（环境工程专业论文）超积累植物美洲商陆锰累积与耐性机制研究.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 美洲商陆( p h y t o l a c c a a m e r i c a n al i n n ) 是近年来颇受关注的锰超积累植物， 然其锰耐性机制仍不清楚。本论文通过实验室人工营养液培养体系，采用电镜结 合能谱、超速离心亚细胞组分分离、化学形态提取、高效液相色谱、晶体x 射 线衍射等方法观察不同锰处理下美洲商陆表观胁迫响应，检测植物对锰的吸收与 累积以及锰在植物组织细胞中的分布，分析美洲商陆锰耐受可能涉及因素与锰累 积与解毒的关系，综合研究美洲商陆锰耐性的可能作用机制。当前研究进一步促 进了植物对锰耐性机理的理解，为实际的锰毒土壤上的作物生产改良、酸性土壤 或相关重金属污染土壤的植物修复等提供一定的理论支持与科学依据。取得的主 要研究结果与结论如下： 不同锰处理培养观察显示，美洲商陆对锰具有极强的耐性。5 0 0 0g m 以下锰 处理，美洲商陆生长良好，无明显锰毒性症状，而更高浓度锰处理，植物地上部， 特别是叶片呈现出典型的锰中毒特征。光合作用检测表明，美洲商陆并非嗜锰植 物，过量锰不能促进植物代谢与生长。较高浓度锰连续胁迫下，美洲商陆根部依 锰处理浓度高低先后析出含锰晶体，表明美洲商陆对锰存在一定的排斥机制，可 能与根际沉淀作用相关。电镜观察发现，锰对美洲商陆细胞毒性作用较弱。扫描 电镜下美洲商陆细胞内观察到两类晶体：草酸钙异胞体与含锰晶体。叶片含锰晶 体能谱扫描显示，锰可能主要与羟基、羧基、磷酸根等含氧基团结合。检测美洲 商陆可能涉及锰耐性的相关作用物质，发现该植物草酸与巯基含量较高。初步研 究结果表明，美洲商陆锰耐性可能与草酸、钙、巯基及磷酸根等因素密切相关。 美洲商陆可以耐受和累积高浓度的锰，将过量的锰累积于叶细胞可溶性组分 内，而在细胞器与细胞膜组分的过量累积则导致锰植物毒性。液泡成分包含于可 溶性组分内，作为锰累积的关键场所，同时也是植物储存草酸的细胞器。不同锰 处理植物，美洲商陆可溶性组分内总可以提供过量的草酸络合过量累积的锰，使 之转化为无植物毒性的化学形态。x r d 检测证实可溶性组分中锰以草酸盐形式 存在。研究表明，锰的液泡区室化作用及草酸的络合作用很可能是美洲商陆锰超 积累与耐受最重要的生物机制 浙江大学博士学位论文 比较美洲商陆钙和锰的累积发现，钙和锰主要都以草酸盐形式储存于植物叶 片中。其中，钙对锰的累积具有非常显著的影响，但美洲商陆叶片中草酸钙晶体 并未发现对锰的解毒起到作用。在美洲商陆叶中含锰晶体的发现揭示锰可能被草 酸盐络合，也或与磷酸根结合。美洲商陆钙和锰以如此相近的形式累积，提示参 考植物对钙的调控机制的认识，深入比较研究锰的吸收、转运与累积，将有助于 迸一步理解植物对锰动态平衡的维持与植物对锰的解毒机制。 较高浓度锰连续处理美洲商陆，植物根部随着锰处理浓度的高低先后析出磷 酸锰晶体。含磷与缺磷实验发现，磷酸盐可促进美洲商陆锰的累积并明显减缓锰 的毒性效应。电镜与能谱检测发现，含磷锰处理的美洲商陆叶与根内存在锰的磷 酸盐晶体，而缺磷处理组植物组织中没有出现。特别是美洲商陆根的皮层与表皮， 存在明显的锰磷酸盐晶体。当前研究结果表明，磷酸盐在美洲商陆锰的超积累与 耐性中扮演着重要角色：一方面，磷酸根在植物体内通过固定作用将锰沉积，降 低锰毒性；另一方面，磷酸根可通过根际沉淀作用将锰以磷酸锰晶体形式累积于 根表或表层细胞内，从而阻滞植物对锰的进一步吸收。 研究美洲商陆对不同硫锰作用下的植物锰的累积与总巯基类物质( t s h ) 含量 变化情况，以及分析两者之间对美洲商陆相互作用的关系，结果表明，不同的硫 锰处理对美洲商陆t s h 含量以及植物锰耐性与累积均具有一定影响。其中，美 洲商陆经不同的锰硫处理，其根组织锰的累积量与t s h 含量呈现良好的正相关 关系。研究结果表明，根中巯基类物质对于美洲商陆锰的耐性与超累积具有重要 作用鉴于美洲商陆极强的生长适应性以及对多种重金属耐受与超积累的特性， 根中巯基类物质可能发挥着关键作用，为植物的正常生长和免受外界金属离子的 损伤建立重要的保护机制。 关键词：美洲商陆；锰；超积累植物；累积；解毒；耐性机制 2 浙江大学博士学位论文 a b s t r a c t p o k e w e e d ( p h y t o l a c c aa m e r i c a n al i n n ) h a sd r a w nm u c ha t t e n t i o n f o ri t s h y p e r a c c u m u l a t i o no fm a n g a n e s e ( m n ) i nr e c e n ty e a r s h o w e v e r , t h em e c h a n i s m so f i t sm nr e s i s t a n c ea r es t i l ln o tw e l lc l a r i f i e d t h ep r e s e n ts t u d yc a r r i e do u ts e r i e so f e x p e r i m e n t s ，i n c l u d i n gh y d r o p o n i cc u l t u r e ，p h o t o s y n t h e s i sd e t e c t i o n ，s c a n n i n g e l e c t r o n i cm i c r o s c o p y ( s e m ) a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p y ( t e m ) ，e n e r g y d i s p e r s i v ea n a l y s i s o fx - r a y s ( e d ) ( ) ，a t o ma b s o r p t i o n s