（食品科学专业论文）产γ聚谷氨酸纳豆芽孢杆菌的选育及其发酵条件的优化.pdf

摘要 7 聚谷氨酸( ) , - p g a ) 主要是由一些芽孢杆菌产生的一种水溶性的胞外氨基酸聚合 物。近年来被作为高吸水性材料、增稠剂、药物载体、生物絮凝剂及重金属吸附剂等广 泛地应用于农业、食品、医药、化妆品及水处理等领域中，是一种具有极大开发价值和 广阔应用前景的新型多功能高分子材料。 本研究是从r 本和国产纳豆产品中筛选出) , - p g a 产量较高的纳豆枯草芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 伽a l l 纠s 0 0 3 ，并以此菌株为出发菌，通过紫外硫酸二乙酯复合诱变， 获得稳定的高产菌株b a c i l l u ss u b t i l i s 伽a r t s 0 0 3 d 6 。为了降低生产成本，以食品加工 下脚料味精废液和脱脂豆粕粉为主要成分进行了培养基优化，并对分离纯化后的样品结 构进行了鉴定。主要研究结果如下： 1 从五种不同的纳豆产品中筛选得到一株产了p g a 的纳豆枯草芽孢杆菌菌株 b a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t l o ) s 0 0 3 ， p p g a 产量为1 4 6 6 9 l 。 2 以b a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3 菌株为出发菌，通过紫夕b ( u v 卜硫酸二乙酯( d e s ) 复合诱变，筛选到一株遗传性能稳定的高产突变株b a c i l l u ss u b t i l i s 伽a t t 彩s 0 0 3 d 6 其 ) - p g a 产量由诱变前的1 4 6 6 9 l 提高到2 0 5 8 9 l ，提高- j 4 0 3 8 。 3 考察了培养基成分对b a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3 d 6 发酵合成丫p g a 的影响。在单 因素试验的基础上，对培养基成分进行了正交优化，得到一组最佳培养基，其组成为： 味精废液12 0 m l l ， 拳f 1 5 0 9 l ，葡萄糖3 0 9 l ，f e c b 6 h 2 00 4 9 l ，m g s 0 4 7 h z o0 s g l ， m n s 0 4 h 2 00 0 2 9 l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 00 3 9 l ，p h 7 o ：优化后的发酵培养基在5 0 0 m l = 角 烧瓶装液量1 0 0 m l ，3 7 0 c ，2 3 0 r r a i n 的条件下培养6 4 h ，发酵液中的y p g a 产量可达到 3 5 3 2 l 。 4 经分离纯化后样品的高效液相色谱图中谷氨酸的出峰时间与l 一谷氨酸标准品的 出峰时间一致，可以认为发酵产物是谷氨酸的同聚物。经红外光谱鉴定其结果与台湾对 照品的图谱基本一致，可确定纯化产物为丫p g a ，纯化后样品的纯度可达n 5 4 4 。并 根据s d s - p a g e 和色谱凝胶渗透法测定纯化后的发酵液样品呈多分子质量聚集体形式， 并非由单一分子量组成，分子量范围为5 8 0 k d - - 6 6 9 k d 。 关键词：丫一聚谷氨酸；纳豆枯草芽孢杆菌；菌种筛选；复合诱变；优化；味精废液 a b s t r a c t t - p o l y ( g l u t a m i ca c i d ) ( 7 - p g a ) i saw a t e r - s o l u b l ep o l y m e rw h i c hi sm a i n l yp r o d u c e db y s e v e r a lb a c i l l u ss p e c i e so u t s i d et h ec e l l s p o t e n i a la n du n i q u ea p p l i c a t i o n so f 丫一p g aa n di t s d e r i x ，a t i v e sh a v eb e e no fi n t e r e s ti nt h ep a s tf e wy e a r si nab r o a dr a n g eo fi n d u s t r i a lf i e l d s s u c ha sa g r i c u l t u r e ，f o o d m e d i c i n e ，c o s m e t i c sa n dw a t e rt r e a t m e n t ，w h i c hc a nb eu s e da s h i g h l yw a t e ra b s o r b a b l em a t e r i a l s ，t h i c k e n e r ，d r u gc a r r i e r ，b i o p o l y m e rf l o c c u l a n t sa n dh e a v y m e t a la