（化学工程与技术专业论文）表面活性剂和dna之间的作用研究.pdf

摘要 表面活性剂与d n a 之间相互作用的研究 摘要 d n a 与表面活性剂的相互作用因其潜在的作为基因治疗载体的功能 而得到广泛的注视。文献研究显示，虽然当前对表面活性剂与d n a 相互 作用的研究已经有了很大进步，但多数研究集中在d n a 与表面活性剂在 体相中的作用。表面活性剂与d n a 的复合物在空气水界面的吸附状态与 复合物在亲水疏水的细胞膜界面有类似之处。如果能了解其界面结构及组 成进而可通过表面化学操纵改变复合物的吸附性或活性性质。然而由于设 备所限，许多关于d n a 构象凝聚的实验和理论研究还有待发展。同时在 表面活性剂与d n a 相互作用的研究中，研究所选用的表面活性剂品种单 一，以十二烷基三甲基溴化铵阳离子表面活性剂与d n a 之间的相互作用 研究的最多。 本论文在前人对d n a 与阳离子表面活性剂相互作用研究工作的基础 上，着重尝试将最新发展起来的中子衍射技术应用于表面活性剂与d n a 在空气水界面的吸附体系的研究中，以期通过此项研究获得d n a 与表面 活性剂复合物在界面上的大小，形状及结构的定量信息。与此同时设计、 合成并选取了不同种类的新型双子( g e m i n i ) 阳离子表面活性剂和无毒易 生物降解的非离子糖基表面活性剂烷基糖苷。首次研究了以上几种新型表 面活性剂与d n a 之间的相互作用，同时利用中子衍射技术对d n a 与表面 活性剂相互作用进行了研究。以期获得分子水平的信息，并得出其中规律 太原理工大学博士研究生学位论文 性的因素。 本论文共由六部分研究内容组成：1 d n a 和表面活性剂相互作用的研 究进展；2 十二烷基三甲基溴化铵阳离子表面活性剂与负电性d n a s 分子 的复合物在空气水界面的吸附：3 不同头尾基结构的季胺盐表面活性剂对 于表面活性剂d n a 复合物的影响；4 不同盐型的双子( g e m i n i ) 季铵盐表 面活性剂与d n a 在空气水界面吸附作用的研究；5 非离子表面活性剂烷 基糖苷的合成工艺研究；6 非离子表面活性剂烷基糖苷与d n a 相互作用的 研究。主要研究成果如下： 首次成功的运用中子衍射技术，配合以表面张力和表面压力的测试， 对十二烷基三甲基溴化铵阳离子表面活性剂与小牛胸腺d n a ( 5 0 ，0 0 0 碱基 对) ，鲑鱼精d n a ( 3 0 0 碱基对) 之间的作用进行了研究。得到了十二烷基三 甲基溴化铵阳离子表面活性剂d n a 复合物在空气水界面层的吸附数据及 具体的结构信息。研究结果证实在空气水界面，十二烷基三甲基溴化胺与 d n a 分子的键合分为两个阶段。第一阶段由于阳离子表面活性剂与带负电 的d n a 分子的强烈静电作用，二者之间的键合改变了表面膜的性质和表 面单层的结构排列。第二阶段随着键合在d n a 分子上的表面活性剂的增 加，d n a 分子在界面上发生卷缩导致界面层变厚。 对不同头尾基结构的季胺盐表面活性剂与d n a 复合物的影响，研究 结果显示对于单头基单尾基( 十二烷基三甲基溴化铵) 、单头基双尾基( 双 十二烷基二甲基溴化铵) 和双头基双尾基( c 1 2 一c 6 c 1 2 双十二烷基双季铵盐) 三种季铵盐表面活性剂，在空气水界面上以双头基双尾基( c 1 2 c 6 c 。：双 十二烷基双季铵盐) 的双子表面活性剂卷缩d n a 分子的效率最高。 i i 摘要 进一步的不同盐型的三种双子( g e m i n i ) 型季铵盐表面活性剂的中子 衍射实验结果与表面张力的测定结果均显示双十二烷基双季铵硫酸盐与 d n a 的作用，较双十二烷基双季铵氟盐和双十二烷基双季铵溴盐略强。证 实了反离子对表面活性剂与d n a 之间的作用有影响。 此外，从作为基因载体的安全性考虑，我们合成了不同碳链结构的无 毒易生物降解的非离子表而活性剂烷基葡糖苷并比较了不同碳链结构的 脂肪醇对合成反应的影响。研究考察了烷基葡糖苷表面活性剂与d n a 之 间的作用。研究结果显示其可与d n a 发生较强的相互作用，且作用强度 强于一般的非离子表面活性剂。这使得在未来的研究中探索使用阳离子 非离子表面活性剂复配体系进行d n a 的控制传输具有较广阔的前景。 关键词：d n a ，中子衍射，十二烷基三甲基溴化铵阳离子表面活性剂 双十二烷基双季铵盐双子表面活性剂，烷基糖苷 i i 查堕堡三查堂堕主堑窒竺堂垡丝苎 s t u d yo ft h e ln t e r a c tio nb e t w e e n s u r f a c t a n t sa n dd n a a b s t r a c t i n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n dc a t i o n i cs u r f a c t a n th a sb e e np a i dm u c h a t t e n t i o nd u et oi t si m p l i c a t i o n sf o rg e n et h e r a p y , ac o n c e p t u a l l yi l e wa p p r o a c h f o rt h et r e a