（生物医学工程专业论文）蛋白质亚细胞定位方法研究和网络预测平台构建.pdf

蛋白质钏胞定位方法研究和网络预测平台构建 摘要 a b s t r a c t s u b c e l l u l a rl o c a t i o no l 、ap r o t e i ni so n eo ft h ek e yf u n c t i o n a lc h a r a c t e r sa s p r o t e i n sm u s tb el o c a l i z e dc o r r e c t l ya tt h es u b c e l l u l a rl e v e lt oh a v en o r m a lb i o l o g i c a l f u n c t i o n i nt h i st h e s i s ，an o v e lm e t h o dn a m e dl o c s v m p s ih a sb e e ni n t r o d u c e d ， w h i c hi sb a s e do nt h es u p p o r tv e c t o rm a c h i n e ( s v m ) a n dt h ep o s i t i o n s p e c i f i cs c o r i n g m a t r i xg e n e r a t e df r o mp r o f i l e so fp s i b l a s 工w i t haj a c k k n i f et e s to nt h er h 2 4 2 7 d a t as e t ，l o c s v m p s ia c h i e v e dah i g ho v e r a l lp r e d i c t i o na c c u r a c yo f9 0 ：2 ，w h i c hi s h i g h e rt h a nt h ep r e d i c t ! o nr e s u l t sb ys u b l o ca n de s l p r e do nt h i sd a t as e t i na d d i t i o n ， p r e d i c t i o np e r f o r m a n c eo fl o c s v m p s lw a se v a i u m e dw i t h5 - f o l dc r o s sv a l i d a t i o n t e s to nt h ep k 7 5 7 9d a t as e ta n dt h ep r e d i c t i o nr e s u l t sw e r ec o n s i s t e n t l yb e t t e rt h a nt h e p r e v i o u sm e t h o db a s e do ns e v e r a ls v m su s i n gc o m p o s i t i o no fb o t ha m i n oa c i d sa n d a m i n oa c i dp a i r s f u r t h e rt e s to nt h es w i s s p r o tn e w - u n i q u ed a t as e ts h o w e dt h a t l o c s v m p s ia l s op e r f o r m e db e t t e rt h a ns o m ew i d e l yu s e dp r e d i c t i o n 。m e t h o d s ，s u c h a sp s o r t l l ，t a r g e t pa n dl o c n e t a l lt h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tl o c s v m p s ii sa p o w e r f u lt o o lf o rt h ep r e d i c t i o no f e u k a r y o t i cp r o t e i ns u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a no n l i n ew e bs e r v e r ( c u r r e n tv e r s i o ni s1 3 ) b a s e do nt h i sm e t h o dh a sb e e n d e v e l o p e da n di sf r e e l ya