（食品科学专业论文）富硒蛹虫草液体深层发酵研究.pdf

摘要 蛹虫革具有与冬虫夏草相似的功能性，而硒作为人体必需的微量元素，具有重要的 生理功能，因此，富硒蛹虫草集蛹虫草和硒的诸多生理功能于一体。 本论文从富硒蛹虫草的特征( 耐硒富硒特征、发酵条件、功效因子) 和工业化生产 前提( 富硒蛹虫草菌种选育、发酵废液处理) 两个方面对富硒蛹虫草的液体发酵进行了 研究。 论文首先通过正交实验，筛选得到一株发酵周期短、菌丝体产量及富硒量较高、对 原料要求简单的蛹虫草菌株j m ，作为本论文整个实验的出发菌株。该菌株7 2h 左右达 到最大生物量和最高富硒量；固体平板培养耐亚硒酸钠浓度为l o m l ，摇瓶培养耐亚 硒酸钠浓度为1 2 “m l 。 进而，通过单因素实验和正交实验，确定蛹虫草j m 富硒的最佳发酵条件为：大豆粉 3 5 9 ，l ，蔗糖4 0 9 l ，k 1 1 2 p 0 4 1 5 l ，硫胺素5 0 i g ，l ，n 8 2 s e 0 3 1 6 m l ，培养基p h 6 o ， 培养温度2 6 ，种龄2 4 h ，接种量3 m l 1 0 0 m l ，装液量每2 5 0 m l 三角瓶1 0 0 m l 。在此 工艺条件下，富硒蛹虫草生物量可达1 2 6 9g l ，富硒量可达5 6 l 肚m l ，富硒率可达 4 4 2 0 8 i l g 幢。 为了研究生物富硒对蛹虫草营养成分和功效成分的影响，测定了普通蛹虫草与富硒 蛹虫草中化学成分的含量。结果表明，富硒蛹虫草四种营养成分含量高于普通蛹虫草， 腺苷、虫草素、虫草多糖、矿物元素含量亦明显高于普通蛹虫草。同时亦测定了蛹虫草 子实体中化学成分的含量，蛹虫草子实体中虫草素、虫草多糖、虫草酸含量均高于普通 蛹虫草。 高质量、高产量、稳定性好是工业微生物首要的特征，对富硒蛹虫草的原生质体诱 变育种作了初步研究。通过原生质体诱变育种，获得了一株富硒能力强、产量高、性状 稳定的蛹虫草菌株y m 0 7 。与出发菌株相比，其产量提高了1 8 ，富硒量提高了1 6 。 在筛选过程中，硒平板筛选采用“点植”的接种方式，提高了筛选效率。 提取菌丝体之后的发酵废液中，含有一定的无机硒。因此，通过单因素实验研究了 共沉淀法处理含硒发酵废液的工艺参数。控制发酵废液p h 值6 0 7 o ，投加5 9 l 的氯化 铁( f e c l 3 6 h 2 0 ) ，搅拌1 0 m i n ，静置3 0 m m 后，2 6 0 0 r 1 i n 离心3 0 m i n ，出水硒含量可 以达到硒排放一级标准。 关键词蛹虫草富硒液体深层发酵虫草素除硒 a b s t r a c t a b s t r a c t s e l e n i u m r i c h e dc d ，咖c 印s 打7 j ，订r 括，w h i c hh a st h e 如n c t i o n a l 时o fb o 山c d ，咖c 印s 蚴胁日r 括a i l ds e l e n i u m ，i sp r o d u c e dw h e nf e r n l e n t e di n l i q u i dc u l r u r ew m c hh a dc e n a i n c o n c e n t r a eo fs e l e n i u m i nt l l i st h e s i s ，c h a r a c t e r so fs e l e n i 岫一r i c h e dc d 咖哪蚴，f ，口r 括，i n c l u d i n ga 1 1 t l e n i u f n a n ds e l e i l i 岫e 血c h r n e n tc a p a b i l i 吼f e 珊e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，n m c t i o n a lf a c t o r s ， a j l d p r e r e q u i s i t ep m g r 锄so ff b 珊e n t a t i o ni n d u s 砸a l i s a t i o n ，i n c l u d i n gm u t a t i o na i l ds c r e e n i n go f c d 吻c e 眇m 玎f f r 如、v i t i ll l i 曲b i o m a s sa j l ds e l e n i u r n 一 c h e dc 印a b i l 咄a i l ds e l e i l i l l i n r e m o v a l o f c a s t o mw e r es m d i e d j m ，as t r a i no fc 。