t m e n to fh u m a nd i s e a s e a l t h o u g ht h ei n t e r a c t i o no fd n a c a t i o n i c s u r f a c t a n ts y s t e mh a sb e e nf u l l ys t u d i e d m a n ys t u d i e s a r ef o c u s e do nt h e b e h a v i o r si nb u l ks o l u t i o n a d s o r p t i o na t a i r w a t e ri n t e r f a c eo fc o m p l e x e s f o r m e db yd n aa n ds u r f a c t a n tc o m p l e x ，w h i c ha r el i k e l yt oi n t e r a c tb e t w e e n d n a s u r f a c t a n tc o m p l e xa n dc e l lm e m b r a n e b ym a k i n gc l e a rt h ei n t e r r a c i a l s t r u c t u r e ，w ec a r lc o n t r o lt h ei n t e r f a c i a la d s o r p t i o no fs u r f a c t a n ta n dt h e r e f o r e a d i u s tt h ei n t e r f a c i a la c t i v i t y h o w e v e r , b e c a u s eo fl e s se f f i c i e n tt e c h n i q u e s ，t h e i n t e r f a c i a lb e h a v i o ro fd n a s u r f a c t a n tc o m p l e x e sh a sr e c e i v e dr e l a t i v e l yl i t t l e a t t e n t i o nb o t ht h e o r e t i c a l l ya n de x p e r i m e n t a l l y m e a n t i m e ，t h e s u r f a c t a n t s ， w h i c hu s e di ns t u d yb e t w e e ns u r n c t a n t sa n dd n a ，a r er e l a t i v e l ys i n g u l a r i t y c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) i s t h em o s to f t e nu s e do n e ， b a s e do np r e v i o u sr e s e a r c hr e s u l t so nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n a a n d c a t i o n i cs u r f a c t a n t ，i nt h i sd i s s e r t a t i o nw i t ha i do fn e u t r o nr e f l e c t i o nt e c h n i q u e w ed u tt h ee m p h a s i so nt h es t u d ya tt h ea i r w a t e ri n t e r f a c e b ym a k i n gc l e a rt h e i n t e r f a c i a li n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n aa n dc e t y l t f i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) ，w e f u r t h e r m o r ed e s i g n a n d s y n t h e s i z e s o m en e wt y p e o f g e m i n i c a t i o n i c s u r f a c t a n t sa s w e l la san o n t o x i c s u g a r b a s e d n o n l o n l c a 廿3 l k a l l s u r f a c t a n ta l k y lp o l y g l u c o s i d e ( a p g ) f o rt h e f i r s t t i m e ，w eu s e n e u t r o n r e f l e c t i o nt e c h n i q u et os t u d yt h ea d s o r p t i o no ft h ea b o v es