（化学工艺专业论文）海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠ACA液芯微胶囊制备工艺优化及性能研究.pdf

摘要 海藻酸盐壳聚糖固芯微胶囊在生物细胞发酵领域虽然具有显著的优势，但仍存在一 些不足：由于微胶囊内是固芯三维网状结构，使得细胞生长空间位阻较大，影响了细胞 的大量增殖，同时固芯造成分子传质阻力大，微胶囊中心区域细胞不能及时获得营养物 质和排出代谢产物，致使微囊化细胞生长和生产能力下降。针对这些不足，本文采用柠 檬酸钠液化微胶囊的固芯，制得海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠( a c a ) 液芯微胶囊。首先采 用响应面优化法对液芯微胶囊的制备工艺条件进行优化，寻找制备具有较好机械强度的 液芯微胶囊的工艺条件；然后考察液芯微胶囊的传质性能包括小分子物质通过膜的传质 系数和微胶囊膜的截留分子量；最后对细胞进行微囊化培养，考察a c a 液芯微囊化细 胞的生长和代谢情况。旨在为a c a 液芯微囊化技术在细胞发酵培养领域的应用奠定理 论与实践基础。 主要结论如下： 1 对成膜材料壳聚糖进行改性，目的是提高壳聚糖的脱乙酰度和降低壳聚糖分子 量。采用醇溶剂法制得具有高脱乙酰度( 9 0 ) 的壳聚糖，采用n a n 0 2 氧化法降解高分 子量壳聚糖制得一定低分子量范围的壳聚糖。 2 通过单因素实验确定制备a c a 液芯微胶囊的工艺条件范围：壳聚糖脱乙酰度 9 0 ，壳聚糖分子量为3 0 0 0 0 - - , 5 0 0 0 0 ，壳聚糖的p h 值5 0 “3 ，壳聚糖浓度 5 o g l ， 成膜反应时间1 5m i n 一- 3 0 m i n ，柠檬酸钠的p h 2 0m i n 。 3 在单因素实验基础上，用膨胀率( s w ) 来表征液芯微胶囊膜的机械强度，采用 响应面优化法对a c a 液芯微胶囊制备过程中1 1 个因子进行优化实验，寻找显著影响因 子，确定最优工艺条件。首先由p l a c k e t t - b u r m a n 实验结果得到壳聚糖浓度、壳聚糖p h 值和柠檬酸钠p h 值是影响a c a 液芯微胶囊膜强度的三个显著因子；然后由最陡爬坡 实验逼近响应值最大的中心区域，确定中心点的条件为：壳聚糖浓度为5 5 叽，壳聚糖 溶液p h 为6 2 ，柠檬酸钠p h 为6 o ；最后由最陡爬坡实验的中心点设计中心组合实验， 建立模型，绘制响应面曲线，计算最优化的制备条件为：壳聚糖浓度5 9 虮，壳聚糖溶 液p h 为6 2 2 ，柠檬酸钠p h 为5 5 3 。进行验证实验，实验结果与优化理论值相符。 4 在优化条件的基础上制备a c a 液芯微胶囊，考察液芯微胶囊的传质性能。首先 建立传质模型，考察4 种小分子底物( 谷氨酸、l 苯丙氨酸、葡萄糖和乳糖) 通过微胶 囊膜的传质系数，通过实验数据拟合得到谷氨酸、l 广苯丙氨酸、葡萄糖和乳糖的传质系 数分别为0 0 1 2 6 ，o 0 1 1 0 ，0 0 0 7 1 及0 0 0 4 9 ；其次，由一系列已知分子量的聚乙二醇作 为模型分子确定液芯微胶囊膜的截留分子量为2 0 0 0 。 5 在优化条件的基础上制备a c a 液芯微胶囊并包埋大肠杆菌和酿酒酵母细胞，考 察a c a 液芯微囊化细胞的生长和代谢情况。首先比较了大肠杆菌和酿酒酵母细胞在 a c a 液芯微胶囊内和固芯微胶囊内的生长情况，其次考察了液芯微囊化酿酒酵母细胞 的代谢和多批次培养情况。实验结果证明大肠杆菌和酿酒酵母细胞在液芯微胶囊内的生 长情况良好，细胞密度比固芯微胶囊大；液芯微胶囊化酿酒酵母细胞代谢产物( 酒精) 浓度维持稳定，对细胞进行多批次培养，液芯微胶囊形态完好，细胞生长代谢维持稳定。 关键词 海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠微胶囊，液芯，优化，响应面，传质系数，新陈代谢 a b s t r a c t a l t h o u g ha l g i n a t e c h i t o s a ns o l i dc o r em i c r o c a p s u l eh a ss i g n i f i c a n ta d v a n t a g e si n a s p e c t so ft h eb i o l o g i c a lc e l lf e r m e n t a t i o nb u tt h e r ea r es t i l ls o m ed e f i c i e n c i e s ：a st h ec a p s u l e h a sas o l i dc o r ew i t h i nt h et h r e e d i m e n s i o n a ln e t w o r ks t r u c t u r e ，m a k i n gc e l l sm o r es t e r i c h i n d r a n c e , a f f e c t i n gal a r g en u m b e ro fc e l lp r o l i f e r a t i o n , c a u s i