p e c t r o m e t e r ( a a s ) ， s u b c e l l u l a rf r a c t i o n i n g ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，e x t r a c t i o n o fd i f f e r e n tc h e m i c a lf o r m s ，a n dp h a s ea n a l y s i so fx - r a yd i f f r a c t i o n ( x r d ) ，t o i n v e s t i g a t et h er e s p o n s e so fp o k e w e e d st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n ，d e t e c tm n u p t a k e ，a c c u m u l a t i o na n ds u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o ni np o k e w e e d ，a n a l y z et h e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e p o s s i b l ef a c t o r si n v o l v e d 、析t hm nr e s i s t a n c ea n dm n a c c u m u l a t i o na n dd e t o x i f i c a t i o n ，a n df u r t h e re x p l o r et h ep o t e n t i a lm e c h a n i s m so fm n r e s i s t a n c ei n t h ep l a n t t h i sr e s e a r c hc o u l da d v a n c eo u ru n d e r s t a n d i n go fm n r e s i s t a n c ei np l a n t ，a n dp r o v i d et h e o r e t i c a le v i d e n c ea n ds c i e n t i f i cd i r e c t i o n sf o rt h e c o r r e c t i o no fm n t o x i c i t yt oc r o p sa n dp h y t o r e m e d i a t i o no fa c i ds o i l so rr e l a t i v eh e a v y m e t a l c o n t a m i n a t e ds o i l s t h em a j o rr e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s p o k e w e e ds h o w e dg r e a tt o l e r a n c et om n ，a n di tg r e ww e l l 诚t l ln od i s c e r n a b l em n p h y t o t o x i c i t yu n d e rd i f f e r e n tm nt r e a t m e n t d e t e c t i o no fi t sp h o t o s y n t h e s i sf o u n dt h a t p o k e w e e di sn o tam n p h i l i cp l a n t ，a n dt h a tm nc a nn o te n h a n c ei t sm e t a b o l i s ma n d g r o w t h m n - c o n t a i n i n gc r y s t a l sw e r ef o u n dt oa p p e a rt i m es e q u e n t l yo nt h er o o t so f p o k e w e e d st r e a t e d 、i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fm n ，w h i c hs u g g e s t e dt h a t p o k e w e e dc o u l de x c l u d em nt h r o u g hr h i z o d e p o s i t i o n o b s e r v a t i o nw i t he l e c t r o n i c m i c r o s c o p yf o u n dt h a tm n h a dm i n o rt o x i c i t yt op o k e w e e dc e l l si nw h i c h ，m e a n w h i l e ， t w ok i n d so fc r y s t a l sw e r ef o u n d ，c a l c i u mo x a l a t ec r y s t a l sa n dm n - c o n t a i n i n g c r y s t a l s e d xd e t e c t i o ns h o w e dm nc o u l db ee o m p l e x e dw i t hh y d r o x y l ，c a r b o x y lo rp h o s p h a t e g r o u p s p o k e w e e dw a sa l s of o u n dt oh a v eah i g hc o n t e n to fo x a l