u r f a c t a n ts a m p l e si n t h ep r e s e n c eo fd n a ，i no r d e rt o g e ta ni n s i g h t i n t ot h em o l e c u l a r l e v e l i n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n ds u r f a c t a n t sa n dm a k ec l e a rt h em e c h a n i s ml y i n g b e h i n d t h i sd i s s e r t a t i o nc o n t a i n ss i xp a r t s ：1 r e s e a r c hp r o g r e s so nt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nd n aa n ds u r f a c t a n t ；2 a d s o r p t i o na ta i r w a t e ri n t e r f a c eo fc o m p l e x e s f o r m e db yd n aa n dd o d e c y lt f i m e t h y lb r o m i d e ；3 t h ei n f l u e n c eo fq u a t e r n a r y a m m o n i u ms u r f a c t a n tw i t hv a r i o u sh e a dg r o u pa n da l k y lc h a i ns t r u c t u r eo nt h e f o r m e dd n a s u r f a c t a n tc o m p l e x ；4 a d s o r p t i o na ta i r w a t e ri n t e r f a c eo f c o m p l e x e sf o r m e db yd n aa n dg e m i n iq u a t e r n a r ya m m o n i u m w i t hd i f f e r e n t c o u n t e ri o n s ；5 s t u d yo nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n ds u g a r b a s e d n o n i o n i cs u r f a c t a n ta n d6 s t u d yo nt h es y n t h e s i sd i f f e r e n c e sb e t w e e na l k y l p o l y g l u c o s i d e s o fn a t u r a la l c o h o la n do x o a l c o h 0 1 r e s e a r c hr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： f o rt h ef i r s tt i m e ，n e u t r o nr e f l e c t i o nt e c h n i q u ec o m b i n e dw i t hs u r f a c e p r e s s u r ea n ds u r f a c et e n s i o nm e a s u r e m e n t s ，t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nd o d e c y l t r i m e t h y lb r o m i d e ( c t a b ) a n ds a l m o n t e s t e s d n a ( 3 0 0b a s ep a i r ) a n dc a l f t h y m u sd n a ( 5 0 ，0 0 0b a s ep a i r ) w e r es t u d i e d a d s o r p t i o n d a t aa n dt h e s t r u c t u r a li n f o r m a t i o no fd n a c t a bc o m p l e xa ta i r w a t e ri n t e r f a c ew e r e o b t a i n e d b i n d i n go fc t a bo nd n aa ta i r w a t e ri n t e r f a c ec a r lb ed i v i d e di n t o t w os t a g e s i tc a l lb ed e d u c e dt h a ts t r o n g l ya b s o r b e db e t w e e nd n a sa n d c 1 2 t a bi m p o s ean e wp a c k i n ga r r a n g e m e n to ft