嘲阳够，m f m 口，曲w i t hh i 曲b i o m a s sa n ds e l e n i u m r i c h e dc 印a b i l i t y ，w a s s c r e e n e dt 1 1 r o u 曲o r t h o g o n a le x p e r i m e n tf r o mf o u la r e rf 毫m e m e di ni i q u i dc u l m r ef o r7 2 h o u r s ，j mg o tt h eh i 曲e s tb i o m a s sa i l ds e l e n j u m r i c h e dc a p a b i l i t y t h ea i l t i s e l e n i u m c 印a b i l 时o fj mw a sl o 肛咖l n a 2 s e 0 3i ns o l i dc u l t u r e ，a 1 1 d1 2 肚g 1 1 1 li n1 i q u i dc u l t u r e 1 1 l e0 p t i m u i l lm e d i u mo f ( 0 咖掣肌i ，i f 日r 括w h e nc u l t t l r e d b yl i q u i df e n i l e n 诅t i o nt or i c h s e l e i l i 啪w a sd e t e r n l i n e d i tc o m a i n e d3 5 9 ls o yb e a l lp o w d e r ，4 0 9 ，ls u g 甄1 5 9 ，lk h 2 p 0 4 ， 5 0pg i 。v i t 锄i i lb l ，1 6m g ，ln a 2 s e 0 3 ，a 1 1 dp h6 o a n dt 1 1 eo 面m 呦c l l l t l l r ec o n d i t i o nw a s i i l o c u l a t i n g3 m l s e e d sc u l m l e df o r2 4h o u r si nan a s ko f2 5 0 m l c o n t a i l l i n g1o o m lm e d i 吼 a n dc u l t u r e d 衄d e r2 6 w h e nf e n n e m e di ns u c hc o n d “i o i l s ，m eb i o m a s sc o u l dg e tt o1 2 6 9 g l ，s e l e l l i u me 面c h m e n tc o u l dg e tt o5 6 1 肛g m l f o u rb a s i cn u 砸e n t s ，i n c l u d i n gp m t e i i l s ，f 址s ，c a r b o h y d r a t e s ，a 1 1 dc a s h e s ，o fs e l e i l i u m r i c h e d a n do r d i i l a r ym y c e l i ao fc d ，咖c 哗坫m f ，打盯捃w e r ea i l a l y z e d a l s o ，s i 】( f 1 1 n c t i o n a lc o m p o n e n t s ， i n c l u d i n gc o r d y c e p i n s ，a d e n o s i n e s ，p o l y s a c c h 撕d e s ，m a l l n i t 0 1 s ，唧i n oa c i d s ，a i l di 1 1 0 唱a n i c e l e m e m s ，w e r ea 1 1 a l y z e d nw a sc o n c l u d e dt 1 1 a ts e l e l l i u m r i c h e da n do r d i n a r ym y c e l i ao f c o 朋弦e 芦m f ，f 栅妇w e r en o tn u t r i t i o n a l l yp a m u e l ，a n dt l l e r e 、e r es i 嘶f i c o u l d td i 妇f e r e n c e s b e t w e e ns e l e n i u m r i c h e da n do r d j i l a r ym y c e l i ao nf u n c d o n a lc o m p o n e n 乜 1 h e1 l l t r a _ v i o l c tr a d i a t i o n 、v a su s e dt o 仃e a tp r o t o p l a s to fc d 哟旧e 筘m f ，f 衙担j m ，a n dt 1 1 e na m u t a mg 昀j ny m 0 7 ，d l i c hh a dh i 曲e rs e l e l l i 皿e n r i c h m e n tc 印a b i l i 魄、a so b t a i n e d c o m p a r e d 、i 也j m ，t 1 1 e b i o m a s so f y m 0 7i n c r e a s e d1 8 ，a n ds e l e n i 衄e n r i c