖醛酸基 图l - 2 甘蔗渣木聚糖化学结构 f i g 1 3c h e m i c a ls t r u c t u r eo fb a g a s s ex y l a n s 从图1 - 3 中可以看出甘蔗渣木聚糖主要由d 一木糖构成。 从甘蔗渣组成成分和其半纤维素结构可知，甘蔗渣可以作为制备低聚木糖的原料。 我国从上世纪八十年代末开始进行功能性低聚糖的研究，并于1 9 9 6 年开始工业化 生产，虽然起步晚，但发展快。目前低聚糖的年销售量己达到3 万多吨，其应用范围已 涉及到食品、饮料、医药保健品、饲料、农业生产等各领域。功能性低聚糖，因为具有 使双歧杆菌增殖的功效，备受关注，发展非常迅速。人民寄希望于功能性低聚糖在促进 人体自身健康、促进传统食品工业的高薪技术改造、促进廉价农副产品的高附加值转化 等方面，发挥重要的作用。 我国是农业大国和甘蔗大国，我国每年甘蔗的种植面积约为9 0 万公顷，除每年生 广西大掌硕士学位论文微波处理甘蔗渣酶法制畚低聚木糖的研究 产8 0 0 多万吨蔗糖外，还产生8 0 0 多万吨蔗渣纤维。这些蔗渣除部分用于造纸外，大部 分直接被用作锅炉燃料烧掉，并未得到充分的利用，这样一是污染环境：二是浪费资源。 因此，利用这些纤维质副产品制造高附加值产品有诱人的发展前景。同时甘蔗渣为可再 生资源，用来制造高附加值产品具有可持续发展的潜力，能促进农村及其他相关行业的 经济发展，具有广阔的应用前景。 1 2 国内外研究现状 迄今为止，低聚木糖的制备方法主要有如下五种： ( 1 ) 酸水解法 酸水解法是采用酸使木聚糖的主链与侧链发生分离的原理。低聚木糖的制备最先采 用的方法是化学降解法。h a v l i c e kj 等( 1 9 7 2 ) 2 7 1 2 8 j 采用三氟醋酸、m i t s u i s h iy 等( 1 9 8 8 ) 2 9 】采用盐酸以及b r a ym r 等( 1 9 9 0 ) 1 3 0 采用硫酸等稀释部分水解木聚糖进行低聚糖的 制备研究。但酸水解法不适合工业化生产，主要是由于对技术要求较高，而且水解过程 中会伴随有害物质的生成，使精制工艺繁琐，得率低。 ( 2 ) 碱水解法 在研究植物中的木聚糖组成结构时，一般采用碱水解法来提取木聚糖。碱水解法提 取木聚糖的阿拉伯糖侧链在提取过程中没有脱出。含有侧链的木聚糖残基构成的木糖苷 键不能为木聚糖酶水解。碱液可以使木聚糖主链水解，从而使低分子量木聚糖溶解到提 取液中而纤维素不溶解。i s a o 等( 1 9 8 3 ) 1 3 1 1 采用稀碱液对玉米芯进行预处理，脱出原 料中的部分木质素，然后使用s p e - 8 6 菌株产木聚糖酶对已经处理过的玉米芯进行酶解 制备低聚木糖，获得较为满意的效果。但是该方法由于产生大量的碱性废水，而且木聚 糖酶用量偏高，因此有待进一步改进。g o u l d ( 1 9 8 4 ) 3 2 】采用碱性h 2 0 2 预处理木质纤维 材料，去除了麦杆中的大约一半的木质素，从而大大提高了木聚糖酶的酶解得率。 ( 3 ) 热水抽提法( 含蒸汽喷暴法) 日本专利昭5 3 4 4 6 4 0 1 9 7 8 0 4 2 【3 3 1 曾提出热水抽提法制备低聚木糖。但是该方法是 利用木聚糖自身含有的乙酰基在一定温度或压力的作用下脱落生成乙酸，造成体系的 p h 值降低，从而使木聚糖的p 一1 ，4 一糖苷键断裂发生自身水解作用，木聚糖分子量降低， 溶解度增大。但是，这种方法得到的糖液及低聚木糖的结晶颜色较深，极大程度上限制 了其用途。