h em o n o l a y e ra tt h ef i r s ts t a g e s t h r o u g hs u r f a c ep r e s s u r em e a s u r e m e n t a tt h es e c o n ds t a g ea c c o m p a n yw i t h t h es u r f a c t a n tc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e ，d n a c t a bc o m p l e xi n t e r f a c el a y e r b e c o m et h i c k e r ，i n d i c a t i n gt h ec o n d e n s a t i o no fd n am o l e c u l e s t h ei n f l u e n c e so fq u a t e r n a r ya n a r n o n i u ms u r f a c t a n tw i t hv a r i o u sh e a da n d v 太原理工大学博士研究生学位论文 t a i l sg r o u po nt h ef o r m e dd n a s u r f a c t a n tc o m p l e xw e r es t u d i e d t h es t r u c t u r e o fc o m p l e x e sf o r m e db yt h e s et h r e es a m p l e s ，s i n g l e h e a d g r o u p ，s i n g l ea l k y l c h a i n c t a b ，s i n g l e h e a d g r o u p ，d o u b l e - a l k y l c h a i n d i d o d e c y l d i m e t h y l a n l m o n i u mb r o m i d e d d a ba n dd o u b l e - h e a d g r o u p ，d o u b l e a l k y lc h a i n d i d o d e c y ld i m e t h y l d i a m o n i u mb r o m i d ec 1 2 - c 6 - - c 1 2 a n dd n aa ta i r w a t e r i n t e r f a c ea sw e l la sb u l kp h a s ei se x a m i n e db yn e u t r o nr e f l e c t i o na n ds m a l l a n g l en e u t r o ns c a t t e r i n g o b t a i n e dc o n c l u s i o n sa r et h a tg e m i n is u r f a c t a n ti st h e m o s te f f i c i e n tc o m p a c t i n ga g e n tf o rd n aw h e t h e ra ta i r w a t e ri n t e r f a c eo ri n b u l kp h a s ea n di sap r o m i s i n gc a n d i d a t ef o rg e n ed e l i v e r y a d s o r p t i o na t a i r w a t e ri n t e r f a c eo fc o m p l e x e sf o r m e db yd n aa n d g e m i n iq u a t e r n a r ya m m o n i u mw i t hd i f f e r e n tc o u n t e ri o n si e d i d o d e c y l d i q u a t e m a r y a m m o n i u mb r o m i d e ，d i d o d e c y ld i q u a t e m a r y a m m o n i u mf l u o r i d e a n dd i d o d e c y ld i q u a t e m a r y a m m o n i u ms u l f a t ea r es t u d i e d n e u t r o nr e f l e c t i o n r e s u l t sh a v eag o o da g r e e m e n tw i ms u r f a c et e n s i o nd a t ai nt h a tt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nd n aa n ds u l f a t eg e m i n is u r f a c t a n ti ss t r o n g e rt h a