（药理学专业论文）皮质脊髓投射神经元的在体分离与基因表达分析.pdf

缩略词表3 中文摘要4 英文摘要5 前言7目3 吕7 材料和方法10 一、实验材料、仪器设备和试剂10 l 实验动物10 2 主要仪器10 3 主要试剂1 1 二、实验方法17 1 小鼠的麻醉17 2c s p n 的标记17 3 灌注固定18 4 冰冻切片19 5 激光显微切割19 6 基因线 生放大20 7 定量p c r 21 8r n a 原位杂交2 2 结果23 1c s p n 在脊髓的发育：观察f e z f 2 - e g f p 小鼠背侧皮质脊髓束( d c s t ) 1 文一 堂 录 壁 =|、 院一 ， 学 e 医一州一温一 3 2 通过l c m 分离p 8 小鼠的c s p n 2 8 3 3c s p n 的r n a 线性放大29 3 4 标志性基因定量p c r 结果3 0 4 基因芯片结果分析与原位杂交验证3 1 4 1 基因芯片的结果3 1 4 2 s p g3 a 在发育期小鼠大脑中的表达3 3 4 3 印记基因m e 9 8 在发育期小鼠大脑的表达3 3 分析与讨论3 5 1 线性放大对基因表达谱的影响3 5 2 背旁侧皮质脊髓束( d l c s t ) 可能参与调节反应的投射3 6 3 轴突的形成与消除3 7 4a tl a s ti n 与印记基因m e 9 8 在神经发育中可能产生的作用3 7 致谢4 2 文献综述43 学位独创性声明5 6 2 温州医学院硕士学位论文 缩略词表 宰按首字母排序 3 温州医学院硕士学位论文 皮质脊髓投射神经元的在体分离和基因表达分析 中文摘要 目的：哺乳动物的大脑皮层接受、整合来自身体各处的感觉信息，并依靠第五皮 层的下行性投射神经元将控制信息传递出去。来自不同区域的第五皮层投 射神经元其下行性投射靶区是不同的。视觉区的下行性投射神经元投射到 上丘，运动区则投射到脊髓。上述的这种现象是由于出生后轴突的选择性 修剪引起的。本研究是为了寻找皮质脊髓投射神经元( c s p n ) 发育的关键 基因，尝试建立一种在体分离投射神经元和基因表达分析的方法。 方法：我们在p 8 小鼠椎体交叉处注射逆行标记物，用来标记第五皮层的下行性 投射神经元。同时用显微捕获激光切割的方法对视觉区和运动区的投射神 经元进行分离。分别提取r n a ，通过线性放大后，对其进行质量控制。 对于质量合格的r n a ，送去上海做基因芯片实验，通过对c s p n 表达谱 以及皮层组织表达谱的对比分析，寻找特异性表达在c s p n 的基因。 结果：我们发现有很多个基因在纯化的c s p n 上富表达。如遗传痉挛性截瘫病变 基因s p 9 3 a 与印记基因m e 9 8 。对于这一结果我们也通过r t p c r 和原位 杂交的方法进行了验证。结果表明，s p 9 3 a 在e 1 8 5 至p 8 期间在大脑第 五皮层有高表达。同样，m e 9 8 也在发育的早期选择性表达在小鼠大脑第 五皮层中。 结论：利用r e t r o b e a d 的逆行标记、激光捕获显微切割、r n a 线性放大、基因芯 片以及原位杂交技术，我们系统建立了一种投射神经元的分析方法，这种 方法可以成功用于发现投射神经元发育及疾病的关键基因。 关键词：基因芯片；锥体神经元；大脑皮层；逆行标记；基因表达。 4 t h ed e s c e n d i n gp r o j e c t i o nn e u r o n si nt h el a y e rvo fc o r t e x m o t o ra n d s e n s o r yc o r t i c a l a r e a si n n e r v a t ed i s t i n c ts u b c o r t i c a lb r a i nr e g i o n s h o w e v e ei nn e wb o r nm i c e ，t h e ya l lp r o j e c tt ob r a i ns t e m t h e m a t u r a t i o no fd i f f e r e n t p r o j e c t i o n si s a np o s t n a t a l p r o c e s s d u et o s e l e c t i v ea x o np r u n n i n g t od i s c o v e rt h ek e ym o l e c u l e su n d e r l y i n gt h e d e v e l o p m e n to fs u b c o r t i c a lp r o j e c t i o n s , w ei n i t i a t e das i l l d y o nt h e i s o l a t i o na n dg e n ee x p r e s s i o na n a l y s i so fc o r t i c o s p i n a lp r o j e c t i