（化学工程专业论文）雷公藤内酯醇、内酯二醇的分离与电容特性.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 雷公藤是一种重要的中药材，其有效成分雷公藤内酯醇( t - o ) 、雷公藤内酯二 醇f r 8 ) 在治疗风湿病、皮肤病等方面有着广泛的应用。工业上常用的雷公藤多苷 片制造流程主要包括提取、浓缩、萃取、柱层析等主要工段。 论文以雷公藤前段浸膏为原料，经过一系列前处理过程后，以正己烷一乙酸 乙酯一乙醇一水( 1 ：1 ：1 ：1 ) 为溶剂系统，使用高速逆流色谱分离提纯雷公藤内酯 醇，得到了含量为1 1 8 的雷公藤内酯醇粗品；另外还以雷公藤根皮为原料，经 过提取、正丁醇一水( 1 ：1 ) 溶剂系统萃取，离心薄层色谱分离、结晶等过程得到了 纯度较高的雷公藤内酯二醇晶体，并考察了萃取系统，原料浓度对萃取效果的影 响。 论文还测量了柱层析工段洗脱液的电容，研究了洗脱液电容与雷公藤内酯 醇、雷公藤内酯二醇含量之间的关系，并根据电容曲线的特性提出了一种雷公藤 多苷片生产中质量在线检测的方法，并在实际生产中得到应用。 关键词：雷公藤内酯醇；雷公藤内酯二醇；分离；电容特性 浙江大学硕上学位论文 a b s t r a c t t h et r i p t e r y g i u mb l f o r d i ih o o k fi so n eo ft h ei m p o r t a n tc h i n e s eh e r b a l m e d i c i n e s i t se f f e c t i v ec o m p o n e n t sl i k et r i p t o l i d ea n dt r i p d i o l i d ea r ew i d e l yu s e di n r h e u m a t i s ma n dd e r m a t o s i s t h ei n d u s t r i a lp r o c e s st op r o d u c et r i p t e r y g i u mw i l f o r d i i p o l y g l y c o s i d e ( t w p ) i n c l u d e st h ef o l l o w i n gu n i t s ：l e a c h i n g ，e v a p o r a t i o n ，e x t r a c t i o n a n dc o l u m nc h r o m a t o g r a m t r i p t o l i d ew a sp u r i f i e db yas e r i e so ff o r m e rd i s p o s a la n ds e p a r a t e db yh s c c c f r o mt h ep r o d u c t i o no ft h ef i r s tp e r i o do fc o l u m nc h r o m a t o g r a ma n dt h ep u r i t yw a s 1 1 8 t r i p d i o l i d e w a ss e p a r a t e db yc r u d ee x t r a c t ，s o l v e n te x t r a c t i o n u s i n g b u t a n o l - w a t e r ( 1 ：1 ) a ss o l v e n t ，c h r o m a t o g r a ma n dc r y s t a l l i z a t i o nf r o mt h er o o to f t r i p t e r y g i u mv h l f o r d i ih o o k fa n dt h ec r y s t a l o ft r i p d i o l i d ew e r eg a i n e d t h e i n f l u e n c eo fs o l v e n ts y s t e ma n dc o n c e n t r a t i o no ff e e do ne x t r a c t i o nw a sa l s o r e s e a r c h e d t h ec a p a c i t a n c eo ft h ee l u t i o ns o l u t i o nf r o mt h ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h i cu n i ti n t h ep r o d u c t i o no ft h et r i p t e r y g i u mw i l f o r d i ip o l y g l y c o s i d ef r w p ) w e r em e a s u r e d ，t h e r e l a t i o nb e t w e e nt h ec a p a c i t a n c ea n dc o n c e n t r a t i o no ft r i p t o l i d ea n dt r i p d i o l i d ew a s r e s e a r