b s o r b e r i nt h i ss t u d y , as t a b l em u t a n tb a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3 d 6h i g h l yp r o d u c e d1 - p g a w a so b t a i n e da f t e rm u t a t e db yu va n dd e sc o m p o u n dm u t a t i o nu s i n gb a c i l l u ss u b t i l i s 0 7 a t t o ) s 0 0 3a st h eo r i g i n a ls t r a i nt h a tw a ss c r e e n e df r o mt h en a t t op r o d u c t si nj a p a na n d c h i n a i no r d e rt or e d u c ep r o d u c t i o nc o s t s ，t h eb y - p r o d u c to ft h em o n o s o d i u mg l u t a m a t e i n d u s t r ya n dd e f a t t e ds o ) b e a nw a su s e da sm a i ni nt h i se x p e r i m e n ta n do p t i m i z a t i o no ft h e m e d i u m i d e n t i f i c a t i o no ft h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o ns a m p l e t h em a i nr e s u l t so ft h i s p a p e ra r ea sf o l l o w s ： 1 as t r a i nw a ss c r e e n e df r o mf i v en a t t op r o d u c t sa n ds h o w nt op r o d u c e7 - p o l y g l u t a m i c a c i d t h es t r a i nw a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i sa n dn a m e db a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3 t h ep r o d u c t i o no ft - p g ar e a c h e d14 6 6 9 l 2 o r i g i n a ls t r a i nb a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3p r o d u c i n gt - p o l y g l u t a m i ca c i dw a s m u t a t e db yu va n dd e sc o m p o u n dm u t a t i o n ；an e wh i g h y i e l ds t a b l em u t a n tw a ss e l e c t e d a n dn a m e db a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3 - d 6 c o m p a r i n gw i t ht h ey i e l do ft h eo r i g i n a ls t r a i n ， t h et - p g ay i e l dw a si m p r o v e d4 0 38 ，f r o m14 6 6 9 lt o2 0 5 8 9 l 3 t h ee f f e c t so fc o m p o s i t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u mo fb a c i l l u s s u b t i l i s ( n a t t o ) s 0 0 3 一d 6o nt h e ) , - p g aw - e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mc o m p o s i t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u m f o rt h em u t a n tw a sm s gw a s t el i q u i d12 0 m l l ，d e f a t t es o y b e a n5 0 e l l ，g l u c o s e3 0 9 l ， f e c l 3 6 h 2 00 4 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 l ，m n s 0 4 h 2 0o 0 2 