o n n e u r o n s ( c s p n ) m e t h o d s ：w eh a v el a b e l e dc s p nf r o mp 8m o u s eb r a i nb yr e t r o g r a d ew a c i n ga t p y r a m i d a ld e c u s s a t i o n ，a n di s o l a t e dt h eh b e l e dn e u r o n sf r o mv i s u a la n d m o t o rc o r t e xs e p a r a t e l yb yh s e rc a p t u r em i c r o d i s s e c t i o n ( l c m ) t h e m r n ai nt h ei s o l a t e dc e l l sw e r el i n e a r l ya m p l i f i e d a f t e re x a m i n i n gt h e e x p r e s s i o no fl a y e rs p e c i f i cm a r k e r s ，t h eq u a l i f i e ds a m p l e sw e r es e n tt o s h a n g h a if o rd e t e r m i n i n gm r n ae x p r e s s i o n p r o f i l e sb ym i c r o a r r a y s c r e e n i n g t h ee x p r e s s i o no fs e l e c t e dg e n e sf r o mt h em i c r o a r r a yw e r e v e r i f i e db yr e a l - t i m ep c ra n di ns i t uh y b r i d i z a t i o n r e s u l t s ：l a y e r vm a r k e r sf e z f 2a n do t x lw e r eh i g h l ye x p r e s s e di nt h ei s o l a t e d c s p n ，s u g g e s t i n gs u c c e s so ft h e i s o l a t i o na n dg e n ea m p l i f i c a t i o n m u l t i p l eg e n e sw e r ee n r i c h e di nt h e i s o l a t e ds u b c o r l a c a l p r o je c t i o n n e u r o n s a m o n gt h e s e ，e x p r e s s i o no fh e r e d i t a r ys p a s t i cp a r a p l e g i a g e n e ss p 9 3 aa n dt h ei m p r i n t e dg e n e sm e 9 8h a db e e nv a l i d a t e db yi ns i t u h y b r i d i z a t i o n s p 9 3 aw a se n r i c h e di nt h el a y e r5p r o j e c t i o nn e u r o n s s 温州医学院硕士学位论文 f r o me 1 8 st op 8 m e 9 8w a sa l s os e l e c t i v e l ye x p r e s s e di nt h el a y e r5 d u r i n gt h ee a r l yd e v e l o p m e n t c o n c l u s i o n s ：t h es t r a t e g yc o m b i n i n gr e t r o b e a dl a b e l i n g , l c m ，r n aa m p l i f i c a t i o n ， m i c r o a r r a ya n a l y s i s a n di s hh a sb e e ne s t a b l i s h e df o rt h es t u d yo f p r o j e c t i o nn e u r o n s t h em e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od i s c o v e rt h e g e n e si m p o r t a n tf o rt h ed e v e l o p m e n ta n dp a t h o g e n e s i s o fp r o j e c t i o n n e u r o n s nv i v o k e y w o r d s ：m i c r o a r r a ys c r e e n i n g ；p y r a m i d a ln e u r o n ；c e r e b r a lc o r t e x ；r e t r o g r a d e w a c i n g ；g e n ee x p r e s s i o n 6 温州医学院硕士学位论文 刖舌 哺乳动物的大脑皮层具有高级的认知分析功能和调控运动功能。