（遗传学专业论文）转基因番茄作为生物反应器的初步探索.pdf

摘要 很多“小分子药物”是来自于植物的自然产物，或者是在植物来源分子经过合成加 工之后形成的，几千年以来，人们一直以这种方式利用植物来预防和治疗疾病。然而， 大量的药用蛋白是从动物或人中获得的，并在微生物或动物生物反应器中进行商业化生 产。但就在最近十几年来，植物基因组被改造来生产重组蛋白。相较于其他生物反应器 系统，植物可以以农业规模生产重组蛋白，而且可以排除产品被内毒素或以人病原体污 染的危险；另一个优点是生产疫苗类重组蛋白时，可以不加工或部分加工后被采用。植 物生物反应器为重组蛋自的生产提供了广阔的前景。 人类酸性成纤维细胞生长因子( a f g f ，f g f 一1 ) 是成纤维细胞生长因子超家族成员。 来自于三个胚层的多种细胞都可以表达a f g f 。a f g f 在治疗帕金森综合症、急性脊柱扭 曲性损伤、断指中神经功能重建、脑缺血、肾缺血、心肌梗塞、闭塞性脉管炎、视网膜 缺血、胃溃疡及难愈合性伤口等多种临床应用方面具有巨大潜力。 为了满足对a f g f 这种价格昂贵的细胞因子的需求，结合植物生物反应器的优点，本 实验就转基因番茄表达a f g f 进行了探索。我们构建的双元表达载体带有一个经过改构 的人类酸性成纤维细胞生长因子基因( a f g f ) ，载体上的选择标记基因为胱泐 ，它使得 转化过程中可以使用p m i 这种不合抗生素及除草剂的选择系统。我们利用农杆菌介导的 转化方法获得了a f g f 转基因番茄植物，并且通过s o u t h e r n 杂交、r t p c r 证明了a f g f 在宿主基因组中的整合及表达。 关键词：植物生物反应器人类酸性成纤维生长因子转基因番茄 a b s t r a c t m a n yo fo u r s m a l h n o l e c u l e d r u g s a r en a t l 】r a lp r o d u c t s 矗o mp l a n t s ，o ra r es y n t h e t i c c o m p o u n d sb a s e d0 nm o l e c u l e sf o u l l dn 删1 y mp l a i l 招p l a n t sl l 【v eb e e nl l s e dr ) rt h o l l s a n d s o fy e a r st op r e v e n ta n dc l l r ed i s e a s e si n t h i sw a y s of 打也ev a s tm 旬o r i 哆o fm ep r o t c m t h e m p e u t i c s ( o rb i o p h a m l a c e u 廿c a l s ) w eu s ea r ef b m 枷m a lo rh 砌a l ls o u r c e s ，a n da r e p r o d u c e dc o n n e r c i a j l yi nm i c r o b i a lo rm a m m a l i a nb i o r e a c t o rs y s t e m s h o 、e v e r ，o i l l yi n 也e 1 a s t1 5y e a r sh a s 啦ep l 吼tg e n o m eb e e nm a n i p u l a t c df b rm e p u r p o s eo f p r o d u c i n gt h e r 印e m i c m o l e c l l l e s c 伽叩a r e dt oo t h e rb i o r e a c t o rs y s t e m s ，p l a n t sa l l o wm ec o g t - e f f e c 垃v ep r o d u c t i o n o fr e c o m b i n 肌tp r o t e i n so n a na g r i c u l t 啪l s c a l e ，w h i l ee l i m i n a t i n gr i s k so fp m d u c t c o i l t a m i n a t i o n 谢t l le n d o t o x i n so rh u m a np a 也o g e n s a n o t h e ra d v a n t a g eo f 也eu s e o f p l a n t si n r e c o m b i n a n tp r o t e i np r o d 枷o ni st h a 土v a c c i n ec a n d i d a t e sc a nb ee x p r e s s e di ne d i b l ep 1 锄t o r g a n s ，a l l o w m g 也e mt ob c 删i s t e r e da su r l p r o c e s s e do rp a r t i a l l yp r o c e s s e dm a