p u l sj ( 1 9 8 5 ) 3 4 】发现，蒸汽喷爆后半纤维素主要以低聚木糖的形式存在。随着 6 广西大掌硕士掌位论文 微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 喷爆温度的提高，低聚木糖的平均聚合度d p 值呈下降趋势，一般情况下，温度范围为 1 7 04 c - - 一2 2 0 。c 。冈崎昌子等( 1 9 9 0 ) 1 3 5 认为高温高压下喷爆处理植物原料制备低聚木糖 的方法精制工艺烦琐，产品得率低。 研究认为，热水抽提法对于棉籽壳、玉米芯、养麦皮、甘蔗渣等为原料时采用热水 抽提即蒸煮法效果较好，而以桦木等阔叶木材为原料时，由于木质素含量较高，因此采 用蒸汽喷爆法合适。户枝一喜( 1 9 9 7 ) 3 6 1 用蒸汽喷爆法预处理稻壳，然后再利用s p e 一8 6 菌株产木聚糖酶对所抽提出的木聚糖液进行酶解制备低聚木糖的方式获得满意的效果。 目前在日本，已经研制出连续式蒸汽喷爆装置用于低聚木糖的生产。 竹村元宏等( 1 9 8 6 ) 1 3 7 1 利用热水或饱和蒸汽处理植物原料如棉籽壳、玉米芯、荞麦 皮、甘蔗渣以及桦木等富含木聚糖的植物，g i lg a r r o t e 等( 2 0 0 1 ) 3 s 】曾以蓝桉树木质纤 维为原料来进行在高压蒸汽条件下分解木聚糖生产低聚木糖的研究，并采用响应面分析 得到低聚木糖为主要成分的水解溶液，同时糠醛的含量维持在较低水平。国内杨瑞金 ( 1 9 9 9 ) 3 9 】等报道了以玉米芯为原料经稀酸预处理后加水蒸煮( 1 6 0 。c 以下) 提取木聚 糖，然后经酶水解提取液来生产低聚木糖的工艺路线。 ( 4 ) 酶水解法( 含物理或化学一酶联合法) 木聚糖是植物木质纤维成分的一部分，主要存在于植物的细胞壁中，植物材料中 的木聚糖不是以游离的形式存在，而是与木质纤维的其它成分如木质素，果胶和纤维 素等连接在一起的。木聚糖与其它成分的连接方式有多种，如共价键和氢键等。现在 已经证实木聚糖与木质素是通过共价键连接的，其具体连接方式为：木聚糖的阿拉伯 残基和葡萄糖醛酸残基同木质素的苯环通过共价键连接在一起。 在低聚木糖的生产过程中，与木聚糖结合的这些成分以及木聚糖本身的侧链，都 会妨碍木聚糖酶的活性中心与木聚糖的接近，影响木聚糖的水解，从而影响低聚木糖 的生成速度和最终产品的得率。木聚糖为生物大分子，在自然状态多与其它成分如木 质素复合存在。木质素被认为是酶降解植物细胞壁的限制因子，在进行木聚糖的水解 之前，必需对原料进行处理，尽可能多的去除这些妨碍木聚糖与木聚糖酶接近的“木质 素障碍”即在进行酶法水解前要从原料中提取出木聚糖或对原料迸行有效的预处理以 消弱木聚糖与其它成分之间的结合力。但是为了获得以木二糖和木三糖为主要成分的 高纯度低聚木糖产品，所以在木聚糖的提取或酶解前的预处理过程中不仅要考虑提取 率，而且还有保证木聚糖不过分水解生成木糖。 v o s s 等( 1 9 8 3 ) 1 4 0 1 发现水溶性的木聚糖比不溶性的木聚糖更容易酶解。b e n d e r 等 7 广西大掌硕士掌位论文微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 ( 1 9 7 0 ) 1 4 1 1 研究指出，蒸汽喷爆法是从植物原料中提取半纤维素的最佳方法。日本专 利昭4 6 1 2 9 3 6 2 1 9 7 11 4 2 1 报道了采用线状菌作用于高纯度的木聚糖，当反应进行至一定 程度时停止酶解反应。