h m e n tc a p a b i l i t y i n c r e a s e d1 6 a n e rt 1 1 em y c e l i u mo fc d 嘲阳e 筇聊玎订口r 捃w a ss 印a r a t e d ，t l l ec a s t o 圩h a dc e n a ：i n c o n c e n 仃a t eo fs e l e n i u m s o ，s e l e l l i u m r e m o v a lt e c h d o l o g yw a ss t i l d i e d c o n 廿o l l i n gp hv a l l l l e t o 也el e v e lo f 6 o 一7 o ，a d d i n g5 9 lf e c l 3 6 h 2 0 ，c h u 砌血gu pf o r l o m i n u t e s ，r 印o s i n gf o r3 0 n 血i u t e s ，a i l dc e n t r i 如g i l l g1 1 n d e r2 6 0 叫m i nf o r3 0m m m e s ，t 1 1 ec o n c e n 仃a t eo fs e l e n i 啪i n 也e c a s t o 行c o u k la c c o r dw i t hn a t i o l l a ls 切i n d a r d k e y w o r d s ：c d ，砂c e p sm f ，f f 甜如；s e l e n i u m r i c h e d ；s u b m e 唱e df e m e n 雠i o n ；c o r d y c e p i n s ； s e l e n i u m r e m o v a i 1 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：二香讧日期：2 胂z 年6 月夕日 签名：缉寻盆华一日期：2 胂z 年6 月罗日 l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名 弘 、 第一章绪论 第一章绪论 1 1 蛹虫草简介 众所周知，冬虫夏草( 图l 一1 、l 一2 ) 是我国名贵的中药材，与人参、鹿茸并称“三 大中药补品”。然而，由于其严格的寄生性( 寄生于蝙蝠蛾科昆虫蛾蝠的幼虫) 及特殊 的生长地理环境( 3 0 0 0 m 以上、雪线以下) ，天然虫草的产量有限n 铂。而且，近年来采 挖过度和资源的破坏，使得天然虫草更加紧缺。 图1 1 野生冬虫夏草图l 一2 冬虫夏草药材 国内外学者一直致力于寻找研究新的虫草菌种及其人工培养技术，进行产业化生产 和综合开发，以替代冬虫夏草。而其中尤以蛹虫草研究和应用最多1 3 叫，目前已经具备 产业化、规模化瓶栽生产条件，仿野生培养蛹虫草子实体( 子座) 技术已研发成功。同 时，大量研究0 】表明，从功效成分比较来看，人工蛹虫草可以作为冬虫夏草的代用品。 1 1 1 生物学特征 蛹虫草( c o r d y c e p s1 1 1 i l i t 捌s ) ，又名蛹草、北冬虫夏草、北虫草，为子囊菌亚门 ( a s c o m y c 撕n a ) 、核菌纲( p y r e n o m y c e t e s ) 、麦角菌目( c l a v i c i p t a l e s ) 、麦角菌科 ( c l a v i c i p i t a c e a e ) 、冬虫夏草属( c o r d y c 印s ) 真菌1 1 l j 。其子座单生或数个，从昆虫头部 或节上发出，橙黄色，大多不分枝，高2 5 c m ( 图1 3 ) 。 图1 3 蛹虫草 江南大学硕士学位论文 全世界已知冬虫夏草属真菌有3 5 0 余种，我国已正式发表的有拉丁学名的共6 8 种。 冬虫夏草属真菌的特征之一是其生活史类型的多样性，其生活史可以分为产生担孢子或 子囊孢子的有性型( t e l e o m o r p h ) 和不产生担孢子或子囊孢子的无性型( a i l a m o r p h ) t 1 2 】。 国际植物命名法规允许对有性型和不同的无性型分别给予不同的名称【1 1 】。目前，可 人工培养的( 包括菌丝体发酵的) 冬虫夏草属真菌如表1 1 所示。 表1 - l 可人工培养的( 包括茵丝体发酵的) 冬虫夏草属真菌 有性型( t e l e o m o r p h )无性型( a n m o r p h ) 蝻蝉c i i l a r i s 冬虽夏草c s i n e n s i s 蝉辊c s o b o l i f e r d 古尼虫草c g u m “ 棒形虫革c c ，口v “肠佗 布氏盈草c _ b r o n 印i n r t i i 蛹草 l l 膏霉p a e c i l o m g c e sm 锄n s 中国被毛孢h i r s m l e l l ds i n s i s 蜱棒柬孢i s d r 记c i c 口d n em i 口m e i 1 占昆拟南霉p q e c i o m g c e sg m h n 蜷蝓被毛孢h i r s h 佗1 1 0l e n c n l l i i 布氏自僵菌b e n u m r 泌b m n 蝉i f h 相对来说，蛹虫草的生长条件远没有冬虫夏草那样严格。