t 甜a l s a sam e m b e ro f t l l es u p e r f h m i l y ，b 砌锄a c i d i c 劢r o b l a s tg m w m f h c t o r ( a f g fo rf g f l ) ， e x p r e s s e db yav a r i e t yo fc d l sf 如ma 1 1 也r e eg e r n ll a y e r s ，s h o 、v sag r e a tp o t e n t i a lf o rc l i n i c a l t h e r a p yo fav 耐e t yo fd i s e a s e s ，s u c ha sp a r k 试s o n sd i s e a s e ，s p i n a lc o r dc 加s i o n 蜥i 姒 n e u r a lr e g e n 训o ni nr e h p l 趾t a t i o no fb r o k e n o 丘f m g e r ，b m i ni s c h e m i a ，r e n a li s c h e m i a ， m y o c a r d i a li i l f 缸c t i o 玛o c c l l l s i v ev a s c u l a r i t i s ，r e t i l l a li s c h e i n i a ，g a s t d cu l c e r 卸dn o n h e a l i n g w o u n da n ds oo n t bm e e tt h e 抽c r e a s i n gd e m a n do fm i se x p e n s i v ec y t o k i n ea 1 1 dp l a n tb i o r e a c t o rh a ss o m a n ya d v a n t a g e s ，w ee x p l o r e dt h ee x p r e s s i o no fa f g fi n 仃 m s g e n i ct o m a t o w ec o ns c ：m c t e da b i n a r yv e c t o rc a r r y i n gam o d i n e dh u m a na ：f g fg e n ea n dam a n ag e n et h a ta l l o w e dt h eu s eo f p m is e l e c t i o ns y s t e m ，a i la 1 1 t i b i o t i ca n dh e r b i c i d e 一舶es y s t e m ，d u r i n g 血et r a n s f 0 咖a t i o n p r o c e s s w ep m d u c e dm et m s g e n i ct o m a t op l a n t sb ya 1 1a g r o b a c t e r i 岫t u m e f 如i e n m e d i a t e d m e t l l o d s o u t h e mh y b r i d i z a t i o na i l d 王m p c rr e v e a i e d 也ei n t e 掣a t i o no fa f g fg e n ei np l a m g e n o m ea n d 沁s u c c e s s 矗l l 仃a n s c r i p t i o ni nt r a n s g e l l i cp 1 锄tc e l l s ， k e yw o r d s ：p l a n tb i o r e a c t o r ；h l l m a na f g f ；仃 m s g e l l i ct o m a t o 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：越垫药日期：曼竺! ：! ! ：! i 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：莲黜指导教师签名：丝差堑 日 期：盛：2 亟：! 日期：鱼i 垒塑哩 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 电话 邮编 1 引言 动物作为最早的生物反应器生产重组蛋白质“3 ，曾获数十亿美元产值，目前仍足生 产重组蛋白质的主要生产系统，其表达的重组蛋白质在防治传染病中起着重耍作用。但 为了生产更加安全、有效、廉价、易于推广应用的蛋白质，生物学家们努力寻找新的表 达系统。采用植物作为生产重组蛋白质的生物反应器就是一个新兴的研究领域。自从 1 9 8 3 年f r a l e y 等“1 首次报道将细菌基因导入植物细胞获得成功表达以来，植物转基因 技术发展迅速。b a r t a 和他的同事。1 于1 9 8 6 年首次在植物中表达了人类基因。第一个植 物来源的药用蛋白人血清白蛋白于1 9 9 0 年在转基因烟草和马铃薯中被表达。