（植物学专业论文）拟南芥mate家庭成员atdtx18的功能研究.pdf

p 、： 0 - 摘要 和其它生物体一样，植物体合成和积累各种次生代谢物。这些物 质对于植物生长发育和防御病虫害等有着重要的作用。然而，次生代 谢物在植物细胞中过多的积累对于细胞来说是一种毒害。因此，处理 和解毒这些有毒化合物就变得十分必要。 在模式植物拟南芥中存在一个具多药物和有毒化合物转运功能 的m a t e 基因家族，该家族有5 6 个成员，其中有一些成员已被鉴定具 有多药物和有毒化合物转运功能。 本研究以其中一个成员a t d t x l 8 为对象，进行了功能研究，得到 的结果如下： 1 采用分子克隆的方法将a t d t x l 8 的c d n a 克隆到p m d l 8 - t 载体 上，测序结果显示其序列与a g i 预测的序列一致。该基因位于第3 条 染色体上，编码一个具有4 6 9a a 的蛋白。结构分析表明其具有m a t e 家族的共同特征，即具有1 2 个跨膜结构域。 2 把at d t x l 8 亚克隆到p t r c 9 9 a 载体上构建重组表达质粒重组 质粒电转化至细菌突变株k a m 3 ，经i p t g 诱导表达，在含有i 0 0 肛g m l 小檗碱、0 4 5 一- - 0 7 5m o l lt m a c i 、3m m o l li a a 的培养基上观察 到k a m 3 生长减弱。结果表明a t d t x l 8 蛋白具有向胞内转运小檗碱、 t m a c l 、i 从或者其类似物的活性。 3 通过p c r 的方法从拟南芥基因组中扩增到a t d t x l 8 的启动子序 列，构建到双元表达载体p b i1 0 1 2 上，通过农杆菌介导的方法转化 拟南芥，然后对转基因植株用g u s 底物进行组织化学显色分析。结果 表明：a t d t x l 8 在叶片中特异表达，并且表达量受伤害诱导，在伤害 处理的叶片中a t d t x l 8 的表达量开始增加。 4 通过半定量r t - p c r 的方法进一步证实，伤害处理后的野生型 叶片中彳芒刃7 船占的m r n a 量有明显的提高。 5 结合生物信息学的分析，发现该基因的表达量受到伤害、m j 和真菌的诱导，推测a t d t x l 8 参与m j 有关的植物抗病信号途径。其 生理功能可能是转运该抗病途径中的某种次生代谢物。 关键词：拟南芥，m a t e 家族，次生代谢物 n a b s t r a c t j u s t 1i k eo t h e r o r g a n i s m s ，p l a n t ss y n t h e s i z ea n d a c c u m u l a t ead i v e r s er a n g eo fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，w h i c ha r e v e r yi m p o r t a n ti nt h ep r o c e s s e so fg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to f p l a n t s ，o ri np a r t ici p a ti n gd e f e n s er e s p o n s e st ov a r i o u s i n s e c t sa n dm i c r o b e s e c t h o w e v e r ，e x c e s s i r es e c o n d a r y m e t a b o li t e sa c c u m u l a t e di nc y t o p l a s ma r et o x i cf o rp l a n t s t h e r e f o r e ，d i s p o s a la n dd e t o x i f i c a t i o no ft h e s e t o x i c c o m p o u n d sa r en e c e s s a r yf o rp l a n t s t h e r ei sam u l t i d r u ga n d t o x i cc o m p o u n de x t r u s i o nf a m i l yi nt h em o d e lp l a n ta r a b i d o p s i s ， w h i c hc o n s i s to f5 6m e m b e r s s o m eo ft h ef a m il ym e m b e r sh a v e b e e ni d e n t i f i e da sm u l t i d r u ga n dt o x i cc o m p o u n dt r a n s p o r t e r s i nt h i sp a p e r ，a t d t x i s , w h i c hb e l