i ca c i da n dt h i o l s t h e 浙江大学博士学位论文 p r i m a r ys t u d yi n d i c a t e dt h a tm n r e s i s t a n c ei np o k e w e e dc o u l db ec l o s e l yr e l a t e dt o f a c t o r s ，i n c l u d i n go x a l i ca c i d ，c a l c i u m ，t h i o l sa n dp h o s p h a t e t h ep l a n tw a sf o u n dt oa c c u m u l a t ee x c e s sm ni nt h el e a v e s ，m a i n l yi nt h ew a t e r s o l u b l ef r a c t i o na n do v e r8 0 e x i s t i n gi naw a t e r - s o l u b l ec h e m i c a lf o r m ，w h i l e a c c u m u l a t i n ge x c e s sm ni nt h ef r a c t i o no fc e l l u l a ro r g a n e l l e sa n dm e m b r a n ew a s o b s e r v e dt oc a u s ep h y t o t o x i c i t y i na d d i t i o n ，p o k e w e e dw a sf o u n dw i t hi n t r i n s i c a l l y h i g ho x a l a t ec o n t e n t i na l lc a s e s t h e r ew e r es u f f i c i e n tl e v e l so fo x a l a t et oc h e l a t em n i nl e a fw a t e re x t r a c t st h r o u g h o u td i f f e r e n tl e v e l so fm n p h a s ea n a l y s i so fx - r a y d i f f r a c t i o nd e t e c t e dt h eo x a l a t e - - m nc h e l a t ec o m p l e x e si nt h ef r e e z e - d r i e ds o l u b l e f r a c t i o no fp o k e w e e dl e a v e s t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tp o k e w e e da c c u m u l a t e se x c e s s m ni nt h es o l u b l ef r a c t i o no fl e a fc e l l s ，m o s tl i k e l yi nv a c u o l e s ，i nw h i c ht h e d e t o x i f i c a t i o no fm nc o u l db ea c h i e v e db yc h e l a t i o nw i t ho x a l a t e c ah a sa ni m p o r t a n ti m p a c to nd i v a l e n tm e t a la c c u m u l a t i o ni np l a n t s ，a n dh e n c e ， t h ea c c u m u l a t i o no fc aa n dm na n dt h e i ri n t e r a c t i o ni np o k e w e e dw e r ei n v e s t i g a t e d e x o g e n o u sc aw a so b s e r v e dt oh a v ead i s t i n c t i v ei m p a c to nt h em np h y t o t o x i c i t ya n d a c c u m u l a t i o ni n p o k e w e e d ，b u te x o g e n o u sm nh a d l i t t l ei n f l u e n c eo nt h e a c c u m u l a t i o no fc a b o t hc aa n dm na c c u m u l a t e di np o k e w e e dw e r ed e t e c t e dt ob e m a i n l yi nt h ef o r mo fo x a l a t e i n v e s t i g a t i o nw i t hs e ma n dt e mf o u n dt h e r ew e r et w o k i n d so fc r y s t a l si nt h el e a v e s ，c ao x a l a t ec r y s t a l sa n dm n c o n t a i n i n gc r y s t a l s f u r t h e r d e t e c t i o ns h o w e dt h a tt h e r ew a sn oi n c l u s i o no fm ni n s i d et h ec ao x a l a t ec r y s t a l s ，a n d t h a to t h e re l e m e n t s ，s u c ha sc ，0a n dp ，w e r ep r e s e n ti nt h em n - c o n t a i n i n gc r y s t a l s t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tc ao x a l a t ec r y s t a l si np o k e w e e dh a v en od i r e c te f f e c to nt h e d e t o x i f i c a t i o no fm n i na d d i t i o n ，t h ef i n d i n go fe l e m e n tpa n doi nt h e m n c o n t a i n i n gc r y s t a l si n d i c a t e st h a te x c e s sm nc o u l db ed e p o s i t e db yp h o s p h a t e ， w h i c hc o u l dc o n t r i b u t et om na c c u m u l a t i o na n dd e t o x i f i c a t i o ni np o k e w e e d m n p h o s p h a t ec r y s t a l sw e r eo b s e r v e dt oa p p e a ro nt h er o o ts u r f a c e ，a n dp h o s p h a t e w a si n v e s t i g a t e dt oh a v ead i s t i n c t i v ee f f e c to nt h em na c c u m u l a t i o na n dt o x i c i t yi n p o k e w e e d t h ef i n d i n go fm n - c o n t a i n i n gc r y s t a l si nt h el e a fa n dr o o ti n d i c a t e dt h a t m nc o u l db ep r e c i p i t a t e db yp h o s p h a t e ，a n dt h ec r y s t a l si nt h et i s s u eo fr o o tc o d e x ， e p i d e r m i s ，r o o th a i ra n dr o o ts u r f a c es h o w e dt h a tp o k e w e e dc o u l de x c l u d ee x c e s sm n 4 浙江大学博士学位论文 b yr h i z o d i p o s i t i o nw i t hp h o s p h a t e t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tp h o s p h a t ep l a y sav e r y i m p o r t a n tr o l ei nm n t o l e r a n c ea n de x c l u s i o ni np o k e w e e d i n v e s t i g a t i o no fm n a c c u m u l a t i o na n dt o t a ls u l f h y d r y l ( t s h ) a n dt h e i ri n t e r a c t i o n i np o k e w e e d st r e a t e d 、析t l ld i f f e r e n tl e v e l so fm na n ds u l p h a t ef o u n dt h a tt r e a t m e n t 谢t l ld i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f s u l p h a t ea n dm nh a da l li m p a c to nt h ec o n t e n to ft s h ， m na c c u m u l a t i o na n dt o l e r a n c e i np a r t i c u l a r , m na c c u m u l a t i o ns h o w e dam u c h p o s i t i v ec o r r e l a t i o nt ot h ec o n t e n to ft s hi nt h er o o t t h er e s u l t ss u g g e s tt h a t s u l f h y d r y lc o m p o u n d s i nt h er o o ta c t 私a ni m p o r t a n tr o l e i nt h em n h y p e r a c c u m u l a t i o na n dr e s i s t a n c ei np o k e w e e d c o n s i d e r i n gt h eg r e a ta d a p t a b i l i t y a n dm u l t i p l et o l e r a n c e st oh e a v ym e t a l s ，t h i o l si nt h ep o k e w e e dr o o tc o u l dp l a yav i t a l r o l ew h i c h p r o t e c t st h ep l a n tf r o mt h ed a m a g e sf r o mh e a v ym e t a li o n s k e y w o r d s ：p o k e w e e d ；m n ；h y p e r a c c u m u l a t o r ；a c c u m u l a t i o n ；d e t o x i f i c a t i o n ； r e s i s t a n c em e c h a n i s m 浙江大学博士学位论文 图表索引 图1 1 植物重金属耐受与解毒机制 图1 2 植物细胞锰转运与信号识别机制 图1 3 课题研究技术路线 图2 - 1 美洲商陆生物学特征的观察 图2 。