9 l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 00 3 9 la n d p h 7 0 ，w h i c hw a sd e t e r m i n e db yt h es i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h em u t a n ts t r a i nw a sf e r m e n t e di na5 0 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g10 0 m ls u c hm e d i u m ，a t3 7 0 c ， p h 7 0 ，2 3 0 r m i nf o r6 4 h u n d e rt h ec o n d i t i o n ，t h ep r o d u c t i o no f t - p g ar e a c h e d3 5 3 2 9 l 4 t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o ns a m p l ew a sd e t e r m i n e db yh p l cc h r o m a t o g r a ma n d f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ，t h ep r o d u c tw a sah o m o p o l y m e ro fg l u t a m i ca c i d a n dt h es a m p l es t r u c t u r ew a sc o n s i s t e n tw i t ht h et a i w a ns a m p l eo f7 - p g a t h ep u r i t yo f s a m p l ei s5 4 4 a c c o r d i n gt os d s - p a g ea n dg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d ，t h e p r o d u c t sm o l e c u l a rw e ig h tw a sb e t w e e n5 8 0 k d - 6 6 9 k d k e yw o r d s ：| i , - p g aa c i d ；b a c i l l u ss u b t i l i s ( n a t t o ) ；s t r a i ns c r e e n ；c o m p o u n dm u t a t i o n ； o p t i m i z a t i o n ；m s gw a s t el i q u i d 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 发表论文 1 张姝，李楠，黄登禹，等y 聚谷氨酸高产菌株b a c i l l u sh a l l os 0 0 3 d i 6 的选育和优 化【j 】中国酿造，2 0 0 9 ，1 ：7 0 - 7 3 学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入 中国学位论文全文数掘库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博 硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 铃一章前高 第一章前言 1 1 丫一聚谷氨酸( 丫一p g a ) 简介 丫聚谷氨酸( y p o l y g l u t a m i ca c i d ，7 - p g a ) ，是一种可由微生物合成的氨基酸聚合物。 它由d 一谷氨酸和l 一谷氨酸通过 r 谷氨酰键聚合而成( 见图1 1 ) ，相对分子量一般在l o 万 1 0 0 万。_ l , - p g a 是由多种杆菌产生的一种胞外高分子聚合物，是某些微生物荚膜的主要组 分1 1 2 】。细菌合成的丫聚谷氨酸靠丫酰基结合，能被土壤细菌分泌的水解酶所分解。 ，h 。十n l o c o o h 幽1 i 微生物合成丫- 聚谷氨酸的化学结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo f $ 一p o l y ( g l u t a m i ca c i d ) b ym i c r o b i o l o g i c a lf o r m a t i o n 7 - p g a 是迄今发现的少数几个可利用微生物聚合得到的聚氨基酸之一，1 9 3 7 年 i v a n o v i c s l 3 1 等人首次发现次疽芽孢杆菌的荚膜中存在7 - p g a 。1 9 4 2 年b o v 锄i c k 【4 】等人研究 发现有些芽孢杆菌属细菌能在发酵培养基中蓄积 - p g a ，还有很多的杆菌也可以在胞外分 泌1 , - p g a 。而且 ) - p g a 也是同本传统食品纳豆中黏性物质的主要成分【5 1 。