n gb i g g e rm a s st r a n s f e r r e s i s t a n c e c e n t r a lr e g i o no fc e l lm i c r o e n c a p s u l a t i o nc a nn o tr e c e i v et i m e l yd i s c h a r g eo f n u t r i e n t sa n dm e t a b o l i t e s ，g r o w t ha n dp r o d u c t i o no fm i c r o e n c a p s u l a t e dc e l l sd e c r e a s e d f o r t h e s ed e f i c i e n c i e s ，i nt h i s p a p e r , s o d i u mc i t r a t el i q u i ds o l i d c o r em i c r o c a p s u l e s ，a n d a l g i n a t e c h i t o s a n a l g i n a t e s o l i dl i q u i d c o r em i c r o c a p s u l e sb e p r e p a r e d t h ep r e p a r a t i o n c o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e di no r d e rt om a d eg o o dm e c h a n i c a ls t r e n g t hl i q u i dc o r e m i c r o c a p s u l e s s m a l lm o l e c u l e st h r o u g ht h em e m b r a n em a s st r a n s f e rp e r f o r m a n c ea n d f i x e d c e l lf e r m e n t a t i o no nc e l l g r o w t ha n dm e t a b o l i s m w e r ei n v e s t i g a t i o n , f o rt h e a l g i n a t e c h i t o s a n a l g i n a t el i q u i dc o r em i e r o e n c a p s u l a t i o nt e c h n o l o g ya p p l i e di nt h ef i e l do f c e l lc u l t u r el a i dt h et h e o r ya n dp r a c t i c e t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 b ye x p e r i m e n t a lm e t h o d sa n dt h es i n g l ef a c t o rs c r e e n i n ge x p e r i m e n t ，c h i t o s a nf i l m m a t e r i a lw e r em o d i f i c a t i o n , o b t a i n e db yh e t e r o g e n e o u sm e t h o dw i t hah i g hd e g r e eo f d e a c e t y l a t i o n 9 0 ，o x i d a t i o nn a n 0 2w e r e u s e dt oo b t a i n eas e r i e so fm o l e c u l a rw e i g h t c h i t o s a n 2 s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sw e r eu e s dt os c r e e nl e v e lo fa 1 9 i n a t e c h i t o s a r d a l g i n a t e l i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e s f a c t o r sa n dd e t e r m i n e dt h ec o n d i t i o n s ：c h i t o s a n sd e g r e eo f d e a c e t y l a t i o n 9 0 ，t h em o l e c u l a rw e i g h to f3 0 0 0 0 5 0 0 0 0c h i t o s a n , c h i t o s a n sp hv a l u eo f 5 o 6 3 ，c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a ni sg r e a t e rt h a n5 0 9 l ，r e a