c h e d a no n l i n ed e t e c t i o nm e t h o dw a sp r o p o s e dt ot h eq u a l i t yc o n t r o lo ft w p b a s e do nt h ec a p a c i t i v eb e h a v i o ra n dh a db e e na l r e a d ya p p l i e di nt h ep r a c t i c a l p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：t r i p t o l i d e ；t r i p d i o l i d e ；s e p a r a t i o n ；c a p a c i t i v eb e h a v i o r i i 浙江人学硕士学位论文 1 1 雷公藤介绍 第一章文献综述 雷公藤( t r i p t e r y g i u mw i l f o r d i ih o o k f ) ，为卫矛科植物雷公藤的全株，又名 黄藤、黄藤木、断肠草等，主产于浙江、江苏、安徽、福建等地，苦，寒，有大 毒，归心，肝经。功效为怯风除湿，活血通络化瘀，消肿止痛，杀虫解毒。其药 用最早收载于神农本草经，已有近2 0 0 0 年的应用历史。 雷公藤化学成分复杂，上世纪三十年代开始已经有学者开始研究其化学组 成，至今已经从雷公藤属植物中分离出了7 0 余种化学成分，主要包括生物碱类、 二萜、三萜、倍半萜、甙类、糖类、醇类及微量元素。其中有1 7 种化学成分有 化学活性，主要药理作用有免疫调节作用，抗肿瘤作用，抗炎作用，抗菌等作用 吐近年来，雷公藤在抗风湿、免疫及肾炎、皮肤病、器官移植等方面的应用愈 来愈多，临床常用的雷公藤制剂有汤剂、雷公藤片和雷公藤多苷片f n i ) 、雷公藤 浸膏片等多种剂型。 1 1 1 雷公藤生物碱介绍 生物碱一般是与有机酸如草酸、苹果酸、柠檬酸、醋酸等或无机酸如硫酸、 磷酸等结合成盐存在于中草药中，也有少数以游离碱、苷或酯的形式存在。含有 生物碱的中草药有时可以含有许多种结构近似的生物碱，一种生物碱也可以存在 于不同的中草药中。 大多数生物碱为无色固体，味苦。只有少数生物碱如烟碱、毒芹碱在常温下 为液体。生物碱大多具有旋光性，自然界存在的多是左旋体，一般具有疗效的也 是左旋体。 游离态的生物碱一般不溶或难溶于水，易溶于乙醇、丙醇、乙醚、氯仿等有 机溶剂。生物碱与酸结合成盐能溶于水，再遇碱又变为不溶于水的游离态生物碱。 生物碱的盐与生物碱相反，大部分易溶于水和乙醇，而难溶于其他有机溶剂。利 用此性质可以进行生物碱的提取、分离和精制。 浙江大学硕士学位论文 生物碱与某些试剂作用产生沉淀，例如，生物碱的酸性水溶液与碘一碘化钾 试剂作用产生棕色或暗棕色沉淀：与碘化铋钾( i , a 3 i 1 4 1 试剂作用产生黄色或红棕色 沉淀；与碘化汞钾( k h g l 3 ) 试剂反应则生成淡黄色或白色沉淀等等。 生物碱还能与一些试剂发生颜色反应，其颜色随生物碱的不同而异。常用的 显色剂有：含少量甲醛的浓硫酸、1 钒酸铵的浓硫酸溶液、1 钼酸钠的浓硫酸 溶液等，利用颜色反应可以鉴别生物碱。 1 1 1 1 雷公藤生物碱的化学成分 国内外就雷公藤生物碱的化学成分进行了许多研究，现在已经分离出的雷公 藤生物碱已经有2 2 种，根据其结构不同可以分为以下三类【2 】： ( 1 ) 倍半萜大环内酯类生物碱 此类生物碱的基本骨架符合倍半萜或其衍生物，具体为： w i l f o r d i n e ( 雷公藤定碱，雷公藤碱) ，w i l f o r i n e ( 雷公藤灵碱，雷公藤次碱) ， w i l f o r i d i n e ( 雷公藤碱戊) ，w i l f o r g i n e ( 雷公藤晋碱，雷公藤碱乙，雷公藤吉碱) ， w i l f o r t r i n e ( 雷公藤春碱，雷公藤特碱，雷公藤碱丁) ，w i l f o r d i n i n e ( 雷公藤定宁) ， w i l f o r z i n e ( 雷公藤增碱，雷公藤辛碱，雷公藤庚碱) ，w i l f o r d s u i n e ( 雷公藤植碱) ， w i l f o r d c o n i n e ( 雷公藤康碱) ，w i l f o r d s i n e ( 雷公藤明碱) ，w i l f o r d m i n e ( e u o n i n e 雷公 藤新碱，雷公藤碱已) ，i s o w i l f o r t r i n e ( 异雷公藤春碱) ，i s o w i l f o r d i n e ( 异雷公藤碱) ， e u o n y m i n e ，p e r i t a s s i n e s a 。其母核结构如图1 1 。 图1 1 倍半萜大环内酯类生物碱母核 。戈 i 厂 掣酉 ：芝一 浙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 精眯类生物碱 精眯类生物碱结构上有三个氨基，属于多胺脂肪族化合物，具体为： c c l a c i 加i n e ( 苯乙烯南蛇碱) ，c e l a f i l r i n e ( 呋喃南蛇碱) ，c e l a b a z i n e ( 苯代南蛇碱) ， c e l a l l o c i n n i n e ( 南蛇藤别内桂酰胺碱1 。