由此可见1 , - p g a 是一种在自然界存在较为广泛的天然高聚物。 i , - p g a 是一种水溶性的高分子物质，可生物降解、可食用并且对人没有毒害、对环境 没有污染。因此，1 , - p g a 及其衍生物广泛应用于食品，化妆品，医药等领域。 1 2 丫- p g a 的应用 通过微生物生物聚合尘产的y 聚谷氨酸是一种高分子量的聚合物，它的分子链上有大 量游离羧基，使其具有一般聚羧酸的性质，如强吸水、能与金属螯合等。此外，存在的大 量活性位点便于材料的功能化，如部分交联后成高吸水树脂，因此用途十分广泛。 1 2 1 食品 在食品方面，由于活细胞、生物活性物质及食品中频繁的冷冻、解冻会使这些物质遭 受不可避免的损坏。为了防止这一点，添加防冻剂被广泛应用。1 9 9 8 年m i t s u i k i 用热量测 定仪扫描丑l i c h e n i f o 删括合成的1 , - p g a ，结果表明，t - p g a 在分子量1 0 0 ，0 0 0 以下时的 第一帝前吉 防冻性能好于一些常用的防冻剂1 6 l 。同时， y - p g a 还是冷冻食品的保鲜剂。由于糖类、无 机盐、氨基酸等一些小分j ：量保鲜剂的味道很大，而 y - p g a 的味道很小，因此食品中可以 添加大量的 ) - p g a 而不影响食品的风味。另外，高矿物质食品中添加7 - p g a 可以促进小 肠对矿物质的吸收，并且掩盖高浓度矿物质所带来的不良风味1 7 l 。 7 - p g a 还可作为苦味去除剂1 8 1 ，在有苦味的食品中添加 y - p g a 可以去除食品的苦味。 在淀粉类食品中添加7 - p g a ，可以防止淀粉老化，改善淀粉的结构，保持食品的形状【9 1 。 另外，7 - p g a 还可以做冰洪淋的稳定剂，果汁饮料的增稠剂l l o l 。 】2 2 医药 7 聚谷氨酸在医药上的应用专利非常多，约占丫聚谷氨酸专利总数的5 0 。主要用于 抗肿瘤药物的载体、靶向药物的载体、外用药物的载体和药物缓释等【。 利用丫聚氨基酸作为药物的载体或介质，制成定的剂型，控制药物在人体内的释放 率，使药物按照设计的剂量，在要求的时间内按一定的速率在体内释放，以达到有效治疗 的目的。例如，红豆杉中紫杉烷类化合物紫杉醇( p a c l i t a x e l ，t x l ) ，具有抗肿瘤活性， 但水溶性差，使药用丌发受到很大限制，但t x l p g a 体系显示较高的水溶性，在体内连 续释放t x l ，以保持t x l 在细胞内的浓度。临床发现t x l p g a 体系对白血病细胞的治 疗效果优于t x l ! 。 7 聚谷氨酸用糖基修饰后的衍生物可作为肝细胞特殊药物的载体，把药物运输到肝细 胞内。动物静脉内给药试验表明药物和糖酯化的丫聚谷氨酸复合物在肝脏中有很大积聚， 起到了靶向作用1 1 2 l 。糖酯化的丫聚谷氨酸在肝脏中由酶作用能被迅速降解成内源性物质谷 氨酸，不会在体内产生积哲和毒副作用。 丫聚谷氨酸的医药用途还表现在它可作为外用药物的载体。丫聚谷氨酸与明胶有较好 的兼容性，适用制作外科及手术用的粘胶剂、止血剂及密封剂】。 1 2 3 农业 在农业方面，t - p g a 已经被用作固沙植被的新材料。据科技同报2 0 0 2 年8 月1 9f 报 道，同本九州大学农学系教授原敏夫等人，以只本的纳豆丝( 聚谷氨酸) 为原料，开发出了 种吸水性极强( 可吸自重5 0 0 0 倍的水) 的纳豆树脂，用这种树脂把植物种子包起来，在植 物不能生长的沙漠及缺水地区种植，可很快发芽，效果十分理想。同时 i , - p g a 还应用在新 型液体肥料中。在传统氮肥使用过程中，有大量的氨氮没被利用而释放到环境中引起污染， m a r k u s p a e r 等用y - p g a 产生菌b a c i l l u sl i c h e n i f o 删西a t c c 9 9 4 5 和b a c i l l u ss u b t i l i s 的培养 液作为液体肥，可在4 8 h 内把土壤氨氮从1 3 9 l 降到0 7 5 j 1 3 】。 2 箱一章前高 在肥料、杀虫剂、除啦剂、驱虫剂等使用时， 药物在作用对象表面上的停留时间，不易因干燥、 1 2 4 污水处理 d h , x , 适量的y 一聚谷氨酸盐可以延长这些 下雨而被冲刷掉。 y - p g a 是一种极具发腱潜力的新型绿色絮凝剂，是一类絮凝活性高、易生物降解、无 二次污染、对环境友好的生物絮凝剂。近来发现枯草芽孢杆菌p y 9 0 1 1 4 l ，枯草芽孢杆菌 i f 0 3 3 3 5 1 15 l 和地衣芽孢杆菌c c r c l 2 8 2 6 【1 6 1 产生的丫p g a 显示了很高的絮凝活性。因此丫p g a 作为由微生物生产的生物多聚物絮凝剂可广泛应用于废水处理领域和饮用水处理以及食 品，发酵工业的下游工艺。 姚俊等人对y - p g a 高产菌株b a c i l l u s s u b t i l i sn x 2 2 发酵制备的7 - p g a 生物絮凝剂的絮 凝条件进行了研究。研究结果表明，1 - p g a 对高岭土、活性炭等悬浮液具有较高的絮凝活 性，絮凝活性稳定，热稳定性好，且金属离子中c a 2 + 的助凝效果最好【1 7 】。 