HPLC及HPLCMS分析方法的开发及其在药物分析中的应用课件.ppt

HPLC及HPLC/MS分析方法的开发及其在药物分析中的应用,2,基于分离分析科学技术小颗粒填料的色谱柱以光谱、质谱技术作为检测手段专属性、分离效率及灵敏度适用于广泛的色谱应用适用于开发新方法适用于现有方法的改进,HPLC及HPLC/MS法,3,质量源于设计（QualitybyDesign，QbD）准则实验设计方法学（DesignofExperiment，DoE）方法验证（MethodValidation）：确保方法在样品分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。,分析方法学的开发及验证,4,方法开发,实验室获得方法及运用过程,方法验证,方法确认,方法转移,准确度，精密度，专属性，检测限，定量限，线性，范围，耐用性,分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等）及优化（梯度、柱温、流速等）,法定检验方法在使用环境中适用性评估（人员、仪器、样品、试剂）,非法定检验方法在实验室之间传递的文件化过程,5,实验室获得方法及运用过程,方法验证,方法确认,-用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法,用一个确定方法来挑战现实的分析环境专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ一般不需要进行线性，范围，耐用性实验,6,ICH、USP、ChPIIAppendixXIXA,方法验证的内容,准确度（Accuracy）精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度专属性（Specificity）检测限（LOD）定量限（LOQ）线性（Linearity）范围（Range）耐用性（Robustness）,7,方法验证-系统适用性,系统适用性试验的内容在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系统之性能达到规定的要求塔板数，拖尾因子，分离度确定重现性（%RSD）系统适用性“样品”主组份与预期副产物之混合物系统适用性试验是色谱方法的一部分,8,方法验证-系统适用性,容量因子k2精密度/进样重复性RSD1%,n5分离度Rs2(主峰与最近洗脱的色谱峰之间),拖尾因子T2理论塔板数通常N2000,9,方法验证-USP,类型1主组份或活性成份定量分析方法类型2杂质或降解化合物测定方法类型3性能特点之确定分析方法如溶出度实验类型4鉴别试验,10,方法验证-USP,*可能需要，具体与特定试验的性质有关。,11,如何进行方法验证,分析实验阶段按照规定的实验计划或步骤通常需要3到5天在不同操作条件下，进不同浓度的试样原料及制剂皆需分析数据分析阶段对分析结果进行统计学计算色谱结果是相对的用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真实变化,12,方法验证步骤,线性Day1-3,定量限,检测限,实验参数2Min2).与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,当流动相pH值小于3时,硅醇基趋于中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统C8硅胶柱,离子交换作用,当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离),碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,27,固定相,低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！,28,固定相,未浸润的孔,浸润的孔,注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低有机溶剂或纯水溶液流动相,C18硅胶,29,固定相,Minutes,流动相：0.1%醋酸水溶液,阿莫西林,Vo：被分析物没有保留,起始：填料完全浸润“Wetted”,停止流速后：填料完全脱离浸润状态“De-Wetted”,丧失浸润现象：100%水溶液中保留完全丧失,30,流动相,甲醇质子化溶剂氢键供给者洗脱能力较乙腈弱粘度较乙腈高低紫外波长下有吸收乙腈非质子化溶剂氢键接受者洗脱能力较甲醇强粘度较甲醇低低紫外波长下透光性好,31,流动相,Jenkins,Diehl,RP18LowpH(pH3),100%MeOH,100%ACN,1:1ACN:MeOH,1,2,4,3,5,6,2,8,7,9,6,10,12,11,8,9,10,11,10,11,12,12,8,9,1,6,7,2,3,4,4,3,1,5,7,5,1.Gentisicacid(A)2.Caffeine(WB)3.Ritodrine(B)4.Hydroguinidine(B)5.1-Pyrenesulfonicacid(A)6.Imipramine(B)7.Amitriptyline(B)8.Flavone(N)9.4-Dimethylamino-benzophenone(WB)10.Diclofenac(WA)11.Dioseb(A)12.Octanophenone(N),32,流动相pH值,影响带有可离子化官能团的分析物胺羧基酚有些化合物含有一个以上的可离子化官能团改变流动相pH将使选择性发生极大改变,33,流动相pH值,酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大中性化合物的保留不受pH影响,SilicapHRange,HybridParticlepHRange,Neueet.al.AmericanLaboratory1999(22)36-39.,34,固定相、溶剂和流动相pH的影响因素,I,A,P,Fl,Fe,D,O,Fluoro-PhenylpH3,MeOH,P,C18pH3,ACN,I,A,P,Fl,Fe,D,O,I,A,Fl,Fe,D,O,C18pH10,ACN,Phenyl-HexylpH10,MeOH,TestProbes:I:ImipramineBA:AmitriptylineBFl:FlavoneNO:OctanophenoneN,碱性及中性化合物,35,固定相、溶剂和流动相pH的影响因素,I,A,P,Fl,Fe,D,O,Fluoro-PhenylpH3,MeOH,P,C18pH3,ACN,I,A,P,Fl,Fe,D,O,I,A,Fl,Fe,D,O,C18pH10,ACN,Phenyl-HexylpH10,MeOH,TestProbes:P:1-pyrenesulfonicacidAFe:fenoprofenAD:diclofenacA,酸性化合物,36,固定相、溶剂和流动相pH的影响因素,分析物在其未电离中性状态时保留较强甲醇的洗脱能力较乙腈弱，因此所有化合物的保留都会得到增强，同时也具有不同于乙腈的选择性当流动相pH值能改变分析物的带电状态时，能得到选择性的极大改变在任一条件下，使用不同固定相时，能获得大的选择性改变最显著的选择性差异在于将固定相、溶剂和流动相pH因素综合时,37,梯度洗脱,优点单位时间的分离能力增加较大的峰容量检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式色谱柱需再生定量分析的重复性较低,38,梯度洗脱,高压梯度及低压梯度,溶剂A,溶剂B,泵A,泵B,混合器,A高压梯度,溶剂A,泵,溶剂B,比例阀（溶剂混合点）,混合器,B低压梯度,（溶剂混合点）,39,梯度洗脱滞后体积,注意滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路！,40,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min时梯度晚2分钟如流速为0.1ml/min，实际梯度晚20分钟滞后