2 美洲商陆根的观察 图2 3 美洲商陆地上部锰植物毒性观察 图2 4 美洲商陆叶片缺损现象观察 图2 5 锰处理美洲商陆根的观察 图2 - 6 美洲商陆根形态 图2 7 不同锰处理对美洲商陆光合作用影响情况 图2 - 8 不同锰处理美洲商陆叶透射电镜观察 图2 - 9 锰处理美洲商陆叶细胞内不明结构透射电镜观察 图2 1 0 不同锰处理美洲商陆叶细胞核透射电镜观察 图2 1 1 不同锰处理美洲商陆叶叶绿体和线粒体透射电镜观察 图2 - 1 2 锰处理美洲商陆根透射电镜观察 图2 1 3 美洲商陆叶片草酸钙晶体扫描电镜观察 图2 1 4 美洲商陆叶片含锰晶体扫描电镜观察 图2 1 5 美洲商陆草酸钙晶体透射电镜观察 图2 1 6 美洲商陆叶片内不明品状物质透射电镜观察 图3 - 1 不同浓度锰处理美洲商陆观察 图3 2m n 在美洲商陆根茎叶的累积 图3 - 3 经不同浓度锰处理1w 的美洲商陆锰毒性观察 图3 - 4 美洲商陆叶片水溶态组分内锰与草酸的含量 图3 5 美洲商陆叶片锰可溶态组分冷冻干燥物质物象分析 图4 - l 不同钙浓度处理美洲商陆锰毒性影响的观察 图4 2 美洲商陆叶片钙亚细胞分布 图4 3 美洲商陆叶片锰亚细胞分布 6 浙江大学博士学位论文 图4 - 4 美洲商陆叶片沉淀钙组分的物质物象分析 图4 5 美洲商陆叶片中含c a 晶体扫描电镜与能谱观测 图4 - 6 美洲商陆叶片中含m n 晶体扫描电镜与能谱观测 图4 7 美洲商陆叶片中含c a 晶体透射电镜与能谱观测 图4 8 美洲商陆叶片中合锰晶体透射电镜与能谱观测 图5 1 锰处理美洲商陆根部析出晶体观察 图5 2 锰处理美洲商陆根部析出晶体的鉴定 图5 3 美洲商陆及其根对5 0 0 0u mm n 处理6d 的响应观察 图5 4 含磷与缺磷对5 0 0 0g mm n 处理美洲商陆锰累积的影响 图5 5 缺磷加锰处理后含磷- 9 缺磷对5 0 0 0g mm n 处理美洲商陆锰累积的影响 图5 - 6 不同磷处理对美洲商陆锰毒性影响的观察 图5 7 含磷锰处理美洲商陆叶组织透射电镜观察 图5 8 含磷锰处理美洲商陆叶组织针性晶体能谱检测 图5 - 9 含磷锰处理美洲商陆根组织透射电镜观察 图5 1 0 加磷加锰处理美洲商陆叶片组织能谱e d xm a p p i n g 检测 图5 11 含磷锰处理美洲商陆根表皮组织透射电镜观察与能谱检测 图6 1 不同硫锰处理美洲商陆根锰含量 图6 2 不同硫锰处理美洲商陆叶锰含量 图6 3 不同锰硫处理美洲商陆根蛋白含量 图6 4 不同锰硫处理美洲商陆叶蛋白含量 图6 5 不同锰硫处理美洲商陆根总巯基含量 图6 6 不同锰硫处理美洲商陆叶总巯基含量 表1 - 1 植物锰转运相关基因 表1 2 美洲商陆( p h y t o l a c c aa m e r i c a n al ) 4 5 1 条e s t 序列聚类注释情况 表2 1h o a g l a n d 营养液配方 表2 2m n 处理营养液自由离子浓度与活度 表2 3 美洲商陆根各部分结构中锰的含量 表3 1 美洲商陆m n 亚细胞分布 表3 2 美洲商陆m n 主要化学形态分析 表3 3 美洲商陆根茎叶草酸与锰的含量 7 浙江大学博士学位论文 表4 1 美洲商陆根茎叶对钙和锰的累积 表6 1 美洲商陆中涉及金属硫蛋白e s t 分析 8 浙江大学博士学位论文 i n d e xo ff i g u r e sa n dt a b l e s f i g 1 - 1t o l e r a n c eo rd e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s m so fh e a v y m e t a li np l a n t s f i g i - 2h y p o t h e t i cv i e wo fm n t r a f f i c k i n ga n dc e l l u l a rs e n s i n g f i g 1 - 3t e c h n i q u er o u t ef o rt h ep r e s e n tr e s e a r c h f i g 2 - 1o b s e r v a t i o no fp o k e w e e d f i g 2 - 2o b s e r v a t i o no fp o k e w e e d r o o t f i g 2 - 3o b s e r v a t i o no fm np h y t o t o x i c i t y t op o k e w e e d f i g 2 - 4o b s e r v a t i o no fl o s sa n dd a m a g eo nt h ep o k e w e e dl e a v e s f i g 2 - 5o b s e r v a t i o no ft h er o o t so fp o k e w e e d s t r e a t e d 、析t hm n f i g 2 - 6m o r p h o l o g i e so fp o k e w e e d r o o t s f i g 2 - 7e f f e c t so fd i f f e r e n tm nt r e a t m e n t so nt h ep h o t o s y n t