1 2 5 t - p g a 的其他用途 研究指出丫p g a i 拘羧基经酯化后可作为极好的热塑性塑料1 8 1 。 而丫p g a 和a 苯甲酯能 形成纤维和膜，具有极好的强度、透明度和弹性。此夕b p g a 还能增加细胞内和细胞p i , c a 2 + 的可溶性，及肠内c a 2 + 的吸收，因而可作为一种治疗骨质疏松症的重要载体。 1 - p g a 还可作为多种环境下的适应剂，例如在碱性环境下细胞表面附近的p h 中和作 用，以及在极端高盐环境一f 能防止嗜盐菌的剧烈脱水。由于它是一种7 多聚体，因而也可 保护细胞发生蛋白酶水解反应。此外，由于p g a 有许多羧基，也适合作为一种低温防护材 料【1 9 1 。 由此可见t - p g a 作为一种有着极为广泛研究价值和应用价值的生物合成多聚体，它必 将产生很高的经济效益和社会效益，这还不包括7 - p g a 本身作为细胞结构的组成成分的重 要性，因为它与叶酸结合后，还作为微管蛋白结构的附器存在，这对于我们详细地研究细 胞内微管蛋白组织结构也有着一定的意义。 1 3 y - p g a 的生产方法 1 3 1 化学合成法 1 3 1 1 传统的肽合成法 传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这个过程一般包括基团保护、反应物 活化、偶联和脱保护等，合成的a p g a 的分子量一般小于9 0 0 0 ，显著小于生物合成的丫p g a 的分子量。谷氨酸聚合为不成环聚合，合成步骤较多，路线复杂、副产物多、收率低、合 成过程中需要光气等有毒性气体，使得该法的应用受到很大的限制【2 0 l 。 筘一帝前高 1 3 1 2 二聚体缩聚法 由l g l u 、d g l u 及消诞体( d ，l g l u ) 反应生成a 一甲基谷氨酸，后者聚合成谷氨酸二聚 体后，再与浓缩剂1 ，3 二耳j 氨丙基3 乙基碳亚二胺舱酸盐及1 一羟苯基三吡咯水合物在n , n - - 甲基甲酰胺中发生聚合，获得产率为4 4 9 1 、相对分子量为5 0 0 0 2 0 0 0 0 的聚谷氨酸甲基酯， 经碱性水解变成y p g a 。化学合成法合成丫p g a 需要的技术更先进、成本更高、难度很大， 没有工业应用价值，但对f 了解丫p g a i 拘结构与功能的关系，分析丫p g a 合成酶的反应机 制以及发展y p g a 实际应川的修饰技术等都十分可贵【2 l 】。 1 3 2 提取法 早期，同本生产y p g a 大多采用提取法，用乙醇将纳豆( 一种同本的传统食品) 中的 丫p g a 分离提取出来。由于纳豆中所含的y p g a 浓度甚微，且生产上波动很大，因此提取 工艺复杂，生产成本甚高，同样难以大规模生产 1 9 1 。 1 3 3 微生物的生物合成法 自从1 9 4 2 年b o v a m i c k 等发现芽抱杆菌属微生物能在培养基中积累丫p g a 以来，利用微 生物生物聚合生成y p g a t t ；j 研究十分活跃。同化学合成法及提取法相比，微生物发酵法生 产聚谷氨酸具有尘产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、便于大规模生产等显著优 点，已逐步成为目前研究和生产聚谷氨酸的主要方法和途径。 1 4 7 - p g a f l 勺产生菌及诱变育种 1 4 1 7 - p g a 的产生菌 根据培养基中是否需提供谷氨酸，将1 , - p g a 产生菌分为两类：( i ) 需要l 一谷氨酸合成 1 , - p g a ，如最s u b t i l 如i f 0 3 3 3 5 1 2 2 1 ， 最s u b g 西f - 2 0 1 t 2 3 l ，且i i c h e n i f o r m i s9 9 4 5 a t 2 4 】等，这类 菌通常能合成较多量的7 - p g a ；( i i ) 不需要l 一谷氨酸合成1 , - p g a ，如丑l i c h e n i f o r m i s a 3 5 2 5 1 和最s u b i l i st a m 4 2 6 1 等。表1 1 列出了研究较多的几种产y p g a 微生物的基本情况。 4 第一帝前a - 表1 i 儿种土要的1 ，聚谷氮酸产生凶 t a b l el 一1 丫- p g ap r o d u c i n gb a c t e r i a a 分子髦取决丁培养条f ， 在这斯p g a 生产菌种中研究比较集中的是地衣杆菌( 最l i c h e n i f o r m i s ) 和枯草芽孢杆菌 ( 丑s u b t i l i s ) 。大量研究工作对这两类菌体生长所需的营养物质，菌体生长和产物合成的培 养条件进行了研究。 1 4 2 诱变育种 和其它微生物活性物质高产菌株的选育类似，为了提高y p g a 产量，首先对较高产量 的出发菌株采用物化方法进行诱变。国内研究者进行高产菌种筛选和诱变育种，均取得良 好效果。1 - p g a 的诱变育种可采用传统的物理、化学的诱变手段，例如紫外线照射、亚硝 基胍诱变等。