在我国东北、华北、西南 的针叶林地、阔叶林地或混交林地、山地均有蛹虫草生长，寄生于鳞翅目、鞘翅目、双 翅目等昆虫的幼虫或蛹体上i l “。 蛹虫草生活史的有性阶段包括菌丝体生长和子实体生长。鳞翅目、鞘翅目、双翅目 等昆虫幼虫把蛹草拟青霉的孢子吃入体内，还可以自由活动，即为“冬虫”。条件适宜， 孢子便萌发形成菌丝体。菌丝体吸取虫蛹的营养作为其生长发育的物质和能源。当蛹虫 草的菌丝把蛹体内的各种组织和器官分解完毕后，菌丝体发育由营养生长转为生殖生 长。菌丝体逐渐扭结分化为橘黄色或橘红色的顶部略膨大的里棒状的子座( 子实体) ， 从蛹体空壳的头部、胸部、近尾部等处伸出，即为“夏草”【l 】。 1 1 2 生理功能及功效成分 自从1 9 9 3 年“马家军”因食用冬虫夏草而缔造了世界女子田径赛中十七项世界纪录 后，冬虫夏草及蛹虫草的生理、药理功能已有大量的文献研究【1 3 - 2 4 】。归纳起来，蛹虫草 的生理功能主要包括：提高免疫、抗疲劳、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、延缓衰 老、镇定作用等。从1 9 9 6 年至2 0 0 0 年中国卫生部批准的保健食品来看，虫草类( 包括 冬虫夏草及蛹虫草的菌丝体、子实体) 保健品申报的保健功能包括免疫调节、抗疲劳、 辅助抑制肿瘤、延缓衰老、减肥功能、调节血脂、耐缺氧、对化学性肝脏损伤有保护作 用”，如表1 2 所示。 蛹虫草功效因子的研究，亦有大量的文献报道【2 8 1 。对蛹虫草药效起作用的物质一 般属于核苷类、糖醇类、多糖类、氨基酸类、酶类以及矿物元素等。己确定的功能因子 主要有虫草素、腺苷、甘露醇、虫草多糖、超氧化物歧化酶( s o d ) 等。 2 第一章绪论 表1 2 虫草类保健品的保健功能统计 保健功能批准号 免疫调节 瑟乏裴篓誓黧9 9 7 蕊：? 己麓p 2 0 抗疲劳 鬻：翟嚣；篆6 4 9 7 4 6 7 9 7 6 7 4 辅助抑制肿瘤9 7 1 7 1 ，9 7 1 9 2 ，9 7 6 3 4 延缓衰老 9 7 9 l ，9 8 2 7 2 减肥功能9 7 2 0 调节血脂 9 9 1 2 7 耐缺氧 9 7 6 7 9 对化学性肝脏损伤有保护作用 9 7 5 0 8 9 7 2 7 6 ，9 7 ，5 0 8 9 7 - 6 7 5 ，9 7 8 1 2 1 1 3 人工培育现状 蛹虫草的天然资源有限，但人工培养己获成功，目前主要有以下三种培养方法：一 是采集野生的蛹虫革，进行菌种的分离、纯化，然后将蛹虫草菌种接种在蚕蛹米饭等固 体培养基上，在一定的温度、湿度和光照条件下量培养3 5 4 5 d 得蛹虫草子实体( 图i - 4 ) ； 二是以大豆粉蔗糖或玉米浆蔗糖为培养基，采用液体发酵培养蛹虫草；三是将蛹虫草菌 种接种在柞( 家) 蚕幼虫或活蛹体内，在同第一种方法相同的条件下培养4 0 5 0 d 得蛹 虫草子实体【2 9 ，3 0 】( 图1 5 ) 。 图1 4 人工蛹虫草图1 5 柞蚕蛹蛹虫草 对于第一种培养方法。一般采用玻璃瓶( 或塑料瓶) 瓶载( 图1 6 ) ，一般1 0 0g 培 养基大约可产鲜子实体5 0g ，也有的采用浅盘栽培，目前均已实现工业化。 江南大学硕士学位论文 图1 6 蛹虫草瓶载规模化生产 对于第二种方法，蛹虫草液体发酵一般采用液体深层发酵来生产蛹虫草菌丝体；液 体静置发酵生产蛹虫草子实体亦有报道。 由上可知，蛹虫草的人工培育，可以分为固体发酵和液体发酵。从两个过程比较看 来，固体发酵要比液体深层发酵周期长，经历的生理过程复杂。而液体发酵的特点是周 期短、成本低、可以采用工业法大规模生产。液体发酵一般仅得到一定菌龄的菌丝体， 而固体发酵的过程包括了菌丝体的生长、予实体的分化、子实体的生长【3 ”。菌丝体与子 实体两者营养成分和功效成分有所不同，对于两者何者更具有生理活性的研究不多。 1 2 硒与人类健康 1 2 1 硒元素简介 硒，是一种非金属元素，元素符号为s e 。结晶状态的硒为黑色，非结晶状态的硒为 暗红色。 1 8 1 7 年，瑞典化学家博茨路易斯( b e r z e l i u s ) 在检验制硫酸剩下的残渣时发现了硒， 并以希腊月亮女神的名字s e r e n e 命名为“s e l e n i u m ，。 此后的1 0 0 多年时间里，人们曾一度认为硒是一种有毒的微量元素，对其毒性研究 较多。实际上，硒对人和动物的毒性与硒的形态有关，元素硒不溶于水，基本无毒；有 机硒的毒性相对较小，亚硒酸钠和硒酸钠易溶于水，则毒性较大。硒中毒是通过硒对含 硫氨基酸中硫代谢的干扰而产生的p 3 j 。 1 9 5 7 年，法国科学家施瓦茨( s c h w a r z ) 在研究肝坏死的病因时，发现硒是一种防 止营养性肝坏死的保护因子，硒才在营养学上受到重视。 经过各国科学家多年的研究，基本上明确了硒的生理作用，明确了人体健康与硒密 切相关。