根据皮层解 剖形态以及功能的差异，大脑皮层分为若干个功能区域，这些功能区分别处理不 同的信息。以人为例，其枕叶皮层为处理视觉信息的主要皮层区，而运动中枢则 位于额叶皮层。在整个大脑皮层中，包含着数以百万计的细胞，其中有神经细胞、 胶质细胞等等。成熟的大脑皮质，根据其中神经元细胞的种类、分子的特异性以 及信息传递途径等差异，从皮层表面开始到髓质可分为六层。 第五皮层( 大锥体细胞层) 由大、中锥体细胞，星型胶质细胞和m a r t i n o t t i 细胞 组成，其细胞密度在六个皮层中是最低的，但是所包含的锥体细胞也是六层中最 大的。第五皮层的大锥体神经元发出向上的树突，投射到浅皮层；同时也发出向 下的轴突，将调控信号投射到除丘脑以外的很多皮层下区域，如丘核、脑桥和脊 髓等。 皮质脊髓投射神经元( c o r t i c o s p i n a lp r o j e c t i o nn e u r o n ，c s p n ) 位于第五皮层， 运动区的c s p n 向下发出轴突投射到脊髓并构成了体内最长的神经轴突联系，即 皮质脊髓束( c o r t i c a s p i n a lt r a c k ，c s t ) ；而成熟的视觉区神经元则投射到上丘。 这种差异是在生后逐渐地显现出来，而造成这种差异的原因是由于出生后早期的 神经轴突的选择性修剪所致。这种现象从果蝇到小鼠都有存在。早在上世纪9 0 年代，0 l e a r y 通过对出生早期大鼠c s p n 的逆行追踪研究，提出了大脑皮层投 射神经元发育的3 阶段假说。首先，贯穿大脑皮层各区的第五皮层神经元向脊髓 发出一支无分叉的轴突投射。然后，由这条轴突主干衍生出分支伸向其它多个靶 位，如脑桥、上丘和下丘以及深层小脑核团。最后，多数神经纤维联系被修剪去 除，仅保留一小簇的特异性投射纤维束。即发育成熟后，视皮层神经元向脊髓的 轴突投射从基底脑桥远端起消失，但保留与上丘的轴突投射联系；而运动皮层神 经元向上丘和下丘的投射消失，形成了特异性的运动皮质脊髓束( 图1 ) 。这一过 程说明轴突修剪并不是由于细胞凋亡所致，而是去除掉了多余的轴突分支，这是 投射神经元的一个特异性退化过程【l 】。 7 温州医学院硕士学位论文 c s c 帅拟酬嘲艄如n 图l ：大鼠大脑第五皮层下行性神经纤维束的三个发育阶斟1 , 4 】。a ，轴突主干延伸，第五皮 层神经元发出向脊髓投射的轴突主干( 胚胎晚期至生后早期) 。b ，滞后的侧支形成，向脊髓 投射的轴突主干间隔产生滞后延伸的侧支，这些侧支与皮层下其它脑区形成联系。所有的第 五皮层下行性投射神经元在出生后早期都形成这样的神经侧支。c ，选择性轴突去除，侧支 和轴突主干片段的选择性去除形成了第五皮层神经元的特异性轴突投射( 生后2 3 周) 。 近年来在轴突导向分子方面的研究促进了我们对轴突投射形成过程的了解。 已知转录因子f e z f 2 ( 亦称为z f p 3 1 2 ) 选择性表达在大脑第五皮层锥体神经元中， 并决定该层锥体神经元轴突的下行性投射方向口1 。f e z f 2 促进转录因子c t i p 2 的 表达【3 1 ，并有可能通过调节n e u r o p i l i nl 而影响c s p n 向皮层下的轴突投射，表 明下行性神经纤维束的最初发育方向依赖于轴突导向分子。相反，转录因子s a t b 2 f e z f 2 l 富表达在上皮层投射神经元上，并决定其沿胼 胝体的轴突投射【引。f e z f 2 c t i p 2 和s a t b 2 的表 达似乎存在相互抑制，从而确保个体神经元在 早期发育过程中不是下行性投射神经元就是 胼胝体投射神经元( 图2 ) 。虽然人们对转录因 子在皮质神经元发育中的作用已有一定的认 识，但它们本身是如何受到调节还有待进一步 的研究。 图2 ：f e z f 2 作用于c t i p 2 并决定投射神经元的下行 性投射，而s a t b 2 抑制c t i p 2 的表达并且是神经元轴突沿胼胝体投射的必要性基科1 。 8 温州医学院硕士学位论文 目前的研究表明，有很多基因与c s t 的修剪有关，除了开始时的生长发育， 皮层下行性神经纤维束的修剪过程也可能受到转录调控。w e i m a n n 等对转录因 子o t x l 突变小鼠的研究发现，o t x l 基因敲除小鼠失去了对发育时轴突投射的修 剪能力p 】。但a n d o 等却认为o t x l 只是调节视觉区在整个皮层分布的比例而不能 直接影响其锥体神经元的投射特征【6 l 。因此，早期轴突修剪的分子机制还有待于 进一步研究。 