c t i o nt i m ef i l ms h o u l db e15 m i n 3 0 m i n , p ho fs o d i u mc i t r a t ei sb e t w e e n 4 0a n d6 5 ，l i q u e f a c t i o nf o rm o r et h a n2 0 m i n u t e sw h e nl i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e sw i mah i g h e rf i l ms t r e n g t h 3 o nt h eb a s eo ft h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ，11i n f l u e n c i n gf a c t o r so ft h ep r e p a r a t i o n o fa c a l i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e so p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g ye x p e r i m e n t s t h ee x p a n s i o nr a t ei sc h a r a c t e r i z e dt h ef i l ms t r e n g t ha n dt h es i g n i f i c a n tf a c t o r sw e r ef o u n dt o d e t e r m i n et h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h e r ea r et h r e es i g n i f i c a n tf a c t o r st h a td e p e n d i n gt h e s t r e n g t ho ft h em e m b r a n eo fa c al i q u i dc o r em i c r o c a p s u l eo nt h er e s u l to fp l a c k e t t - b u r m a n e x p e r i m e n t t h et h e r ef a c t o r sa r ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n , c h i t o s a np h a n ds o d i u mc i t r a t e p h d e t e r m i n e dt h ec e n t e ro fb o x - b e h n k e nd e s i g ne x p e r i m e n tb yt h er e s u l t so fs t e e p e s ta s c e n t e x p e r i m e n ta n d t h ec e n t e rc o n d i t i o n sa r et h a tc h ic o n c e n t r a t i o ni s5 5 9 l ，c h ip hi s6 2a n d s o d i u mc i t r a t ep hi s5 5 3 4 i n v e s t i g a t eo nt h et r a n s f e rp r o p e r t i e st h r o u g ht h em i c r o c a p s u l em e m b r a n eo ft h ef o u r k i n d so fs m a l lm o l e c u l e sw h i c ha r eg l u t a m i ca c i d ，l p h e n y l a l a n i n e ，g l u c o s ea n dl a c t o s e m a s s t r a n s f e rm o d e lw a se s t a b l i s h e da n dm a s st r a n s f e rc o e f f i c i e n t sw e r ef i t t e d 船o 0 1 2 6 ，o 0 110 ， 0 0 0 71a n d0 0 0 4 9 as e r i e so fk n o w nm o l e c u l a rw e i g h to fp o l y e t h y l e n eg l y c o lm o l e c u l e s w e r em e a s u r e da sam o d e la n dm e m b r a n em o l e c u l a rw e i g h tc u t o f fi sm e a s u r e d 嬲2 0 0 0 5 t h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo ft h