（发酵工程专业论文）木瓜凝乳蛋白酶抗体的制备及其免疫学检测方法的初步建立.pdf

摘要 摘要 木瓜凝乳蛋白酶( c h y m o p a p a i n 简称c h p ) 是番木瓜乳汁中的一种半胱氨酸 蛋白酶，具有凝乳和蛋白水解能力。它可用于治疗腰椎问盘突出症、r h 血型鉴定、 肿瘤的辅助治疗、消炎、细胞分离以及啤酒的澄清和奶酪的制造等。 由于番木瓜乳汁中的几种半胱氨酸蛋白酶具有相似的结构和性质，木瓜凝乳 蛋白酶的特异性检测和高纯度分离纯化都存在一定的困难。为了更好地进行木瓜 凝乳蛋n 酶的检测和分离纯化，本课题用自制的抗原进行了该酶多克隆抗体和单 克隆抗体的制备研究，并初步建立了本瓜凝乳蛋白酶免疫学检测方法。 采用m a c r o p r e ph i g hss u p p o r t 作为层析介质，分别采用p h 5 0 醋酸钠缓冲 溶液和p h 9 5 硼酸钠缓冲溶液沈脱，纯化两次，分离得到较高纯度的木瓜凝乳蛋 门酶。此分离方法易于操作，结果稳定，重现性好。 片j 纯化的木瓜凝乳蛋向酶免疫新西兰大耳兔，经三次加强免疫后，检测达到 理想效价，收集血液，制备抗血清。采用e l i s a 法对抗血清的效价和特异性进行 分析，效价达1 ：1 0 6 ，抗血清中除了含有木瓜凝乳蛋臼酶的抗体外，还含有少量 木瓜蛋白酶的抗体。 用纯化的木瓜凝乳蛋白酶免疫b a l b c 小鼠，小鼠的血清达到理想效价后， 取其脾细胞与预先准备好的骨髓痛细胞s p 2 0 在p e g 的作用下进行融合，用h a t 作为筛选培养基获得阳性克隆。经过3 次亚克隆，筛选得到阳性杂交瘤细胞，细 胞培养上清效价高于1 0 一。将一定数量的杂交瘤细胞注入b a l b c 小鼠腹腔， 星期左右得效价约为1 0 6 的腹水。 用p r o t e i na s e p h a r o s ec l 一4 b 作为纯化介质，p h 3 0 甘氨酸缓冲溶液作为洗 脱液，纯化兔抗血清与小鼠腹水，初步建立了木瓜凝乳蛋白酶免疫学检测方法， 与传统酶活检测法比较该法灵敏度高，特异性强，操作简便。 本论文通过制备木瓜凝乳蛋白酶的多克隆抗体和单克隆抗体并初步建立免疫 学榆测方法，为木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化和药代动力学的研究奠定了基础，并 可用于番木瓜资源的调查。 关键词木瓜凝乳蛋白酶；分离纯化；多克隆抗体；单克隆抗体 a b s t r a c t c h y m o p a p a i n ( c h p ) i so n eo fc y s t e i n ep r o t e i n a s e sf o u n di nt h el a t e xo fc a r i c a p a p a y a ，w h i c hh a sm i l kc l o t t i n g a n dp r o t e o l y t i ca c t i v i t i e s i tc a nb eu s e df o r t r e a t m e n to fl u m b a rd i s c p r o t u s i o n i ta l s o c a nb e u s e di nc e l li s o l a t i o n ，b e e r c l a r i f i c a t i o ni nb r e w e r yi n d u s t r ya n dc h e e s em a n u f a c t u r ed a i r yi n d u s t r y a st h es e v e r a lc y s t e i n ep r o t e i n a s e si nt h el a t e xo fc a r i c ap a p a y ah a v er e s e m b l e s t r u c t u r e ，c h a r a c t e r sa n ds p e c i f i c i t yo fs u b s t r a t e ，i ti sd i f f i c u l tt os p e c i f i c a l l yd e t e t e c t a h ds e p a r a t ec h y m o p a p a i nf r o mt h el a t e xo fc a r i c ap a p a y a i no r d e rt od e t e c ta n d s e p a r a t ec h y m o p a p a i nm o r ec o n v e n i e n t l y ，w ep r e p a r e dt h ep o l y c l o n a la n t i b o d ya n d m o n o c l o n a la n t i b o d yo fc h y m o p a p a i n c h y m o p a p a i nw a sp u r i f i e df r o mc o m m e r c i a lp a p a y al a t e xb ym a c r o p