为了研究c s p n 的( 1 ) 早期轴突生长和它随后的( 2 ) 选择性修剪的机理，首先要 从基因筛选着手进行了探索。高通量基因筛选、基因芯片分析是目前流行的主要 手段。由于大脑皮层各层之间没有明显的细分结构，因此对于在体分离单一类型 的c s p n 以保证基因芯片分析数据的完整与可靠，目前仍是一个挑战。陈捷光等 曾对来自大脑皮层组织的r n a 进行过基因芯片高通量分析【2 】，但是这些组织涵 盖了不同的细胞类型。虽然a r l o t t a 等人从分选的神经元中检测到了部分基因的 表达谱( 4 3 0 a 芯片，含2 2 6 9 0p r o b es e t s ) t 7 j ，但由于制备单细胞悬液时会破坏c s p n 的轴突，因此其基因表达不能完全反映具有最长轴突c s p n 的在体情况。本项目 以激光捕获显微切割这一技术平台为支撑点，开创一种可以从活体直接分离单一 神经元胞体的方法；并由此出发，获得出生早期小鼠运动区和视觉区c s p n 的完 整基因表达谱；进而通过比较分析，筛选出可能参与选择性修剪和或轴突长距 离生长的基因加以研究，力求为阐明机理作出贡献；同时也为探索神经性疾病的 致病因子提供帮助。 9 温州医学院硕士学位论文 材料和方法 一、实验材料、仪器设备和试剂 1 实验动物 f e z f 2 e g f p 荧光鼠，购自于美国杰克逊实验室0 a c k s o nl a b o r a t o r y ) ，繁殖于 温州医学院动物学实验室；清洁级i c r 小鼠，来自并繁殖于温州医学院动物学 实验室。 2 主要仪器 a b l 7 5 0 0 荧光定量p c r 仪 a r c t u r u sx t 激光显微切割仪 d u 一8 0 0 紫外分光光度仪 g e l d o cx r 凝胶成像系统 k o p f9 4 0 立体定位仪 超低温冰箱 5 4 17 r 高速离心机( 冷冻型) 移液器 移液枪 h m 5 0 5 e 冰冻切片机 i m a g e r - z1 荧光显微镜 电子天平 c a p t a i rc h e m 通风柜 o l 旧u sb x 4 1 切片显微镜 8 5 2 a 双向恒温磁力搅拌器 x w 8 0 a 漩涡混合器 电热恒温振荡水槽 手术器械 ( a p p l i e db i o s y s t e m ，u s a ) ( a r c t u r u s ，u s a ) ( b e c k m a n ，u s a ) ( b i o - r a d ，u s a ) ( d a v i dk o p f , u s a ) ( t h e r m o f o r m a ，u s a ) ( e p p e n d o f , g e r m a n y ) ( e p p e n d o f , g e r m a n y ) ( e p p e n d o f , g e r m a n y ) ( m i c r o m ，g e r m a n y ) ( z e i s s ，g e r m a n y ) ( m e t t l e ，s w i t z e r l a n d ) ( e r l a b ，f r a n c e ) ( o l y m p u s ，j a p a n ) ( 金坛市医疗仪器厂) ( 上海医大仪器厂) ( 上海森信实验仪器有限公司) ( 苏州六六视觉眼科显微器械) 温州医学院硕士学位论文 3 主要试剂 激光显微切割试剂： p b s 1 0 x ，p h 7 4 a r c t u r u sr i b o a m ph sp l u sk i t p i c o p u r er n ai s 0 1 a t i o nk i t c s p s u r eh sl c mc a p s 乙醇 d e p c - t r e a t e dw a t e r 二甲苯 原位杂交试剂： s a l m o ns p e r md n a ( s h e a r e d10 m g m 1 ) s d s 1o s o l u t i o n y e a s tt r n a ( 1 0m g m 1 ) 2 0 xs s c 5mn a c l d e p c - t r e a t e dw a t e r d p b s ( 1 0 x ) n o r m a ls h e e ps e r u m d e x t r a ns u l f a t e5 0 s o l u t i o n t 7r n a p o l y m e r a s e d i gr n a l a b e l i n gm i x d i gw a s ha n db l o c kb u f 诧rs e t 卜旺t b c i ps t o c ks o l u t i o n t r i s - b u f f e r1ms o l u t i o np h7 5b u f f e r t r i s - b u f f