其所用的木聚糖原料是用传统的碱抽提法得到的，即将植物原 料用碱液抽提后，在经充分精制而得的纯度较高的木聚糖。由于工业规模和成本等方 面的因素，迟迟没能工业化。 藤川茂昭( 1 9 9 0 ) 【4 3 】针对木聚糖酶与木聚糖反应时会被木聚糖吸附这一特性，提出 了采用连续式生物反应器制备低聚木糖的构想。其主要思路为：预先在柱型反应器中填 充不溶性木聚糖底物吸附木聚糖酶，酶解生成的低聚木糖同解吸下的木聚糖酶由适当的 缓冲液沈出，再经过超滤将木聚糖酶和低聚木糖分离，所以截留的木聚糖酶可循环使用。 此外，还有将木聚糖酶固定化，然后通入可溶性木聚糖( 如经过高温蒸煮、蒸汽喷爆等 方法由富含木聚糖植物中抽提出的木聚糖) 生产低聚木糖的方法f 删。 ( 5 ) 微波降解法 传统的加热方式根据热传导、对流和辐射原理使热量从外部传到物质内部，加热速 度慢，受热不均，且能耗高。微波技术是近年来发展起来的一种新的前处理技术。微波 是一种电磁波，能使样品中极性分子在高频交变电磁场中发生震动，相互碰撞、摩擦、 极化而产生高热。在微波场作用下，特别在密闭加压条件下，样品吸收能量后不断破裂。 微波技术是高效率、无污染的一项新技术，目前在食品中己得到广泛的应用，如微波干 燥、微波萃取、微波加热、微波消解等【4 5 1 。近二十年来微波辐射研究取得了迅速发展， 涉及领域也相当广泛。但利用微波技术提取甘蔗渣中木聚糖制备低聚木糖方面却未见报 道。 微波提取技术在食品工业、制药工业和化学工业上的应用研究虽然起步只有短短几 年的时间，但已有的研究成果和应用成果足以显示其优越性：在实验室中已经完成香料、 调味品、天然色素、草药、化妆品、保健食品、饮料制剂等产品微波萃取工艺的研究。 目前微波萃取已经用于多项天然产物的浸提生产线之中，如大蒜、茶叶、银杏和甘草等； 微波辅助提取已列为我国2 l 世纪食品加工和中药制药现代化推广技术之，研究机构 用微波提取方法处理了上百种植物，无论是提取速度、提取效率还是提取品质均比常规 工艺优秀得多。 低聚木糖的制备工艺中，分离精制是关键步骤之一。水解液常含有各种杂质，如木 质素、酶蛋白( 酶水解液) 和盐等，因此需要进行脱盐除杂或脱色等步骤。较常用的分 离精致方法有以下四种： f - 西大学硕士掌位论文锶波处理甘蔗渣酶漫嘲i 备低聚木糖的研究 ( 1 ) 柱层析法 随着层析分离技术的进步与发展，低聚糖产品的质量得到了很大的改善，其中柱层 析分离低聚糖是最有效的方法之一。h a v l i c e k e r 等( 1 9 7 2 ) 1 2 7 1 研究表明，当样品中含有 大量低聚糖时，采用聚丙烯酰胺凝胶色谱能得到很好的分离效果。洪枫等( 1 9 9 9 ) 4 6 1 采用聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e lp 一4 ) 为吸附介质，对木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖所得低 聚木糖糖液经柱层析进行分离提纯，效果很好，可以得到纯度大于9 8 的低聚木糖单一 组分。 w h i s t l e rr l 4 7 1 等研究了活性炭与硅藻土为吸附剂的柱层析，结果发现葡萄糖、鼠李 糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等单糖都能被水以大致相同的速度洗脱下来；蔗糖、蜜二 糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖等二糖能被5 的乙醇溶液洗脱，而纤维二糖只能被5 的 乙醇较缓慢洗脱，能被7 ，5 的乙醇快速洗脱；棉籽糖和松三耱可被1 5 的乙醇洗脱， 也能被1 0 的乙醇以较慢的速度洗脱下来，但不能被水和5 乙醇洗脱：更高聚合度 的糖要求更高浓度的乙醇才能洗脱。