1 9 7 3 年，世界卫生组织宣布：硒是人和动物生命活动中必不可少的微量元素【3 2 】。 1 9 8 8 年，中国营养学会在每日膳食中营养素供给量与我国的膳食指南中，将硒 列为1 5 种每日必需营养素之一。我国微量元素与健康学会理事长于若木指出：“中国是 一个缺硒大国，人体补硒是关系到亿万人民健康的大事，我们应当象补碘那样抓好补硒 工作。” 1 2 2 硒的生物学功能 4 第一章绪论 硒在生物体内主要以硒半胱氨酸的形式存在各种硒蛋白之中，如g s h p x ( 谷胱甘 肽过氧化物酶) 家族、i d ( 脱碘酶) 家族、硒蛋白p 和硒蛋白w 等。人体内，硒的生 物学功能主要有以下几个方面| 3 ”。 第一，硒是构成机体抗氧化系统的必要成分。机体代谢过程中会不断产生自由基， 如果自由基产生过多或机体对自由基的清除速度过慢，机体自由基水平过高会对组织细 胞造成损伤，使机体器官功能下降或紊乱，最终引发疾病。g s h p x 能催化过氧化氢还 原，减少活性氧和自由基的产生，从而维持机体内自由基水平的动态平衡。 第二，硒对机体免疫功能的影响。分布于巨噬细胞、中性白细胞、淋巴细胞中的硒 的存在可以增加人体免疫功能：g s h _ p x 的抗氧化作用可以减少脂质过氧化物对免疫细 胞的损害；硒作用于巯基化合物，进而影响免疫应答；硒影响淋巴细胞的酶系而影响淋 巴细胞的功能。 第三，硒对心血管系统的影响。硒和v e 在一定程度上有调节血脂代谢的作用，可 以预防高脂血症。 第四，硒的遗传损伤保护。研究表明，硒对致突变剂引起的遗传损伤有抑制作用。 1 2 3 硒与疾病 梅紫青【3 4 】等从生物医学角度详细地总结了硒与各种疾病的关系，现归纳如下： ( 1 ) 硒对甲状腺代谢至关重要，脱碘酶即为含硒酶。 ( 2 ) 用硒防治克山病取得了世界公认的成效。 ( 3 ) 硒能防治地方性心血管病。 ( 4 ) 硒能够结合重金属离子，且对乙肝病毒有抑制作用，从而保护肝脏。硒可以治 疗酒精性肝炎。 ( 5 ) 硒可以保护胰脏，改善糖尿病代谢功能。 ( 6 ) 硒可以防治大骨节病。 ( 7 ) 硒参与光子传导并减少白内障。 ( 8 ) 硒可以修复吸烟造成的生理危害。 ( 9 ) 儿童补硒可以改善营养不良；孕妇补硒可防治婴儿猝死综合症。 0 0 ) 硒可以提高生殖机能。 0 d 硒对预防爱滋病有一定的关系。 硒可以治疗类风湿病。 0 3 9 硒对于y 射线的照射具有保护作用，可以减少因紫外线引起的皮肤炎症。 补硒可使癌症发病率下降。 1 3 富硒产品开发现状 富硒产品可以分为无机富硒产品和有机富硒产品两类。无机硒的毒性大于有机硒， 而活性又低于有机硒。 1 3 1 无机类富硒产品 江南大学硕士学位论文 无机类富硒产品主要有亚硒酸钠、硒酸钠、硫化硒、二硫化硒等。其中亚硒酸钠是 用途较广泛的硒制品，含硒量为4 5 7 ，常作为硒源补充人体硒，也是目前最常用的禽 畜饲料硒源补充剂。因此，常作为食品添加剂用于保健食品开发；还常用于无机硒向有 机硒的生物转化生产中。g b l 4 8 8 0 食品营养强化剂使用卫生标准中规定了亚硒酸钠 在食盐、饮液及乳饮料、乳制品、谷类及其制品中的使用量。 无机类富硒产品都有定的毒性，如亚硒酸钠为剧毒物品。 1 3 2 有机类富硒产品 有机类富硒产品可以分为硒化合物制品、微生物富硒产品、植物富硒产品、动物富 硒产品四类，主要产品如表1 3 。而其中已工业化生产、能够作为食品营养强化剂使用 的主要是硒酸酯多糖、富硒酵母和富硒食用菌。 表l 一3 主要有机富硒产品汇总 1 3 2 1 硒酸酯多糖1 4 1 l 硒酸酯多糖，又称硒化卡拉胶，是以海洋藻类的提取物卡拉胶( 硫酸酯多糖) 为载 6 第一章绪论 体，将人体必需微量元素硒与多糖结合而成的新型有机硒化物。 硒化过程中，硫酸酯多糖结构中的部分硫被硒取代形成硒酸酯多糖。这种有机态结 构极为有效地提高了硒的生物可利用度，且毒性大大降低。同时，硒酸酯多糖保持了硫 酸酯多糖的基本构型和生理功能。 硒酸酯多糖具有一定的海藻多糖的特性和反应性、形成凝胶及高粘度溶液的性能、 弹性、透明度及溶解性等。因此，作为硒的营养强化剂，硒酸酯多糖在食品工业中具有 较广泛的应用前景。 1 3 2 2 富硒酵母1 4 刮 酵母对许多微量元素，如铁、钙、锌、硒、铬及锗等都具较强的富集作用。具体的 富集途径有物理吸附、生物吸附、表面沉积、主动运输与被动扩散等，其中生物富集的 主要途径是生物吸附和主动运输。在富硒酵母的生产中，硒源一般都是用亚硒酸钠。 硒酵母一般含硒3 0 0 1 0 0 0 “g 左右，其中有机硒占9 5 左右，主要以硒代氨基酸 和硒蛋白的形式存在，同时一部分形成硒多糖。硒一般取代化合物中硫原子的相应位置， 由硫化物转化为相应的硒化物。 国外从七十年代就开始进行富硒酵母的研究。可以进行富硒培养的酵母主要有酿酒 酵母、葡萄汁酵母、鲁氏酵母、阿舒接合酵母、汉逊酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母 属、假丝酵母属。目前，国内已有商品化的富硒酵母作为食品加剂、药物和保健品出售。 