e r1 ms o l u t i o np h9 5b u f f e r d e n h a r d t ss o l u t i o n5 0 xc o n c e n t r a t e s o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o n s u c r o s e w 绷e r m g c l 2 f o r m a m i d e r n a 线性放大试剂： p o w e rs y b rg r e e np c rm a s t e rm i x g e n e a m p 10 xp c rb u f r e r g e n e c h i ps a m p l ec l e a n u pm o d u l e 1 1 a m b i o n a r c t u r u $ a r c t u r u s a r c t u r u s m e r c k s i g m a 九泰 a m b i o n a m b i o n a m b i o n a m b i o n a m b i o n a m b i o n c h e m i c o n j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c h m i l l i p o r e r o c h e r o c h e r o c h e r o c h e s a n g o n s a n g o n s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a a b i a b i a f f y m e t r i x 温州医学院硕士学位论文 m e g a s c r i p tt 7k i t s u p e r s c r i p t i i if i r s ts t r a n dk i t 5 x s e c o n d s t r a n db u t t e r e g e l 1 2 s t a r t e rp a k r n e a s ym i n ik i t 其他试剂： r e dr e t r o b e a d s t m ( 10 0 1 1 ) n e g - 5 0f r o z e ns e c t i o nm e d i u m p b s 水合氯醛 多聚甲醛 蔗糖 a m b i o n i n v i t r o g e n i n v i t r o g e n i n v i t r o g e n q i a g e n l u m a f l u o r r i c h a r d a l l a ns c i e n c i f i c 福州迈新生物技术有限公司 上海天莲精细化工有限公司 上海凌峰化学试剂有限公司 汕头市西陇化工厂有限公司 温州医学院硕士学位论文 4 主要试剂配制 4 1 普通灌注固定用试剂 1 ) 麻醉剂的配n - 10 水合氯醛麻醉剂5 0 m l 水合氯醛 1 p b s 溶液( p h7 4 ) 5 9 加至5 0 m l 2 ) lx p b s 溶液( p h7 4 ) 的配制 lx p b s 溶液( p h7 4 ) p b s d h 2 0 1 包 加至2 l 3 ) 4 多聚甲醛溶液( p f a ) 将8 0 0m l1x p b s 溶液( p h7 4 ) 加热至5 6 c ，加入多聚甲醛4 0g 搅拌至其全部 溶解，冷却至室温，用1 x p b s 溶液( p h7 4 ) 定容至1 0 0 0m l ，过滤后4 。c 保存 备用。 4 ) 3 0 蔗糖水溶液的配n - 3 0 蔗糖水溶液 5 0 m l 蔗糖 d d h 2 0 1 5 9 加至5 0 m l 4 2 激光捕获切割用试剂 1 ) 2 0 蔗糖水溶液的配n - 2 0 蔗糖水溶液5 0 m l 蔗糖 d e p c t r e a t e dw a t e r 1 0 9 加至5 0 m l 1 0 0 乙醇 d e p c t r e a t e dw a t e r 3 7 5 m l 1 2 5 m l 9 5 乙醇溶液的配制： 9 5 乙醇溶液 5 0 m l 1 0 0 乙醇 d e p c t r e a t e dw a t e r 4 7 5 m l 2 5 m l 4 3 原位杂交用试剂 1 ) t b s t 溶液的配n - t b s t 溶液 5 0 0 m l 1 mt r i s - h c i ( p h7 5 ) 5 m n a c l 1 w e e n 一2 0 d e p c t r e a t e dw a t e r 5 0 m l 1 5 m l 0 5 m l 4 3 4 5 m l 2 ) n t m t 溶液的配制： n t m t 溶液 5 0 m l 1 m t r i s h c i ( p h9 5 ) 5 m n a c l 1 mm g c l 2 l e v a