迄今己有 多种来自细菌、病毒及哺乳类动物的肽或蛋白质分子分别在烟草、豆类、马铃薯、番茄、 香蕉及莴苣等农作物中成功表达“。近十年来，越来越多的研究成果表明：利用转植 物作为生物反应器，规模化生产高附加值的重组蛋白质，具有广阔的应用前景。 1 1 植物生物反应器 1 1 1 植物生物反应器的特点 植物生物反应器，就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官，以及整株植物 为工厂来生产具有商业价值的生物制品包括疫苗、抗体、药用蛋白等。广义上讲，不仅 仅指经基因工程改造的植物细胞、组织器官以及整株植物，也包括天然的植物，例如些 天然植物的次生代谢产物也具有重要的药用价值。7 “。 l 、准确表达、正确组装重组蛋白质 转基因植物细胞能够相对忠实地转录、翻译及组装外源性重组蛋白质。它不仅能够 表达和组装低分子量( 小于0 6 k d ) 、结构简单的单链肽或肽片段，如单链抗体“，还 能表达和组装大分子量( 大于8 0 k d ) “4 、结构复杂的多聚体蛋白质0 4 ，如人体乳铁蛋白 ( h u m a n1 a c t o f e r r i n ，h l f ) “。有文献报道，采用转基因植物技术已实现完整结构的重 组抗体分子的表达和组装“”，如m a 等“在烟草中有效地装配了有功能的分泌型免疫球 蛋白，这充分说明了植物细胞对外源蛋白的加工能力。相比之下，细菌等微生物对外源 蛋白的表达和组装能力较低。即使用表达能力较强的大肠杆菌，欲表达双链结构的重组 抗体分子，也必须借助于十分复杂的基因，亡程技术才能完成。尚未有重组多聚体蛋白质 在细菌表达系统成功表达的报道。 2 、稳定、大量地生产重组蛋白 植物是一个能进行大规模生产的廉价生产系统，在获得稳定遗传的转基因植株后， 扩大耕种面积就能提高重组蛋白质的产量。它的上游生产成本较低，田问栽培不需特殊 培养基或设备。而那些能直接食用的植物疫苗不需特殊贮存条件“。3 “”3 ，还可省去下游 培养基或设备。而那些能直接食用的植物疫苗不需特殊贮存条件“。3 “”3 ，还可省去下游 1 的加工开支。 3 、安全性 植物不是肝炎、艾滋病病毒等许多人类和动物致病性病原体的天然宿主，这就避免 了这些病原的传播。且转基因植物生产重组蛋白质原料工艺简单、田间栽培、不需添加 特殊试剂。另一方面，转基因植物不存在类似转基因动物的一些伦理学问题。 1 1 2 几种常用的生产重组蛋白质的植物表达系统 目前植物表达系统主要有两大类：稳定表达系统和瞬时表达系统。 1 、稳定表达系统 所谓稳定表达系统就是编码蛋白的外源基因整合到基因组。通过不同的转基因方法 可以把基因整合到细胞核”和质体。1 “基因组中，植物细胞在一定条件下就可以稳定表 达外源蛋白，并把这种性状遗传给予代，形成表达外源蛋白的植物品系。常用的植物转 化技术有适用于双子叶植物的农杆菌介导法和适用于单子叶植物的基i 园枪法。植物转化 是植物生物技术的瓶颈问题同时也影响分子农业作物品种的选择。这种表达系统比较耗 时，从开始转化到得到可以用于检测蛋白功能和特性的转基因植株需要3 9 个月，植 物品种不同耗时不同。不同品种作物生产外源蛋白所需的费用和能提供价值等方面都是 不同的，各方面均衡考虑从中选出分子农业的最经济作物( 表1 ) 。 通过构建含有特异性表达启动子的植物表达载体，可以使外源基因在植物的特定 组织或器官中稳定表达，如以籽粒和块茎等天然蛋白贮藏器官作为生物反应器，其特 点是耐贮藏。ve r w o e r d 等。”将植酸酶基因转入油菜，植酸酶表达可以稳定遗传下去， 第1 5 代的种子仍含有最初的植酸酶表达水平。外源基因在转基因植物中具有较好的稳 定性。ar t s a e n k o 等。”将s c f v 抗体基因转入马铃薯，转基因块茎在4 贮存一年半后， s c f v 活性仍能达到收获时的一半。 2 、瞬时表达系统 这种瞬时表达系统可用于检测构建的用于稳定表达的表达载体中基因的表达情况， 也可作为生产蛋白的一种方法。一种有效的方法是农杆菌浸染法即含重组质粒的农杆菌 进入植物组织中o 。t d n a 被转运到大量植物细胞的细胞核中，几天之内可以产生毫克 级的重组蛋白o 。 另一种比较吸引人的方法是利用病毒载体的瞬时表达系统，利用植物病毒为载体将 编码重组蛋白的基因插入植物病毒基因组中，再用此重组病毒感染植物，重组蛋白随 病毒在植物体内复制、装配而高效表达”7 。既然植物病毒不能整合到基因组中，那么 就没有稳定的转化和目的基因传递到下一代。然而，病毒增殖速度快，在接种后卜2 周 以内就可达到最大量的积累，表达快速灵活不受位置效应的影响，可在不同发育阶段 诱导异源基因的表达，避免对正发育植物造成负面影响。同时，瞬时表达系统易于检测 外源蛋白的结构和表达，能及时发现和解决问题。利用烟草花叶病毒( t m v ) 、豇豆花叶 病毒( c p m v ) 、花椰菜花叶病毒( c a m v ) 、李痘病毒( p p v ) 已构建了多种表达载体 。7 。”。3 “3 1 。”“。用植物病毒作载体生产重组蛋白，为生物技术开辟了新的领域，极有希望 成为有重要价值蛋白的主要来源和生产方法。 