nt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nd n aa n df l u o r i d ea n db r o m i d eg e r n i n is u r f a c t a n t s a st h eg e n ed e l i v e r yc a r r i e r , s a f e t yi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r s t h e r e f o r ew es y n t h e s i z et h en o n t o x i cs u g a rs u r f a c t a n ta l k y lp o l y g l u c o s i d ea n d s t u d i e so nt h es y n t h e s i sp r o c e d u r e s t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nn o n t o x i cs u g a r s u r f a c t a n ta l k y lp o l y g l u c o s i d ea n dd n aw a ss t u d i e d e x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o wt h a ta l k y lp o l y g l u c o s i d ec a ni n t e r a c tw i t hd n a ，m u c hs t r o n g e rt h a no t h e r n o n i o n i cs u r f a c t a n t s t h i sm a k e sap o t e n t i a lb r e a k t h r o u g hf o rc h o o s i n gt h e m i x e dc a t i o n i c n o n i o n i cs u r f a c t a n ts y s t e ma sg e n ed e l i v e r yc a r r i e r k e yw o r d s ：d n a ，n e u t r o nr e f l e c t i o n ，a l k y lp o l y g l u c o s i d e ， d o d e c y it r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，d i d o d e c y l d i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e a l k a n e d i y l a ，p - b i s ( d o d e c y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ) ， v i 第一章文献综述和课题选择 第一章文献综述和课题选择 聚合物与表面活性剂在水溶液中的相互作用由于其在科研和生产很多领域中的应 用而被广泛研究( 1 5 】。d n a 由于每个核酸单元上都连有负的磷氧基而可被视做高度负 电性的聚合物。它与表面活性剂相互作用形成沉淀可用来对d n a 进行分离、纯化6 1 ， 形成的复合物在分子生物学如基因载体 7 和新材料如非线性的光学材料，电致发光设 备，固态激光染料等的应用中都具有一定的实用价值”。 1 表面活性剂和d n a 之间相互作用的研究现状 处于水溶液中的链状大分子，当温度或溶剂性质改变时都会从空间舒展构象转变 为紧密堆积构象。这种急剧的构象转变在许多化学及生理现象中都扮演着重要角色， 如d n a 凝聚【9 】、蛋白质交叠【l o 】及合成大分子在溶液中的行为 1 h 。d n a 般以多种构 相形式存在，其中四种( a 、b 、c 、d 型) 为右手螺旋，而z 型为左手螺旋，d n a 在溶液中的构象强烈依赖于溶液环境，如离子强度、p h 等。在活体细胞中，天然状态 的d n a 通常都以密集堆积方式存在【1 2 】。近年来，分子生物学的飞速发展使得基因疗法 成为一种很有希望的分子水平的治疗方法 1 3 ，基因疗法的关键是基因d n a 能够在载体 的携带下通过细胞膜进入细胞内部【1 4 叫5 1 ，而各种表面活性剂与d n a 相互作用形成复 合物作为非病毒基因输送载体由于其诸多优越性而受到广泛关注1 6 “8 1 。然而至今还没 有报道对表面活性剂与d n a 作用形成复合物过程的机理给出全面准确的解释。 一般说来，能够与d n a 发生强烈相互作用的表面活性剂都会对其构象发生影响， 并生成复合物。在对d n a 和表面活性剂相互作用形成的复合物的研究中，测试手段的 选取较为困难。目前的研究多是通过对复合物的各种物化参数如粒径分布，形状、物 理状态、z e t a 电位及熔解温度，吸附等温线等进行表征，复合物的不同理化性质及形 态标志着不同种表面活性剂与d n a 的不同的作用方式。d n a 与表面活性剂相互作用 中，基于构象变化的单分子水平研究主要有以下几种，选取的d n a 链长适中且浓度较 稀以保证仅有构象变化而不出现相分离【l ”。 