活性炭对混合样的分离也取得了较好的效果，而 且糖样中含有的无机盐对分离无影响，糖浓度也关系不大。b i s h o p 等【4 8 利用活性炭和 硅藻土柱分离木糖和木寡糖，用不同浓度的乙醇分级沈脱，水洗可得到阿拉伯糖和木 糖，用5 和1 5 乙醇溶液洗脱可分别得到木二糖和木三糖，3 0 乙醇洗脱液中含有 木四糖至木八糖等五个组分，将该分级洗脱液重新上柱分级洗脱可完全分离。 ( 2 ) 膜分离法 膜分离技术是一种新兴的高效、分离、浓缩和提纯技术，由于该技术具有常温、无 相交、高效、节能、无污染等特点，因此，近3 0 年来在食品加工、医药、生物化工等 领域获得了较大发展。膜分离技术主要分为微滤( m f ) 、超滤( u f ) 、纳滤( n f ) 、反 渗透( r o ) 、透析( d s ) 、电渗析( e d ) 和渗透汽化( p v ) 等。用于低聚糖分离的膜技 术主要有超滤、纳滤和反渗透。 超滤可以去除大分子物质或固体微粒，根据其膜孔径的大小，还可用于低聚糖的分 级分离。m i t s u r o 等【4 9 1 利用截留不同分子量的超滤膜对低聚木糖进行了分级处理，分析 结果显示，截留分子质量小于5 0 0 的膜所得组分主要为木糖和木二糖，截留分子质量大 于5 0 0 而小于1 0 0 0 的膜所得组分为木四糖和木五糖，截留分子质量大于1 0 0 0 而小于 5 0 0 0 的膜所得组分主要为木七糖和木八糖。w a n i s k a 掣5 0 1 也曾将超滤膜p m l 0 、u m l 0 和u m 2 用于玉米糖浆d p 5 1 0 和1 0 , - - - 2 0 的分级分离研究。 纳滤在过滤分离时，能在截留小分子有机物的同时，透析出盐，即集浓缩与透析为 9 广西大掌硕士掌位论文微波处理甘蔗渣n ：- - t 滞1 鲁低聚木糖的研究 一体。u r a n o 等1 5 l j 对纳滤膜用于低聚糖分离的规律进行了研究，并将4 种不同的纳滤膜 ( g 5 、g i o 、g 2 0 、g 5 0 ) 对从耶路撒冷洋蓟中提取的低聚果糖进行了分离，结果表明， g 5 0 能除去分子质量大于1 0 0 0 0 d a 的大分子，其它三种纳滤膜能将低聚果糖按分子质量 的大小依次分离。a t h a n a s i o s 等旧研究了2 种纳滤膜( n f c a 一5 0 和n f t f c 一5 0 ) 对单 糖、低聚糖的分离特性，结果表明两种纳滤膜可有效分离单糖和二糖，其中n f c a 一5 0 纳滤膜用于低聚糖混合物分离时可去除8 1 的单糖而保留8 8 的低聚糖，其分离特性 满足低聚糖分离纯化的要求。 反渗透是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂和小分子物质的膜分离操 作。反渗透在分离完成的同时，也将料液进行了浓缩，节约了后续浓缩工艺的费用。对 于功能性低聚糖的分离，若能找到加大各组分在反渗透中渗透率差异的措施，反渗透不 失为一种较好的分离手段， ( 3 ) 微生物发酵法 除常规的物化分离方法外，还可通过微生物发酵法将功能性低聚糖中的无功效组分 选择性去除。