表1 用于分子农业的几种主要农作物的比较 1 2 人类成纤维生长因子 1 2 1 成纤维生长因子的结构及活性 成纤维细胞生长因子超家族是广泛存在于从线虫到人类中的一类短肽类生长 因子。在脊椎动物中，目前已发现了2 3 个这一家族的成员( 对于人类为f g f 卜1 4 及f g f l 6 2 3 ) ，它们的分子质量从7 到3 8 k d a 不等。其长度从6 个氨基酸到2 8 8 个 氨基酸( f g f 一2 ) 不等。大多数的成纤维细胞生长因子的中心结构区都是相似的，这 一中心区含有2 8 个高度保守的氨基酸残基，其中的6 个氨基酸残基完全相同吼1 。 中心区中l o 个高度保守的氨基酸残基在与f g f 受体的相互作用中起重要作用口。 f g f 的中心保守区形成1 2 个反向平行的8 折叠，这一结构在f g f 功能方面有重要 意义，f g f 分子对肝素及硫酸肝素有很高的亲合力。这一特性在f g f 生物学功能的实 现有关m ，州。 多数的f g f ( f g f 3 8 ，1 2 ，1 5 ，1 7 1 9 ，2 卜2 3 ) 在肽链的n 端都具有信号肽序列，它们在 合成后被分泌到细胞外。f g f 9 ，1 6 及2 0 没有典型的n 端信号肽序列，但仍可被分泌到 细胞外。”。f g f l 与f g f 2 也没有信号肽序列，与f g f 9 不同，它们不能通过内质网一高尔 基体途径分泌到细胞外，但可通过其它途径被运到细胞外，如在热激情况下通过分子伴 侣的帮助或从损伤的细胞中直接释放口“。第三类f g f 分子( f g f l l 一1 4 ) 不含信号肽序列， 它们可能不被分泌到细胞外，而是保留在细胞内发挥其功能n “4 “。 f g f s 主要是通过与跨膜的f g f 受体( f g f r ) 相互作用而发挥其生物学功能。f g f r 属 免疫球蛋白受体超家族成员，为膜结合的受体蛋白激酶。在肝素及其它胞外基质的辅助 下，f g f s 与特异受体结合，引发细胞内一系列蛋白质的磷酸化，调节特异基因的表达。 f g f 能促进内皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、黑色素细胞、以及其它多种细胞的增殖， 它们还具有促进脂肪细胞的分化，引发巨噬细胞及成纤维细胞产生i l 一6 ，促进星形胶质 细胞迁移，延长神经元存活寿命的作用。f g f s 在多细胞生物的发育、内稳态的维持、创 伤修复、血管生成以及肿瘤的形成过程中都起重要的作用“”。 1 2 2 成纤维生长因子的临床应用前景 1 、神经系统疾病 ( 1 ) 神经元损伤：a f g f 是神经营养因子，在多种疾病中都表现出神经保护作用， 修复损伤的神经元。 i 癫痫发作：能引起脑部分神经元损伤，系统给予患鼠a f g f ，可防止海马中神经 元的退化，减轻了癫痫发作所致的脑损伤h “。 i i 运动神经元损伤：将新生大鼠的正中神经及尺骨神经、面神经及运动神经元分 别轴切后，局部给予a f g f 能使运动神经元的成活率大大提高，分别达到6 3 和7 0 ，因 而有可能用于治疗临床上体内运动神经元损伤，如重建断指再植后运动神经的功能“。 i i i 神经元化学损伤：在神经毒素诱导多巴胺神经元化学损伤的捺模型中，发现 纹状体中a f g f 和b f g f 的m r n a 表达水平明显增高，当神经末梢再生后又恢复正常，提 示其在神经再生过程中的促进作用”“。 ( 2 ) p a r k i n s o n 氏帮目： a f g f 不仅是神经营养因子，还能调节其他神经递质的生成，如儿茶酚胺( c a ) 。实 验表明无论是在表达还是不表达c a 合成酶_ t h ( 酪氨酸短化酶) 的神经元中，a f g f 与共激活因子( t p a 等) 协同作用都能诱导表达t h ，上调c a 的合成。将a f g f 及其激活 物质注入多巴胺神经元损伤鼠的纹状体，能使纹状体中t h 的活性及多巴胺水平明显增 高，鼠运动失调得到纠正，并且这种作用呈剂量依赖性。而在正常鼠脑中注入这些物质 却不能引起多巴胺生化指标的改变，因此，a f g f 对损伤的黑质纹状体多巴胺神经系统具 有神经化学效应，将来可以作为药物治疗多巴胺失衡的某些神经系统疾病，如p a r k i n s o n 氏病3 。 2 、疼痛： a f g f 还与疼痛行为有关，鼠腹腔内注射a f g f 能诱导短暂的止痛效应，并且其止痛 作用需要a f g f 通过血脑屏障，并与诱导一氧化氮的生成有关口“。 3 、缺血性疾病 a f g f 的促血管形成作用及其多种生物学活性使其极有可能成为治疗缺血性疾病的 新药物。给药方式很多，通过皮下注射a f g f 与肝素能达到较好疗效。 ( 1 ) 脑缺血：在蛛网膜下腔出血后常有基底动脉痉挛，系统给予a f g f 则能起到解 痉作用，缓解缺血。短暂结扎沙鼠颈动脉并再灌注，能导致鼠脑中锥体神经元的坏死， 但若在缺血前后持续脑室内注射a f g f ，则能显著减少缺血神经元的坏死。由于应用脑室 内注射的局限性，最近改用脑缺血再灌注后静脉注射a f g f 的方法达到了同样的保护缺 血神经元的效果。