es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n de c o l iw e r e c o m p a r e dw i t h i nt h ee n v i r o n m e n ts i t u a t i o ni na c al i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eg r o w t hd e n s i t ya n dt h ec o n c e n t r a t i o no fm e t a b o l i t e so fi m m o b i l i z e d s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ec e l l si nl i q u i dc o r em i c r o c a p s u l e sp e r f o r mb e t t e rt h a ni nt h es o l i d c o r em i e r o c a p s u l e sa n dm e t a b o l i s ma l c o h o lc o n c e n t r a t i o nr e m a i n e ds t a b l eo nm o r eb a t c h c u l t u r e k e y w o r d s a l g i n a t e c h i t o s a n a l g i n a t em i c r o c a p s u l e s ，l i q u i dc o r e ，o p t i m i z a t i o n , r e s p o n s es u r f a c e ， m a s st r a n s f e rc o e 街c i e n t m e t a b o l i c 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：灶指导教师签名：盔 埠 如f o 年占月，7 日夕。年乡月，7 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 ：亡巳 思0 学位论文作者签名： 纠。年石, e l ，7 日 西北大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 固定化技术 1 1 1 固定化技术概论 早在1 9 世纪初，人们就利用微生物细胞在固体表面吸附的现象，采用滴滤法来生 产醋酸。后来，又有人采用类似方法来进行污水处理。现代的固定化细胞技术是在固定 化酶技术的推动下而发展起来的。固定化细胞技术起始于1 9 5 9 年，h a ：t t o n 等人首次实 现了大肠杆菌的固定化。1 9 7 3 年，日本首次在工业上成功地利用固定化微生物细胞连续 生产l 天冬氨酸，接着，固定化细胞技术受到广泛重视，并很快从固定化休止细胞发展 到固定化增殖细胞。经过几十年发展，已形成较为完备的理论和方法【1 一。 固定化技术3 , 4 , 5 1 是指利用物理或化学等手段，将游离的细胞或酶与固态的不溶性载 体相结合，固定在限定的空间区域，并保持细胞及其内酶的活性、并能够反复使用的方 法。它包括固定化酶技术、固定化细胞技术和固定化藻技术。由于此技术既不需要把酶 从细胞中提取出来，也不需要加以纯化，酶活力损失少i 因此固定化细胞技术己超过固，。 定化酶技术的应用。 固定化细胞技术是从固定化酶技术发展起来的，目前已广泛应用于工业、医学、制 药、化学分析、环境保护、食品发酵及能源开发等多种领域6 7 ，8 1 。在工业方面，如利用 产葡萄糖异构酶的固定化细胞生产果葡糖浆；将糖化酶与含q 淀粉酶的细菌、霉菌或酵 母细胞一起共固定，可以直接将淀粉转化成葡萄糖；利用海藻酸钙或卡拉胶包埋酵母菌， 通过批式或连续发酵方式生产啤酒；利用固定化酵母细胞生产酒精或葡萄酒；此外，还 可利用固定化细胞大量生产氨基酸、有机酸、抗生素、生化药物和甾体激素等发酵产品。 在医学方面，如将固定化的胰岛细胞制成微胶囊，能治疗糖尿病；用固定化细胞制成的 生物传感器可用于医疗诊断。在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，除上述 医疗诊断外，还可测定醋酸、乙醇、谷氨酸等。此外，固定化细胞在环境保护、产能和 生化研究等领域都有着重要的应用。 固定化细胞技术与细胞在游离状态下培养相比具有显著的优势：细胞生长密度增 高；耐毒害能力增强；产物易于分离；酶活损失少、稳定性高；细胞可回收或循环使用、 回收率高；反应过程易于控制；能够实现连续化操作；大大提高生产能力；生产工艺自 动化、连续化，处理效率高，无二次污染、能耗低。因而迅速发展成为生物工程学中一 个研究热点。 第一章绪论 1 1 2 固定化细胞方法 常用于制备固定化细胞的方法主要有：吸附法、包埋法、共价结合法、交联法 9 ，1 0 , 1 。 ( 1 ) 吸附法 吸附法即利用微生物细胞自身带电和载体之间的静电力作用或者细胞核载体之间 表面张力和粘附力作用，将细胞固定在载体表面和内部的方法。吸附法根据吸附力的不 同又分为物理吸附和离子吸附两种。