m i s o l e t w e e n 2 0 d e p c t r e a t e dw a t e r 5 m l l m l 2 5 m l 1 2 m g 0 0 5 m l 加至5 0 m l 1 4 温州医学院硕士学位论文 3 ) 杂交液的配制( h y b r i d i z a t i o nb u f f e r ) ： h y b r i d i z a t i o nb u f f e r 5 0 m l f o r m a m i d e 2 0 x s s c l m n a 2 肿0 4 y e a s tr n a ( i o m g m e ) d e x t r a ns u l f a t e 5 0 x d e n h a r d t s s s d n a ( 1m g m 1 ) d e p c t r e a t e dw a t e r 2 5 m l l o m l 2 5 m l 0 5 m l 5 m l 1 m l 1 m l 5 m l 4 ) s o l u t i o nx 的配制： s o l u t i o nx5 0 0 m l f o r m a m i d e 2 0 x s s c ( p h4 5 ) 1 0 s d s d e p c t r e a t e dw a t e r 2 5 0 m l 5 0 m l 5 0 m l 1 5 0 m l 5 ) 羊血清溶液的配制( s h e e ps e r u ms o l u t i o n ) ： s h e e ps e r u ms o l u t i o n 1 0 m l n o r m a ls h e e ps e r u m d e p c t r e a t e dw a t e r 1 瓶 1 0 m l 6 ) 封闭液的配带l j ( b l o c k i n gs o l u t i o n ) ： b l o c k i n gs o l u t i o n 1 0 m l s h e e ps e r u ms o l u t i o n t b s t l m l 9 m l 温州医学院硕士学位论文 7 ) 1 羊血清的配制( 1 s h e e ps e r u ms o l u t i o n ) ： 1 s h e e ps e r u ms o l u t i o n l o m l b l o c k i n gs o l u t i o n t b s t l m l 9 m l 8 ) 地高辛抗体溶液的配制( d i ga n t i b o d ys o l u t i o n ) ： d i g a n t i b o d ys o lu t io n 1 0 m l d i g a n t i b o d y 1 s h e e ps e r u ms o l u t i o n 2 u l 加至1 0 m l 9 ) 显色液的配制( n b 咖c ds o l u t i o n ) ： n b t b c i ps o l u t i o n1 0 m l n b t b c i p n t m t 溶液 2 0 0 u l 加至1 0 m l 温州医学院硕士学位论文 二、实验方法 1 小鼠的麻醉 p 2 1 及成年小鼠以o 0 5 m l 3 0 9 的注射剂量，腹腔注射1 0 水合氯醛溶液，右 手持小鼠尾巴，左手下压抓紧小鼠头背部的皮肤将小鼠提起，右手持抽取1 0 水合氯醛溶液的注射器在下腹部腹中线右侧刺破皮肤，进入腹腔，感觉有落空感 并回抽注射器有阻力且见有空气，将水合氯醛注入腹腔，停留片刻拔出注射器。 过约2 - 3 分钟，小鼠完全麻醉。而出生天数小于p 1 5 的小鼠于冰上放置约5 分钟， 冰冻麻醉。 2 c s p n 的标记 2 1 椎体交叉部位的注射 1 ) 分离：待小鼠麻醉后，将其固定在小鼠脑立体定位仪上，切开颈部背侧 皮肤，钝性逐层分离肌肉，直至颈髓部位，在枕骨大孔处将硬脊膜撕去。 2 ) 注射：紧靠第一颈椎，在脊髓中线垂直进针，缓慢注射r e dr e t r o b e a d s 0 3 u l 。 3 ) 缝合：用显微针逐层缝合肌肉与皮肤，放置在热板上，待恢复后放回动 物笼中饲养。 2 2 上丘部位的注射 1 ) 分离：待小鼠麻醉后，将其固定在小鼠脑立体定位仪上，剪去头部毛发， 切开皮肤，暴露颅骨。 2 ) 钻孔：参照小鼠大脑图谱所示上丘的位置坐标，用小鼠脑立体定位仪在 小鼠颅骨上标记该部位，并用颅钻打孔。 3 ) 注射：在钻孔的中间位置垂直进针，缓慢注射r e dr e t r o b e a d so 3 u l 。注 射坐标为：前囟后4 2 5 m m ，旁开0 6 0 m m ，深度0 7 5 m m 。以注射在上 丘的灰质层( s u g ) 部位为准( 图3 ) 。 4 1 ) 缝合：用显微针缝合头部皮肤，放置在热板上，待恢复后放回动物笼中 饲养。 1 7 温州医学院硕十学位论文 图3 ，小鼠脑图谱。红色箭头所指为上丘的灰质层。 