o n g st ot h em a t ef a m i l y ， w a sc h o s e na sat a r g e tg e n ef o rf u n c ti o n a lc h a r a c t e r iz a ti o n 1 t h ec d n ao fat d t x l 8w a sc l o n e db yr t - p c ra n d1i g a t e d t op m d l 8 一tv e c t o r t h es e q u e n c i n gr e s u l ts h o w st h a ti t i s i d e n t i c a lw i t ht h ed a t aa sp r e d i c t e db ya g i t h i sg e n el o c a t e s o nt h et h i r dc h r o m o s o m ee n c o d i n ga4 6 9a ap r o t ei n s t r u c t u r a l a n a l y s i sr e v e a l s a t d t x l 8h a st h eg e n e r a lm a t ec h a r a c t e r i s t i c ， s u c ha s12t r a n s m e m b r a n ed o m a in s 2 t h e n ，t h e c d n af r a g m e n to fa 芒删8w a ss u b c l o n e dt o p t r c 9 9 av e c t o rt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p t r c 9 9 a d t x l 8 t h e nt h ec o n s t r u c tw a st r a n s f o r m e di n t ot h e m u t a n tb a c t e r i a lk a m 3t od ot h ef u n c t i o n a lc o m p l e m e n t a t i o n a f t e rb e i n gi n d u c e db yi p t g ，t h et r a n s f o r m e ds t r a i ng r e w w e a k e rt h a nt h en e g a t i v ec o n t r o l so nt h ec u l t u r em e d i u m c o n t a i n i n g1 0 0p g m lb e r b e r i n e ，o r0 4 5 o 7 5m o l lt m a c io r 3m m o l li 从t h i sr e s u l ti m p l i e sa t d t x l 8m a y b ea ni n f l u x t r a n s p o r t e ro fb e r b e r i n e ，t m a c la n di a ao rt h e i ra n a l o g u e s 3 t h ep r o m o t e rf r a g m e n to fat d t x l 8w a sa m p li f i e db yp c r f r o mg e n o m i cd n ao fa r a b i d o p s i s ，a n dt h e nl i g a t e di n t ob i n a r y p l a s m i dp b i 1 0 1 2t oc o n s t r u c tp b i 1 0 1 一d t x l 8 一g u s ，w h i c hw a s ， s u b s e q u e n t l yt r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i sb ya g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dm e t h o d t h eh i s t o c h e m i c a lg u ss t a i n i n gr e s u l ts h o w s h a ta t d t x l 8e x p r e s s e si nl e a v e ss p e c i f i c a l l y ，a n di t s e x p r e s s i o nw a si n d u c e db yw o u n d a f t e r0 5h o u rs t i m u l a t i o n o fw o u n d ，t h et r a n s c r i p t so fat d t x l 8s t a r tt oi n c r e a s e 4 s e m i q u a n