杨革等提到应m i l e n e 激光对b 1 i c h e n i f o r m i sa t c c 9 9 4 5 a 进行辐射处理， 初步筛选到产丫p g a 含量有较大变化的辐射变异菌株b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sw b l 3 ；徐艳萍 等1 3 1 】采用亚硝基胍和6 0 c o 诱变获得高产菌株b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sc 9 其丫一p 6 a 能j 产量由 9 4 4 9 l 提高到1 9 7 6 9 l ，提高了1 0 9 ，而且传代稳定，通过培养条件的优化- p g a 产量达 至t 2 3 3 2 9 l ，比优化前提高了1 8 ；马晓娜等1 3 2 】从超高压灭菌的哈密瓜汁中筛选得到高产 茵b a c i l l u ss p b 5 3 ，在优化发酵条件下，b a c i l l u ss p b 5 3 合成丫p g a 可达1 9 1 2 9 l ；桑莉等 p 习从土壤中筛选得到l 株依赖谷氨酸为发酵底物的高产菌株b a c i l l u ss u b t i l i sp g a n 1 2 ，在谷 氨酸钠浓度y 口7 0 9 l 时，1 , - p g a 取得最大产量1 8 3 2 9 l ；陈咏竹【3 4 】p a b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 5 籀一章前- a a t c c 9 9 4 5 a 为出发菌株，采用多组复合诱变株混合发酵选育技术及用紫外线( u v ) - 亚硝基 胍( n t g ) 复合诱变进行y - p g a 生产菌的诱变育种，选育到高产菌功5 0 ，7 - p g a 最终产量为 2 3 6 6 2 9 l 。 另外由m a d l a 等1 3 5 l a l i p r a s e r t s a n 等3 6 1 ，从温泉中筛选到耐高温发酵株b a c i l l u s t h p 朋d ，o l e r a n tw d 9 0 f t i 和k f 4 1 一三株菌，7 - p g a 发酵产量最高达5 4 4 5 9 l - - 5 8 0 8 9 l 。这些经筛选 诱变得到的高产7 p g a 菌株有望用于生产。 1 5 微生物合成丫一p g 人的生物合成途径及其代谢调控 1 5 1 , - p g a 的生物合成途径 自从1 9 3 7 年i v a n o v i c - 3 1 等人发现炭疽芽孢杆菌的细胞央膜中含有丫，p g a 以来，众多学者 相继丌展了对丫p g a 的研究，由于产物中存在两种构型谷氨酸单体，故存在d 一谷氨酸如何合 成的问题，所以至今了p g a 的代谢途径仍然是推测途径。但因不同的丫p g a 产生菌表现出 对谷氨酸不同的营养需求，可以知道不同的y p g a 产生菌应该存在不同的生物合成途径。 大量的实验证实，7 - p g a f ( j 生物合成与j 下常蛋白质的生物合成不同，其合成不需要r n a 模 板，属非依赖核糖体的肽合成。但跟非核糖体合成的其他肽类相比，y - p g a 又有其非同寻 常的特点：分子量大且含仃两种不同的对映体。1 - p g a 的合成中首先要搞清d 一谷氨酸的供 应问题，其次要探明聚合酶( 系) 的存在。 k u n i o k a l 37 1 研究b s u b t i l i s ( n a t t o ) i f 0 3 3 3 5 ，推测y p g a 主要是由a 一酮戊二酸和氨合成， 前者由柠檬酸通过三羧酸循环形成，如图l 一2 所示。外源谷氨酸作为该菌株y p g a 日；j 体和 或y p g a 合成的活化剂，而不是合成y p g a 的直接前体。y - p g a 的主要成分是d 一氨基酸 ( 8 3 ) ，从l - 至i j d - 谷氨酸的转化有两条不同的途径：由谷氨酸消旋酶参与的直接途径和d 一 氨基酸转氨酶参与的间接途径，k u n i o k a 及其合作者认为丙氨酸消旋酶偶合的d 一氨基酸转 氨酶机制在丑s u b t i l i s 向a t t i f 0 3 3 3 5 合成y p g a 过程中对d 一谷氨酸供应至关重要。 6 鹅一章前高 幽1 - 2b s u b t i l i s l f 0 3 3 3 5d ? 7 - p g a 的合成途径 f i g 1 2p m h w a yo f $ - p o l y ( g l u t a m i ca c i d ) s y n t h e s i si nb s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 1 谷氮酰胺：2 氧化谷氦酸( “一酮戊二酸) 转氦酶；2 谷氨酸合酶；3 l 一氮基酸转氨酶； 4 丙氨酸消旋酶：5 d 氨基酸转氩酶：6 聚谷氨酸合酶t c a ：二羧酸循环 a n n e m a r i ec r o m w i c k l 3 8 】等人通过用1 3 c 标记的柠檬酸和谷氨酸作为培养基碳源，对y 聚谷氨酸的生物合成进行了研究，表明地衣芽孢杆菌在谷氨酸培养基中，如果不另加碳源， 将产生很少的丫聚谷氨酸，添加带有标记的柠檬酸后，产生大量的带有b c 标记的丫聚谷 氨酸。