物理吸附采用具有具有吸附能力的载体如硅胶、活 性碳、多孔玻璃、石英砂和纤维素等。离子吸附是根据细胞在解离状态下静电引力( 即 离子键合作用) 与带有相异电荷的离子交换剂作用，使细胞附着于带有相异电荷的上实 现固定化。离子吸附载体主要有d e a e - 纤维素、c m 纤维素等。吸附法具有操作简单， 操作条件温和，载体可以反复使用等优点，但是因为吸附活化能较低，载体与细胞的结 合力弱，细胞容易脱落，并且固定的细胞数量有限，因此使用受到限制。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是指将细胞包裹于凝胶网格结构中或半透性膜内，小分子物质可以自由扩散 通过膜，大分子物质和细胞不能通过。该法操作简单，操作条件温和，不会明显影响生 物活性，是目前应用较广泛的方法。对于包埋材料的要求应对微生物无毒性，传质性能 好，性质稳定，不易被生物分解，强度高，寿命长，价格低廉等。使用较多的材料有海 藻酸盐、卡拉胶、壳聚糖、琼脂、聚丙烯酞胺凝胶、角叉藻聚糖、聚乙烯醇、光硬化性 树脂等。 ( 3 ) 共价结合法 共价结合法利用细胞或酶表面上功能基团( 例如琉基、氨基、羟基、咪唑基、酚基 等) 与固相支持物表面反应基团之间形成化学共价键，制成固定化细胞或酶。该法中细 胞或酶与载体之间的连接键能高，因此结合牢固，使用过程中不易发生脱落，稳定性良 好，但是此法不足是反应剧烈、操作过程复杂、控制条件苛刻，此法制备得到的固定化 细胞的死亡率较高。 ( 4 ) 交联法 交联固定法是利用双功能或多功能试剂与细胞或酶表面的反应基团( 如氨基酸、硫 基、羟基、咪唑基等) 反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞或酶，通过共价 键相结合。常用的交联剂有甲苯二异氰酸醋、戊二醛等。由于交联固定法化学反应比较 激烈，固定化微生物的活力较脆弱。此外，交联法所用的交联剂价格较贵，因此限制了 该方法的应用。 2 西北大学硕士学位论文 1 2 生物微胶囊技术 1 2 1 生物微胶囊概述 生物微胶囊技术是一种新兴的细胞固定化技术，随着固定化酶在工业生产上的成功 应用，引发了人们对固定化细胞的探索和热情，生物微胶囊法是细胞固定化的主要方法 之一。生物微胶囊是采用半透囊膜将细胞或酶等生物质包裹在囊内形成微胶囊。微胶囊 内部的物质称为囊芯，外部由成膜材料形成的包覆膜称为微胶囊膜。微胶囊允许小分子 营养物质自由进入和囊内代谢产物自由排出，同时阻止囊外生物大分子进入微胶囊。微 胶囊技术的优势在于形成微胶囊时，囊芯被胶囊膜包覆与外界环境隔离，微囊膜起到保 护膜内活性物质，并且可以控制膜内、外小分子物质的传递。随着生物技术和膜技术研 究的不断深入，微胶囊制备方法不断完善，应用领域正在不断扩宽，在各个领域都得到 了极大应用，前景广阔。微胶囊作为一种极有前途的载体，已被用于细胞培养、细胞和 酶固定化、药物缓控释、人工器官及基因运载工具、抗癌药物筛选等生物医学领域阮1 3 ， 1 4 】 o c h a n g e l 5 】于1 9 5 7 年首次提出了“人工细胞”概念。随后报道了将酶、蛋白质和激 素等生物活性物质包埋在不同材料的微胶囊中，并能够长时间内保持活性，为人工细胞 的研究拉开了序幕。8 0 年代，l i m 1 6 】将微囊化技术与组织细胞移植相结合，制备了具有 良好生物相容性海藻酸钠聚赖氨酸( a p a ) 微胶囊，包埋猪胰岛细胞形成“人工细胞 ， 作为免疫隔离工具移植人糖尿病大鼠体内，结果表明该“人工细胞”成功地调节了血糖 水平，具有鼠胰腺功能，被称为“人工胰腺”。从此为细胞移植治疗神经内分泌系统疾 病提供了新思路。9 0 年代微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具 1 刀，利用重 组细胞的代谢产物调节机体生理功能，治疗相关疾病。随着生物微囊化技术研究的进一 步发展，结合基因工程技术的发展，生物微胶囊对基因工程茵进行包埋，将研究扩展到 器官移植领域。目前，生物微胶囊技术不仅广泛应用于医药卫生领域，同时通过固定化 细胞进行日用化学工业的研究也日益增多。生物微胶囊已经成为材料、化学、化工、生 物和医学等多学科领域工作者的研究热点，具有广阔的应用前景。 1 2 2 生物微胶囊材料 生物微胶囊的制备材料选择是制备微胶囊的重要环节。适合于制备生物微胶囊的材 料需要符合几点原则：1 ) 成膜材料中至少有一种聚合物：2 ) 聚合物带有电荷或通过调 节p h 值而带有电荷，以便于与具有相反电荷的物质发生凝聚成膜反应；3 ) 成膜材料要 具有良好的生物相容性；4 ) 材料易得，生物稳定性好，晁面反应条件温和，界面凝聚 3 第一章绪论 反应迅速。 常用于生物微胶囊的材料主要分为天然、半合成和合成高分子三类。天然的主要有 脂类如卵磷脂，多糖如海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、淀粉，蛋白质如明胶、白蛋白、纤维 蛋白；半合成材料有羧甲基纤维素钠，醋酸纤维素等；合成材料有乳酸乙醇酸共聚物、 聚内酯、聚酐、聚氨基酸、聚酰胺、聚氯乙烯等。带电荷的天然多糖和聚氨基酸是制备 生物微胶囊的最理想的聚电解质，聚阴离子如纤维素硫酸钠、海藻酸钠等，聚阳离子如 脱乙酰壳多糖、聚l 赖氨酸等。