i s a o 等1 5 3 】利用酵母( c a n d i d ap a r a p s i l o s o sv a r k o m a b a e n x i sk 一7 5 ) 在3 0 c 条件下发酵木糖和木二糖的混合溶液2 5 d 后，可将混合液中的木糖选择性发酵而去除， 离心去除酵母后便得到了纯化的木二糖溶液。酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e se e r e v i s i a e ) 可 以将功能性低聚糖混合物中的葡萄糖发酵成酒精而除去，利用此法纯化低聚异麦芽糖， 可使其纯度超过9 0 ，k o r e n 等 5 4 1 曾利用此法将果糖提纯到1 0 0 。 ( 4 ) 酶法 该法的原理是利用酶制剂将低聚木糖混合物中的某一种或某些成分专一地去除而 达到纯化的目的。由于酶制剂的价格较高，使得分离纯化操作变得不经济。随着酶固定 化技术的发展，有望降低使用成本，使最终进入工业化生产。 尽管采用凝胶柱层析对低聚木糖液进行分离可得到令人满意的效果，然而由于凝胶 价格昂贵，再生困难，因此目前仅用于实验室研究上，而很难用于低聚木糖单一组分的 规模化生产。为适应规模化生产低聚木糖单一组分的要求，本文主要进行以廉价易得的 活性炭为吸附介质。柱层析分离制备低聚木糖单一组份的实验研究，为低聚木糖单一组 分的规模化生产提供一定的理论依据。 1 0 广西大学硕士学位论文微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 1 3 研究存在的问题 对木聚糖酶酶解制备低聚木糖的研究，是食品加工中崭新的领域。几十年来，人们 对低聚木糖制备过程中所需的原料特性、木聚糖酶的相关性质、原料预处理方法和酶解 反应相关条件进行了广泛深入的研究，推动了实现低聚木糖工业化的进程。但是就甘蔗 渣酶法制备低聚木糖而言，对于低聚木糖生产工艺的研究相对较少，且缺乏系统的、有 针对性的研究。目前在木聚糖酶制备、原料预处理方法、酶解反应特性和低聚木糖分离 纯化等方面存在许多问题。 ( 1 ) 微波处理甘蔗渣为较佳方法。虽然已有一些与其相关的报道，但描述的只是 一些简单的预处理过程，而对于该预处理方法对甘蔗渣木聚糖和木质素溶出规律等方面 还缺乏深入的研究； ( 2 ) 对木聚糖酶水解甘蔗渣微波消解液和微波消解的反应特性缺乏研究，且缺乏 对木聚糖酶酶解动力学特性的研究； ( 3 ) 现有低聚木糖的分离纯化绝大部分选用凝胶柱层析分离的方式。这虽然可以 将低聚木糖各组分较好的分离开来，但是由于吸附介质凝胶的价格较昂贵，因此该方法 目前仅用于实验室规模的研究方面，而对于适合工业生产规模的低聚木糖分离纯化方法 还缺乏研究。 目前世界上规模化生产低聚木糖的公司只有日本三得利公司等少数几家，国内只有 山东龙力生物科技有限公司规模生产，远远不能满足市场需要。低聚木糖独特的功能性， 使得国内外对低聚木糖的市场需求量急剧增加。 我国甘蔗种植面积大，产量高。从我国对甘蔗渣的利用来看，除部分用于造纸外， 大部分直接被用作锅炉燃料烧掉，并未得到充分的利用，与发达国家相比，我国甘蔗渣 资源的开发和利用程度还相距甚远。就甘蔗渣酶法制备低聚木糖而言，对于低聚木糖制 备生产工艺的研究相对较少，且缺乏系统的、有针对性的研究。目前对木聚糖酶制备、 原料预处理方法、酶解反应特性和低聚木糖分离纯化等方面仍存在许多问题。 1 4 研究内容 本论文在研究实验所用甘蔗渣组成成分、微波处理法对甘蔗渣木聚糖和木质素溶出 规律的影响的基础上，对木聚糖酶酶解甘蔗渣制备低聚木糖做较深入的研究，并对规模 广西大学硕士掌位论文 微：波处理甘蔗渣酶法靠g 备低聚木糖的研究 化分离纯化低聚木糖提出了解决方法。