r e ph i g hs s u p p o r tw i t hc a t i o ne x c h a n g ea ss e p a r a t i o nm e d i u ma tp h5 0u s i n gas o d i u ma c e t a t e g r a d i e n te l u t i n gs o l u t i o na n da tp h 9 5u s i n gas o d i u mb o r a t eg r a d i e n te l u t i n gs o l u t i o n a f t e rt w ot i m e so fi o ne x c h a n g e s ，c h y m o p a p a i nw a sg o t t e n t h i sm e t h o di sn o to n l y s i m p l e ，b u ta l s oc o n s i s t e n t i tw a s av e r ye f f e c t i v em e t h o dt op u r i f yc h y m o p a p a i n n e wz e a lr a b b i t sw e r ei m m u n i z e dw i t hc h y m o p a p a i nw h i c hw es e p a r e a t e df r o m t h el a t e xo fc a r i c ap a p a y a b l o o dw a sc o l l e c t e da n da n t i s e r u mw a ss e p a r a t e dw h e n s e r u mg o tp e r f e c tt i t r e e l i s aw a su s e dt od e t e c tt i t e ra n di d e n t i f yt h es p e c i f i c i t yo f a n t i s e r u m ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e r ei sal i t t l ea n t i b o d yo fp a p a i ni na n t i s e r u mi n a d d i t i o nt ot h a to fc h y m o p a p a i n t h et i t e ro ft h ea n t i s e r u mi su pt o1 ：1 0 0 b a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t ht h es e p a r a t e dc h y m o p a p a i n ，a f t e rt h es e r u m o fm o u s eb l o o dw e r eg o ti d e a lt i t e r ，t h es p l e n i cc e l l so fb a l b cm i c ew e r ef u s e d w i t ht u m o u rc e l ls p 2 1 0u n d e rp e g 4 0 0 0 u s i n gh a tm e d i u ma sf i l t e r i n gm e d i u ma n d g o th y b r i d o m aw h i c hs e c r e t i n ga n t - c h y m o p a p a i na n t i b o d y a f t e rt h r e et i m e so f s u b c l o n i n g ，t h r e em a s c u l i n eh y b r i d o m aw e r ed e t e r m i n e d n u m b e ro fh y b r i d o m aw e r e i n j e c t e di n t oa b d o m i n a lc a v i t yt op r o d u c ea s c i t i cf l u i d a n t i s e r u mo fr a b b i ta n da s c i t i cf l u i do fm i c ew a sp u r i f i e d b y p r o t e i na s e p h a r o s ec l 一4 bu s i n gp h 3 0a m i n o a c e t i ca c i da se l u t i n gs o l u t i o n u s i n gs e p a r a t e d m o n o c l o n a la n t i b o d ya n dp o l y c l o n a la n t i b o d yw es e tu pai m m u n o l o g ym e t h o dt od e t e c t c h y m o p a p a i