说明组成 r 聚谷氨酸的单位谷氨酸主要由柠檬酸和硫酸铵产生。因此，在添加柠檬 酸的培养基中，胞内的谷氨酸是通过由柠檬酸在t c a 循环产生的异柠檬酸、a 酮戊二酸来 合成的。所以随着谷氨酸的浓度在细胞内增高，大量的y 聚谷氨酸也就被合成。另外在培 养基中添加t c a 循环的i | 】间产物节果酸、琥珀酸或者延胡索酸，由于糖原异生作用，这 些碳源将尘成大量的多糖。 k a m b o u r o v a t 3 9 】测试了氮源和碳源对b 1 i c h e n i f o r m i ss 1 7 3 生成1 , - p g a 的影响，认为无 机铵盐对1 , - p g a 的合成产量较有机铵盐高。在所研究的碳源中，柠檬酸对1 - p g a 生成最 有利，易于由t c a 循环代谢转化为a 一酮戊二酸。由于无机铵盐对于1 - p g a 合成很有效， 作为1 - p g a 前体的l 一谷氨酸更可能是由仅一酮戊二酸和氨合成。l 谷氨酰胺和l 一精氨酸 分别通过l 一谷氨酰胺合成酶偶合的l 一谷氨酸合酶途径和精氨酸异化途径转化为l 一谷氨 酸。l 一天冬氨酸转氨酶将l _ 天冬氨酸和仅一酮戊二酸分别转化为草酰乙酸和l 一谷氨酸。 1 5 2 1 - p g a 生物合成的相关酶及基因 7 第一章前吉 天然存在的1 ，p g a 的：i i 要成分通常是d 一谷氨酸，到目前为止已经鉴定了两种d 一谷氨酸 合成酶。在b s u b t i l i sa t c c 9 9 4 5 a 中丙氨酸消旋体偶联的d 一氨基酸转氨酶( d a t ) 途径参与了 丫d p g a 、y - l p g a 、y d l p g a 的合成。d 一谷氨酸( 丫一p g a 前体) 和丙酮酸是d a t 催化a 一酮 戊二酸和d 一丙氨酸生成的1 4 0 】。虽然认为在芽孢杆菌属中d a t 催化生成d 一氨基酸，但是没 有在枯草芽孢杆菌( n a t t o ) l f 0 3 3 3 6 的细胞裂解液中检测到活性。另一方面在这株菌中又发现 了高活性谷氨酸消旋酶1 4 1 】。d a t 和谷氨酸消旋酶在枯草芽孢杆菌陋h u n g k o o 枷删细胞中共 存于对数生长期1 4 m 。在枯江芽孢杆菌( 至少是谷氨酸依赖性的生产菌) 中，提供y p g a 合成的 d 一谷氨酸的主要酶是g l rj 型谷氨酸消旋酶。研究y p g a 的合成发现p g a 的产生可能是由 一对复合酶系统完成的1 1 9 j 。o g a w a - 等t 2 9 】报道过一种转谷氨酸酶，它与b a c i l l u ss u b t i l l i sn r 2 1 产p g a 有关。但是g a r d n e r 等也曾报道过转谷氨酸酶与b 1 i c h e n i f o 朋话产生p g a 无关。他 们发现与膜结合的p g a 合成酶复合体能催化l 一谷氨酸聚合形成p g a l 4 0 】。k u n i o k a t 3 7 1 研究了 枯草芽孢杆菌i f 0 3 3 3 5 合成p g a 的过程后，认为由2 氧化谷氨酸形成l 一谷氨酸的途径是利 用谷氨酰胺合成酶( g s ) 和2 。氧化谷氨酸转氨酶( g g a t ) 来完成的。但丫p g a 的合成机制至今 尚未弄清，因此，在众多文献中仍存在着许多争议，也可能说明不同的菌株形成1 ，p g a 的 酶系统不同。 为了弄清楚7 - p g a 的代谢合成途径，对y - p g a 合成的相关基因的研究正在兴起。 a s h i u c h i 等用遗传方法，得到一个克隆编码b s u b t i l i s ( n a t t o ) i f 0 3 3 3 6 的1 - p g a 合成酶复合 体的基因簇通过筛选合成y - p g a 的大肠埃希氏菌。该大肠埃希氏菌克隆携带三个基因，命 名为：p g s b 、p g s c 、p g s a 。证明了在大肠埃希氏菌克隆中所有p g s b 、p g s c 、p g s a 三个基 因都是7 - p g a 合成必不i j 少的【4 3 1 。 2 0 0 2 年u m s h i b a t a 等1 4 4 l 将克隆到的c a p b c a 基因在e c o l i 中表达，发现其产物为四种不同 的蛋白质，当时称其为c a p b 、c a p b + 、c a p c 、c a p a ，呈膜结合蛋白形式存在。同时确定c a p b 基因可编码两种蛋白，为霞叠基因。 1 5 3 7 - p g a 的立体构型 研究表明b a n t h r a c i s 合成的p g a 仅由d 一谷氨酸构成。由纳豆枯草芽孢杆菌【2 9 】产生 的p g a 则含有大量的d ，l 一谷氨基酸，d 一型占5 0 - 8 0 而l 一型占2 0 - 5 0 。而口 1 i c h e n i f o r m i s l 2 7 1 则产生了多种立体化学结构的p g a ，d 一型同分异构体的比例从1 0 1 0 0 不等。