1 3 2 3 富硒食用菌 能够进行富硒培养的食用菌主要有：金针菇、猴头、香菇、灵芝、平菇、灰树花、 黑木耳等。 食用菌富硒培养可分为固体发酵生产子实体和液体发酵生产菌丝体。相同培养方式 下，不同食用菌的富硒、耐硒能力不同；不同培养方式下，同种食用菌的富硒、耐硒能 力亦不同。 尚德静、王关林【4 3 】研究了金针菇、香菇、猴头菌和灵芝在液体深层培养中的富硒能 力。结果表明，四种食用菌均具有富硒能力，灵芝的富硒能力最强，是其他三种食用菌 的1 0 一2 0 倍。 黄渊泽等州用电感偶合等离子光谱法( i c p s ) 测定了木耳、平菇、猴头菇、金针菇、 灵芝5 种富硒人工蘑菇中的硒含量。结果表明，木耳和平菇的富硒效果最好，富硒蘑菇 中的硒含量为：木耳z 平菇 猴头菇z 金针菇z 灵芝。 同样是生产富硒食用菌菌丝体( 或子实体) ，由于不同研究者所使用的菌株不同、 培育条件不同等，最终得到的产物硒含量会存在一定的差异。 1 4 立题背景及意义 本课题的目的是研究液体发酵生产富硒蛹虫草，并结合其功效成分探讨其生物活 性。本课题的研究在开发富硒蛹虫草功能性食品方面具有重要的意义。 首先，相对于蛹虫草的瓶栽技术，液体发酵周期短、成本低、可以采用工业法大规 江南大学硕士学位论文 模生产。 其次，本课题研究的富硒蛹虫草较之其他的富硒产品更具优势，主要表现在： ( 1 ) 一般而言，食用菌都具有较强的富硒能力和较高的产率，而富硒酵母的产率在 仅为1 左右。因此，我们认为富硒蛹虫草将较富硒酵母具有更高的产量。 ( 2 ) 许多研究表明，蛹虫草具有与冬虫夏草相似的功能性，因此，我们认为蛹虫草 富硒之后将较其他富硒产品更具生物活性。 1 5 本课题的主要研究内容 本课题主要研究以下几个方面，以期为工业化生产提供理论依据。 ( 】) 富硒蛹虫草菌株的筛选及其耐硒特征的研究 从不同产地的四株蛹虫草中筛选出富硒效果较好的一株菌株，并研究其耐硒特征。 ( 2 ) 富硒蛹虫草摇瓶发酵条件的确定 通过单因素实验和正交实验确定富硒蛹虫草摇瓶发酵的最优营养条件和培养条件。 ( 3 ) 生物富硒对蛹虫草化学成分影响的研究 研究比较富硒蛹虫草与普通蛹虫草在营养成分和功效成分方面的差异。 ( 4 ) 富硒蛹虫草原生质体诱变育种 建立一套简单、快速、准确的富硒蛹虫草原生质体诱变育种方法，并通过原生质体 诱变育种获得一株较高富硒能力的、宜用于工业生产的蛹虫草菌株。 ( 5 ) 富硒蛹虫草发酵废液处理的研究 研究发酵废液的共沉淀除硒工艺，使出水硒含量达到硒排放一级标准。 第二章富硒蛹虫草菌株筛选及其耐硒特征研究 第二章富硒蛹虫草菌株筛选及其耐硒特征研究 文献报道4 0 ，4 ”，食用菌液体培养具有一定的富硒能力。蛹虫草与食用菌具有相 似的性质，但其富硒能力并未见文献报道。本课题研究富硒蛹虫草，因此，蛹虫草的富 硒能力应该是首先需要了解的菌种特征。 其次，本课题研究所选用的供试菌种应当是具有较高生物量和较高富硒率的蛹虫草 菌株，只有这样才能获得一定质量和一定产量的发酵产物。 本章通过正交实验筛选出一株较高生物量和较高富硒率的菌株，并研究了其耐硒特 征。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 l l l 菌种 供试蛹虫草菌株( o ，咖够，j ，f 纫宙) 为本实验室保藏菌种。各菌株编号如下：c m 为赤峰蛹虫草、h m 为海安蛹虫草、j m 为吉林蛹虫草、s m 为山西蛹虫草。 2 1 1 2 培养基 ( 1 ) 斜面培养基( g l ) 土豆2 0 0 ；葡萄糖2 0 ；k h 2 p 0 41 5 ；m g s 0 41 5 ；硫胺素5 0 1 0 ；琼脂2 5 ；p h 6 7 。 1 2 l 下灭菌2 0 m i n 。 保藏培养基、活化培养基配方与斜面培养基相同。 ( 2 ) 种子培养基( g ，l ) 大豆粉3 0 ；蔗糖1 5 ；k h 2 p 0 41 5 ；m g s 0 41 5 ；p h 6 7 。大豆粉煮沸，两层纱布过 滤。培养基配制、分装后1 2 l 下灭菌2 0 m i n ，下同。 ( 3 ) 发酵培养基( g ，l ) 大豆粉综合培养基：大豆粉3 0 ；蔗糖3 0 ；k h 2 p 0 41 5 ；m g s 0 41 5 ；n a 2 s e 0 31 0 1 0 ： p h 6 7 麦麸综合培养基：麦麸1 5 0 ；蔗糖3 0 ；k h 2 p 0 41 5 ；m g s 0 41 5 ；n a 2 s e 0 31 0 1 0 - 3 ； d h 6 - 7 2 1 1 3 主要试剂 蔗糖 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 氢氧化钠 盐酸 硝酸 中国医药集团上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 上海恒信化学试剂有限公司 中国上海兴塔化工厂 中国医药集团上海化学试剂公司 上海振兴化工厂 宣兴市化学试剂厂 江南大学硕士学位论文 过氯酸桃浦化工厂 亚硒酸钠金山县兴塔化工厂 e d t a 一2 n a 中国医药集团上海化学试剂公司 3 ，3 二氨基联苯胺中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 甲苯宜兴市展望化工制剂厂 精密d h 试纸( o 5 7 0 、1 1 2 )上海三爱思试剂有限公司 无水硫酸钠宜兴市第二化学试剂厂 琼脂( 粉) ( 生化试剂)上海化学试剂站分装 大豆粉市售 麸皮市售 注：以上试剂( 大豆粉、麸皮除外) 未经注明的均为分析纯。 