其母核如图1 2 。 ( 3 ) 卫矛碱、翅卫矛辛宁 图1 2 精眯类生物碱 1 1 1 2 雷公藤生物碱的医用价值 r 雷公藤生物碱在医学上有广泛的应用，其主要用于抗炎、免疫抑止作用。张 绍伦【3 】发现雷公藤生物碱可减轻关节炎疾病的损伤程度、推迟发病时间。夏志林 等【4 】发现雷公藤生物碱可以降低关节炎模型研究动物的血清i g 浓度，抑制c o n a 诱导的大鼠单个核细胞外增殖反应，抑制血单个核细胞i l - 2 的活性。虞春燕掣5 】 通过雷公藤春碱( b c ) 、雷公藤蛇碱( b d ) 、雷公藤碱乙( b a ) 、雷公藤碱戊( b e ) 、雷 公藤晋碱( b b ) 对正常人p b m c ( 夕h 周围血单个核细胞) 增殖反应的影响的量效关系 研究，发现5 种生物碱中除雷公藤蛇碱不呈现抑制作用外，其余4 种生物碱具有 抑制p h a 诱导p b m c 增殖反应的作用。 雷公藤总生物碱还具有抗生育功能，是有希望的男性避孕药。孙小蓉等1 6 j 发现，给雄性大鼠一次性服以1 5 0 、1 0 0 、5 0 m g k g 的雷公藤总生物碱后，可引起 不同程度的睾丸生精细胞的损伤，其靶细胞主要为精子细胞和精母细胞，精原细 胞未见明显的损伤，睾丸问质细胞、副睾未见形态学改变，肝、肾形态及功能均 无明显变化，因此其对生精细胞的损伤是可恢复的。 另外，雷公藤生物碱还具有一定的抗肿瘤功效。林绥等1 7 1 用m t i 法检测雷 公藤康碱在体外对k 5 6 2 细胞( 红白血病细胞) 及h l 6 0 细胞( 急性骨髓白血病细胞) 一0 浙江大学硕士学位论文 的杀伤作用，发现在3 0 q u g m l 浓度时，对k 5 6 2 细胞的抑制率为8 7 ，对h l 6 0 细胞的抑制率为9 0 ，t 检验，与对照比较，p o 0 0 1 。由此可见，雷公藤生物 碱的单体成分具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。 雷公藤生物碱还具有抗艾滋病作用，杀虫活性。l u c k 掣8 】发现，含生物碱成 分的t r i p t o n i n ea 和h y p o g l a u n i n eb 具有抗艾滋病活性，其e c 5 0 分别为 2 5 4 a g m l 和0 1 弘g m l ，治疗指数分别为3 9 4 和大于1 0 0 0 ，显示其具有很强的 抗艾滋病活性。罗都强等【9 】发现雷公藤总生物碱对5 龄菜青虫具有很强的麻醉、 拒食和毒杀作用。 1 1 2 雷公藤内酯醇介绍 雷公藤内酯醇( t r i p t o l i d e ) ，又称雷公藤内酯、雷公藤甲素口1 0 ) ，是从卫矛科 雷公藤属雷公藤、昆明山海棠，以及苍山雷公藤、东北雷公藤等物质中分离出来 的一种含有3 个环氧基的二萜内酯化合物，分子式为c 2 0 h 2 4 0 6 ，其分子结构如图 1 3 。 图1 3 雷公藤内酯醇分子结构 雷公藤内酯醇为白色晶体，m p2 2 6 2 3 0 c ，不溶于水，溶于二甲亚矾、丙 酮、乙醇等有机溶剂，并可稳定地存在于这些溶剂中。 作为免疫抑制药物，雷公藤内酯醇可应用于许多自身免疫性疾病的治疗。由 于它的生理活性强，具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗生育及免疫调节作用，在临床 上得到了广泛的应用。 1 1 2 1 雷公藤内酯醇的药理作用 1 抗肿瘤作用 4 浙江大学硕士学位论文 高小平掣1 0 】应用来源于人体组织的1 5 个恶性肿瘤细胞系，测定了不同浓度 雷公藤内酯醇的体外抗癌活性，并与已经应用于临床且效果较好的抗癌药物紫杉 醇进行了比较。结果发现，雷公藤内酯醇对五种组织类型的恶性肿瘤细胞生长均 有显著的抑制作用，尤其对卵巢癌细胞的作用尤为明显，平均g i ；。( 5 0 细胞生 长抑制所需的浓度1 显示低于紫杉醇；旦对肾癌细胞的体外生长也青明显的抑制 作用，同时发现雷公藤内酯醇诱导细胞凋亡期间的b c l 一2 裂解，并触发c a s p a s e 3 的激活和b c l 2 的酶解。而c a s p a s e 3 参与了细胞凋亡过程中的形态学变化与生 化变化等，被认为是引发细胞凋亡的重要执行者，而且其活性广泛存在于发生凋 亡的各类细胞中，而癌基因产物b c l 2 的异常表达参与了细胞的凋亡调控，其功 能是阻遏凋亡的发生，实验结果表明，雷公藤内酯醇对肿瘤细胞的生长抑制作用 是通过诱导细胞凋亡而实现的。魏一生等【1 1 l 将雷公藤甲素分别与乳腺癌细胞株 m c f - 7 、b t - 2 0 、胃癌细胞株m k n 4 5 、m k n 一7 以及人前骨髓白血病细胞株h l - 6 0 共同培养，发现雷公藤甲素能抑制以上各株细胞增殖，提示其可能对胃癌、乳腺 癌等具有治疗作用。郭红威等【1 2 】报道，甲素对人胃癌细胞株f g c 8 5 用药早期出 现核仁脱颗粒及核仁碎裂等改变；晚期，电镜下可见细胞凋亡改变，提示细胞凋 亡可能在甲素的抗肿瘤效应中有一定意义。 2 降低肾小球肾炎患者尿蛋白水平作用 雷公藤内酯醇体外实验证实，其对t 细胞及b 细胞均有影响，且可明显抑 制有丝分裂原刺激的淋巴细胞增生反应，诱导活化的淋巴细胞发生凋亡，同时还 通过抑制淋巴细胞n f k b 的活力而减少多种促炎因子( 如i l 厂1 ，t n f a 等) 及细 胞因子的产生【1 3 】。