a f g f 的缓解脑缺血及神经保护作用，提示将其应用于临床，治疗人各 4 种缺血性脑病的可能性“。 ( 2 ) 心肌缺血：临床上治疗心梗的主要原则是改善缺血及保护心肌，a f g f 既能改 善缺血，也能保护心肌。在慢性心肌缺血的猪模型中，使修饰的a f g f 在局部血管外稳 定释放，能明显增加冠脉血流量，增强左室及整个心脏的功能。心肌缺血和再灌注能使 局部中性粒细胞浸润，导致严重的心肌损伤。而静脉给予a f g f 则能明显减少中性粒细 胞的外渗，防止其在局部心肌的聚集，减轻心肌受损的程度，为心肌梗塞的心肌保护治 疗提供了新的途径。 ( 3 ) 肢体缺血：将重组人a f g f 皮下注入后肢缺血的鼠，发现能明显促进缺血部位 侧支血管的形成，建立侧支循环，改善缺血状态。这种促血管生成作用将来可能用于缓 解临床病例的肢体缺血状态，如闭塞性脉管炎。a f g f 也能为缺血后再灌注的骨骼肌提供 组织保护作用，在缺血再灌注后静注a f g f ，能减轻组织的缺血再灌注损伤，推测此保护 机制源于a f g f 能调节胞外和胞内的钙离子浓度，并参与缺血状态下血管紧张度的调节 5 0 o ( 4 ) 血管损伤：在体内a f g f 和b f g f 是血管内皮细胞及平滑肌细胞的强有力的有丝 分裂原。在血管受伤后，血管壁中a f g f 和b f g f 的释放能使鼠主动脉平滑肌细胞增殖， 促进血管修复。因而控制血管壁中f g f 的表达是调节血管形成的重要机制陆“。 4 、溃疡 ( 1 ) 胃溃疡：用乙酸诱导鼠发生胃溃疡后，使鼠系统口服a f g f 及肝索，一周后即 可观察到溃疡底部血管密度增至服药前的3 倍，溃疡面积减少8 0 ，a f g f 促进溃疡愈合 的疗效是法莫替丁的1 3 3 3 倍。其治疗机制不同于目前临床应用的溃疡治疗药物，与一 直胃酸分泌无关，而主要是由于它的促血管生成作用，使溃疡底部血管增生促进溃疡修 复。a f g f 治疗溃疡的显著疗效使其可能成为新一代治疗人胃溃疡的有效药物。“。 ( 2 ) 肢体溃疡：有临床实验用含有包括a f g f 等多种生长因子的敷料包扎伤口，能 明显加速糖尿病患者下肢慢性溃疡的伤口愈合。提示a f g f 对难治性溃疡的作用拍“。 5 、其他 a f g f 还有很多其他方面的作用。如给新生鼠注射a f g f 能影响毛囊的发生和发育， 使毛发周期明显滞后，有助于深入研究毛发发生的机制；a f g f 能引起实验动物急性暂时 性的低血压效应，为氧化氮依赖性，并考虑激肽是其必需的介质；此外，肝素可能是 治疗血小板减少症的新药物，其机制也是通过增强a f g f 等因子的作用而促进巨噬细胞 增生刚。 2 1 材料 2 材料与方法 2 1 1 植物材料 丽春为市售番茄品种； 番茄种子m i c r o t o m 由佛罗里达大学h a r r yk l e e 博士惠赠。 2 1 2 质粒和菌种 质粒p c a 拯i a l 3 9 0 由澳大利亚国际农业分子生物学应用中心惠赠； 质粒p r o k i i a f 为本实验室保存； 质粒p w e n 5 f 由中科院遗传与发育研究所薛永彪博士惠赠； 质粒p e t 3 c h a f g f 由暨南大学生物技术中心提供； 大肠杆菌菌种d h 5q 、j m l 0 9 ，根瘤农杆菌菌种l b a 4 4 0 4 、e i a l 0 5 为本实验室保存。 2 1 3 化学试剂 d n ag e le x t r a c t i o nk i t 凝胶回收及p c r 产物回收试剂盒购自上海生工生物工程公司； t a 克隆试剂盒购自p r o e g a 公司； 总r n a 提取试剂盒购自p r o e g a 公司； r t p c r 试剂盒购自p r o e g a 公司； s o u t h e r n 杂交试剂盒购自a e r s h 锄公司； 核酸限制性内切酶e c o r i 、h i n d i i i 、k p n i 、s p e i 、x h o i ，来自大肠杆菌碱性磷酸酶 ( b a p ) ，t 4d n a 连接酶，t a q 酶( o n es h o r tl ap c rm i x ) 购自大连宝生物公司。 2 1 4p c r 引物 m a n a 引物( 引物1 和引物2 ) 和a f g f 引物( 引物3 和引物4 ) 由上海生工公司合成。 引物 引物 引物 引物 5 一g c a c t c g a g c a t g c a a a a u a c t c a t t a a c t c a g 3 5 一g c a c t c g a g c t c t t a c a g c t t g t t g t a a a c 一3 5 一g g t a c c a t g g c t g a a g g g g a a a t c a c 5 一g a g c t c t t a a t c a g a a g a g a c t g g c a 2 1 。5 培养基 l b 液体培养基( 1 l ) ： 1 0 9 胰蛋白胨，5 9 酵母提取物，1 0 9n a c l ，p h 值为7 o 。 