太原理工大学博士研究生学位论文 1 1d n a 热变性实验 众所周知，温度升高到一定值一般会导致d n a 变性，因变性过程类似于晶体熔解 因此称为d n a 的熔解。以吸光度对温度作图取吸光度突跃的中点对应的温度为d n a 的熔解温度。不同种属的d n a 具有特有的主要由碱基对间氢键强弱决定拉0 1 。李来 生等 2 1 1 选用荧光分光光度计固定最佳激发波长和最佳发射波长( k = 5 3 5 n m ， k 。= 5 9 5 n m ) 测量不同温度下体系的荧光强度。用荧光强度对温度作图，即得d n a 的 热变性曲线图。结果显示，阳离子表面活性剂c t a b ( 十六烷基三甲基溴化铵) 使d n a 溶解温度明显下降即d n a 稳定性降低，其次是非离子表面活性剂t r i t o nx - 1 0 0 ( 壬基 酚聚氧乙烯醚) 和阴离子表面活性剂s d s ( 十二烷基苯磺酸钠) 。这标志着从热变性角 度也证实，阳离子表面活性剂与d n a 之间的作用最强。尽管，阳离子表面活性剂与 d n a 之间存在着强烈的静电作用，但是如前所述t 。取决于碱基对之间的氢键强弱， 因此静电作用不应对t m 有较大影响，对此李来生等认为d n a 与表面活性剂之间存在 着“预胶束”及胶束，而一般胶束内部相对水溶液极性较低、粘度较高，使得处于胶束 内的d n a 感受的微环境不同，碱基对的氢键和疏水作用下降从而导致其t m 降低【2 0 】。 非离子表面活性剂由于可使溶液的极性降低，增加碱基对的溶解性，使碱基配对能力 下降，因此也可使t 。降低22 1 。另外，由于d n a 为一双链螺旋结构。其基本单位为核 苷酸，同一链上核苷酸与核苷酸之间以共价键结合，两个d n a 链之间的碱基对以氢键 结合f 2 0 1 。对于核苷酸的紫外吸收光谱在2 6 0 n m 处有一最大吸收峰，但吸收小于所有核 苷酸的总和，在d n a 变性后( 即双链解开) 吸收增强即所谓增色效应【1 9 l ，在研究d n a 与表面活性剂相互作用时观察其紫外吸收光谱强度即可判断双链间氢键受外界表面活 性剂的影响，因此也可用紫外分光光度计代替荧光光度计做类似实验【2 0 】。 i 2 表面活性剂与d n a 分子的两阶段键合模式及构象转变 一般认为阳离子表面活性剂与d n a 的键合可分为两个阶段2 3 27 1 。第一阶段，由 于静电吸引作用，表面活性剂与凝聚在d n a 分子链上的反离子交换，键合引起的熵损 失由反离子向体相的扩散补偿，高效毛细管电泳证实第一阶段d n a 链的净电荷基本不 2 第一章文献综述和课题选择 变。在第二阶段，即表面活性剂浓度达到一一定值时，丌始以协同方式与d n a 分子发生 键合。s p i n k 等2 7 1 认为第二阶段协同键合本质上是表面活性剂非极性链之间的疏水缔合 推动的。由键合协同性所获得的稳定化能正是疏水链之间“肩并肩”缔合的结果。这种 缔合方式使得烷基链尽可能的靠拢在d n a 分子表面，形成聚集体从而最大的避免与水 的接触。不过此时聚集体仍然只能部分的将水分子排除于缔合区之外。只有当复合物 发生凝聚后疏水烷基链才会象胶束和囊泡那样完全地包埋于复合物内部。因此可以认 为在第二阶段的协同键合过程中，表面活性剂非极性链的疏水作用起着关键作用。关 于第二阶段键合的协同性已经被键合等温线证明【2 8 】。 目前各种文献中对d n a 与表面活性剂形成的聚集体有称作表面活性剂的胶束状 聚集体( m i c e l l e l i k ea g g r e g a t e s ) ，也有称作“混合胶束”( m i x e d m i c e l l e ) 。后者似乎更为合 理，因为d n a 链上也存在着疏水区，所以最终形成的复合物很可能是d n a 链上的疏水 部分也参与了胶束的形成。形成的聚集体可看作一个大的多价离子，其进一步导致d n a 构象缩拢，这与以前发现的精胺、亚精胺等简单高价离子可以诱导d n a 构相变化类似 【2 9 】。结合聚电解质与带相反电荷的离子表面活性剂相互作用的知识，d n a 与阳离子表 面活性剂的可能作用过程如图1 1 。 图1 1d n a 与阳离子表面活性荆相互作用过程示意图 p ：聚合物单元s ：表面活性剂 一：静电作用：疏水作用 f i g1 1s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o no f t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n a a n dc a t i o n i cs u r f a c t a n t 太原理丁大学博士研究生学位论文 另外有人认为表面活性剂与d n a 的相互作用为一“全或无”的过程，即只有当表面 活性剂将一个d n a 分子链完全饱和后，才会与另一个d n a 分子开始键合【3 。而n i k a s 等【3 1 1 通过实验及理论证实，非离子聚合物与表面活性剂的相互作用如p v p 与s d s ，在 临界聚集浓度( c a c ) 时链上仅有一个胶束，当所有链上都存在一个胶束后才会继续在聚 合物链上形成第二个胶束，这说明聚电解质与非离子聚合物和表面活性剂相互作用存 在着很大的区别。