t i t i e sr t p c ra n a l y s i sc o n f i r m st h a tu n d e r w o u n ds t r e s s t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa t d t x l 8i n c r e a s e si nt h e l e a v e so fw i1 dt y p ep l a n t s 5 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i ss h o w e dt h a ta t d t x l 8m a yb e i n v o l v e di nm jd e p e n d e n ts i g n a l i n gp a t h w a yt op a r t i c i p a t e d e f e n s er e s p o n s e sa ss o m es e c o n d a r ym e t a b o lit et r a n s p o r t e r k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ，m a t ef a m i l y , s e c o n d a r ym e t a b o l i t e i v 缩写词 a a a a g i a t p b p c c d n a d e p c d n a e b 叵c o l i e d t a g g f p g u s h i 从 i p t g k b m a t e m l n m j o d 英文全称 a d e n i n e a m i n oa c i d 英文缩写词表 a r a b i d o p s i sg e n o m ei n i t i a t i v e a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b a s ep a i r c y t o si n e c o m p le m e n t a r yd n a d ie t h y p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n ed i a m l n et e t r a a c e ti c a c i d g u a n i n e g r e e nf 1u o r e s c e n c ep r o t ein b g l u c u r o n i d a s eg e n e h o u r i n d 0 1 e 一3 一a c e t i ca c i d is o p r o p y l b d 一 一t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k il o b a s ep a i r m u l t i d r u ga n dt o x i cc o m p o u n d e x t r u s i o nf a m il y m i n u t e m e t h y lj a s m o n a t e o p t i c a ld e n s i t y v 中译名 腺嘌呤 氨基酸 拟南芥基因组计划 三磷酸腺苷 碱基对 胞嘧啶 互补脱氧核糖核酸 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸钠 鸟嘌呤 绿色荧光蛋白 b 一葡萄糖醛酸酶 小时 吲哚乙酸 异丙醇一b 一硫代半 乳糖苷 千碱基对 多药物和有毒化合 物排出家族 分钟 茉莉酮酸甲酯 吸光度 p c r r n a r n a s e r t - p c r s s d s t t a m c l u w t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e a s e r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p c r s e c o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t h y m i n e t e t r a m e t h y l a m m o n i u mc h l o r i d e u r a c i l e w il d t y p e v l 多聚酶链式反应 核糖核酸 核糖核酸酶 反转录酶多聚酶链 式反应 秒 十二烷基磺酸钠 胸腺嘧啶 氯化四甲基铵 尿嘧啶 野生型 目录 中文摘要0 00 0000 00000000000 ( i ) 英文摘要0 000000000 00 000 ( i i i ) 英文缩写词表( v ) 第一章引言 1 1 多药物转出蛋白研究进展0 0 000000b0000000000000 000000000000000 000 0 0 ( 1 ) 1 2m a t e 基因家族研究进展( 2 ) 1 3 拟南芥m a t e 家族研究进展( 4 ) 1 4 其他植物中的m a t e 基因功能鉴定( 7 ) 1 5 本文的研究目的及意义( 8 ) 第二章材料与方法 2 1 材料( 9 ) 2 2 方法- ( 1 1 ) 2 2 1 原核表达载体构建及检测( 1 1 ) 2 2 2l 洲3 的功能互补实验( 1 4 ) 2 2 3 彳芒汐7 = f 馏组织定位研究( 1 5 ) 2 2 4 半定量p c r 检测伤害诱导下彳加删占的表达情况。