na n dc o m p a r e dt h i sm e t h o dw i t ht r a d i t i o n a ld e t e c t i n gc h y m o p a p a i nm e t h o db y a n a l y z i n ga c t i v i t yo fp r o t e o l y t i ce n z y m e w ef o u n dt h a t o n rm e t h o di ss p e c i f i ca n d c o n f i c i e n t i n c o n c l u s i o n ，t h er e s u l t f r o mt h i sr e s e a r c ho nt h e p r o d u c t i o n o f a n t i c h y m o p a p a i na n t i b o d ya n dt h ei m m u n o l o g ym e t h o dp r o v i d e dab a s i sf o r r e s e a r c h i n gp h a r m a c o k i n e t i c so fc h y m o p a p a i na n di n v e s t i g a t i n gc a r i c ap a p a y a k e y w o r d ：c h y m o p a p a i n ，p u r i f i c a t i o n ，p o l y c l o n a la n t i b o d y ，m o n o c l o n a la n t i b o d y 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文巾以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：丁戛、兰 日期c r d 丁年g 月g 日 、j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位沦文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 丁护要 d 红彬抄 日期：用j 年月，同 日期河年z 月，_ 7 日 第一章绪论 第一章绪论帚一早珀下匕 1 。1 番木瓜及木瓜蛋白酶家族 番木瓜( c a r i c a p a p a y l ) 的根、莘、叶和果实中含有人量的酶，以未成熟果 实中的含量最丰富，约占果实干重的4 0 。木瓜凝乳蛋白酶足番木瓜乳汁中的一 种半胱氨酸蛋白酶，在木瓜蛋白酶复合酶中有较高的含量，和木瓜乳汁中其他三 种半胱氨酸蛋白酶具有相似的结构和性质。 1 1 1 番木瓜 番木瓜是番木瓜科番木瓜属植物，是热带常绿果树，小乔木。栽培种番木瓜， 又名木瓜、乳瓜、万寿果、石瓜、万寿果、番瓜等【m ，3 1 。番木瓜属有4 0 多个种， 较重要的资源尚有：茎花番木瓜( c a u l i f o l i a j a c q ) 、秘鲁番木瓜( c m o n o i c a d e s f ) 、 山番木瓜( c c a n d a m o r e n s i sh o o k f ) 、五棱番木瓜( c p e n t a g o n ah e i l b ) 、槲叶番木 i l ( c q u e r c i o “4b e n t h e th o o d ) 等。 木瓜原产美洲热带地区，中国引入栽培约有2 0 0 多年历史。生产番木瓜最多 的国家是巴西、墨西哥，亚洲以印度尼西亚、印度、泰国、越南、孟加拉、菲律 宾、缅甸等国。在我国，番木瓜分布较广，广东、广西、云南、福建和台湾等地 均有栽培，以台湾、广东栽培为最多。我国栽培的品种主要有：岭南种、穗中红、 蓝茎、苏劳、泰国红肉等。 明代李时珍本草纲日中记载：木瓜性温味酸，平肝和胃，舒筋络，治腰 酸背痛，降血压。木瓜实气味酸，尤毒。主治湿淠邪气，霍乱大吐下，转筋不i r 。 治脚气冲心，取嫩者一棵去子煎服佳。强筋骨，卜冷o i ，止呕逆，心膈痰唾，消 食，止水利后渴不止，作饮服之。凋营卫，助谷气，去湿和胃，滋脾益肺，治腹 胀善噫，心下烦痞。 木瓜含有的齐墩果酸【4 1 ，具有消炎抑菌、降转氨酶、促进肝细胞再生、防止 肝硬化，促免疫作用、抑制变态反应、降血脂、降血糖、强心，利尿和抑制s 1 8 0 瘤株生长等作用。木瓜t ”含有的黄酮类物质具有稳定血管和毛细血管弹性、降低 血压、增加动脉流量、抗心律不齐、抗溃疡等作用。木瓜中的果胶物质能抗辐射 和促进人体重金属盐的分解，并有稳定抗坏向酸的作用。 现代医学证明：木瓜富含多种氨基酸和营养元素，能抗菌消炎、舒筋活络、 软化i f 【i 管、抗衰养颜、驱风止痛消肿，并能阻止人体致癌物质亚硝胺的合成，是 一种营养十富的果中珍品。番木瓜以“百益之果”著称，足甲生部首批公布的药食 兼用食品之一。 华南坪上人学硕士学位论文 在我国，特别是岭南地区，番木瓜资源极其午富。但其资源调查还仪限于性 状和理化指标，即使在这些方面，研究也不多，从而限制了番小瓜的进一步开发。 