一般认为表面活性剂与d n a 磷酸根摩尔比为1 ：1 时复合物呈电中 性，而b l e s s i n g 等吲在对阳离子表面活性剂与d n a 形成的复合物进行电位测定时发现 在表面活性剂与d n a 浓度比达1 5 时复合物的电位仍在一4 5 m v 一4 0 m v 之间， b l e s s i n g 等【3 2 1 认为该现象是由于表面活性剂的疏水链倾向于包埋于复合物内部而使得 部分d n a 负电荷暴露于复合物与水的界面而使电位呈较高的负值。 m e l ，n i k o v 等 3 3 1 利用荧光显微镜对单个d n a 分子的构象变化观察发现，d n a 分子 在阳离子表面活性剂c t a b 的诱导下会发生由线圈向小球的构象转变，即d n a 分子发 生凝聚( 如图1 2 ) 。通过对荧光照片中d n a 分子的长轴长度( 荧光照片中一个d n a 分子轮廓图的最长直径) 的测量可以表征d n a 的构象变化，结果表明c t a b 浓度小于 9 4 x 1 0 。6m o ll - 1 时，d n a 都以线圈态存在( 图2 a ) ，当c t a b 浓度为20 x 1 0 5 m o ll - 1 时d n a 全部以小球状态存在( 图2 c ) ，在这个浓度区间内线圈与小球态共存( 图2 b ) 。 图1 2 c t a b 诱导d n a 由线圈向小球构象转变的荧光照片 f i g l2m i c r o g r a p hf o rt h ec o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o no f d n a f i o mc o i lt og l o b u l ei n d u c e db yc t a b 在共存区线圈态的d n a 被认为处于亚稳态，放置一段时间后会自动向小球态转 变。中间两种状态共存区及亚稳态的存在进步说明了d n a 与表面活性剂相互作用为 4 第一章文献综述和课题选择 “全或无”的刁i 连续过程。表面活性剂与各个d n a 分子相互键合的不连续导致d n a 分子构相变化的不连续。从动力学角度来说共存区只能在一定时间内存在，可看作类 似于溶液的过冷或过饱和状态。另外m e l n i k o v 等【3 3 】还通过在载玻片上滴一滴较浓 c t a b 溶液利用其在载玻片上形成浓度梯度，对其与d n a 的键合过程利用荧光显微镜 观察证实每一个凝聚态复合物仅包含一个d n a 分子。一般选取阳离子表面活性剂与 d n a 相互作用时其链长不应超过1 6 个碳，因为链长超过1 6 碳原子的阳离子表面活性 剂很难溶于水，更重要的是较长链的表面活性剂分子由于其与d n a 分子链的强烈的缔 合及聚集作用可能导致d n a 双链内碱基对的氢键被破坏【3 4 j 。 1 3d n a 与表面活性剂相互作用的动静态光散射研究 如前所述，d n a 与表面活性剂相互作用会生成处于凝聚状态的复合物可以作为基 因输送的载体，但是作为基因载体的复合物其尺寸应被限制在1 5 0 n m 以内，只有符合 此要求才能保证细胞内吞( 复合物进入细胞的重要途径) 正常进行以及确保复合物通 过血管3 5 。因此对d n a 与表面活性剂形成复合物的粒径进行测量是必要的，同时以粒 径分布对表面活性剂浓度作图可以考察d n a 与表面活性剂的键合情况 3 6 1 ，如 m e l n i k o v 等2 8 1 以复合物粒径分布对表面活性剂浓度作图发现在一定表面活性剂浓度 区间内粒径分布呈明显的双峰分布，这正是由两种不同粒径构象( 线圈与小球) 共存 而导致的。荧光显微镜得到的d n a 复合物的荧光镜象由于仪器本身的分辨率及电视镜 头的强光效应”1 而不能用来估算粒径，因此一般采用动态光散射技术测定复合物颗粒 的平动扩散系数。由平动扩散系数以s t o k e s e i n s t e i n 公式为基础，根据z i m m 模型计算 出复合物的水力学半径【3 7 】。m e l n i k o v 等测得在c t a b 作用下d n a 的体积缩小了约5 倍多，可见二者的相互作用非常强烈。需要指出，由于线圈态d n a 的空间密度很低所 以由动态光散射测得的线圈半径一般小于实际半径 3 3 】。另外由静态光散射可测出复合 物的质均分子量，根据d n a 的分子量及表面活性剂的分子量及键合度即可估计出每个 复合物中几个d n a 分子及表面活性剂的聚集数。 太原理工大学博士研究生学位论文 1 4 荧光光谱法对d n a 构象变化及d n a 复合物疏水区的研究 荧光光谱法利用荧光的淬灭来研究d n a 的构象变化，一般选用的探针在以自由状 态存在于溶液中时基本不发荧光，但与其它分子相互作用后其荧光强度大大增强，如 溴化乙锭( e b ) 与d n a 相互作用时嵌入d n a 的碱基对之间发出荧光，当d n a 发生 剧烈的构象变化时会将e b 挤出而使荧光淬灭f 3 8 】。c l a m m e 等选取e b 为探针，以荧 光强度对c c t a e c d n a 作图，结果发现随c t a b 浓度的增加荧光强度逐渐减小，表明部 分d n a 的构象缩拢。