6 l b 固体培养基： l b 液体培养基中加入1 5 的琼脂粉。 发芽培养基( 1 2m s o 培养基1 l ) ： 2 1 5 9m s 盐，o 0 5 9 肌醇，2 m gv b l ，0 5 m gv b 6 ，o 5 m g 烟酸，1 0 9 蔗糖，p h = 5 8 。 侵染培养基： 4 3 9 m s 盐，2 o i 1b 5v i t 硼i n s ( 5 0 0 倍母液) ，3 0 o g 蔗糖，2 0 m g l 玉米素，p h = 5 8 。 预培养及共培养培养基( 1 l ) ； 2 2 9m s 盐，2 2 m 1t h i 枷i n e h c l ( 0 4m g m 1 ) ，3 0 9z 裳自蕾，o 2 9k h z p 0 4 ，0 2 m 1k i n e t i n ( 0 5 曙m 1 ) ，0 2 m l2 ，4 一d ( 1 m g m 1 ) ，2 5 p h y t e g e l ，8 1a c e t o s y r i n g o n e ( 4 9 1 m g m 1 ) ， p i _ 6 o 。 选择再生培养基： 4 3gm s 盐，2 om lb 5v i t a m i n ( 5 0 0 倍母液) ，3 0 og 蔗糖，2 om g l 玉米素，2 5 gp h y t e g e l ，p h = 5 8 。 生根培养基： 1 2m s o + o 1 i i l g 几萘乙酸( n a a ) 2 2 实验方法 2 2 1 植物表达载体的构建 2 2 1 t l 引物设计及p c r 扩增 ( 1 ) 利用软件p r i m e rp r e m i e r5 o 设计引物 引物l 与引物2 为m a n a 引物，为了用腑删替换p c a 她i a l 3 9 0 中的矗酌基因，设计一 对特异性引物：引物1 ( 5 一g c a c t c g a g c a t g c a a a a a c t c a t t a a c t c a g 一3 ) 和引物2 ( 5 一g c a c t c g a g c t c t t a c a g c t t g t t g t a a a c 一3 ) ，均含有核酸限制性内切酶x h o i 识别位 点阽”。以引物l 和引物2 进行扩增。 p c r 反应体系： o n es h o tl ap c rm i x2 5 u 1 弓i 物1 ( 5 i lm )3 u l 弓物2 ( 5 um ) 3u 1 模板d n a1 1 1 1 d d h 2 01 8 “l p c r 参数：9 5 4 5s e c ，7 1 5 0s e c ，7 2 7 5s e c ，共3 0 个循环。 ( 2 ) 为了将经p c r 扩增的基因连入载体p m 3 9 0 r 中，设计一对特异性引物，h a f g f ( 引 物3 ：5 一g g t a c c a t g g c t g a a g g g g a 从t c a c ：引物4 ：5 一g a g c t c t t a a t c a g a a g a g a c t g g c a ) ， 扩增所得的片段5 端含有k p n i 酶切识别位点。以p e t 3 c 咱a f g f 为模板扩增h a f g f 。 p c r 反应体系： 7 0 n es h o tl ap c km l x 引物5 ( 5 p m ) 引物6 ( 5 p m ) 质粒d n a ( p e t 3 c - h a f g f ) d d h ：o p c r 参数：9 5 5 0s e c ，6 0 5 0s e c 。7 2 5 0s e c ， 2 5 ul 3 ul 3 l l1 1u1 1 8 p1 共3 0 个循环。 2 2 1 2t a 克隆 用购自t a k a r a 的d n ag e l 既t r a c t i o nk i t 试剂盒对以上两种p c r 产物分别进行纯 化，操作过程按说明书。分别取回收片段与t a 克隆载体p g e mt e a s y 连接，反应体系 如下： 2 x t 4d n a 连接酶缓冲液 纯化的p c r 片段 p g e mt e a s y ( 5 0 n g u1 ) t 4d n a 连接酶 5 u1 3 u1 1u1 1ul 室温放置1 小时，4 过夜。将连接产物2 ul 转化感受态宿主细胞d h 5d ，从过夜 培养的氨基苄青霉素抗性的平板上取白色菌落，放入2 0 斗1 无菌双蒸水中，9 0 1 0 0 煮1 0 分钟，以所得的溶液为模板进行p c r 扩增，挑取p c r 阳性的菌落，以碱裂解法小 量制备质粒。以e c o r i 对制备的两个质粒分别酶切，筛选出重组的t a 克隆。将a n a 和 h a f g f 的重组质粒分别命名为p t e m a n a ，和p t e h a f g f 。 2 2 1 3 重组质粒p m 3 9 0 的构建 ( 1 ) 插入片段的制备 将t a 克隆重组质粒p t e m a n a 用限制性核酸内切酶x h o i 消化： 质粒p t e m a n a1 2 u1 1 0 x hb u f f e r 6 u l x h o i3 u1 d d h 2 03 9 u l 3 7 温育3 小时。