合成的聚阴离子一般细胞毒性也很小，如高分子量的聚 丙烯酸等。其中因为天然材料一般具有无毒、免疫原性低，生物相容性好、可降解等特 点，使其得到广泛应用。尤其是海藻酸盐、壳聚糖等天然多糖因其资源丰富、制备简单、 价格便宜，具有很大应用价值。对于合成材料，应用较多的是乳酸乙醇酸共聚物，多用 于药物缓控释材料 1 8 】。 1 2 3 生物微胶囊制备方法 微胶囊的制备方法主要有化学法、物理化学法和物理法。化学法有界面聚合法、原 位聚合法、凝聚法、乳化法、辐射化学法；物理化学法有相分离法、溶剂蒸发法、界面 沉淀法、喷雾干燥法；物理法有静电沉积法、气相沉积法、流化床喷雾包衣法、喷雾干 燥法等。由于生物微胶囊所包埋的是具有生物活性的酶或细胞，因此要求制备条件温和 能满足医药和生物技术中保持生物活性的要求【l 8 】。 凝聚法 1 9 2 0 】：通过对体系温度、p h 值和组成等参数的调节使聚合物溶液的液滴分 成内外二层，液态内核为凝聚层，外层为预膜层，然后采用加热、交联或溶剂移除等方 法使预膜层固化，从而制得外膜包裹液芯的微胶囊。 界面聚合法【2 1 ，捌：通过在界面处发生聚合反应制备生物微胶囊的一种方法。首先是 一种单体水溶液在搅拌力的作用下分散于有机相中，然后加入另一可溶于有机相的单 体，油溶性单体和水溶性单体在界面处发生聚合反应生成膜，得到囊芯为液态的胶囊。 预凝胶溶解澍2 3 , 2 4 】：首先制备得到球形的水凝胶，然后将此凝胶放入另外一种聚合 物水溶液中，聚合物分子与凝胶表面的基团反应形成覆盖在凝胶表面的膜，然后溶解囊 内的凝胶，使之成为液态内核的胶囊。 1 2 4 生物微胶囊的性能 生物微胶囊的主要应用优势在于它可以保护固定化细胞或酶免于囊外有机、有毒物 质的毒害，给细胞或酶提供一个温和的生存环境。因此对微胶囊性能的要求主要有以下 4 西北大学硕士学位论文 几方面 2 5 , 2 6 , 2 7 】： 1 机械强度：机械强度主要指生物微胶囊能够承受压力、剪切力、溶胀等各种作用 力的大小，包括搅拌、分离、重复使用等生产和处理过程中所能承受的负荷能力。微胶 囊膜的机械强度的大小决定了微胶囊在生物环境中能否保持形态完整，保证囊内细胞或 生物质活性。测量微胶囊机械强度的方法主要有：1 ) 膜厚度表征法；2 ) 单轴按压法； 3 ) 膨胀度法等。 2 传质性能 2 8 】：微胶囊膜对小分子物质的传递性能是其应用的关键，尤其对于固 定化细胞培养，因为营养物质的流入与代谢产物的流出从根本上决定了固定化细胞功能 的正常发挥。传质性能主要包括分子在囊膜中的扩散系数和微胶囊膜的截留分子量这两 个参数。扩散系数表明小分子物质透过胶囊膜的速率；截留分子量是指不能透过微囊膜 的最小分子量，主要反映微胶囊膜对不同分子量溶质的阻隔能力。小分子在囊膜中的扩 散系数的方法是将空白微胶囊放入底物分子溶液中，使底物分子向囊内扩散，直到达到 平衡，记录底物溶液中底物浓度随时间的动态变化，根据数学模型来描述物质通过微胶 囊膜的扩散行为，由模型计算出溶质在微胶囊膜中的扩散系数。截留分子量的测定一般 采用一系列已知分子量的物质，考察其通过微胶囊的扩散情况，不能通过的最小分子量 即为截留分子量，此种方法较粗略，或者用多分散葡聚糖结合凝胶色谱测量较为精确。 3 生物微胶囊的生物相容性【2 9 3 0 3 1 】：对于生物微胶囊其主要应用目的是保护并运 载生物活性物质或细胞，因此其材料除了应具备一定物理化学性质外，还需要维持生物 质和细胞的活性功能。生物相容性是指制备微胶囊的材料和微胶囊是否对固定化细胞或 酶的存活、生长有毒害或抑制作用，是否会引起细胞生理现象的改变。尤其在器官移植 领域，微胶囊的生物相容性还包括是否引起移植受体的免疫排斥反应和微囊膜表面是否 会蔓生微纤维等，材料是否会引起宿主异常反应，如过敏炎症等。宿主或生物体不能对 材料产生较大的影响如老化、变性等。由此看来，微胶囊的生物相容性对固定化细胞和 酶的应用具有决定性的影响。 1 - 3 海藻酸钠壳聚糖海藻酸钠( a c a ) 液芯微胶囊 1 3 1a c a 液芯微胶囊概述 a c a 液芯微胶囊基于其良好的性能已被开始应用于药物缓控释、细胞发酵培养、 微反应器、人体器官移植、基因运载工具和分离介质等领域。海藻酸盐、壳聚糖等天然 多糖资源丰富，价格便宜，作为生物微胶囊制备材料具有巨大的潜力。a c a 液芯微胶 囊制备条件温和，生物相容性好，免疫原性低等优点，因此a c a 液芯微胶囊越来越广 5 第一章绪论 泛地应用于微生物固定化培养领域【3 2 3 3 , 3 4 , 3 5 , 3 6 】。在微生物细胞培养方面，与游离培养环 境相比，囊内液芯环境对细胞的生长、代谢情况具有重要的影响3 7 , 3 8 】。 1 3 2 海藻酸钠 海藻酸( a l g ) 是最常用的微胶囊制备材料，它是从褐藻类海洋生物中提取出的线性 阴离子天然多糖，由a l - 古罗糖醛酸与其立体异构体p d 甘露糖醛酸两种结构单元通过 ( 1 - 4 ) 糖苷键聚合而成的一种无支链的线性嵌段共聚物【3 9 , 4 0 。海藻酸钠的独特性质是从 溶胶向含水量 9 5 的凝胶转变：当其遇见c a 2 + 等二价阳离子，在离子移变作用下c a 2 + 将n 矿置换出，形成既有机械强度又有弹性的海藻酸钙凝胶。