2 1 1 4 主要设备 电子天平 7 2 1 分光光度计 电热恒温培养箱 8 0 一1 离心沉淀机 电热恒温水浴锅 h y g h 回转式恒温调速摇瓶柜 立式圆形高压蒸汽灭菌锅 超净工作台 p h 一2 型酸度计 2 1 2 方法 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海跃进医疗器材厂 上海手术器械厂 上海医疗器械厂 上海新星自动化控制设备成套厂 无锡第二医疗器械厂 无锡空气净化设备厂 上海市第二分析仪器厂 2 1 2 1 富硒蛹虫草菌丝体粉的制备 以添加一定量亚硒酸钠的大豆蔗糖综合培养基摇瓶发酵的蛹虫草菌丝体，经离心、 7 0 烘干、粉碎后过6 0 目筛，得到的干粉。 2 1 2 2 生物量测定 采用干重法，将发酵液2 6 0 0 r m i l l 离心3 0 i i l i n ，倾出上清液用于硒含量的测定，茵 丝体泥1 0 0 烘干至恒重，称量。 2 1 2 3 硒含量测定 3 ，3 二氨基联苯胺比色法【4 6 】。 ( 1 ) 硒标准曲线的绘制吸取1 肛m l 亚硒酸钠标准液o 、4 、8 、1 2 、1 6 、2 0 m l 分 别移入分液漏斗，加水至3 5 m l ，加入1 m le d t i a 一2 卜a 溶液，摇匀，调p h 2 3 ，加0 5 3 ，3 二氨基联苯胺4 m l 摇匀，避光静置3 0 m i n ，调p h 到中性，加1 0 m l 甲苯震荡，静 置分层，弃水层，甲苯层通过棉花栓过滤于比色皿中，4 2 0 m 波长处测定吸光度，绘制 标准曲线。 ( 2 ) 发酵液中残留无机硒( 残硒) 含量测定吸取5 m l 发酵液上清液于分液漏斗中， 1 0 第二章富硒蛹虫草苗株筛选及其耐硒特征研究 加水至3 5 m l ，以标准曲线绘制方法测定吸光度。萃取时若产生乳化现象，放出水相后 加入少许无水硫酸钠于分液漏斗中，震荡后静置，从分液漏斗上口倾出甲苯层。根据测 得的吸光度，从标准曲线中查得相应的亚硒酸钠含量。亚硒酸钠含量乘以其中的硒百分 含量( 4 5 7 ) 即为发酵液中残留无机硒( 残硒) 含量。 ( 3 ) 蛹虫草菌丝体粉中富集的硒( 富集硒) 含量测定称取1 9 富硒蛹虫草菌丝体粉 于2 5 0 m l 磨口三角瓶中，加水约5 0 m l ，加入1 0 m l1 + 1 硝酸一过氯酸消化。放冷后再加 入5 m l1 + 4 盐酸消化。消化液定容至1 0 0 m l 即为待测液，吸取5 m l 按上述方法测定待 测液中的硒含量，进而计算出蛹虫草菌丝体粉中富集的硒( 富集硒) 含量。 ( 4 ) 蛹虫草菌丝体粉中吸附的硒( 吸附硒) 含量测定称取1 9 富硒蛹虫草菌丝体粉 于2 5 0 m l 磨口三角瓶中，加水约5 0 m l ，浸泡2 4 h 。滤液定容至1 0 0 m l 即为待测液，吸 取5 m l 按上述方法测定待测液中的硒含量，进而计算出蛹虫草菌丝体粉中吸附的硒( 吸 附硒) 含量。 ( 5 ) 蛹虫草菌丝体粉中吸收的硒( 吸收硒) 含量测定 本文中定义富集硒与吸附硒 之差即为吸收硒，同时定义吸收硒与富集硒之比为吸收率。 2 1 2 4 蛹虫草茵丝体培养条件 从活化培养基上刮取一环菌丝体，接种到种子培养基中，摇床转速1 5 0 r h 血，温度 2 6 ，装液量1 0 0 m l 2 5 0 m l ，培养3 6 h ，得种子培养液。种子培养液以3 的接种量接 种于发酵培养基中，上述条件下培养7 2 h ，得发酵培养液。 2 2 结果与分析 2 2 1 蛹虫草富硒效果考察指标探讨 富集硒、吸附硒、吸收硒含量的测定首先要制备菌丝体粉，并对菌丝体粉进行消化 处理，然后才能按3 ，3 一二氨基联苯胺比色法来测定。残硒的测定则不需要进行预处理， 直接以发酵液测定即可。因此，确定即操作简便又合理可行的蛹虫草富硒效果考察指标 是本课题首先应当解决的问题。 同时，蛹虫草富集硒作用可以分为其菌丝体对硒的吸收和吸附。考察吸收硒与吸附 硒之间的比例关系亦是必需的。因为，吸收硒的功能性和安全性均优于吸附硒。吸附硒 较高、吸收硒较低对于富硒蛹虫草是没有意义的。 表2 1 发酵液中添加硒、残硒以及菌丝体富集硒的关系 因此，本课题首先考察了发酵液中添加硒、残硒以及菌丝体粉富集硒的关系，结果 如表2 1 所示( 三次平行实验) 。同时，亦考察了蛹虫草菌丝体粉中富集硒、吸附硒及 吸收硒的关系，结果如表2 2 所示( 三次平行实验) 。 江南大学硕士学位论文 表2 2 蛹虫草菌丝体粉中富集硒、吸附硒及吸收硒的关系 由表2 1 、2 2 可以得出，富集硒中大部分为吸收硒，吸附硒含量极少；残硒与富集 硒之和等于发酵液中中添加的硒含量。同时，残硒的测定要较富集硒或吸收硒的测定简 单的多。