v a i l a b l et ob o t ha c a d e m i ca n dc o m m e r c i a lu s e r s ，w h i c hc a n b ea c c e s s e db ya th t t p ：b i o i n f o m a a t i c s u s t c e d u , c n l o c s v m p s i l o c s v m p s i p h p 蛋白质亚自l l 胞定位方法研究和网络预删平台构建 第一章绪论 第一章绪论弟一早三：百化 1 1 基于计算方法的蛋白质亚细胞定位预测 自从1 9 9 0 年美国启动人类基因组计划以来，人与模式生物基凼组的测序工 作进展极为迅速。迄今已完成了约4 0 多种生物的全基因组测序工作，人基因组 约3 x 1 0 9 碱基对的测序工作【f i 接近完成。至2 0 0 0 年6 月2 6 日，被誉为生命“阿 波罗计划”的人类基因组计划，经过美、英、日、法、德和中国科学家的艰苦努 力，终于完成了工作草图，这是人类科学史上又个里程碑式的事件。它预示着 完成人类基因组计划己经指日可待。截【t 到日前为止，仅登录在美国g e n b a n k 数据库中的d n a 序列总量已超过7 0 亿碱基对。在人类基因组计划进行过程中 所积累起来的技术和经验，使得其它生物基因组的测序工作可以完成得更快捷。 可以预计，今后d n a 序列数据的增长将更为惊人。生物学数据的积累并不仅仅 表现在d n a 序列方面，与其同步的还有蛋白质的一级结构，即氨基酸序列的增 长。此外，迄今为止，已有一万多种蛋白质的空问结构以不同的分辨率被测定。 基于c d n a 序列测序所建立起来的e s t 数据库其记录已达数百万条。在这些数 据基础上派生、整理出来的数据库已达5 0 0 余个。这一切构成了一个生物学数据 的海洋。对这些序列数据的分析处理是现在计算分子生物学的主要工作 1 】【2 。 功能注释的研究工作力求能够揭示蛋白质在细胞环境中所扮演的角色，比如找出 代谢通路和构建蛋白相互作用网络等等。 真核细胞能够合成大约1 0 0 0 0 种不同的蛋白质，而每种活性蛋白质都处于一 个或者多个特定的细胞器中。蛋白质要正常的发挥功能，必须处于自己特定的亚 细胞定位中，因此蛋白质能够最终被运送到正确的亚细胞定位对其功能的发挥起 到了至关重要的作用。个新合成的蛋白质被传输到目标定位的过程通常被叫做 p r o t e i n t a r g e t i n g 或者p r o t e i ns o r t i n g 。蛋白质传输的失败会导致许多人类疾病，比 如癌症或者a l z h e i m e r 病 3 4 j 5 。计算生物学的方法力求找到自动的大通量的 方法来预测每种蛋白质的亚细胞定位。这种计算方法对生物实验是非常重要的指 导和补充。蛋白质亚细胞定位预测方法的改进是近几年计算生物学和生物信息学 研究中很活跃的领域 6 j 7 】。蛋白质定位过程的复杂性，不同的传输通路，以及 蛋白质亚纠胞定位方法研究和网络预测平台构矬第一章绪论 每种细胞器中完整蛋白质数据的缺乏等问题给蛋白质亚细胞定位预测方法的研 究提出了非常大的挑战。， ， 真核细胞中有至少1 0 种主要的亚细胞定位，其中的几个亚细胞定位还可以 被进一步划分为更小的定位。细胞中的每种细胞器有自己独特的并且自足的功 能。它们被认为是由原核细胞和细菌的内共生进化而来f 8 1 。细胞内大部分蛋白 质是由细胞核d n a 编码，只有很小一部分蛋白质是由叶绿体或者线粒体d n a 编码。细胞中一个非常精确传输机制保证了每种蛋白能够最后到达正确的目的地 【9 1 0 。 m r n a 在细胞核周围的细胞质中被转录为蛋白质。细胞质中的蛋白质能够 通过某些分泌通路( s e c r e t o r yp a t h w a y , s e ) 转移到刁；蚓的非分泌通路( n o n s e c r e t o r y p a t h w a y , n s p ) 细胞器中，或者留在细胞质中。分泌通路中的蛋白质在蛋白质序列 的前端有特殊的向导序列，使得蛋白质能够通过同转录的方式被转移通过内质网 ( e n d o p l a s m a t i cr e t i c u l u m ，e r ) 膜。e r 中的蛋白质被继续传输到高尔基体( g o l g i a p p a r a t u s ) ，细胞膜( p l a s m am e m b r a n e ) ，溶酶体( 1 y s o s o m e ) ，液泡( v a c u o l e ) 或者 细胞夕b ( e x t r a c e l l u l ms p a c e ) ，含有内质网保持序习 ( e r - r e t e n t i o ns e q u e n c e ) 的蛋白质 能够继续留在内质网中。