3 灌注固定 3 1 手术： 1 ) 将己麻醉的动物仰卧在灌注架上，躯干背部至尾侧下用泡沫板垫起，保 持头低脚高势。用手指轻触上腹部正中位，找到剑突。 2 ) 用左手持弯止血钳在剑突下夹起腹部皮肤，右手持直剪自腹部剪- - 4 , 口， 由此沿与腹中线垂直方向横行向两侧前开，分别剪至腋中线。 3 ) 用弯止血钳夹住剑突，掀起，用直剪剪开膈肌中部一小口，由此向两侧 沿肋缘剪开膈肌。 4 ) 分别从两侧沿与肋缘垂直方向从外向内向嘴侧剪断肋骨，剪至锁骨处， 将剑突与下嘴唇用弯止血钳夹在一起，充分暴露心脏。 5 ) 用膜瓣镊轻捏心脏，向尾侧轻拉，可见连接于心脏的乳白色管腔，即为 升主动脉。 6 ) 眼科剪在心尖偏左剪开左心室，剪口大小为灌注针直径，将灌注针以向 右1 0 度稍向上方向插入左心室并送至升主动脉内，打开p b s 输液器阀， 见右心耳充盈，剪开右心耳，使血液排出。再调节p b s 输液流速，使p b s 液滴呈串珠状，灌注p b s ，灌注时的灌流量约2m l 分钟。用动脉夹固定 灌注针，使之不能退出。 7 ) 观察小鼠四肢、嘴唇、舌头、肝脏逐渐变为白色，并观察到流出的液体 转为清亮无血色，此时p b s 灌注量约1 0 2 0 m l ，心脏沿未停止跳动。 3 2 内固定：旋转三通管使之对准p f a 固定液输液器，开始灌注固定液。首先 温州医学院硕士学位论文 快速灌注，灌流速度为5 滴秒，使固定液滴呈串珠状，固定液进入小鼠血 管后，逐渐出现四肢、头部、嘴唇等部位剧烈抽动，表明灌注液进入小鼠 大脑，待抽动完全停止，固定液己灌入1 0 2 0 m l ，转为慢速滴注( 1 滴秒) ， 共滴入约5 0 m l ，历时约2 0 2 5 m i n 。 3 3 取脑：灌注完毕后全身组织器官变硬，取脑组织。 3 4 外固定：置入装有4 多聚甲醛溶液( 4 ) 的标本瓶中4 小时。 3 5 脱水：将外固定后的小鼠大脑置入3 0 蔗糖水溶液( 4 ) 中过夜，直至沉降 在溶液中。 4 冰冻切片 4 1 包埋：将脱水后的小鼠大脑沿中线矢装切开，用虑纸吸干蔗糖水溶液，而 后以矢装切面为底面，置于模具中，倒入胶水直至没过标本5 m m 左右。将 模具置于液氮中，迅速冷冻。 4 2 切片：将冷冻好的标本置于冰冻切片机中，3 0 m i n 后开始切片。普通观察 与原位杂交实验切片厚度为5 0 u m ，激光捕获显微切割( l c m ) 切片厚度为 1 4 u m 。 5 激光捕获显微切割： 1 ) i c r 小鼠在取材的前两天，于椎体交叉部位注射逆行追踪剂r e dr e t r o b e a d s ，用来标记大脑第五皮层的锥体神经元。 2 ) 注射后小鼠存活2 天，将其麻醉。之后用l om l 预冷的p b s 、2 0m l 预 冷的2 0 蔗糖水溶液在冰上进行灌注。p 3 和p 5 小鼠在冰上取脑后直接 置于2 0 蔗糖水溶液。 3 ) 灌注后迅速取出大脑，用胶水包埋后，置于液氮中冰冻，转移并储藏在 8 0 。 4 ) 将大脑标本转移至冰冻切片机中，在2 0 稳定3 0 分钟，而后进行切片， 切片的厚度为1 4l a m 。切片贴在预冷的载玻片上。 5 ) 将贴有切片的载玻片分别依次置于预冷的7 5 、9 5 、1 0 0 和1 0 0 的 酒精中脱水，各3 0 秒次；然后在室温的二甲苯中脱水2 次，9 0 秒次。 空气干燥5 分钟后进行激光捕获切割。 6 ) 应用a r c t u r u sx t 系统进行捕获切割。在白光下，浏览整个切片，找出海 马的位置。打开荧光，使用c y 3 滤片，在l o 倍下对第五皮层锥体神经 元的边界做标记。在4 0 倍下进行细胞选择。选择单个细胞的胞体部分， 不囊括神经元的轴突。捕获时所用到的激光能量为7 0 毫瓦( m w ) ，时程 为2 5 毫秒( m s e c ) 。 7 ) 以海马后1 3 作为划分视觉区的界线，以侧脑室作为划分运动区的界线。 1 9 温州医学院硕上学位论文 每片标本分别取视觉区与运动区第五皮层锥体细胞约5 0 个，粘附在 c a p s u r eh sl c m 的盖子上。 8 ) 将c a p s u r eh sl c m 盖子取下，把e x t r a c s u r ed e v i c e 扣在盖子上，而后 加入l o p 1 裂解溶液，并用0 5m l 离心管盖在e x t r a c s u r e d e v i c e 上，置于 4 2 下气浴3 0 分钟。而后在室温下8 0 0 9 离心2 分钟，转入8 0 储存。 6 基因线性放大 用p i c o p u r er n a 试剂盒从不少于1 0 0 0 个激光切割获得的细胞中提取r n a 。 细胞经裂解后与酒精混合加入到r n a 纯化柱中，吸附的r n a 经清洗后用d n a 酶处理，加1 1 l 洗脱液离心收集r n a 。r n a 的放大遵循a f f m e t r i x 的少量r n a 标记方案，采用来自i n v i 仃o g e n 的一链合成试剂盒，以o l i g o ( d t ) 2 4 t 7 为引物， 逆转录合成第一链c d n a 。