戴春笋等【1 4 】通过实验研究表明，雷公藤内酯醇可以明显改善 肾小球基底膜( g b m ) 肾炎大鼠的肾脏病变，表现为尿蛋白排泄量降低，肾小球脏 层上皮细胞病变明显改善，肾小球新月体明显减少。 3 抗移植排斥反应 近年来在组织器官移植中面临的主要障碍是移植排斥反应，环孢霉素、强的 松等免疫抑制剂是临床抑制排斥反应的主要措施。但由于自身免疫疾病病程长， 长期服用激素类免疫抑制剂副作用大，常合并肝肾损坏及感染，其治疗不能从根 本上纠正免疫异常，不能有效地控制疾病的发生、发展。邹小明等1 1 5 】采用小鼠 同种异位心肌移植模型研究雷公藤内酯醇抗同种移植排斥反应的效果。实验显 浙江大学硕士学位论文 示，雷公藤内酯醇可以明显延长移植心肌的存活期。应用雷公藤内酯醇o 1 o 5 m g k g d 均可明显延长移植心脏存活时间，与环孢霉素等药物的作用效果相近 ( p ) 0 0 5 ) 。且其抗排斥反应效果与给药剂量和给药时间有关，手术前给予雷公藤 内酯醇并不会产生抗排斥反应的作用，由此推断其抗排斥反应的作用是发生于排 斥反应期间，作用方式可能为直接抑制排斥反应或者减轻排斥反应的严重程度。 丁文龙等【1 6 l 将日本大耳兔的神经移植于w i s t a r 大鼠坐骨神经后，给大鼠术前1 d 和术后2 周口服溶解于自来水中的雷公藤甲素，观察雷公藤甲素对异种神经移植 后神经再生的影响，实验发现大鼠存活4 、8 、1 2 、1 6 、2 4 周，可见再生神经纤 维长入移植神经并向远段坐骨神经延伸，即重新支配。 4 防治动脉粥样硬化作用 有学者研究发现，在动脉粥样硬化病变初期，血管壁细胞数增多，内膜增厚， 管腔变窄，除了与平滑肌细胞f s m c s ) 过度增殖有关，同时与由于凋亡率下降所 导致的细胞累积，数量增多也有密切关系，因此调节s m c s 的凋亡率非常有可能 会成为抗动脉粥样硬化的一种途径。李玫等【1 7 】采用体外主动脉s m c s 培养和流 式细胞仪技术，观察雷公藤甲素对s m c s 细胞周期进程的影响和诱导细胞凋亡作 用。实验资料显示，雷公藤甲素作用于s m c s 后，光镜下的s m c s 出现凋亡的形 态学改变：细胞发生皱缩，核染色质固缩，聚集至核膜下，凋亡小体形成。用 p 班c m 检测发现，药物作用后指数增殖期s m c s 细胞周期中凋亡峰增高，同时 用抗c d 9 5 抗体标记s m c s ，发现在凋亡峰升高前，c d 9 5 表达有明显的一过性 增高，证明雷公藤甲素可以诱导指数增殖期s m c s 凋亡。且凋亡可以避免细胞内 容物散出所引起的周围组织炎症反应，所以雷公藤甲素诱导s m c s 凋亡对于抗动 脉粥样硬化颇具意义。 5 抗支气管哮喘作用 郭晓明等【1 8 l 采用原位杂交方法检测3 组豚鼠( 共3 0 只) 肺组织i l - 5 、g m c s f m r n a 的表达，以探讨i l - 5 、g m c s fm r n a 在哮喘豚鼠肺组织中的表达及雷 公藤甲素的影响。实验结果表明雷公藤甲素能抑制哮喘豚鼠肺组织i l - 5 、 g m c s fm r n a 表达，可能是雷公藤甲素减轻哮喘气道炎症，降低气道高反应 性，缓解临床症状的重要机制。 6 抗生育作用 6 浙江大学硕士学位论文 8 0 年代，我国学者发现雷公藤多苷( g t w ) g 致男子精子计数下降，动物试 验也显示，g t w 可使雄大鼠产生可逆性不育。张建伟等【1 9 以雷公藤多苷片为原 料，通过制各高效液相色谱分离出雷公藤甲素、雷公藤乙素及雷公藤氯丙酯醇三 种成分，通过实验表明，上述三种成分都具有抗生育活性。 1 1 2 2 雷公藤内酯醇的提取分离 雷公藤甲素在雷公藤中的含量很低，据文献报道，植物分离得率为 o 0 0 1 ( w w ) ，也有报道含量为o 0 0 4 ，其中雷公藤叶子中雷公藤甲素的含量是 根的3 倍。李汉堡等1 2 0 】以叶为原料制成雷公藤总酯片，比较了水提醇沉法、醇 提石油醚脱酯法、水提有机溶剂萃取法3 种工艺的提取率，实验结果表明以水体 有机溶剂萃取法雷公藤甲素的得率最高，得率为o 0 0 8 2 。王诗宏等【2 1 】使用超临 界c 0 2 萃取技术提取雷公藤有效成分，结果表明在萃取温度为5 0 。c ，压力3 0 m p a ， 时间1 2 0 r a i n ，以乙醇作改性剂下，萃取物中有效成分雷公藤甲素的含量为0 0 4 ， 甲素的得率为0 0 0 1 6 8 。程敬丽等1 2 2 j 用不同含量的甲醇、9 5 乙醇、水进行回 流提取、浓缩制得浸膏，并用不同比例的四氯化碳石油醚对浸膏预处理，再用 氯仿萃取的方法得氯仿部位。结果表明：用7 0 甲醇回流提取雷公藤叶子，雷公 藤甲素提取率最高，可达o 0 1 4 。采用四氯化碳洗涤浸膏，再用氯仿萃取的方 法，得到的氯仿部位中雷公藤甲素的含量最高，可达1 8 3 。王曙东等1 2 3 】应用大 孔树脂d 1 0 1 型和氧化铝柱分离、纯化雷公藤甲素，结果表明，雷公藤甲素含量 经处理后，含量可达2 3 3 。 1 1 2 3 雷公藤内酯醇的合成与结构修饰进展 由于雷公藤内酯醇在雷公藤中含量很低，同时由于其毒性高，制约了其在临 床上的应用，因此国内外许多学者对雷公藤内酯醇进行了合成与结构修饰的研 究。