基于此三者考虑，本实验中定义“富硒量”、“富硒率”两个指标来考察蛹虫草的 富硒效果；把“富硒量”定义为每毫升发酵液中硒加入量与残硒量之差：“富硒率”定义为 富硒量与生物量之比。 这样定义了“富硒量”之后，尽管“富硒量”实际上反映的是蛹虫草富集硒的效果，而 并非吸收硒的效果，但由于富集硒绝大多数即为吸收硒，因此，“富硒量”亦能反映出蛹 虫草吸收硒的效果。更重要的是，定义“富硒量”、“富硒率”两个指标来考察蛹虫草的富 硒效果，将会使硒含量测定过程大大简化。( 尽管硒含量测定依然较为繁琐，但如此处 理可减少一半的工作量。) 生产富硒蛹虫草菌丝体粉，除满足菌丝体粉具有较高的富硒率之外，还必须达到一 定的产量( 较高的生物量) ，否则将没有实际的意义。因此，本实验中以富硒量作为蛹 虫草富硒效果的主要考察指标，以富硒率作为次要考察指标。 2 2 2 蛹虫草富硒高生物量菌株筛选 不同产地的蛹虫草菌株对硒的富集效果会有所不同。因此，本课题中首先对赤峰蛹 虫草( c m ) 、海安蛹虫草( h m ) 、吉林蛹虫草( j m ) 、山西蛹虫草( s m ) 共四个菌株 进行了筛选。 从四个菌株中筛选最优菌株，为消除温度、培养基对实验结果的影响，采用l 3 ( 4 2 4 ) 混合正交表安排正交实验，其因素水平表如表2 3 。 表2 3 正交实验因素水平表l 8 ( 4 2 4 ) 实验结果综合考察了生物量、富硒量、富硒率等指标，其结果如表2 4 、图2 1 、 图2 2 所示。 从图2 - 2 可以看出，不管是以生物量还是富硒量、富硒率作为指标，培养温度均以 2 6 为最优，而培养基均以大豆粉综合培养基为最优。对于四个菌株，s m 生物量最高， 但是其发酵液气味不佳。而j m 尽管生物量略低于s m ( 图2 1 ) ，但其富硒量、富硒率 1 2 第二章富硒蛹虫草菌株筛选及其耐硒特征研究 最高，且具有良好的发酵气味，因此，确定j m 为最佳的蛹虫草富硒发酵菌株。综合表 2 4 、图2 1 、图2 2 得出的最佳因子组合为a 3 8 2 c l 。在此组合下，j m 摇瓶培养生物量 可以达到1 2 2 2 胡，富硒量可以达到4 2 2 3 “m l ，富硒率可以达到3 4 5 5 5 “g 。 表2 4 正交实验结果 l 4 8 生k 物k 2 量 b k 较优水平 富k 1 硒 k 2 量k 3 k 4 较优水平 宦k 硒 k 2 率b l 【4 较优水平 c l 34 6 9 33 2 6 c l 3 1 8 5 3 3 1 4 9 8 c 粉红褐色 略带浅红色 乳白色 乳白色 淡黄色 淡黄色 褐色 淡黄绿色 淡淡的恶臭 平淡 淡淡的芳香 芳香气味 淡淡的芳香 芳香气味 恶臭 刺激气味 2 2 3 蛹虫草耐硒特征实验 亚硒酸钠是一种剧毒物品，其作为食品添加剂使用时必须限量使用。同样，过量的 亚硒酸钠对蛹虫草有一定的毒性，除影响菌丝体的生长外，还对菌丝体正常代谢有着重 要的影响。培养基中亚硒酸钠浓度的不同将直接影响蛹虫草的生长和富硒能力，故培养 过程中亚硒酸钠浓度的控制是相当重要的。 马铃薯综合培养基中加入不同浓度的亚硒酸钠，接种j m 培养5 d 后，其菌丝体长势 如表2 5 。从表2 5 可以看出，培养基中亚硒酸钠的加入抑制了蛹虫草菌丝体的生长， 蛹虫草耐亚硒酸钠浓度为1 0 “咖l 。 作为蛹虫草的一个特征数据，该数据对后续蛹虫草的研究将有指导意义，例如，筛 引卯鸵舛硒柳m狮璐m宝暑!珊瑚瑚咖川猫兰；吲 2 3 2 3 3 4 3 4 o 9 o 6 3 2 4 9嘲m邺蚓mm 。2，。：，：，!耋曲弱加拍加m加拍哪 耽撕 如删圳 耽嘶删刚刚螂塞m螂墨螂一一如 江南大学硕士学位论文 选较高耐硒能力突变株时，可以作为筛选平板配方的参考，指导其中亚硒酸钠的添加量。 二j 至匦口 1 3 o o 1 2 0 0 1 1 0 0 1 00 0 90 0 鲴 霹8 o o 7 0 0 60 0 50 0 c mh mj ms m 图2 1以生物量为考察指标的各因素水平趋势图 培养基l 培养基2 c m 丑蛆删驯 2 0 2 6 培养基1 培养基2 图2 - 2以富硒量、富硒率为考察指标的各因素水平趋势图 表2 5 蛹虫草平板培养耐硒实验 3 3 50 0 3 2 50 0 2 8 50 0 2 7 5 0 0 注：w 表示菌丝体长势较壮且很均匀，“+ + + ”表示长势壮且均匀，抖壤示长势壮但不均匀， c c + ，长势弱且不均匀。 发酵培养基中添加不同浓度亚硒酸钠，进行摇瓶培养，考察j m 摇瓶培养时的耐硒 1 4 6 ，d 3 v 爵鼹恤 ；号 | 骞 s 枷 枷 喜| 蓦| 狮 撕俩 咖 j 山o t t v 唧醒缸 第二章宦硒蛹虫草菌株筛选及其耐硒特征研究 特征，其结果如表2 6 所示。 表2 6 蛹虫草摇瓶培养耐硒实验 从表2 6 可以看出，培养基中亚硒酸钠浓度的高低，会影响蛹虫草的生长以及富硒 效果。随着亚硒酸钠浓度的增加，生物量呈下降趋势，而富硒量、富硒率呈上升趋势。 亚硒酸钠有一定的毒往，它的加入影响了蛹虫草的生长，但并不显著。亚硒酸钠浓度达 到1 4 咖l 时，发酵液由淡黄色变为粉红褐色，这可能是由于蛹虫草将亚硒酸钠转化为 单质硒而不