海藻酸钙凝胶不仅材料易 得、价格低廉、无毒害性、机械强度较高等特点，而且具有良好的生物相容性和温和的 溶胶凝胶转变过程，并且三维网状凝胶结构有利于微生物细胞生长代谢和细胞的稳定 化，对于维持生物细胞活性很重要【4 1 1 。 海藻酸盐分子结构如图1 1 所示 4 2 】： h h o 图1 1 海藻酸盐的化学结构，g 是古罗糖醛酸单元，m 是甘露糖醛酸单元 f 培1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fa i g i n a t e ，gr e p r e s e n t sg u l u r o n i ca c i dg r o u p ， mr e p r e s e n t sm a n n u r o n i ca c i dg r o u p 海藻酸钠与c a 2 + 由均相液态转变为凝胶态的机理是：1 个c a 2 + 与2 个g g 单元通过 4 个配位键形成具有2 个六元环结构的稳定螯合物，即蛋格 结构，如图1 2 所示f 4 3 ， “】 o 其基本反应方程式如下： 2 n n a a l g i n a t e + n c a 2 +- n c a 2 + a l g i n a t e + 2 n n a + 6 西北大学硕士学位论文 图i - 2 海藻酸盐与钙离子凝胶的。蛋格”结构 f i g 1 - 2 e g g - b o x ”s t r u c t u r eo fg e l a t i o nw i t ha l g i n a t ea n dc a l c i u mi o n 1 3 3 壳聚糖 壳聚糖( c m ) 是自然界中少见的直链阳离子聚合物，是重要的一类天然生物降解高分 子。壳聚糖是甲壳素在碱性介质中经脱乙酰化反应水解脱去5 0 以上乙酰基制得的一种 聚氨基多糖，它的化学名是聚( 1 ，4 ) 2 一氨基2 脱氧p d 葡聚糖【4 5 】，壳聚糖侧链结构中含 有大量的伯氨基，能够在水溶液中与海藻酸钠等阴离子聚电解质发生络合反应，形成由 聚电解质络合物构成的高分子半透膜。由于壳聚糖无毒，生物相容性好，可生物降解， 资源丰富，价廉易得等特点，已经成为生物医学领域广泛应用的生物材料 4 6 , 4 7 , 4 8 】。 1 3 4 壳聚糖海藻酸钠成膜机理 壳聚糖、海藻酸钠的成膜机理是聚电解质阴离子与阳离子间的库仑力的作用，形成 不溶于水的聚电解质络合物膜。此外分子间的其它相互作用力( 氢键、静电斥力等) 也会 对形成的络合物结构和构象有非常重要的影响。聚电解质水溶液中产生聚离子和带有相 反电荷的小分子离子。在溶液中聚离子的分子链上有一定的电荷密度分布，相互间存在 强大的静电斥力，使分子链比较伸展，并且浓度越稀，离解程度越大。随着聚电解质溶 液浓度增加的增加，由于聚离子能键合的反离子增多，分子链的有效电荷密度相对降低， 静电斥力相应减弱，分子链较为卷曲。所以聚电解质的分子量的大小及其电荷分布密度 是聚电解质的两个最重要的特性，决定了聚电解质在溶液中的构象情况。 壳聚糖一海藻酸钠生物胶囊成膜机理为，壳聚糖分子中存在大量的伯氨基，带正电 荷，海藻酸钠分子中带大量的羧基带负电荷，壳聚糖和海藻酸钠可以通过正负电荷吸引 形成聚电解质膜，其简图如下【4 9 5 0 】： 7 第一章绪论 i i l 3 + h ，+ 一3 + h 一 h 3 h 3 - 图l - 3 海藻酸盐与壳聚糖静电作用示意图 f i g 1 - 3s c h e m eo fe l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e na l g i n a t ea n dc h i t o s a n 1 3 5a c a 液芯微胶囊的制备方法 对于a c a 液芯微胶囊主要有三种制备方法，预凝胶溶解法，一步式液芯法，复合 洼 5 1 ，5 2 ，5 3 1 厶o 1 预凝胶溶解法 预凝胶溶解法是将海藻酸钠滴入c a c l 2 溶液中，在c a 2 + 作用下形成海藻酸钙凝胶， 将海藻酸钙凝胶用壳聚糖( 或聚赖氨酸) 溶液覆膜后，加入螯合剂( 如e d t a 柠檬酸钠等) 又可以将c a 2 + 置换出来，由于壳聚糖是一种带正电荷的聚合物，它在海藻酸盐( 带负电 荷) 周围形成一层半透膜，这层膜在有c a 2 + 的螯合剂或抗凝胶剂存在时不会溶解，而 胶粒内的海藻酸变成了液态，细胞悬浮在囊内生长。这样既有利于细胞的生长，又可以 避开外界的不利环境，保持细胞较高的生理活性，同时可以达到较高的细胞密度。 2 一步式液芯法 一步式液芯法是将壳聚糖和c a c l 2 溶液的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应， 得到了含有壳聚糖沉积层、壳聚糖海藻酸钠络合层和海藻酸钙凝聚层，内部是液态的微 胶囊。或者反向操作将海藻酸钠溶液滴入壳聚糖和c a c l 2 溶液的混合溶液中制成液芯微 胶囊。 3 复合法 复合法是基于上述两种方法，先制备海藻酸钠壳聚糖微胶囊，然后再以双功能团分 子对微胶囊的表面进行修饰。首先将海酸钠溶液乳化、凝胶化，再将凝胶化海藻酸盐与 壳聚糖进行反应形成微胶囊，最后微胶囊用戊二醛、苯四甲酸二酐溶液交联。 