在c c t a b c d n a = 5 时荧光强度减小到e b 自由溶液水平表明此时 构象完全缩拢。1 ，6 二：苯基己三烯( d p h ) ，在水溶液中不发荧光，通常用来表征囊 泡及双层膜的疏水内核f 38 1 。以d p h 为探针对c t a b d n a 荧光光谱进行观察，结果表 明c c t a b c o n “= 1 以前表面活性剂全部处于胶束状区域，这与第二阶段键合过程疏水作 用的重要性是一致的。使用对所处环境非常敏感的奈尔红为探针研究表明，d n a 表面 活性剂相互作用形成的胶束状区域与c t a b 胶束内核的微环境非常类似。另外由实验 得到的荧光光谱的协同性亦可说明d n a 由线圈向小球的转变的不连续构象变化。 1 5p h 控制的两性表面活性剂诱导d n a 构象缩拢 以上介绍的是目前对烷基三甲基溴化铵类表面活性剂与d n a 相互作用的研究进 展，y u l i a 等对十二烷基二甲基氧化铵( d d a o ) 与d n a 的相互作用进行了系统研 究。d d a o 的特别之处在于随着溶液p h 值的降低d d a o 将由阳离子表面活性剂转变 为非离子表面活性剂，因此通过调节p h 即可控制表面活性剂与d n a 的相互键合强弱。 在该研究中y u l i a 等发现存在一个临界p h ，在此值之前只需要极低的表面活性剂浓度 就可诱导d n a 构象变化，该p h 值可认为是d d a o 被完全质子化即完全转变为阳离子 表面活性剂的临界值，该值低于d d a o 单独存在的完全质子化临界值，这是由于d d a o 与d n a 之间强的静电作用导致的。小角x 光衍射对d d a o 与d n a 相互作用生成的 沉淀分析发现复合物为六角状排布，具体结构目前尚不清楚。d d a o 的一个特点是当 其质子化程度低于某一值时( 完全以非离子表面活性剂存在) ，无论其浓度如何改变都 不会与d n a 发生键合。王毅琳等利用d d a o 这一特性通过改变溶液p h 值及溶液 第一章文献综述和课题选择 离子强度研究了表面活性剂胶束与d n a 的相互作用。d n a 与表面活性剂胶束相互作 用可看作是一种简单的静电作用，因此二者的作用完全取决于胶束表面电荷密度，而 胶束表面电荷密度又随溶液离子强度增加呈线形增加。在一定的临界质子化度及离子 强度值时胶束会发生从球状向棒状的转变。随这一临界点位置不同，d n a 与胶束形成 的复合物，从线圈向小球转变的位置也相应改变。从而证明d n a 和复合物相互键合与 d n a 的构象变化是个伴生过程，二者同时发生属同一现象。 1 6 关于d n a 构相变化的理论讨论 作为聚电解质的一种，由舒展线圈向致密小球的构象变化并非为d n a 所特有，许 多大分子都具有的此性质 4 2 】，m e l n i k o v 等【3 3 】利用统计物理学处理对线形大分子的自由 能使用v i f i a l 展开式得到下式： 型：黑+ n b n + n c n ：+ ；( n ，) (11)kt 8 n 矿 、 、 该式中g ( n ) 为大分子的自由能，n 为同一大分子内链结数，r 为链结问分子链的 最大长度。九为大分子的持续长度，n 为单位体积内链结密度：b 、c 分别为第二、第 三v i r i a l 系数。当b 0 ，由于分子内部强烈的斥力，大分子将以线圈态存在，在此情况 下，忽略( 1 ) 式中第三项以及考虑条件o g i o r ：0 及* n r ，得： 善硎o c n 3 7 5 ( 1 2 ) 当b t 时，该试剂分子才能诱导d n a 发生急剧的构象变化。反之，大分 子链如一般的单链d n a ，其持续长度在2 - 3 n m 之间，在外加试剂的诱导下般会发生 连续的构象变化。 1 7 表面活性剂与d n a 形成复合物用于基因输送 如前所述阳离子洗涤剂类表面活性剂会诱导d n a 从线圈型向小球型的转变，且每 一个小球仅含一个d n a 链。然而由于该类表面活性剂有较高的水溶性，在细胞周围会 由于溶解而将d n a 链解聚，并导致与洗涤剂相关的细胞毒性，因而不能用来进行细胞 转染f 4 6 】。c l a m m e 等利用非离子及阴离子囊泡模拟细胞膜的内外表面，考察了 c t a b d n a 复合物低转染效率且有细胞毒性的原因( 图1 3 ) 。如图1 3 a ，当c t a b 与 d n a 形成的复合物由于疏水作用靠近非离子囊泡时，c t a b d n a 复合物的胶束状区域 打开，c t a b 进入囊泡的脂质体双层，使得双层表面带正电，d n a 链通过静电作用附 着于囊泡表面，但不能进入囊泡内部。图1 3 b 中c t a b 进入阴离子囊泡使得囊泡表面 呈电中性，而将d n a 链释放于体相中，同时c t a b 的中和使得阴离子囊泡不稳定而被 破坏( 对应于细胞中内吞核小体将d n a 释放于细胞质中) ，这样会促进转染，这与非 离子脂质体与阳离子表面活性剂混合使用可以提高转染效率的机理类似【4 ”，但同时该 条件下部分c t a b 存在于囊泡中( 对应于细胞膜或质膜) 会导致细胞毒性。综上原因， c t a b 转染效率低的原因是其不易通过非离子囊泡即细胞膜而进入细胞，而即使其能 顺利进入细胞又会导致细胞毒性。 第一章文献综述和课题