建立一种新的、准确的鉴定番木瓜的方法，对大规模开展番木瓜的资源调查有着 极其重要的作用。 1 1 2 木瓜蛋白酶家族 半胱氨酸蛋白酶是一类多年来被广泛研究的酶，研究表明它们在肌肉蛋白降 解和免疫药理反应方面有非常重要的作用bj 。在半胱氨酸蛋白酶家族中，木瓜蛋 一酶家族是最人的一个家族，也是大家最熟悉的一个家族。 ：番木瓜的果实、树干、根和种子等部位含有大量的酶类，在未成熟的木瓜乳 汁中含的酶类约占干重的4 0 ，其中半胱氨酸内肽酶约占整个酶量的8 0 i “。木 瓜果实浆液中的含酶量最为丰富；随着番木瓜的成熟，白色浆液越来越少，因此 一般从未成熟番木瓜中收集乳汁，制备木瓜蛋白酶复合酶【7 8 】。 木瓜乳汁中已知至少含有四种半胱氨酸蛋白酶，它们分别是木瓜蛋白酶 ( p a p a i ne c3 4 2 2 2 ) 、木瓜凝乳蛋白酶( c h y m o p a p a i n ，e c3 4 2 2 6 ) 、甘氨酰肽链 内切酶( g l y c y le n d o p e p t i d a s e ，e c3 4 2 2 2 5 ) 和木瓜蛋白酶q ( c a r i c a i n ，e c 3 4 2 2 3 0 ) 【”。存在于乳汁细胞中的内肽酶处于非活性状态，但是一旦从乳汁细 胞中分泌出来则迅速转化为活性状态，因此到目前为止还未能分离到这些酶的前 体物【10 1 。 木瓜蛋i l | 酶，简称p a p ，在内肽酶中含量很少，约占8 左右，易于分离纯 化，研究的也最多。现已完全阐明了其x 一射线结构及活性位点，被看作木瓜酶家 族中的原形。 甘氨酰肽链内切酶，简称g e p ，也称c h y m o p a p a i nmp a p a y ap r o t e i n a s e l v 、 p r o t e i n a s eg l y c 。等电点与木瓜凝乳蛋白酶的等电点非常接近，其保守序列的残 基在g l y 2 3 和g l y 6 5 分别被g l u 和a r g 替代，活性位点被屏蔽，只能作用于p 1 位 点的甘氨酸残基，比具有较宽底物专一性的其它i 种半胱氨酸内肽酶来说其底物 专一性较窄h “。 木瓜凝乳蛋白酶，简称c h p ，是小瓜乳汁中含量最多药用价值最高的酶。其 结构也最特别，除存2 5 位含有催化所必须的自由巯基外，在1 1 7 位还含一个自由 的巯皋，1 1 7 位的巯基既不与其他巯基形成_ 硫键也小参与活件位点结构。目前 已知至少有9 种升i 同的基凶编码c h p ，其中有6 种亚型的多肽链由2 1 8 个氨基酸 组成，而另外3 种则是由2 2 7 个氨基酸组成旧。木瓜凝乳蛋白酶、v 比其 他几种业型酶存c 端多出9 个氨基酸。在c h p 的9 种砸型中，只有i i 、i i i 、v 中的个别位点氨基酸与其他形式不同，其余大部分都相同，甚至有几种亚型的氨 基酸序列完令一致。c h p 第8 8 位为t h r 、第1 3 2 位为v a l ，而在i l 型和i i i 型中t h r 8 8 2 第一章绪论 被c y s 一8 8 所替代，因而它们含有9 个半胱氨酸。i i 、i i l 和v 中v a l 一1 3 2 则被p h e 一1 3 2 替代。氨基酸序列和x 射线结构证明在东非的_ 术瓜乳汁中才含有木瓜凝乳蛋白酶 i i ：1 扪。 木瓜蛋白酶q ( 简称p a p ，也称p a p a y ap e p t i d a s ea 、p a p a y ap r o t e i n a s ee 1 、 c a r i c a i n ) ，用。表示这种酶主要是用阳离了交换介质分离酶时，它最后洗脱出来。 其氨基酸序列和晶体结构也已经确定，有两个相似的c d n a 编码此酶。实验测定 发现较短的那个氨基酸序列和推测的氨基酸序列完全相同，而较长的那个只是比 短的在c 末端多1 9 个氨基酸残基，- 日2 1 4 位的氨基酸t 由i 代替而已。 除了以上4 种半胱氨酸酶外，木瓜乳汁细胞中还含有溶菌酶( 简称l y s ) ， i i 型几丁质酶( c h i ) 1 3 丝氨酸蛋向酶k u n i t z 一型阻碍子( 简称p p i ) ，g l u t a m i n y l c y c l o t r a n s f e r a s e ( 简称p q c ) ”。现已得到这些物质的纯品，但它们的性质还有 待进一步研究。有的酶虽未得到其纯品，但可以通过它们的c d n a 和酶活来确定， 如：b 一1 , 3 一糖苷酶、c y s t a t i n 和脂肪酶。 1 2 木瓜凝乳蛋白质酶 1 2 1 木瓜凝乳蛋白质酶结构 1 9 8 5 年l v a l l 等人完成了木瓜凝乳蛋白酶的初步测序工作。1 9 9 0 年d a v i d 1 1 5 和s c h n e k 等人研究表明木瓜凝乳蛋白酶是由2 1 8 个氨基酸组成的多肽。圆二色性 光谱研究发现几种不同类型的c h p 其多肽链构型都帽同。d a v i d 等人根据木瓜凝 乳蛋白酶序列，对其三维结构做了预测。直到1 9 9 6 年d o m i n i q u el 1 6 1 等人才得到 c h p 的结晶体，研究了它的x 一射线结构，其结果与1 9 9 0 年c h r i s t o p h e r 等人用计 算机预测的c h p b 模型的三维结构相一致，如图1 - 1 。 