针对液滴生成聚电解质络合技术，采用静电液滴生成技术，即静电液滴发生器， 在电场力作用下制备粒径均匀一致的胶珠，然后进行成膜反应。该方法制备的微胶囊形 状规则呈球形，表面光滑，均匀一致，微胶囊大小可控。目前壳聚糖海藻酸盐微胶囊的 制备多采用此法。本实验采用壳聚糖、海藻酸钠利用脉冲电场工艺制备微胶囊，此工艺 8 西北大学硕士学位论文 具有制备条件温和，操作简单易行、载体尺寸可控等优越性。 1 4 壳聚糖的改性 甲壳素经脱乙酰基反应生成壳聚糖，甲壳素不溶于一般的溶剂，而壳聚糖可溶于稀 酸溶液中。壳聚糖是甲壳素n 脱乙酰基的产物，一般而言，n 乙酰基脱去5 5 以上的 就可称之为壳聚糖，或者说，能在1 乙酸或1 盐酸中溶解1 的脱乙酰甲壳素，即可 称为壳聚糖。作为工业品的壳聚糖，n 。脱乙酰度在7 0 以上。n 脱乙酰度在5 5 7 0 的是低脱乙酰度壳聚糖，7 0 8 5 的是中脱乙酰度壳聚糖，8 5 95 的是高脱乙 酰度壳聚糖，9 5 - 1 0 0 的是超高脱乙酰度壳聚糖。n 脱乙酰度1 0 0 的壳聚糖极难 制备。 脱乙酰基的程度( d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o n , 简称d d 值) 代表了脱乙酰单位的比例， 一般定义为：壳聚糖分子链中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百 分数，即壳聚糖分子链上实测的自由氨基含量( 质量分率) 与理论含量( 壳聚糖结构单元全 部脱除乙酰基后的氨基质量分率) 之比【5 4 ，5 5 1 。壳聚糖脱乙酰度直接影响着它的溶解度、 黏度、离子交换能力、絮凝能力及其应用，是产品质量的一项重要指标。 1 4 1 壳聚糖脱乙酰化方法 由海藻酸钠壳聚糖成膜机理可知，壳聚糖分子链中伯氨基的数目越多，即脱乙酰度 越高，壳聚糖的电荷密度越大，与海藻酸钠分子中羧基链接的键数目越多，所成膜性能 越好【5 6 1 。高脱乙酰度的壳聚糖在制备高强度功能性膜、壳聚糖纤维和固定化细胞和酶等 生物医药领域中具有重要应用价值。 图l _ 4 壳聚糖及脱乙酰化分子结构 f i g 1 - 4 s t r u c t u r e so fc h i t o s a na n dc h i t o s a n w i t hd e a c e 姆i a f i o n 甲壳素脱乙酰反应实质上是酰胺的水解，在碱溶液中o h 。作为亲核试剂进攻甲壳素 中乙酰氨基，使其水解为氨基。壳聚糖脱乙酰化的方法主要有微生物法，微波法，超声 波法和碱液法。 9 第一章绪论 1 微生物法【5 7 】 许多制药和酶制剂的发酵过程产生的下脚料中含有真菌的菌丝体，可以从中提取甲 壳素或壳聚糖。例如从柠檬酸发酵废渣中提取甲壳素或壳聚糖，此外还可以从青霉素， 链霉素等发酵废液滤出菌丝体提取甲壳素。国内已经开展了直接培养真菌制取甲壳素或 直接提取壳聚糖。丝状真菌培养法直接生产壳聚糖就是是一种污染小、流程短、质量好 的极有前途的壳聚糖工业生产法。 2 微波法【5 8 】 利用微波处理甲壳素与碱液的混合物，可以大大提高甲壳素的脱乙酰速率，同时还 能缩短反应时间，避免高温长时间处理导致壳聚糖产品的分子量和粘度下降，从而提高 壳聚糖的质量指标。1 9 7 9 年，q e p e n i s t o n 最早把微波法用于壳聚糖的制备，微波合成 技术以其操作简单，反应时间短，耗能低，产品脱乙酰度高等特点成为一种有效的制备 壳聚糖的技术。 3 超声波法5 9 】 将甲壳素加入一定浓度的n a o h 溶液中，将其置于超声波震荡仪的水缸中，升温至 一定温度，开始超声计时进行超声波震荡处理：反应完毕抽滤，9 5 乙醇洗至滤液呈中 性，真空干燥，采用酸碱滴定法测定脱乙酰度。 4 碱液法【删 这种制备壳聚糖的方法是用质量分数4 0 - - 6 0 的浓碱液，在1 0 0 1 8 0 下进行脱 乙酰处理几小时，得到可溶于稀酸的脱乙酰度一般在8 0 左右的壳聚糖，而持续的碱处 理不能有效地脱乙酰基，却会引起壳聚糖分子链的降解。脱乙酰基反应属于亲核取代反 应，o h 为亲核试剂。当o h 浓度较低，d d 很低。随着o h 浓度的增加，d d 迅速上升。 1 4 2 壳聚糖分子量降解方法 分子量对壳聚糖的性质有很大影响，不同分子量的壳聚糖性质差异很大，壳聚糖的 许多独特功能只有在分子量降低到一定程度时才表现出来。针对a c a 液芯微胶囊的制 备，壳聚糖的分子量也是对微胶囊膜强度影响度重要因素，壳聚糖分子量过大，壳聚糖 分子链进入海藻酸盐体系困难，形成的膜较薄，膜强度较低；而壳聚糖分子量过小，虽 然进入海藻酸盐体系的深度较深，形成的膜较厚，但是单个壳聚糖分子的的结合位点较 少，架桥能力差，膜强度依然不高，因此，选择合适的分子量是制备有较好膜强度微胶 囊的关键因素之一。所以应用壳聚糖成膜之前有必要把壳聚糖降解成一定分子量的壳聚 糖。壳聚糖分子量降解的主要方法有酶降解法【6 1 1 、酸水解法( 采用纤维素酶或壳聚糖酶) 1 0 西北大学硕士学位论文 6 2 】、氧化降解法 6 3 】、物理法( 核辐射、紫外辐射、微波处理【删。 1 酶降解法 与其它方法相比，酶降解法具有无副反应、降解条件温和、降解过程及降解产物相 对分子量分布容易控制、制备的低聚壳聚糖生物活性高，产