( 1 6 ) 2 2 5 伤害诱导表达的拟南芥基因启动子分析( 1 9 ) 第三章结果与分析 3 1m a t e 家族成员a t d t x l 8c d s 鉴定及结构分析o o o ooo ee , ooooo e o ( 2 0 ) 3 2 a t d t x l 8 在大肠杆菌k a m 3 宿主表达系统中的功能鉴定( 2 2 ) 3 2 1 原核表达载体的构建( 2 2 ) 3 2 2 彳加胱2 r 占功能互补结果及分析( 2 2 ) 3 3a t d t x l 8 的组织特异性表达：( 2 4 ) 3 3 1a t d t x l 8 基因启动子的扩增、克隆和测序结果( 2 4 ) 3 3 2 彳t d t x l 8 基因启动子植物表达载体的构建结果( 2 4 ) 3 3 3 转基因植株的获得( 2 5 ) 3 3 4a t d t x l 8 基因启动子的器官或组织特异性表达( 2 5 ) 3 4 伤害诱导的a t d t x l 8 特异表达( 2 5 ) 3 5 受伤害诱导的拟南芥基因启动子分析( 2 5 ) 结语( 3 0 ) 参考文献( 3 3 ) 致谢( 3 5 ) 论文原创性说明( 3 6 ) 拟南芥m a t e 家族成员a t d t x l 8 的功能研究 第一章引言 和其它生物体一样，植物体合成和积累一系列次生代谢物。这些次生 代谢物具有吸引周围环境中的昆虫、微生物传粉和防御昆虫、微生物侵害 等多种功能。另一方面，植物体暴露于许多外源有毒化合物中，如农用化 学品( 杀虫剂) 和其他植物或病原体微生物分泌的有毒化合物等 1 。处理 和解毒各种外源和内源的有毒化合物对于植物体生长和发育来说是十分重 要的过程。植物解毒有许多可能的机制，包括内源酶修饰有毒化合物 2 ； 将有毒化合物螯合至液泡 3 ，4 ；将有毒化合物运出细胞外 5 ，6 。 1 1多药物转出蛋白研究进展 跨膜蛋白催化有毒化合物从细胞中排出是原核生物和真核生物抵抗胞 内毒素最常用的解毒机制之一。已有的研究表明，在生物中有5 类解毒输出 转运蛋白，包括：1 主要促进因子超家族( m f s ) ；2 小基因多药物抗性家族 ( s m r ) ；3 抗性结瘤细胞分裂家族( r n d ) ；4 a t p 结合盒超家族( a b c ) ； 5 多药和有毒化合物排出家族( m a t e ) 。其中m f s ，s m r ，r a n d ，m a t e 家族属 于次级转运蛋白家族，是典型的由质子动力提供能量的转运蛋白家族；而 a b c 家族成员通常被认为是初级转运蛋白 5 ，7 ，利用a t p 作为物质跨膜 运输的能量供体。a b c 家族己在细菌、酵母、动物和植物中被发现，s m r 和 r n d 仅在细菌中被发现 5 ，而m f s 家族成员是最多样的转运蛋白，它们有 1 2 - - - 1 4 个跨膜区，涉及到各种底物的同向转运，反向转运和单向转运，如糖、 k r e b s 循环中间物、磷脂、寡糖、抗生素等的转运 8 。n o r m 和y d h e 是存 在于细菌中具有较高序列同源性的多药转运蛋白 9 ，v i b r i o 硕士学位论文 p a r a h a e m o y t i c u s 中的n o r m 可能是n a 。毒素反向转运蛋白 1 0 ，它有 1 2 个跨膜区，因此以前被归于m f s 家族，然而，这些蛋白与m f s 家族成 员间既无序列同源性，也缺乏m f s 家族成员特有的信号序列 8 ，因此， b r o w nmh 等r 7 把r m 和y d h e 命名为一个新的次级转运蛋白家族 多药和有毒化合物排出家族( m u t i d r u ga n dt o x i ce x t r u s i o nf a m il y ， m a t e ) ，成为生物中第5 类解毒输出转运蛋白家族。 1 2m a t e 基因家族研究进展 m a t e 基因家族成员遍布于古细菌、细菌、酵母、动物、植物。大部分 成员有1 2 个跨膜区，长度为4 5 0 - 5 5 0 个氨基酸残基，酵母m a t e 家族蛋 白稍长，约7 0 0 个氨基酸残基。此类转运蛋白对氨基葡糖、阳离子染料、 多种抗生素和药物有转运作用。 m a t e 家族包括2 0 3 个已经完成测序的蛋白 11 。对超过7 0 个转运蛋 白的家族的大量系统发育研究发现，转运蛋白物质特异性与系统发育相关， m a t e 家族的系统发育分析发现此家族有3 个不同的簇( 第1 、2 、3 簇) 7 ， 表明这三个簇可能在某些方面存在区别。