为了得到不同分子量的7 - p g a 用于不同用途中，a s h i u c h i 等【4 2 1 研究了产y - p g a 的b s u b t i l i s ( c h u n g k o o k j a n g ) 菌株可以在含有l _ 谷氨酸的高盐度培养基中生长，利用培养 基中n a c i 的不同浓度来控制，- p g a 的分子大小以及培养基的粘度。当n a c l 浓度较低时 8 第一章前吉 ( 1 0 0 0 0 0 0 ) ，而在n a c i 浓度较高( 1 0 ) ，优先合 成分予量相对低的y - p g a 1 0 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 0 ) 。 以往的文献报道中还存在着一个争议1 4 0 1 ，即m n 2 + 的浓度变化是否能调整b 1 i c h e n i f o r m i s9 9 4 5 a 所形成的y - p g a 的立体化学结构，因为它可能控制着专一性很强的 d 一和l 一多肽合成酶系统。经研究表明随着m n 2 + 离子浓度的增加，d 一谷氨酸含量不断增加。 但另一方面，掘报道b s u b t i l i s5 e 产的 r - p g a 的立体化学结构却不会随着培养基中m n 2 + 浓度和其他组分的变化而变化。 吴群，徐虹等探讨了在b a c i l l u ss u b t i l 括n x 一2 发酵生产7 - p g a 过程中，m n 2 + 对丫p g a 结构中d 一和l 一谷氨酸组成的影响及其与催化l 一谷氨酸生成d 一谷氨酸的两个相关酶一谷 氨酸消旋酶和d 一氨基酸转氨酶之间的关系。当m n 2 + 浓度由0 增加到o 0 9g l 时，d 一谷氨 酸比例从1 8 增加到7 7 ：谷氨酸消旋酶活性从0 2 0 0 u m g 变为0 4 4 1 u m g ，提高了1 倍 多，d 一氨基酸转氨酶活性则几乎没有变化。说明谷氨酸消旋酶参与了l - 到d 一谷氨酸的转 化过程，且m n 2 + 是通过改变谷氨酸消旋酶的活性来调节产物7 - p g a 的立体组成的。 1 6 1 , - p g a 发酵生产的主要影响因素 19 4 2 年，b o v a m i c k l 4 j 最初研究了丑s u b t i l i sa t c c9 9 4 5 a 合成1 - p g a 。但是直到l9 5 4 年t h o m e l 2 4 1 等人才系统全面的研究了影响菌体生长、y - p g a 产量提高的因素。研究人员发 现随着菌种的不同，所需的营养条件也在不断的变化。除了碳源、氮源外，其它的像离子、 培养基中的p h 、通风等都可以影响丑l i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 合成y - p g a 。 1 6 1 碳源、氮源对y - p g a 发酵生产的影响 作为微生物生长所必需的物质，碳源一方面为微生物的生长提供能量，另一方面可以 同化为微生物自身的组成成分。而氮源对微生物的生长和目标产物的积累有重要的影响， 因此，合适的碳源、氮源对于1 , - p g a 的发酵生产具有重要的作用。 徐虹等从土壤中筛选出一株y p g a 高产菌株b a c i l l u ss u b t i l i sn x 一2 。葡萄糖、蔗糖、 麦芽糖、淀粉和甘油是b a c i l l u ss u b t i l 括n x - 2 适合的碳源。b a c i l l u ss u b t i l i sn x - 2 不能吸收柠 檬酸，当使用柠檬酸作为碳源时，不能合成丫p g a 。内生谷氨酸和外加碳源对其合成丫p g a 是非常重要的。y - p g a 的产量随着谷氨酸在培养基中浓度的增加而增加。当培养基中谷氨 酸浓度达至j 7 0 9 l 时，7 - p g a 的产量达到最高，为4 1 9 l ，但此时谷氨酸的表观转化率仅为 5 8 。当谷氨酸的添加量为3 0 9 l ，发酵时间为2 4 h 时，y - p g a 的产量达到3 0 2 r d l ，此时的 表观转化率达到10 1 。由此推测，b a c i l l u ss u b t i l i sn x - 2 合成丫p g a 的前体不仅来自外源谷 氨酸，而且来自蔗糖通过内循环所合成的谷氨酸。 9 第一币前高 采用枯草芽孢杆菌b ( ，c i h u ss u b t i l i sm r _ 1 4 1 和b a c i l l u ss u b t i l i st a m 一4 1 4 6 】发酵生产 7 - p g a 时，葡萄糖是最佳碳源。对于枯草芽孢杆菌而言，大多以柠檬酸和葡萄糖作为最适 宜的碳源。 k u t o b a 等【2 3 】对b a c i l l u ss u b t i l i sf 2 0 1 发酵生产 r p g a 进行了研究，分别以n h 4 c i 、蛋白胨、 尿素作为氮源，3 7o c 条件f 培养6 天，调节p h i l , 定在7 0 。研究结果表明，蛋白胨是b a c i l l u s s u b t i l i sf 2 0 1 合成y p g a 的最佳氮源。 o g a w a 等 2 9 1 进行了枯草芽孢杆菌大规模的不发泡的稳定发酵生产，以麦芽糖、大豆浆、 谷氨酸钠、k 2 h p 0 4 、m g s 0 4 7 h 2 0 为培养基，添加3 的