图1 - 1 木瓜凝乳蛋白酶结构 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fc h y m o p a p a i n 3 华南理t 大学硕上学位论文 木瓜凝乳蛋白酶的肽链折叠形成了两个大小相同、构型不同的区域：一个是 n 螺旋构成的l 一区，由1 0 1 1 1 和2 1 1 2 1 8 位的氨基酸残基组成；另一个是较 多反向平行的b 片层构成的r 一区，南1 9 和1 1 2 2 1 0 位的氨基酸残基组成。 活性位点氨基酸残基( c y s 2 5 ，a s n l 7 9 ，h i s l 5 9 ) 就位于两个结构域的接触面上， c y s 2 5 位于l 一域内由2 4 4 2 残基构成的n 一螺旋的始端h 扪。 木瓜凝乳蛋白酶具有两个亚部位( s l 、s 2 1 ，其中s 1 由c y s 2 5 ，g l y 2 3 ，g l y 6 5 形成一个大口袋，对底物专一性影响较小。通常认为木瓜蛋白酶家族中s 2 是影响 底物专一性的主要部位。在木瓜蛋白酶中，s 2 由t y r 6 7 ，g l n 6 8 ，v a l l 3 3 ，v a l l 5 7 ， a l a l 6 0 和s e r 2 0 7 构成。c h p 的s 2 氨基酸残基与之相似，只是1 3 3 ，1 5 7 位被基 团较大的l e u 代替，6 8 位被p r o 代替。有人预测这会改变s 2 的几何形状，只有 更小的基团才能进入s 2 ，使酶的特异性发生改变。但x 一射线得到的l e u l 3 3 和 l e u l 5 7 侧链构型和预测的不同，预测认为l e u l 5 7 和l e u l 3 3 的x 1 和x 2 角度分别 为5 0 。和7 9 。，x 一射线结构得到的角度却分别为一4 6 。和一1 7 2 。这说明c l i p 中的l e u l 5 7 在s 2 口袋中转变了方向，l e u l 3 3 的c d l 和c d 2 原子伸出了s 2 口袋， 没有改变s 2 口袋的形状。d r e n t h 等人【1 7 1 模拟用苯环和含有一个苯丙氨酸残基 的氯甲基苯酮抑制剂与c h p 结合，当苯环进入s 2 口袋时，能量达到最低。但还 没有实验证明s 2 口袋的底物特异性。 1 2 2 木瓜凝乳蛋白酶的性质 术瓜凝乳蛋白酶具有广泛的底物特异性，可以与多种蛋白质作用，如明胶、 酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球蛋白和肌纤维蛋白。木瓜凝乳蛋白酶在有机溶剂 介质中比在水介质中具有更广泛的底物特异性【1 8 】。除了蛋白质外，木瓜凝乳蛋白 酶对酯和酰胺类底物也表现出很高的活力。木瓜凝乳蛋白酶的最适p h 随底物不 同而变动，如以蛋清蛋白和酪蛋白为底物时，酶的最适p h 是7 0 ；而以明胶为底 物时，酶的最适p h 降到5 0 【1 9 。在p h 5 0 时，酶溶液具有良好的稳定性【2 “。 木瓜凝乳蛋白酶可溶于水，当p h 3 时，可溶于饱和n a c l 溶液。1 9 4 1 年， j a n s e n 发现，在相同的盐浓度和p h 条件下，木瓜凝乳蛋白酶的溶解度是木瓜蛋 白酶的数倍 2 ”。与木瓜蛋白酶家族的其它三种蛋白酶相比，木瓜凝乳蛋白酶在溶 解度、耐酸性和热稳定性等方面具有更优越的性质。 木瓜凝乳蛋白酶的活性部位中含有巯基，因此巯基试剂能抑制酶活性。当酶 活性部位c y s 被氧化剂氧化或与重金属离子结合时，酶活力受到抑制。还原剂半 胱氨酸盐酸盐( 或亚硫酸盐) 和e d t a 能恢复该酶的酶活性，这是因为还原剂l q + 以使一s s 键再生成为一s h ，而e d t a 可以鳌合金属离了。 4 第一章绪论 1 2 3 木瓜凝乳蛋白酶的用途 12 3 1 鉴定r h 血型 r h 血型与主要的a 、b 、o 和a b 四种血型在临床医学上具有同等的重要性。 r h 血型系统免疫反应可导致受血者死亡、终身残疾、死胎、新生儿溶血等。 在常规血型实验或交叉配血实验中，只能诊断出完全性抗体所导致的血型免 疫凝集反应，以区分a b o 血型及其相容性。而由不完全性抗体所导致的r h 血型 免疫凝集反应则需要在3 7 。c 条件下，通过使用木瓜凝乳蛋白酶等试剂进行实验方 可得出诊断结果。木瓜凝乳蛋白酶可对红细胞膜蛋白抗原进行修饰，充分暴露 r h k i d d 等血型抗原，从而更灵敏、更准确地进行r h 血型抗原与抗体的检测。 国际血液标准化委员会( i c s h ) ，国际血液学会( i s b t ) ，美国食品与药物管 理局( f d a ) 于1 9 9 4 年通过对比性实验认证木瓜凝乳蛋白酶法对r h 血型系统免 疫凝集反应，在最佳酶活力范围内，最佳操作条件下，是最灵敏的实验方法，且 费用低廉、操作简便。在国内，中国输血技术操作规程一9 7 版，全国临床检 验操作规程一9 7 版，将木瓜凝乳蛋白酶法作为r h 血型系统免疫学检测的首选方 法收载。 