郭瞬明等1 2 4 j 以雷酚内酯为原料，经甲基化、氧化、去甲基化、还原、环氧 化等七步反应合成了雷公藤甲素。于德泉等对雷公藤内酯醇进行了结构修饰，得 到了九个雷公藤内酯醇衍生物，并测定其活性，结果表明雷公藤氯内酯和雷公藤 溴内酯醇的免疫抑止活性与雷公藤内酯醇相近，但毒性有所降低。d a i 等瞄】通过 1 4 位羟基与丁二酸酰等反应缩和获得了一系列高水溶性的雷公藤内酯醇衍生 7 浙江大学硕r 上学位论文 物，经测定，这些雷公藤内酯醇的水溶性酯类衍生物在生物体内也具有良好的免 疫抑止活性。王大元等【2 6 】报道了用硫氰离子打开1 2 、1 3 位环氧获得衍生物，实 验表明虽然这个衍生物不易转化为雷公藤内酯醇，但是该化合物却具有很好的抗 肿瘤活性，表明虽然1 2 、1 3 位环氧基团对于抗炎、免疫抑制活性可能是必需的， 但对于抗肿瘤活性也许并不那么重要，而且该化合物的毒性与雷公藤内酯醇相比 大大降低。 1 1 2 4 雷公藤内酯醇的检测方法 雷公藤成分复杂，其中雷公藤内酯醇的含量又较低，且雷公藤内酯醇又为雷 公藤的活性成分和毒性成分，因此准确测量其含量尤为重要。 1 高效液相色谱法( h p l c ) h p l c 由于分离效果高，定量准确而在中药分析研究方面的应用日益广泛。 常雪灵等【2 7 1 采用液固萃取一反相高效液相色谱法测定雷公藤浸膏( 乙酸乙酯提取 物) 中甲素含量，实验中采用l i c h r o s p h e r c t 8 色谱柱，以甲醇：水= 6 0 ：4 0 ( v v ) 溶液为流动相，检测波长为2 1 8 n m 。使用该法可测得回收率为9 9 4 ，变异系 数为0 5 3 ，发现该方法快速，重现性及准确度能满足浸膏中甲素含量要求。同 时在实验中发现采用液固萃取，上中性氧化铝柱对样品进行预处理可获得较好的 回收率及分析效果。 2 高效薄层扫描法( h p t l c ) 由于中药的特点所致，中药分析中t l c s 法应用较多，且多采用双波长反射 法锯齿扫描，用外标法或内标法来定量。宁晓闽等【勰1 采用高效硅胶g 板为吸附 剂，氯仿乙醚f 2 ：1 ) 为展开剂，上行展开约9 c m ，取出晾干后进行测定，采用岛 津c s 9 0 0 0 型薄层扫描仪定位。测得雷公藤内酯醇r f 值为0 7 4 ，所采用的扫描 条件为九2 2 5 n m ，反射锯齿扫描，摆幅1 2 n m ，a yo 0 2 ，资料累积数为1 ，寻峰 参数为2 。在实验过程中发现雷公藤内酯醇在2 2 5 n m 处有最大吸收，且本法灵敏、 简便、快速、稳定性好，所得结果比较满意。 3 毛细管电泳法r c e ) 由于c e 分离效率高，分离模式多，低耗快捷简便等诸多优点，使其在中药 领域得到了广泛的应用。宋秀荣等1 2 9 1 用胶束毛细管电泳法分离和测定雷公藤中 浙江大学硕士学位论文 雷公藤内酯醇的含量，在优化分离条件下其线性范围为0 0 5 3 4 9 4 3 3 9 l ，最低 检测限为0 0 5 3 4 9 9 l ，得到比较满意的分离效果。 4 气相色谱一电子捕获法 杨丽莉等【3 0 l 将含有雷公藤甲素的血浆样品经碱化后用乙醚氯仿( 体积比为 3 ：1 1 混合物提取，浓缩的提取物与三氟醋酐进行衍生化反应，使其成为三氟乙 酸酯衍生物。用气相色谱法分离，6 3 n i 电子捕获检测器测定雷公藤甲素的含量。 甲素的质量浓度在1 0 u g l 5 0 毗g ，l 范围内与峰面积线性关系良好( r = o 9 9 9 0 ) ， 在血浆中的平均回收率为9 6 3 ，最小检测限为o 5 g l ，该方法重现性好，且 准确灵敏、无杂质干扰，所得数据准确可靠，是用于雷公藤甲素含量测定的一种 较好方法。 1 1 3 雷公藤内酯二醇介绍 雷公藤内酯二醇( t r i p d i o l i d e ) ，又称雷公藤乙素f r 8 ) ，分子式为c 2 0 h 2 4 0 7 ，是 雷公藤中一种二萜类化合物。其分子结构如图1 4 所示。 图1 4 雷公藤内酯二醇分子结构 雷公藤内酯二醇是雷公藤主要活性成分之一，为中药雷公藤多苷片中的主要 有效化合物。 现有文献报道的雷公藤内酯二醇的分离方法一般为采用雷公藤提取物经过 反复柱层析，过程繁琐，耗时长且得率较低。也有文献报道采用高效制备液相分 离雷公藤内酯二醇，但是采用此方法每次进样量少，成本高。另有文献报道采用 多维逆流色谱制备雷公藤内酯二醇，但此方法不适用于大规模制备雷公藤内酯二 醇。 9 浙江大学硕士学位论文 1 2 现代中草药有效成分的分离技术 中药制药业中最关键的工序是对有效成分的提取与分离，传统的提取分离方 法包括煎煮法、浸渍法、渗滤法、回流法等。这些方法普遍存在着有效成分提取 不高，杂质清除率低，能耗高，生产周期长等许多缺点，直接制约了中药制药产 业的发展。伴随着现代化工业工程技术的迅猛发展，一些现代高新技术不断被应 用到中药生产中来，大大促进了中药产业的发展，使中药制药业技术水平上升了 一个新的高度。 1 2 1 高速逆流色谱介绍 逆流色谱( c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，c c c ) 产生于上世纪7 0 年代，是一 种简单的液一液分配色谱技术，它不用固体支撑体来保留固定相，因而避免了样 品的不可逆吸附、失活和变性等问题，近年来逐步发展成为一种备受关注的新型 色谱分离技术。 