并采用高效液相色谱( h p l c ) 法测定低聚木糖 的含量。 主要研究内容有： ( 1 ) 分别采用酸法、碱法、双氧水法对甘蔗渣进行预处理： ( 2 ) 采用微波消解法分别消解用酸法、碱法、双氧水法预处理后的甘蔗渣，分析微 波消解过程中不同条件对甘蔗渣组成成分如甘蔗渣木聚糖、木质素溶出的影响规律和相 关机理： ( 3 ) 研究实验所选用的木聚糖酶水解由微波消解提取的木聚糖的反应机理和产物低 聚木糖的变化规律； ( 4 ) 选用活性碳为吸附介质，研究柱层析法分离低聚木糖单一组分的条件和效果， 为规模化分离纯化低聚木糖提供新的方法； ( 5 ) 薄层层析法分析酶解液组成成分； ( 6 ) 高效液相色谱( h p l c ) 法测定低聚木糖的含量。 1 2 广西大掌硕士学位论文 微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 2 。1 试验材料 2 1 1 原料 第二章材料与方法 甘蔗渣，产地：广西南宁市，已经粉碎，过6 0 目筛。 2 1 2 主要试剂 低聚木糖标准品 木聚糖酶( p e n t o p a nm o n ob g ) d 一( + ) 一木糖 3 ，5 一二硝基水杨酸 地衣酚( 3 ，5 一二羟基甲苯) 盐酸 无水乙醇 甲醇 硫酸 氢氧化钠 酒石酸钾钠 三氯化铁 无水亚硫酸钠 苯酚 苯 氯化钡 糠醛 一 氯化钠 乙腈 s i g m a 公司 a r 诺维信生物技术有限公司 b r 北京奥博星生物技术公司 b r 国药集团化学试剂有限公司 c r 国药集团化学试剂有限公司 c r 洛阳化学试剂厂 a r 西陇化工a r 西陇化工 a r 洛阳化学试剂厂a r 西陇化工 a r 西陇化工a r 西陇化工 a r 西陇化工a r 西陇化工 a r 西陇化工， a r 西陇化工a r 西陇化工 a r 西陇化工a r 西陇化工 a r 广西大掌硕士掌位论文微波处理甘蔗渣酶法制备低聚木糖的研究 2 1 3 主要仪器设备 智能微波消解仪x t 一9 9 0 0 型 涡流混合器m v s 一1 紫外可见分光光度计u v 一4 8 0 2 型 p h 计p h s 一3 c 型 恒温振荡培养箱h z q f 16 0 a 型 微型植物试样粉碎机f z l 0 2 数显恒温水浴锅h h 一4 电热恒温鼓风干燥箱d h g 一9 1 4 a 马福炉r j m 一2 8 1 0 电子天平j a l0 0 3 n 高速台式离心机a n k eg l 一1 6 g 数显恒流泵h l 一2 b 定时恒温磁力搅拌器9 0 - 2 型 部分收集器d s b 一1 0 0 日本理学d m a x 一2 5 0 0 v 型自动x 一衍射仪 循环水式真空泵s h z d 型 石英自动双重纯水整理器 索氏抽提器 2 2 实验方法 2 2 1 甘蔗渣中主要成分的测定 上海新拓微波溶样测试技术有限公司 北京金北德工贸有限公司 上海尤尼柯有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海悦丰仪器仪表有限公司 江西南昌红燕采制样设备有限公司 国华电器有限公司 上海精宏试验设备有限公司 沈阳市电炉厂 上海精密科学仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海沪西分析仪器厂 上海沪西分析仪器厂 日本理学株式会社 巩义市英峪予华仪器厂 江