1 2 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切下大小约为 1 2 k b 的亮带，以d n ag e le x t r a c t i o nk i t 回收插入片段，溶于2 0 uld d h 。o 中。 ( 2 ) 载体制各 a 酶切：将质粒p c a i b i a l 3 9 0 用x h 。i 酶切，反应体系如下： 质粒p c a m b i a l 3 9 01 2 u1 1 0 x hb u f f e r6 u l x h o i 3 ul d d h 如3 9 u 1 r 3 7 保温3 小时，1 0 琼酯糖凝胶电泳，切下所需的片段以d n ag e le x t r a c t i o nk i t 回收插入片段，溶于2 0 p1d d h 2 0 中。 b 去磷酸化：以大肠杆菌碱性磷酸酶( b a p ) 处理载体片段，使其5 端去磷酸化。反 应体系如下： 载体片段2 0 u1 1 0 x b a pb u f f e r 5 u1 b a p ( o 3 _ o 6 u 1 )2 5 u 1 d d h 2 0 2 2 5 p l 4 5 放置3 0 分钟，以d n ag e le x t r a c t i o nk i t 纯化回收载体，溶于2 0uld d h ：0 。 ( 3 ) 连接及鉴定 建立以下连接反应体系： 制备载体3 u1 制备a n a 插入片段1 3 ul 1 0 x t 4d n a 连接酶b u f f e r 2 斗l t 4d n a 连接酶 2 1 1 1 1 6 放置过夜。取5u1 连接液转化大肠杆菌感受态细胞d h 5 ，将转化菌液涂于 l b 平板上( 含5 0 ug m 1k a n 锄y c i n ) ，3 7 过夜培养，挑取平板上长出的单菌落接种于 5 m l l b 培养液中( 含5 0ug m lk a n a m y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜。碱裂解法小量制备质 粒，以a p a l i 酶切鉴定重组质粒及其插入方向。将插入方向正确的重组质粒命名为 _ p m 3 9 0 。 2 2 1 4 重组质粒p m 3 9 0 r 的构建 ( 1 ) 插入片段的制备 用h i n d i i i 及e c o r i 双酶切消化质粒p w e n 5 f ： 质粒泖e n 5 f2 0 u l 1 0 x mb u f f e r 6 ul h i n d i 工工 3 u l e c o r 工 3 u l d d h 2 02 8 u1 3 7 放置3 小时。1 琼酯糖凝胶电泳，目的片段用d n ag e le x t r a c t i o nk i t 纯化 回收。 ( 2 ) 载体制备 以e c o r i 与h i n d i i i 酶切消化重组质粒p m 3 9 0 ，反应体系如下： 质粒p m 3 9 02 0 “l 1 0 x mb u f f e r 6 ul 9 h i n d i i i e c o r i d d h t o 3 7 保温3 小时。1 琼酯糖凝胶电泳， 回收。 ( 3 ) 连接及鉴定 建立以下连接反应体系： 制备载体 制备插入片段 1 0 x t 4d n a 连接酶b u f f e r t 4d n a 连接酶 3 u1 3 l 工1 2 8 p1 载体片段用d n ag e le x t r a c t l 0 nk i t 纯化 3 ul 1 3 ul 2 u1 2 u1 1 6 放置过夜。取5l ll 连接液转化大肠杆菌感受态细胞j m l 0 9 ，将转化菌液涂于 l b 平板上( 含5 0ug m 1k a n a m y c i n ) ，3 7 过夜培养，挑取平板上长出的单菌落接种于 5 m 1 l b 培养液中( 含5 0ug m 1k a n a m y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜。碱裂解法小量制备质 粒，用e c o r i 及h i n d i i i 双酶切鉴定，将重组质粒命名为p m 3 9 0 r 。 2 2 1 5 表达载体p m 3 9 0 h a f ( 1 ) 插入片段的制备 将t a 克隆载体p t e h a f g f 用k p n i 及s p e i 双酶切： 质粒d n a2 0 u l 1 0 x 陋b u f f e r 6 ul k p n i3 u1 s d e i 3 | ll d d h ，o2 8 u 1 3 7 放置3 小时。1 琼酯糖凝胶电泳，目的片段用d n ag e le x t r a c t i o nk i t 纯化 回收。 ( 2 ) 载体制备 将质粒p m 3 9 0 r 以k p n i 及s p e i 酶切： 质粒p m 3 9 0 r2 0 ul 1 0 x mb u f f e r 6u 1 k p n i3 p1 s p e i3 ul d d h z o2 8 p l 3 7 放置3 小时。