逆流色谱可以广义地定义为：1 任何利用两相不混溶液体的色谱技术；2 其 中的一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管或一系列的腔体中；3 同 时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。 上世纪8 0 年代初期，高速逆流色谱( h i g hs p e e d c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y ，h s c c c ) 的出现，开始了逆流色谱的现代化进程，其应用范围 己从制备型扩展到微量分析。由于其显著特点，此项技术已广泛应用于医药、生 化、生物工程、天然产物分离、有机合成等领域。我国是继美国、日本之后较早 开展逆流色谱研究的国家，研究水平出于国际一流，尤其在天然产物分离方面， 做出了特色性的成果，在很多方面独树一帜。 1 2 1 1 逆流色谱的发展 1 逆流分溶法 2 0 世纪5 0 年代，逆流分溶法( c o u n t e r c u r r e n td i s t r i b u t i o n ，c c d ) 被广泛用于 天然产物的分离。由c r a i g 发明的非连续逆流分溶装置，可以说是现代几乎所有 逆流色谱仪器的雏形。该装置由系列分液漏斗连接而成，两相不混溶液体在分 1 0 浙江大学硕上学位论文 液漏斗间有序地重复混合、倾析，最终使溶质以逆流分配的方式分离在不同的漏 斗中。但是其存在一些固有的缺陷，如设备庞大复杂、易碎，溶剂体系易乳化， 溶剂消耗量大和分离时间长，因此很快被液相色谱所代替。 2 液滴逆流色谱 2 0 世纪7 0 年代，出现了一种液滴逆流色谱( d r o p l e tc o u n t e c i l r l e n t c h r o m a t o g r a p h y ，d c c c ) 。该装置利用重力场将固定相保留在系列管形柱中，同 时使流动相以液滴的形式通过固定相。d c c c 在1 9 7 2 年由t o k y or i k a k i k a i 实现 了商品化，并在2 0 世纪七八十年代被广泛用于天然产物的分离，并取得了良好 的分离效果。但d c c c 仍存在分离时间长，可使用溶剂体系少，且设备难以清 洗等缺点。因此，在上世纪7 0 年代后期，逐渐让位于i t o 等科学家研制的快速 离心逆流色谱技术。 3 离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱 这两种改进的逆流色谱，利用了离心场来实现固定相的保留，大大提高了两 相溶剂的混合效率，允许使用较高的流动相速度，因而缩短了分离时间。根据固 定相保留方式和柱体设计方式不同，离心分配色谱可以分为两种：流体静力学平 衡体系r h y d r o s t a t i ce q u i l i b r i u ms y s t e m ，h s e s ) 和流体动力学平衡体系 ( h y d r o d y n a m i ce q u i l i b r i u ms y s t e m ，h d e s ) 。 建立于h s e s 体系基础上的逆流色谱仪器，被称为离心分配色谱仪 ( c e n t r i f u g a lp a r t i t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，c p c ) 。c p c 是由d c c c 发展而来的一种逆 流色谱仪器，它利用离心力产生的恒定力场将固定相保留在由管道连接的一系列 的腔体中。c p c 最大特点是噪声低，绝大部分两相溶剂体系都可以使用，其缺 点是由于死体积的存在，两相溶剂不能够总是充分混合，因此和相同体积的流体 动力学逆流色谱仪器相比分离效率较差，且设备存在渗漏等问题。 建立在h d e s 体系基础上逆流色谱仪器主要为n o 教授于2 0 世纪7 0 年代发 明的多层螺旋管式离心分离仪佃u l t i l a y e rc o i lp l a n e tc e n t r i f u g e ，m l c p c ) 。m l c p c 利用螺旋管的行星式运动所产生的变化的离心力场将固定相保留在螺旋管中，并 允许流动相快速流过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，使得其 c c c 的分离效率较前面提到的c p c 有明显提高。 4 高速逆流色谱和正交轴逆流色谱 浙江大学硕上学位论文 2 0 世纪七八十年代，n o 教授通过研究行星式运动模式和螺旋管柱在支持体 上的几何位置之间的结合状态，发明了高速逆流色谱咖g i ls p e e dc c c ，h s c c c ) 。 它利用螺旋管的一种特殊的同步行星式运动模式( j 型模式) ，可以在短时间内实 现高效的分离，并被广泛应用于天然产物和合成物质的分离纯化。 另一种新型的螺旋管行星分离仪系统伍一l 型) 能够使黏度较高的双水相聚合 物溶剂体系实现稳定保留，可以用来分离生物大分子和细胞颗粒。由于其螺旋管 支持件的自传轴与公转轴相互垂直，因此也被称为正交轴逆流色谱仪f c r o s s a x i s c p c i 。 5 p h 区带精制逆流色谱 上世纪9 0 年代初期，一种被称为p h 一区带精制逆流色谱的技术逐渐发展起 来。