接着使用大肠杆菌d n a 聚合酶i ，r n a 酶h 和d n a 连接酶合成第二链。经纯化后，采用a m b i o n 公司的m e g a s c r i p tt 7 试剂盒体外 转录为c r n a ( 图4 1 。 l t s l r m l dc d n a ? ”t o t a l1 褂4 a 。 ， 5 贯耵丁m 可册从椭3 ； l i r 3 t t m - 一5 5 可n 曩可r f 丽从 从箩 髫卫山卫卫j u 卫u ut t t l h r 一一5 2 矾s t r m l ds y n f l l e s i s： 5 ! 广t 。置_ 1 1 _ i f _ t 。墨。叮而 ma 3 卫叫卫刖出卫卫一沮t t t t t m s l i m 衙一1 s c 咖“硼 j i r ；g 皿且阻“山u u u u u5 ； 图4 - r n a 线性放大示意图。 温州医学院硕士学位论文 7 定量p c r 1 ) 计算各反应体系； p c r 反应体系： 4 1 将e p 管放入p c r 仪中，开始扩增； 5 ) 扩增结束后，取出扩增产物进行电泳检测； 6 ) 配制浓度为1 5 脂糖凝胶：4 0m lo 5 x t b e0 6g 琼脂糖； 7 ) 微波炉中用中火加热4m i n 溶解琼脂糖； 8 ) 冷却至6 0 加入溴化乙锭2 出，混匀； 9 ) 将制胶板周围用胶布封好，放加样梳，将琼脂糖溶液倒入板中，待凝固； l o ) 胶凝固后放入电泳槽中，并拔去加样梳； 1 1 ) 加5 山p c r 反应产物和2 山d n a 上样缓冲液； 1 2 ) 电泳电压1 4 0v 约2 0m i n ； 2 1 温州医学院硕士学位论文 1 3 ) 电泳结束后取出凝胶，g e l d o cx r 凝胶成像系统中观察，拍摄，保存。 8 r n a 原位杂交 首先通过b l a s ts e a r c h 选出侯选基因中独特的长约5 0 0b p 的片段。然后从脑 c d n a 文库中对该基因片段进行p c r 扩增，获得的基因片段经克隆转入含有t 7 和s p 6 启动子的p c r i i t o p o 载体上。应用地高辛标记试剂盒进行体外转录生成 反义r n a 作为杂交探针。而小鼠大脑组织经4 多聚甲醛( p f a ) 灌注，取脑并在 p f a 中过夜固定，然后转入3 0 蔗糖沉底后进行冠状切片和矢状切片。切片在 6 0 杂交液中与标记的r n a 探针进行杂交反应过夜，冲洗后用碱性磷酸酶结合 的抗地高辛抗体和n b t b c i p 进行显色，适时终止反应后封片，镜下观察显色情 况。 温州医学院硕士学位论文 结果 1 c s p n 在脊髓的发育：观察f e z f 2 e g f p 小鼠背侧皮质脊髓束( d c s t ) 的生长 情况 为了便于分离出生早期的c s p n ，我们首先对出生早期c s p n 在脊髓的发育 状况进行了观察。我们采用具有g f p 荧光标记的f e z f 2 - e g f p 转基因小鼠作为观 察模型。该转基因鼠是由h e i n t z 等向卵细胞核注射带有g f p 的f e z f 2 人工染色 体( b a cd n a ) 所产生的。因为人工染色体很大，包括了几乎所有的f e z f 2c i s 调 控序列，使得该转基因鼠中g f p 的表达受到与内源f e z f 2 相同的调节，因而g f p 表达与f e z f 2 一致，都出现在第五皮层下行性投射的神经元中。 f e z f 2 一e g f p 转基因小鼠的g f p 报告基因特异性表达在大脑第五皮层的c s p n 中( 图5 a ，b ) 。由于c s p n 向脊髓发出长距离投射，所以皮质脊髓束( c s t ) 中 也有g f p 的表达( 图5 c ) 。因此f e z f 2 e g f p 转基因小鼠脊髓中的c s t 是被特异 性标记的，这为观察c s t 的生长状况提供了一个便利的模型。我们于新生f e z f 2 e g f p 小鼠p 1 ，p 3 ，p 5 ，p 7 ，p 9 ，p l l ，p 1 5 时( 同窝仔鼠) ，进行灌注固定，而 后分离脊髓，参照脊髓背根神经节与颈膨大和腰膨大将其分为颈髓( c ) ，胸髓上 半段( t - i ) ，胸髓下半段( t - i i ) ，腰髓( l ) 四段( 图5 d ) 。之后进行切片拍照，观察结 果( 图6 ) 。我们观察到f e z f 2 - e g f p 小鼠在p l 时，颈髓及胸髓上半段d c s t 有明 显的荧光标记，而在胸髓下半段及腰髓则没有荧光标记。这说明在f e z f 2 一e g f p 小鼠p 1 时，d c s t 生长越过了颈髓，到达了胸髓上段。在f e z f 2 - e g f p 小鼠生长 到p 3 时，d c s t 仍然没有到达胸髓下段，而是在p 5 时才生长到。d c s t 生长到 腰髓的时问是p 7 ，生长完成的时间在p 7 至p 9 之间。这与2