第1 簇有细菌多药排出蛋白n o r m 和y d h e 等，来自嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、集胞蓝细菌属等；第2 簇独特 地由真核蛋白组成，包括真菌、植物等，其中，酵母中的e r c l 蛋白对甲硫 氨酸的类似物乙硫氨酸有抑制作用；第3 簇包括d i n f 蛋白( 来自大肠杆菌 和肺炎链球菌) 以及这些蛋白的同源物( 来自真细菌和古细菌) 。 n o r m 来自副溶血弧菌，是功能描述最清楚的m a t e 家族成员，它是生 物中第一个被发现的n a + 毒素反向转运蛋白，对一些抗生素比如 n o r f l o x a c i n 、卡那霉素、链霉素和一些有毒物质( 溴化乙锭等) 具有转运作 拟南芥m a t e 家族成员a t d t x l 8 的功能研究 用 9 。 根据g e n b a n k 等数据库中基因组d n a 序列，发现大量来自古细菌、真 细菌和真核生物中尚未鉴定功能的膜蛋白与n o r m 具有高度的序列同源性 1 0 。 ：h t h y d h e 来自e s c h e r i c h i a0 0 1 1 9 ，也是一个n a + 毒素反向转 运蛋白。除此之外n a + 毒素反向转运蛋白还有b e x a 1 3 、n o r m i 1 4 都 是利用跨质膜的n a + 电化学梯度作为物质转运驱动力。h e 等报道的p m p m 1 5 来自p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 则利用h + 而不是n a + 作为毒素协同转运的 离子 1 5 。这些证据表明在细菌中不只一种多药物转运机制的存在。 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s ) 基因组测序的完成，发现了 2 个酵母中的m a t e 家族成员e r c l 和y d r 3 3 8 c ，当1 8 5 2 b p 的e r c l 核酸 序列存在于多拷贝质粒中时，导致酵母细胞中的s a d e n o s y 卜l m e t h i o n i n e ( s a m ) 的积累并赋予细胞甲硫氨酸的有毒类似物乙硫氨基酪酸的抗性 1 2 。另一个成员y d r s 3 8 c 是以e r c l 的核酸序列为饵从酿酒酵母基因组 中发现的，目前尚未做进一步的功能鉴定。就目前所知e r c l 和y d r 3 3 8 c ， 不同于细菌中的m a t e 家族成员，并没有表现出介导广泛的阳离子染料、 氨基葡糖、多种抗生素和药物的转运作用。 下表列出了一些m a t e 家族成员的基因名称和转运底物。 硕十学位论文 表1 - 1 几个m a t e 家族成员功能描述 1 3 拟南芥m a t e 家族研究进展 随着拟南芥基因组测序的完成，发现拟南芥中m a t e 家族至少有5 6 个成 员。l ie a j 将其命名为d t x l - d t x 5 6 ，并做了一个拟南芥中m a t e 家族蛋白 的系统树( 图1 - 1 ) ，将5 6 个成员分成5 簇 1 。目前已经鉴定了功能的只是 很少的一部分基因。其中e d s 5 突变体e d s 5 植株对某些细菌病原体异常 敏感，当病原体侵染后表现出比野生型低的水杨酸含量和舻1 转录水平。 在未受到胁迫的植物中，e d s 5 的表达量很少，但当植物受到病原体p s y r i n g a e 的攻击、或暴露在u 、，- c 光照下，表达量显著提高。当接种无毒 4 拟南芥m a t e 家族成员a t d t x l 8 的功能研究 的只s y r i n g a e 菌株2 个h 后，e d s 5 的表达量便开始增加，持续受到诱导 表达的时间为2 天。如果用水杨酸处理，e d s 5 的表达量也会增高，这说明 可能存在着一种正反馈调节。e d s 5 受到病原体的侵害或u v - c 照射后的表达 依赖于抗病反应蛋白e d s l ，p a d 4 和n d r l ，说明u v - c 的照射和病原体的 接种后的信号转导途径可能共用某些元件。植物为了对抗外源的细菌、真 菌或其它寄生生物，演化出一系列组成型和诱导型防御机制。一旦识别病 原体，诱导型防御机制就被激活。目前主要的抗病信号途径有3 条，分别导 致合成3 种不同的信号分子：水杨酸( s a ) 、茉莉酮酸酯( j a ) 和乙烯( e t ) 。 由此推测，该基因的生理功能可能为转运水杨酸或其前体 1 7 ，从而参与 s a 相关的抗病信号转导途径；a l f 5 , 到目前为止，生化功能虽然还不清楚， 通过筛选突变体发现商业琼脂培养基中的有毒化合物污染影响了a - 脚0 根 的生长，意味着a l f 5 可能与根部解毒培养基中的有毒化合物有关，该蛋 白的功能可能是在自然环境中保护根免受有毒物质的侵害 1 6 。