这种方法起源于一个偶然的发现，即当在酸性物质中的样品溶液中加入一定 的有机酸时，可以产生一个窄而尖的峰，收集到的组分仅有几毫升。当样品量增 大时，每个组分将在柱中形成一个高度浓缩的等值p h 一区带，并以一个矩形峰被 洗脱出来，且彼此之间重叠很少。现在p h 一区带精制逆流色谱已被成功应用于氨 基酸、多肽、染料、生物碱以及光学异构体等物质的分离。 另外在以上这些逆流色谱的基础上，还发展除了其他许多类型的逆流色谱， 如离心沉淀色谱，螺线形圆盘柱式高速逆流色谱等。这些逆流色谱技术在生物大 分子分离方面都有很多应用【3 1 】。 1 2 1 2 高速逆流色谱分离机理 高速逆流色谱是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离 方法。螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相 作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里保留值大约是管柱容积的 5 0 ，但这一保留量会随着移动相流速的加大而减小，使分离效率降低。螺旋管 的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋 管长度方向完全分开，其中一相全部占据首端的一段，称为首端相，另一相全部 占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱j ：f 是利用了两相的这种单向性分布 特性，在高的螺旋管转动速度下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移 向首端，同样，如果从首端送入尾端相，它会穿过首端相而移向螺旋管的尾端。 浙江大学硕上学位论文 分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相( 固定相) ，然后从适合的一端泵入移动 相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多， 分离效果越好，且极大地提高了分离速度，故称“高速逆流色谱”f 3 2 1 。 1 2 1 3 高速逆流色谱的应用 1 天然产物的分离 天然产物在当今的医药、化妆品、香料以及食品添加剂等工业领域扮演着越 来越重要的角色。但是从天然产物中分离出活性成分具有很多困难和问题，因为 其中的活性成分都是以很低的含量存在于极其复杂的物质当中。色谱法一直是天 然产物分离纯化中的主要手段，但是物质在固体填充物上的不可逆吸附和变性是 固相色谱所遇到的共同问题。逆流色谱则避免这个问题，由于不使用固体支撑体 介质，因而避免了样品的不可逆吸附和样品组分的化学变性等，使样品的完全回 收称为可能。另外逆流色谱还具有灵活性高，前处理简单，分离量大等优点，因 此近十年来已被广泛应用于天然产物的分离纯化。 生物碱是人类研究最早的动植物有效成分，在植物中分布广泛，至少有5 0 多科1 2 0 属植物中含有生物碱，且其拥有较高的生物活性，因此被广泛应用于l 临 床治疗当中。到目前为止，用高速逆流色谱研究天然产物分离以生物碱报道最多。 y 柚g 等【3 3 i 以氯仿甲醇一0 2 m o l l 盐酸( 4 ：1 5 ：2 0 ) 为两相溶剂，利用h s c c c 分 离得到黄连中的巴马亭、小檗碱、表小檗碱和黄连碱4 种生物碱。c h i o u 等【3 4 】 采用正己烷乙酸乙酯甲醇乙醇水( 5 ：7 ：5 ：1 ：6 5 ) 五元体系分离了紫杉醇和 类似物。字敏等【3 5 】以氯仿一甲醇n a h 2 p 0 4 缓冲液( 4 ：3 ：1 ) 为溶剂系统从弥勒獐牙 菜中分离得到龙宁胆碱。袁黎明掣3 6 】以氯仿甲醇一n a h 2 p 0 3 ( 4 ：3 ：2 ) 系统以茶叶 的总生物碱中分离得到咖啡碱和茶碱。王新宏等【3 7 】以氯仿一磷酸磷酸纳缓冲液 ( p h = 6 2 0 ) 溶剂体系从苦参( s o p h o r a 肚v e s c e n s ) 中分离得到了苦参生物碱。 黄酮类化合物多存在于高等植物和羊齿类植物中，常以游离或与糖成昔的形 式存在，在花、叶、果实等组织中多为苷类，而在木质部组织中多为游离苷元。 主要包括黄酮、异黄酮、二氢黄酮、儿茶精、花色素等及各种衍生物。m a 等【3 8 】 利用h s c c c ，以乙酸乙酯一甲醇乙酸一水( 4 ：1 ：o 2 5 ：5 ) 为溶剂系统，从黄芪粗 提物中出分离出两种异黄酮，纯度均大于9 5 。d u 等【3 9 】利用正己烷一乙酸乙酯一 浙江大学硕士学位论文 正丁醇甲醇乙酸一水( 1 ：2 ：1 ：1 ：5 ：1 ) 从大豆中分离出4 种异黄酮，纯度均大 于9 0 。 葸醌类化合物是广泛存在的重要天然色素，尤其在高等植物和真菌、地衣等 低等植物中更为普遍。袁黎明等【删以氯仿一甲醇水( 4 ：3 8 ：2 ) 系统同样从大黄中 分离出葸醌类成分。y a n g 等【4 1 l 利用乙醚一水的两相溶剂系统，通过调整流动相p h 值，采用梯度洗脱，从大黄中分离了大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等羟基葸醌类 化合物，纯度均大于9 8 。