h e s i so fp o k e w e e d f i g 2 - 8o b s e r v a t i o no fl e a fc e l l so fp o k e w e e dt r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f m nu n d e rt e m f i g 2 - 9o b s e r v a t i o no f u n k n o w ns t r u c t u r e si nl e a fc e l l so fp o k e w e e dt r e a t e dw i t hm n u n d e rt e m f i g 2 - 10o b s e r v a t i o no fl e a f n u c l e io fp o k e w e e d t r e a t e d 、i t l ld i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o f m nu n d e rt e m f i g 2 - 11 o b s e r v a t i o no fc h l o r o p l a s t sa n dm i t o c h o n d r i ai nl e a fc e l l so fp o k e w e e d t r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fm nu n d e rt e m f i g 2 - 12o b s e r v a t i o no fr o o tc e l l so fp o k e w e e dt r e a t e dw i t hm nu n d e rt e m f i g 2 13o b s e r v a t i o no fc a l c i u mo x a l a t ec r y s t a li np o k e w e e dl e a v e su n d e rs e m f i g 2 14o b s e r v a t i o no fc a l c i u mo x a l m ec r y s t a li np o k e w e e dl e a v e su n d e rs e m f i g 2 15o b s e r v a t i o no fc a l c i u mo x a l a t ec r y s t a li np o k e w e e dl e a v e su n d e rt e m f i g 2 16o b s e r v a t i o no fu n i d e n t i f i e dc r y s t a l si np o k e w e e dl e a v e su n d e rt e m f i g 3 - 1p o k e w e e d s t r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so f m nt r e a t m e n t f i g 3 - 2a c c u m u l a t i o no fm n i nt h ep o k e w e e dr o o t ，s t e ma n dl e a f f i g 3 - 3o b s e r v a t i o no fm nt o x i c i t yt op o k e w e e dt r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n 9 浙江大学博士学位论文 f o r o n ew e e k f 。l g 3 4m na n do x a l a t ec o n t e n ti nt h ew a t e re x t r a c t so fp o k e w e e dl e a v e s f i g 3 - 5p h a s ea n a l y s i so ff r e e z e - d r i e dp o w d e ro fs o l u b l ef r a c t i o ni np o k e w e e dl e a v e s f i g 4 - 1o b s e r v a t i o no fm nt o x i c i t yi np o k e w e e d sa f f e c t e db yd i f f e r e n tl e v e l so fc a t r e a t m e n t f i g 4 - 2c as u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o ni np o k e w e e dl e a v e s f i g 4 - 3m ns u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o ni np o k e w e e dl e a v e s f 培4 - 4p h a s ea n a l y s i so fc a - c o n t a i n i n gf r a c t i o ni np o k e w e e dl e a v e sb yx r d f i g 4 - 5s e mo b s e r v a t i o na n de d xd e t e c t i o no fc a c o n t a i n i n gc r y s t a l si nt h el e a v e s o fp o k e w e e d f i g 4 - 6s e mo b s e r v a t i o na n de d xd e t e c t i o no fm n - c o n t a i n i n gc r