另外，a l f 5 c d n a 在酵母中的表达赋予了酵母细胞对于四甲基铵的抗性。这些表型与 a l f 5 作为一个向外运输毒素的转运体功能相一致。组织定位结果表明该基 因主要在根的表皮层细胞中表达，而该部位正是根与外界接触的部位； d e b e a u j o ne ta - ( 2 0 0 1 ) 报道了册2 可能与种皮中类黄酮的运输入液泡 有关，缺失了册2 功能的突变体种子种皮中无法积累花色素前体，导致种 皮颜色较野生型淡。肌2 编码一个具有1 2 个跨膜区域的蛋白，在面包酵母 中表达该蛋白，能够转运花青素。体外实验表明，该基因为一个花青素h + 反向转运体。使用g f p 融合蛋白和共聚焦荧光显微镜技术发现该基因定位 于液泡膜上。由于该基因专一的在种皮液泡膜上表达，而不在叶片、花或 硕士学位论文 是其他部位表达。而拟南芥中有5 6 个m a t e 家族成员( 图1 - 1 ) ，因而，很 可能存在其它的转运体在不同部位表达转运次生代谢物到液泡 1 8 。植 秘40- oo 图1 - 1 拟南芥m a t e 家族系统树 柚哪7 玎n 翱劓棚睁o ，礴 舢为叫捌啦o ”口 勾甜利d d 删 却a 呻 相a 昏o n 罅 蕾瞄o o ，i ， m 喇鼬傅 ”o r n 小 ，0 d l r x 伯 亭 毋住 5 1r o 0 1 x t t m 一耕n m 7 ”o 删1 鲥i 蛳o 住协 m v w o “ 矿m d h 却自堋一 n 柏h 州一 1 鳓 o r x 1 埘剐0 - o r x 2 1 鲥口j o r 翻童 护轴嘲巾r 鬻 翱p 嘲o o t l 嗡 埔 ”d n 瞄 柚巾o 曲啦o t l 口一 如鞫啊o t i 封 柚囊曩翻加n c ， 归蕾由r 描 冉豳d r x 一翱由咖 o r l 曩 | 硼幽巾r x 一 勺r x 勺懈 j u l g l1 8 7 t h ) t x a 8 m - d 期 口n r o 榭 勺扑纠o o 榭 旷 n t x 4 0 柚囊目o 嘲 2 o ”1 a 2 柚衄m t 鼍l 嵋瞄咖口t x s 0i ：= 僦l 4 椭q m d 由_ 翻l _ o _ o 懈l n 旷 b 口住 脚胃聃i 吣t x 一 - 墨厶。艄35 物次生代谢物，包括类黄酮，不仅可以使花果显现出缤纷的色彩，在许多 研究中发现它们甚至影响整个植物的健康并能保护植物免受各种胁迫的侵 害，如防御病原体侵袭和紫外线伤害，而过量的类黄酮合成和积累在胞质 中，对植物来说是一种毒害，需将其转运进液泡中进行解毒。尽管目前许 多次生代谢物合成途径中的各种中间代谢物已经知道了，但是转运机制仍 6 拟南芥m a t e 家族成员a t d t x l 8 的功能研究 不清楚；f r d s , 通过遗传表型分析，推测与拟南芥内环境铁离子的稳定有关， 突变体f r d 3 积累2 倍过量的铁离子，4 倍过量的锰离子和2 倍过量的锌离子 1 9 。铁离子作为一种微量营养元素，如果以高浓度水平存在于植物细胞 中则会造成毒害。因此，植物有十分精细的机制控制铁离子的吸收和分布。 最近的研究表明，f r d 3 介导根中柠檬酸盐转出到维管系统。柠檬酸盐是一 种铁离子螯合剂，它可能对于铁离子在植物体中的正确分布十分重要。相 应地，突变体中木质部的流出液中，测得少于野生型的铁离子含量；a t d t x i 是植物中首个被确定具有生物碱转运功能的蛋白。利用叵c o l ik a m 3 突变体， l ie 舌a 阐述了在植物体外a t d t x i 介导的亲脂阳离子如溴化乙锭、生物 碱、n o r f l o x a c i n 转出，a t d t x i 也介导了c a 2 + 的抗性。该基因定位于质膜 上，主要在根部表达，其功能可能和根部转运内源的有毒化合物有关。 1 4 其他植物中的m a t e 基因功能鉴定 水稻基因组测序的完成，使得我们能够根据序列同源性搜索水稻 中的m a t e 家族成员。通过膜蛋白数据库a r a m e m n o n 分析发现水稻中 有4 9 个基因属于m a t e 家族，到目前为止还没有水稻m a t e 基因进行 了功能鉴定。根据目前的玉米遗传学和基因组学数据库和t i g r 网站 上的小麦基因组数据库，还没有发现这两种植物中的m a t e 家族成员。 随着测序的完全，相信将会发现更多的基因属于该家族。 植物中数目众多而功能多样的多药物转运体，说明植物能够向细 胞外转运多种复合物。这些植物中的转运体究竟是和细菌中一样只是 简单地转运多种毒素，还是象a b c 家族转运蛋白或其他家族的转运蛋白 一样，有其更特殊的功能呢? 这是植物转运体中必须解决的问题。这 硕士学位论文 个问题看起来比较复杂，因为在长期的进化过程中，植物产生了转运 广泛的次生代谢物和多药物的功能。底物特异性、结构多样性、基因 表达模式特异性和亚细胞定位导致了植物中m a t e 基因家族功能的多 样性。功能的多样性意味着植物中每个成员的功能特异性，进而需要 进一步的探索每个成员的功能。 