陈存社等( 4 2 l 采用氯仿甲醇一丙酮水( 9 ：8 ：1 ：8 ) 分离 芦荟中的葸醌类物质，得到纯度为9 5 7 的芦荟大黄素和9 8 9 的芦荟大黄素甙。 此外，h s c c c 对酚类和脂肪类物质也有良好的分离效果。i j 等【4 3 1 采用正己 烷一乙酸乙酯一乙醇水( 3 ：7 ：1 ：9 ) 为溶剂系统，利用h s c c c 从丹参粗提物5 0 0 m g 中得到纯度大于9 8 雕3 丹参酚酸b3 4 2 m g 。t i a n 等 4 4 1 从山茱萸的正丁醇提取物 中，以乙酸乙酯一正t 醇一水( 5 ：1 8 ：6 ) 与乙酸乙酯- 乙醇- 水( 5 ：0 5 ：6 ) 两步分离 得到没食子酸，纯度大于9 7 。 2 抗生素 由于可以直接向h s c c c 进粗品，因此可以采用h s c c c 来分析和制各分离 抗生素。o k a 等用氯仿氯化乙烯一正己烷一甲醇水( 1 ：1 ：1 ：3 5 ：1 ) 体系分离了 道诺红菌素衍生物；用苯氯仿甲醇水( 1 5 ：1 5 ：2 3 ：7 ) 分离了依罗霉素混合物； 用乙醚一正己烷甲醇水( 5 ：1 ：4 ：5 ) 分离了放线菌素合物；用氯仿一甲醇一水( 4 ：4 ： 3 1 体系分离了杀念菌素衍生物；用四氯化碳甲醇0 0 1 m o l l 磷酸钾缓冲液( p h = 7 x 2 ：3 ：2 ) 分离了尼达霉索混合物；用正己烷一乙酸乙酯一甲醇一水( 1 9 ：1 ：1 0 ：l o ) 分离了伊维菌素：用氯仿乙酸乙酯甲醇水( 3 ：1 ：3 ：2 ) 分离了普那霉素。 3 蛋白质和肽 利用新型的p h 区带逆流色谱和离子对逆流色谱，h s c c c 也能用于蛋白或 多肽混合物的分离制备。m a 等采用氯仿苯甲醇水( 1 5 ：1 5 ：2 3 ：7 ) 分离短杆菌 肽；用氯仿乙醇水( 5 ：4 ：3 ) 或氯仿一乙醇甲醇一水( 5 ：3 ：3 ：4 ) 分离杆菌肽；用 正丁醇0 0 3m o l l 三氟乙酸n ：1 ) 分离黏菌素；采用正丁醇一二氯乙酸0 1 m o i l 甲酸铵( 1 ：o 0 1 ：o 0 1 ) 、叔丁基甲基醚- 乙腈一三氟乙酸( o 5 5 ) ( 2 ：2 ：3 ) 、叔丁 基甲基醚乙腈三氟乙酸( 1 ) ( 2 ：2 ：3 ) 或叔丁基甲基醚一正丁醇- 乙腈一三氟乙酸 ( 1 ) ( 2 ：2 ：1 ：5 ) 等体系均可分离二肽混合物：用正丁醇一0 2 m o l l 甲酸铵o h = 1 4 浙江大学硕士学位论文 8 5 ) ( 1 ：1 ，5 0 ) 或正丁醇0 2 m o l l 甲酸铵( p h = 9 ) ( 1 ：1 ) 体系分离缩胆囊素。 4 食品 h s c c c 可用于食品除毒去杂或制备生物活性成分。例如r a s o o l y 等用 h s c c c 检测食品中的毒素含量，分离s e a ( 导致食品污染的常见毒素) ；n i t z 等 用正己烷乙腈一叔丁基甲基醚( 1 0 ：1 0 ：1 ) 从香芹菜中分离f a l c a r i n d 和f a l c a r i n d i e l 。 除此以外，h s c c c 还可用于稀有金属或重金属，手性化合物及紫胶染料等 物质的分离【4 5 】。 1 2 2 离心薄层色谱介绍 离心薄层层析是在传统薄层层析的分离基础上进一步发展起来的一种吸附 色谱分离技术。该方法的分离原理与柱层析和薄层层析的分离原理相同，都是依 据各组分吸附和分配作用的不同使混合物得到分离。其不同之处在于，离心薄层 层析技术在传统的制备型薄层色谱基础上运用离心力，促使流动相加速流经固定 相，其分离过程如图1 5 。 在加入样品后，随着洗脱液的洗脱，可得到各组分的同心圆状色带。薄层板 放置于覆盖石英玻璃的色谱室内，可以使用紫外灯对无色但有紫外吸收的色带进 行观察。在薄层板边缘，色带快速旋转脱离薄层板，然后经流出管收集。在离心 加速作用下，样品中各组分之间的r f 值差变大，从而提高分离效果，加速分离 过程。 离心薄层层析所使用的薄层板一般由硅胶铺板制成，厚度一般有1 、2 、4 m m 几种。硅胶使用范围广，能用于非极性化合物也能用于极性化合物，如芳香油、 萜类、生物碱、苷类、葸醌类，酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸及 一系列合成产物的分离。 浙江大学硕士学位论文 i 一 图1 5 离心薄层色谱分离过程不意图 正相色谱硅胶为多孔性物质，通式为s i 0 2 x h 2 0 表示。它具有多孔性的硅 氧环( s i l o x a i l e ) 及一s i o s i 一的交链结构，其骨架表面的硅醇( s i l a n 0 1 ) 基团能通 过氢键与极性或不饱和分子相互作用。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅醇基的数 目及含水量。随着水分的增加，吸附能力降低，因此硅胶板在使用前需要经过活 化除去水分。 离心薄层硅胶板可以使用的流动相很多，为得到较好的分离效果，一般选择 一定比例的混合溶剂作为流动相。在使用前可使用t l c 检测流动相的分离效果， 在实际应用中也可以采用从低级性逐步递增极性的梯度洗脱方式。常用溶剂的介 电常数f c l 如表1 1 。 除了使用硅胶铺板外，在遇到分离特殊物质时还可以使用其他薄层板，例如： 氧化铝薄层板：氧化铝是一种常用的吸附剂，是由氢氧化铝