1 23 2 治疗腰椎间盘突出症 1 9 6 4 年s m i t h 首次用c h p 治疗腰椎问盘突出症，其成功率即达到7 0 1 2 2 1 。 到目前为止，美国、加拿大、澳大利亚及欧洲的一些国家已有6 0 余万腰椎问盘患 者接受了木瓜凝乳蛋白酶溶核术治疗。它为患者保守治疗失败，手术切除前提供 了新的抉择机会。 自1 9 6 4 年s m i t h 首次用c h p 治疗腰椎问盘突出症来，人们对此酶进行了大 量的研究。s t a n l e y 等陀引研究发现c h p 水解软骨蛋白多糖的活性比木瓜乳汁中任 何种蛋白酶的活性都高，临床上用的c h p 中还含有木瓜蛋白酶i i i ，木瓜蛋白酶 i i i 也对软骨蛋白多糖有较大的活性。现在普遍认为将c h p 注入退变突出的椎问盘 内，它作为催化剂可加快水解髓核中的粒状蛋白而释放出结合水和更小的糖胺聚 糖，从尿中排出，减轻或解除对神经根的压迫，从而达到消除或减缓症状的目的。 最近的研究证实c h p 可调节磷酸脂酶a 2 的活性，在体内表现出抗炎作用，升商 痛觉阈值，这可能是病人术后症状缓解的原因之一 2 4 】。 1 9 7 5 年，f d a 同意使用c h p 时，数以万计的人注射了此酶。但多数外科医 生认为还是应该做双占试验以消除安慰剂的影响。1 9 8 1 年很多机构都做了烈盲实 验，在1 9 8 3 年的j a m a 杂志上报道了实验结果，c h p 组优良率为7 5 ，对照组 为4 5 f 2 5 】。随后，g o g a n 等【2 6 在澳大利亚对3 0 例患者做了双盲研究，其中c h p 组优良率为8 0 ，对照组为3 4 。1 9 8 8 年，d a b e z i e s 等【2 7 l 在美国做的双盲研究 华南理工大学硕士学位论文 也肯定了c h p 的效果。 c h p 溶核术是否比外科切除术的疗效更好，现还存在争议。w e i n s t e i n 眩剐研 究认为c h p 溶核术的短期有效率高于外科手术，而复发率要低于外科手术， m u r a l i k u t t a n 1 却认为c h p 溶核术短期效果欠佳。 n o r d b y 3 叫、b o u i l l e t 3 1 1 等 人的研究证明c h p 溶核术发生并发症的几率明显小于外科手术。另外，c h p 溶 核术不会出现外科手术可能带来的纤维化，而纤维化往往会导致慢性腰腿痛和严 重的行动障碍3 扪。 1 2 3 3 分离细胞 木瓜凝乳蛋白酶在c d 3 4 + 细胞以及一些特殊肿瘤细胞的分离方面具有非常重 要的应用价值。木瓜凝乳蛋白酶能特异性降解c d 3 4 + 细胞表面c d 3 4 抗原，分离 浓缩c d 3 4 + 细胞。具有c d 3 4 抗原表面标志的造血干细胞和祖细胞在器官移植、 癌症化疗后造血功能的恢复等方面有巨人临床应用价值 3 3 】。 木瓜凝乳蛋白酶还能特异性地降解恶性血液细胞表面的多配体蛋白聚糖一1 生 物大分子，从而分离骨髓性白血病患者的骨髓瘤细胞 3 4 1 ，这对于癌症的免疫治疗 具有重要的意义。 1 2 34 辅助治疗肿瘤 木瓜凝乳蛋白酶还可以用于治疗肿瘤。近年来的研究发现木瓜凝乳蛋白酶可 以选择性地去除包裹在肿瘤表面的蛋白质膜，从而使抗肿瘤药物吏有效地发挥作 用，对肿瘤的治疗起良好的辅助作用。 1 2 3 5 用于消炎 在医药短缺的非洲等地，术瓜凝乳蛋白酶的药用价值得到了进一步的证实。 冈比亚的医疗机构发现木瓜凝乳蛋白酶对去除坏死组织、防止烧伤创口感染和促 进伤口愈合均有作用，甚至还呵用于皮肤移植，其机制可能与该酶的蛋白水解活 性及其抗菌作用有关阳。 1 2 3 6 用于医学研究 木瓜凝乳蛋白酶在研究粘多糖与非胶质蛋白的缺失对滑膜间质液渗透性的影 响，以及研究非胶质蛋白和结构蛋白在问质组织中的作用等方面发挥巨大的作用 3 6 ，37 1 。 1 2 3 7 在轻工业中的应用 食品工业是木瓜蛋白酶使用量最大的领域之一，木瓜凝乳蛋白酶町用于啤泗 6 第一章绪论 的澄清和奶酪的制造。啤酒生产中，加入木瓜蛋白酶，能改善口感，提高啤酒的 品质，延长啤酒的有效储存期【3 8 , 3 9 】。在肉类加工中，木瓜蛋白酶是最好的肉类嫩 化剂，用木瓜蛋白酶处理过的肉片嫩香可口，而且还可提高人对肉类蛋白的吸收 能力，增加营养【4 0 , 4 1 】。在饼干生产中加入适量的木瓜蛋白酶，能使生产的饼干更 加薄脆。在日化工业中，木瓜蛋白酶可用于生产含酶化妆品和含酶牙膏。此外木 瓜蛋白酶复合酶还可用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等工业。 1 3 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化 1 3 1 离子交换层析分离木瓜酶 分离纯化木瓜酶第一步常用的方法是用离子交换层析弭扪。不同产地的木瓜乳 汁成分差异较大，对其处理方法不同，得到的沈脱图谱也有一定的差异。下图是 将新鲜的木瓜乳汁用s p - - s e p h a r o s ef a s tf l o w 进行离子交换，用p h 5 0 的洗脱液 洗脱得到的图谱。另外如果经喷雾干燥的乳汁上柱后进行洗脱，则没有图上箭头 所指的峰。 # h 口喇* # 图1 2 s p s e p h a r o s ef a s tf l o w 阳离子交换树脂分离木瓜酶 f i g 1 - 2i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo ft h ep a p a y ae n z y m e s o ns p s e p h a r o s ef a s tf l o w 样品：1 3 3 0 m g 甲基甲烷硫醇磺化术瓜酶；柱子：3 0 2 6 c m ；每管1 5 m l ；流速：6 0 m l h ；室温；用 醋酸钠线4 降梯度沈脱( 总体积1 5 0 0 m 1 ) ，离了强度从1 0 0 m m 到8 0 0 m m ，a 2 8 0 n m 检测各纰分。 7 华南理上人学硕士学位论文 从离子交换柱分离出来的物质主要分四人部分，第部分几乎不含蛋白质， 也几乎没有酶活( 除糖苷酶外) ，存p h 5 0 时它不会和阳离子交换树脂结合。第二 部分主要是p a p 和部分溶菌酶。第三部分主要是c h p 和g e p ，还含有少量的 型角质脂酶。最后出来的是c a r ，其中含有g l u t a m i n y lc y c l o t r a n s f e r a s e 和半胱氨 酸阻碍子。 但并非所有洗脱情况都如上图所示。h o w a r d 和g l a z e r 用a m b e r l i t ec g - - 5 0 的阳离了交换介质分离木瓜酶时发现溶菌酶有多种形式，且主要集中在最后两部 分。 p a p a y ac y s t a t i n c 在沈脱的后三个部分中都存在，可能是南于它缺乏信号肽和 糖基化位点，主要存在于乳汁细胞的细胞质中，在挤压木瓜乳汁时，它和内肽酶 紧密结合在一起的缘故。另外它和p a p 、c h p 结合的要比c a r 、g e p 紧密些， 所以常常混杂在这两种酶中。 1 3 2 疏水介质分离木瓜酶 疏水介质用于分离木瓜酶效果较好，常用的疏水介质有：p h e n y ls e p h a r o s e ， f r a c t o g e lt s kb u t y l 和f r a c t o g e le m dp r o p y l6 5 0 ( s ) 4 3 4 ”。虽然p h e n y ls e p h a r o s e 在小规模分离木瓜酶的效果不错，但进行大规模牛产时却存在很多问题。图1 2 比较了三种疏水介质：f r a c t o g e lt s kb u t y l6 5 0 ( m ) 、f r a c t o g e le m dp r o p y l6 5 0 ( s ) 和亲硫介质( 用二甲亚砜和2 一巯基乙醇处理的t _ 凝胶) 用硫酸铵进行线性 梯度洗脱的层析结果。 由图1 3 可见，在三种介质中，f r a c t o g e lt s kb u t y l6 5 0 ( m ) 需要的洗脱离子 强度范围最宽。即使硫酸铵的离子强度高达2 m 也无法将c a r 洗脱下来，由此可 见它没和此介质结合。另外在无盐环境中p a p 也未洗脱下来，而需要9 的n 一丁 醇才能将其洗脱下来。 ；4 ”： 黧 1 - _ _ _ w _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ 。_ h - _ h _ _ - - _ _ _ h _ 一_ - _ - - h _ 一 x c a # e p# 一、。g 一# ”， 、 = f 一气o g 一邓 “ 图1 - 3 f r a c t o g e lt s kb u t y l6 5 0 ( m ) ( a ) 、 8 。羔。 一孽 第一章绪论 f r a c t o g e le m dp r o p y l6 5 0 ( s ) ( b ) 、亲硫介质( c ) 的比较 f i g 1 - 3c h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ro ft h ei n d i v i d u a lp a p a y ae n z y m e s o f ff r a c t o g e lt s k b u t y l6 5 0 ( m ) ( a ) f r a c t o g e le m dp r o p y l6 5 0 ( s ) ( b ) a n do nt h et h i o p h i l i eg e l ( c ) 柱子：1 2 3 2 c mi d ；每管1 5 m l ；流速：6 0 m l h ；室温；洗脱液：硫酸铵线性梯度洗脱( 总体积： 1 6 0 0 m 1 ) ，离了强度从2 m 到0 m 然后用水洗脱，最后用9 的n 一丁醇洗脱。a 2 s o n m 检测各组分，实 线代表不同酶的洗脱体积。 除g l u t a m i n y lc y c l o t r a n s f e r a s e 和丝氨酸蛋白酶阻碍子外，其他酶在s p s e p h a r o s ef a s tf l o w 和f r a c t o g e lt s kb u t y l6 5 0 ( m ) 中的洗脱形式基本相同，而 这两种酶可以用固定化胰岛素亲和色谱或嗜硫凝胶色谱将它们分开。