1 5 本文的研究目的及意义 我们研究的目的是找出拟南芥m a t e 家族成员之- - a t d t x l 8 1 拘生理功 能，包括克隆该基因，在原核表达系统k a m 3 中鉴定其生化功能，研究基因 的表达模式以及参与的信号转导途径。 m a t e 家族许多成员与生物碱转运有关。植物生物碱中有很多产物具药 用价值，了解生物碱的转运机制，对于药用生物碱工程植物的培育及药用生 物碱的生产将具有重大的指导意义。 拟南芥m a t e 家族成员彳d 脚8 的功能研究 第二章材料与方法 2 1材料 2 1 1 拟南芥实验材料 野生型拟南芥( c o l u m b i a 生态型) 2 1 2 主要实验仪器 p c r 仪( e p p e n d o r f ，m jp t c i 0 0 ，b i o m e t r at 1 ) 、移液器 ( e p p e n d o r f ) 、超净台( a i rt e c h ) 、冷冻离心机( e p p e n d o r f ) 、 超低温冰箱( t h e r m of o r m a ) 、微型离心机( e p p e n d o r f ) 、电子天平 ( m e t t l e rt o l d e na b 2 0 4 一n ) 、p h 计( m e t t l e rt o l e d o3 2 0 - s ) 、 凝胶成像分析系统( k o d a kg e ll o g i c l 0 0 ) 、冷冻超速离心机 ( e p p e n d o r fs i m f 1 2 4 ) 、s i m - f 1 2 4 制冰机( s a n y o ) 、全自动高温 灭菌锅( h i r a y a m a ) 、d y y 一1 1 型电泳仪( 北京六一仪器厂) 、恒温 循环器( 北京博医康技术公司) 、全温振荡器( 东联电子技术开发有 限公司) 、d t y - 2 5 0 生化培养箱( 北京德天佑科技有限公司) 。 2 1 3 培养基和缓冲液 液体l b 培养基：1 胰蛋白胨，o 5 酵母提取物，1 氯化钠，定容 y t 培养基： g y t 培养液： m s 培养基： 至1 0 0m l ，调p h 至7 o 后，高压灭菌 1 6 胰化蛋白胨，1 酵母提取物，o 5 氯化钠， 定容至1 0 0m l ，溶解后调p h 7 ，灭菌。 1 0 ( v v ) 甘油，0 1 2 5 ( m v ) 酵母提取物，0 2 5 ( m v ) 胰化蛋白胨，定容后用o 2 2 m 的滤器过滤， 4 保存 硝酸钾1 9 0 0m g l ，硝酸铵1 6 5 0m g l ，磷酸二 氢钾1 7 0m g l ，七水硫酸镁3 7 0m g l ，二水氯 化钙4 4 0m g l ；碘化钾0 8 3m g l ，七水硫酸锌 8 6m g l ，硼酸6 2m g l ，四水硫酸锰2 2 3m g l ， 二水钼酸钠o 2 5m g l ，五水硫酸铜0 0 2 5m g l ， 氯化钴0 0 2 5m g l ，七水硫酸亚铁2 7 8m g l ， 硕十学位论文 乙二胺四乙酸二钠3 7 3m g l ；肌醇1 0 0m g l ， 甘氨酸2m g l ，盐酸硫胺素0 1m g l ，盐酸吡 哆醇0 5m g l ，烟酸0 5m g l ，蔗糖3 0 9 l ， 琼脂7 5g l 调p h 值5 7 ，灭菌。 2 1 4 菌株和质粒： 大肠杆菌ec o l id h 5q 本室保存； ec o l i 突变株k a m 3 本室保存：一种大肠杆菌突变株，缺乏转运多药 物和有毒化合物的a c r a b 系统，因此对毒素敏感性高于野生型大肠杆 菌。因此可利用此突变系统通过功能互补来进行多药物和有毒化合物 转运基因的功能研究； p m d l 8 - t 克隆载体购自宝生物公司； p t r c 9 9 a 表达载体本室保存； p b i1 0 1 2 表达载体本室保存； 农杆菌g v 3 1 0 1 本室保存。 2 1 5 酶类和试剂盒 历口d n a 聚合酶，晶美公司； p y r o b e s t 聚合酶，t a k a r a 公司： 限制性内切酶，t a k a r a 公司； c d n ap c rl i b r a r yk i t s ，t a k a r a 公司； r e v e r ta c i dt mf i r s ts t r a n d c d n as y n t h e s i sk i t ，i n v i t r o g e n 公司； r n a 提取试剂盒，p r o m e g a 公司； 质粒提取试剂盒，安比奥公司； 胶回收试剂盒，安比奥公司。 