l 琼酯糖凝胶电泳，目的片段用d n ag e le x t r a c t l 0 nk i t 纯化 回收。 1 n ( 3 ) 连接及鉴定 建立以下连接体系： 制备载体 3 ul 制备插入片段 1 3 | 1 1 1 0 x t 4d n a 连接酶b u f f e r 2u1 t 4d n a 连接酶 2u1 1 6 放置过夜。取5u1 连接液转化大肠杆菌感受态细胞j m l 0 9 ，将转化菌液涂于 l b 平板上( 含5 0 g m 1k a n a m y c i n ) ，3 7 过夜培养，挑取平板上长出的单菌落接种于 5 m 1 l b 培养液中( 含5 0hg m 1k a n a m y c i n ) ，3 7 振荡培养过夜。碱裂解法小量制备质 粒，用k p n i 及s p e i 双酶切鉴定，将重组质粒命名为p m 3 9 卟a f g f 。 ( 4 ) 农杆菌转化 利用冻融法将质粒p r o k i i a f 和p m 3 9 0 h a f g f 分别转入农杆菌菌株l b a 4 4 0 4 和 e h a l 0 5 ；利用p c r 或酶切鉴定，确定所得到的菌落为含目的质粒的转化株。 2 2 1 6d n a 测序 重组过程中，经过p c r 扩增的序列均进行了测序，测序工作分别由上海生工公司及 联合基因公司完成 2 2 2 农杆菌介导的西红柿转化 ( 1 ) 番茄无菌苗的获得 将番茄的种子用7 0 的乙醇浸泡1 分钟，转入1 0 n a c l 0 溶液中灭菌5 分钟，然 后用无菌水冲洗5 7 次，置于无菌干燥的滤纸上将水吸干，播种于发芽培养基上z 7 培养6 7 天( 1 6 小时光照8 小时暗培养) 。 ( 2 ) 预培养 用剪刀剪取无菌苗的子叶与下胚轴作为外植体，可根据子叶的大小将每一片子叶剪 成2 3 块，正面朝上放于铺有无菌滤纸的预培养培养基上，下胚轴可剪成1 c m 大小。 低光照2 7 培养2 4 小时。 ( 3 ) 农杆菌培养 在含相应抗生素的l b 平板上划线培养分别含有质粒p m 3 9 0 m h a f ，p m 3 9 0 m g f p 及 p r o k 2 a f 的农杆菌，3 0 培养2 3 天，选择均一的克隆接种于含有相应抗生素的5 m ll b 液体培养基中2 8 振荡培养过夜。取5 0 1 0 0ul 菌液接种于1 0 0 m l 含相应抗生素的新 鲜l b 培养液中，于2 8 振荡培养过夜。将处于对数生长期的菌液离心，用惦o 液体培 养基重悬，使最终菌液浓度为2 5 5 ox1 0 8 个细胞m l 。 ( 4 ) 农杆菌侵染及共培养 吸取3 4m 1 菌液加入预培养2 4 小时的外植体中，侵染1 0 分钟后，吸去菌液。2 5 1 1 低光照共培养两天后转移到选择培养基上。 ( 5 ) 选择和再生 外植体在选择培养基上每3 周继代一次，8 周后将玉米素的浓度降为1 l g l ，1 2 周 后降为0 5 m g 1 。当分化出的再生芽长至3 厘米时将其从外植体上分离开，转移到生根 培养基上，3 4 周后待根系发达后移栽到灭菌的土中。 2 2 3 再生植株的p c r 检测 取再生植株新鲜叶片2 0 m g ，置于2 0 0 u10 5 m 的n a 0 h 溶液中研磨，吸取2 0 ul 研 磨液加到4 8 0 斗lt r i s h c lp h8 0 中混匀，吸取3 4 ul 此混合液作为模板进行p c r 扩增。 2 2 4 植物基因组d n a 的分离 采用改良的c t a b 法提取植物总d n a ： a 取2 克左右新鲜嫩叶片，放于研钵中，用液氮研磨。 b 将研磨后的粉末放入预冷的5 0 m 1 的离心管中。 c 用1 5 m l 的2 x c t a b 溶解粉末，然后于水浴锅中6 5 放置3 0 分钟。 d 加入1 5 m l 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ，涡旋振荡至形成乳浊液，静止分层。 e 5 0 0 0 g 室温离心1 5 分钟。 f 将上清转入新的离心管中，加入2 “1 的r n a 酶( 1 0 m g m 1 ) ，3 7 放置1 小时。 g 重复氯仿：异戊醇抽提一次，离心，将上清转入无菌离心管。 h 加入o 8 倍体积的异丙醇( o 6 一1 0 倍体积均可以) ，颠倒离心管数次，离心，将沉 淀( 基因组d n a ) 挑到1 - 5 m 1 的管中。 i 用7 0 的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥，然后向每管中加入2 0 0 p1( 根据所提 取的d n a 量和所需的d n a 浓度酌情决定) d d h 2 0 溶解沉淀。 2xc t a b 提取液： 1 4 mn a c l 1 0 0 m mt r i sd h8 0 2 c t a b( h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m