用t 一凝胶 l 叮以除去了蛋白酶得到g l u t a m i n y lc y c l o t r a n s f e r a s e ，虽然在s d s p a g e 凝胶电泳 图上很难看出，但可以通过它对荧光底物的酰氨酶活性米确定“3 。用f r a c t o g e l e m d p r o p y l 6 5 0 ( s ) 和t 一凝胶来分离纯化c h p ，g e p ，c a r 和i i 型几丁j 质酶时， 其中含有的杂质比用f r a c t o g e l t s k b u t y l6 5 0 ( m ) 要多些。 1 3 3 共价层析与亲和层析分离木瓜内肽酶 n a t i v e 和s d s p a g e 实验表明结合在s p s e p h a r o s ef a s tf l o w 和f r a c t o g e l t s k b u t y l6 5 0 ( m ) 色谱上的四种内肽酶具有相同的形式。但木瓜乳汁中3 0 一5 0 的蛋白酶会发生不可逆的氧化，其半胱氨酸残基变成了胱氨酸，所以每种酶都 是可逆和不可逆氧化物的混合物。为了得到完全活性的内肽酶，人们尝试用4 i 吲 的介质来进行分离。其中最早使用的是有机汞，得到的p a p 活性较高，但它也会 和c h p 、c a r 结合。随后又出现了固定化的2 一谷胱甘肽吡啶和2 羟丙基吡啶， 它们都能和活性p a p 和c h p 及c a r 进行特异性的结合。但g e p 不能完全结合 在有机汞凝胶及2 谷胱甘肽吡啶琼脂糖凝胶上，当它处于完全活性状态时，它能 和固定化的2 一羟丙基吡啶结合。用固定化的烃基硫醇硫化物也可以得到完全活性 的p a p 。 固定化的g l y 、t y r 、a r g 三肽能与活性的p a p 、c a r 结合，而不与完全氧化 的酶结合，由这种三肽制备的琼脂糖亲和柱结合c a r 的能力明显比结合p a p 的 能力强。在去离子水中，结合在介质上的c a r 依靠s 2 位点和n r ( b z ) 侧链的 疏水作用可以释放出来。 将g l y p h e 氨基乙氰连接到c h 一琼脂糖4 b _ 卜能选择性的截留p a p 和g e p ， 而c h p 和c a r 可直接通过凝胶，洗脱液中p a p 和g e p 的硫醇量分别高达 0 8 4 m o l l 和0 9 5 m o l l 。 9 华南理1 ：_ = 大学硕十学位论文 从黑曲霉j a p o n i c u s 中分离得到的e 6 4 通过它的环氧基团与p a p 、c h p 和c a r 结合，而不与g e p 结合t 4 5j 。当e 6 4 的环氧基吸附到硫丙基琼脂糖上时，其活性 会丧失，但不会影响它和半胱氨酸蛋白酶的结合，实验表明从这个亲和柱上沈脱 下来的p a p 具有完全的活性h 副。 还有人还从蚕豆和鸡半胱氨酸提取k u n i t 2 型胰岛素做亲和柱来分离纯化 c a r 和p a p 4 7 。 1 3 4c h p 的分离纯化 由于c h p 的特殊结构和它在医药上的特殊作用，其分离纯化越来越受到重 视，现已从木瓜乳汁中分离到含有两个自由巯基的c h p 异构体。【_ f ；1 于c h p 5 0 的巯基会发生不可逆的氧化，因此含有两个自由巯基的c h p 约占2 5 ，其余的 c h p 至少有一个巯基被氧化。根据硫原子的氧化状态，可把c h p 看作四种分子 的等量混合物。出于共价层析介质只能和自由的巯基结合，所以它不能和完全氧 化的c h p 结合，这样在层析介质上结合的就是其余三种分子的等量混合物。另外 用活性位点直接亲和凝胶( a c t i v e s i t ed i r e c t e da f f i n i t yg e l s ) 也可分离得到c h p ， 但得到的是1 1 7 位被氧化和未被氧化分子的混合物。 将c h p 修饰后上离子交换柱可得到不同纯度的c h p 。经m p e g 修饰的c h p 制品中大约有2 5 含有两个m p e g 链，5 0 含有一个m p e g 链，其余的则不含 m p e g 链。m p e g 链会屏蔽c h p 的电荷，改变它在离子交换柱中的行为。所以经 m p e g 修饰过的c h p 混合物卜s p s e p h a r o s e f a s tf l o w 柱后，含两个m p e g 链的 分子就能和含一个m p e g 链的分予以及未结合m p e g 链的分子分丌。未被修饰的 酶完全失活，而含有两个m p e g 链的分子活性足含有一个m p e g 链分子活性的2 倍。1 1 7 位的半胱氨酸经磺酸和硫醇甲基修饰得到的衍生物，晶体的分辨率可达 2 4 k 。而经s s 一二甲基硫醇修饰得到的单晶体分辨率可达1 4 1 , 。 经过很多学者的不懈努力，现在已能分离到纯木瓜凝乳蛋白酶，甚至得到此 酶部分亚型的晶体。但目前这些分离方法的步骤都极其繁琐，这对于酶的分离是 非常不利的，而且还仅适用于实验室中。寻求一种简单而有效的规模化生产纯木 瓜凝乳蛋白酶的方法直