2 1 6 其它试剂： 标准d n a 分子量m a r k e r ( 2 5 0 b p ，5 0 0 b p ，7 5 0 b p ，1 0 0 0 b p ，1 5 0 0 b p ， 2 0 0 0 b p ，3 0 0 0 b p ，4 0 0 0 b p ，5 0 0 0 b p ，6 0 0 0 b p ，8 0 0 0 b p ，l0 0 0 0 b pg e n e r u l e r m ) ，晶美公司； m a r k e r 3 ( 2 5 0 b p ，5 0 0 b p ，7 5 0 b p ，12 0 0 b p ，2 0 0 0 b p ，3 0 0 0 b p ，4 0 0 0 b p ) ，天 根生物公司 l o 拟南芥m a t e 家族成员a t d t x l 8 的功能研究 引物由奥科公司合成，5o d 每管，p a g e 纯化； i p t g ，t a k a r a 公司； r n a s e a ，上海生工； 琼脂糖( a g a r o s e ) ，胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 和酵母提取物( y e a s t e x t r a c t ) ，b b i 公司； 氨苄青霉素和卡那霉素，b b i 公司。 2 1 7 生物信息学分析的主要软件与数据库： 水稻基因组数据库h t t p ：r g p d n a a f f r c g o j p e i n d e x h t m l ； 玉米遗传学和基因组学数据库h t t p ：硼w m a i z e g d b o r g ； t i g r 小麦基因组数据库h t t p ：w w w t i g r o r g t d b e 2 k 1 t a e l ； b l a s t 程序h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t 用于核酸蛋白 质系列匹配查找； s m a r t 分析蛋白质结构域h t t p ：s m a r t e m b l h e i d e l b e r g d e ； p r i m e rp r e m i e r5 0 软件用于p c r 引物设计； d n a m a n 软件用于d n a 序列，蛋白质性质分析； p l a n t c a r e 是一个收录植物顺式作用元件、增强子和抑制子的数据库。 h t t p ：b i o i n f o r m a t i c s p s b u g e n t b e w e b t 0 0 1 s p l a n t c a r e h t m l ： 膜蛋白数据库：h t t p ：a r a m e m n o n b o t a n i k u n i k o e l n d e 2 2 实验方法 2 2 1 原核表达载体构建及检测 2 2 1 1 质粒的酶切 a t d t x l 8 c d n a 购自a b r c 种子中心。( s t o c kn u m b e r ：u 1 8 3 4 5 ) 。n c o i 和s a l i 酶切连有含有at d t x l 8c d n a 的质粒u 1 8 3 4 5 ，反应体系为：5 “l 质 粒u 1 8 3 4 5 ，1 5 b u f f e rt ，2 山b s a ，1 山v c oi ，1 p js a l i ，加纯水到2 0 肛l 。 用v c o i 和s a l i 双酶切质粒p t r c 9 9 a ：5 山p t r c 9 9 a ，1 5 xb u f f e rt ，2 p l b s a ，1 p ln c oi ，1 ls a l i ，力口纯水到2 0 肛l 。 2 2 1 2 酶切产物胶回收 将酶切产物按照a m b i o g e n 试剂盒的操作程序进行胶回收。 ( 1 ) 将凝胶中目的d n a 片段小心切下，置于1 5i i l l 离心管内，尽量去 硕士学位论文 掉多余的胶； ( 2 ) 称量胶条的重量( m g ) ，加3 倍体积的b u f f e ro g ( 即l o o m g 胶加 3 0 0 p j 的b u f f e rq g ) ； ( 3 ) 5 0 温浴1 0m i n 直至胶完全溶解，溶液应该是淡黄色，若为橙色 或紫色时，则需加i o m i3m o l ln a h c ( p h5 0 ) ，混匀，则溶液会 转变为黄色； ( 4 ) 加1 倍体积的异丙醇( 即1 0 0m g 胶加1 0 0p l 异丙醇) ，混匀； ( 5 ) 将溶液转移到含收集管的离心柱内，1 2 0 0 0g 离心1r a i n ； ( 6 ) 倒去收集管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内； ( 7 ) 加0 5 m lb u f f e r0 g 于离心柱内，1 2 0 0 0g 离心1m i n ，倒去收集 管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内； ( 8 ) 加入7 5 0 肛1b u f f e rw b 于离心柱内，1 2 0 0 0g 离心1m i n ，倒去收集 管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内； ( 9 ) 重复步骤8