y s t a l si nt h el e a v e s o fp o k e w e e d f 培4 - 7t e ma n de d xd e t e c t i o no fc a - c o n t a i n i n gc r y s t a l si nt h e p o k e w e e dl e a v e s f i g 4 - 8t e me d xd e t e c t i o no fm n c o n t a i n i n gc r y s t a l si nt h ep o k e w e e dl e a v e s f 嘻5 - 1o b s e r v a t i o no fa p p e a r a n c eo fc r y s t a l so nt h er o o ts u r f a c eo fp o k e w e e dt r e a t e d w i t hm n f i g 5 - 2i d e n t i f i c a t i o no ft h ec r y s t a l sb yp h a s ea n a l y s i sx r a yd i f f r a c t i o n f i g 5 - 3r e s p o n s e so fp o k e w e e d sa n dt h e i rr o o t sc o n t i n u a l l ye x p o s e dt o5 0 0 0 肛mm n f o r6d f 培5 4e f f e c to fe x o g e n o u sp h o s p h a t eo nt h ea c c u m u l a t i o no fm ni np o k e w e e d t r e a t e d 、析n 15 0 0 0l a mm n f o r1w f i g 5 - 5e f f e c to fe x o g e n o u sp h o s p h a t eo nt h ea c c u m u l a t i o no fm ni np o k e w e e d t r e a t e dw i t h5 0 0 0p mm na n dn op h o s p h a t e f i g - 5 - 6e f f e c to fd i f f e r e n tt r e a t m e n to fe x o g e n o u sp h o s p h a t eo nt h ep h y t o t o x i c i t yo f m nt op o k e w e e d st r e a t e dw i t h5 0 0 0p mm n f 培5 1 7t e mo b s e r v a t i o no fl e a ft i s s u e so fp o k e w e e d st r e a t e dw i t hp h o s p h a t ea n dm n f i g 5 - 8t e mo b s e r v a t i o na n de d xd e t e c t i o no fs o m ec r y s t a l si nt h el e a v e so f p o k e w e e d f i g 5 - 9t e mo b s e r v a t i o no fs o m ec r y s t a l si nt h er o o t so fp o k e w e e dt r e a t e dw i t h p h o s p h a t ea n dm n t h eb l a c ka r r o w si n d i c a t es o m ec r y s t a l si nt i s s u e s 1 n 浙江大学博士学位论文 f i g 5 - 1 0e d xm a p p i n gd e t e c t i o n o f l e a f t i s s u et r e a t e dw i t hm na n dp h o s p h a t e f i g 5 - 11 t e mo b s e r v a t i o na n de d xd e t e c t i o no fc 巧s t a l si nt h et i s s u eo fr o o t e p i d e r m i so fp o k e w e e dt r e a t e dw i t hp h o s p h a t ea n dm n f i g 6 - 1m n i nt h ep o k e w e e dr o o t st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n 2 + a n ds 0 4 2 f i g 6 - 2m n i nt h ep o k e w e e dl e a v e st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n 2 + a n ds 0 4 2 - f i g 6 - 3p r o t e i nc o n t e n t si np o k e w e e dr o o t st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n 2 + a n d s 0 4 2 - f 唔6 - 4p r o t e i nc o n t e n t si np o k e w e e dl e a v e st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n 2 + a n d s 0 4 2 。 f i g 6 - 5t s h i nt h ep o k e w e e dr o o t st r e a t