蛋白质通常利用小泡状的搬运器来传输以及在内质网和 高尔基体问来回穿梭 1 1 1 1 1 2 】。非分泌通路中的蛋白质在细胞质中的自由核糖体 中合成并被在转录后被运送到细胞质中，前提是这些蛋白质中带有特定的细胞质 ( c t p ) ，线粒体( m t p ) 或者溶酶体n 端向导序y 0 1 3 1 1 4 。这些向导序列通常在成 熟的蛋白质到达最终的压细胞定位后会被特定的信号肽酶剪切掉【1 5 】 1 6 1 7 。其 他的内在序列，比如成熟蛋白质中远水的转移停止序列能够初始化跨膜蛋白插入 膜。叶绿体中的某些蛋白存在二级向导序列，使得它们能够进行更多的细胞器问 传输 1 8 】。所有细胞核中的蛋白都是从细胞质中传导的。当细胞核上的小孔聚合 物结合细胞核蛋白所特有的核定位信号( n l s ) ，蛋白就能够进入核内 1 9 2 0 。多 种细胞核蛋白的n l s 已经被精确的找出，但是有许多核蛋白并不包含任何n l s 。 此外，翻译后修饰，比如蛋白糖基化 2 1 1 ，也在蛋白传输过程中起到了很重要的 作用 2 2 2 3 2 4 。有一些普遍的信号序列具有很高的特殊性和保守性 2 5 。些 定位信号序列在蛋白质中表现出特定的二级结构 2 6 2 7 1 。正确的t p s 剪切和蛋 白序列有很大关系，人们已经找出了些序列m o t i f 。不同的细胞器为蛋白质提 蛋白质亚细妇定位方法研究和刚络预测平台构建第一覃绪论 供了不刷的生物环境。在生物进化进程中，只有对细胞有利的变异能够被保留下 来。观察发现，不同细胞器中，蛋白质的氨基酸组成是有区别的【2 8 。 预测蛋白质亚细胞定位的计算方法。q 以人致被分成四大类：( i 1 基于蛋白质氨 基酸组成，( i i ) 基于已知的蛋白定位信号序列，f i i i ) 基j 二蛋白序列的同源性或者 m o t i f s ，( i v ) 以上三类的组合( 组合方法) 。 ( i )最早利用蛋白质氨基酸组成来预测蛋白质弧细胞定位的工作是由 n a k a s h i m a 和n i s h i k a w a 完成。他们提出了一种预测算法来区分细胞内蛋 白和细胞外蛋白 2 9 。利用蛋白质氨基酸组成的不同，c e d a n o 等提出了 p r o t l o c k 算法来预测5 种不同的亚细胞定位 3 0 1 。 r e i n h a r d t 和h u b b a r d 提出了n n p s l 算法，利用人工神经网络进行真核细 胞中四种亚细胞定位和原核细胞中三种亚细胞定位的预测【3 1 。根据 r e i n h a r d t 和h u b b a r d 收集的数据，人们又提出了多种亚细胞定位预测算 法。其中包括利用k o h o n e n 自组织映射f 3 2 ，支持向量机 3 3 】和马尔科夫 模型等方法 3 4 。基于氨基酸组成预测算法的进一步发展是利用序列的先 后顺序信息。c h o u 等提出了一种基于s v m 的哑细胞定位预测算法，其 中利用了序列的先后顺序信息 3 5 1 1 3 6 。p a r k 和k a n e h i s a 后来提出了一种 叫做p l o c 的类似算法 3 7 】。h u a n g 等利用模糊k 近邻的方法采用双氨基 酸组成信息对1 1 种亚细胞定位进行预n 3 8 1 。c e l l o 算法能够预测格兰 氏阴性菌的5 种亚细胞定位，这种方法基于变长的氨基酸组成 3 9 1 。 a n d r a d e 等首次将蛋白质结构信息结合氨基酸组成对亚细胞定位进行预 测。他们利用结构已知蛋白质的表面氨基酸组成信息来区分核蛋白，细胞 外蛋白和细胞质内蛋白。 ( i i ) t a r g e t p 是一种基于n 端定位信号序列进行亚细胞定位预测的综合方法 4 0 】。它实际上可以看作是1 个综合了s i g n a l p 4 1 和c h l o r o p 4 2 n j 预测工 具。以上三种算法都是由g u m a a rv o nh e i i l i e 小组提出的。m i t o p r o l 4 3 , 和 、 p r e d o t a r 是两个专门区分叶绿体蛋白和线粒体蛋白的算法。这个大类中的 另一个算法是i p s o r t 4 4 。i p s o r t 使用基于先验知识的规则来预测蛋白 质亚细胞定位，并且使用a a i n d e x 数掘库中的蛋白质序列 4 5 】。 蛋白质亚细胞定位方法研究# o n _ e g 预测平台构建 第一章绪论 ( f i i )m a r c o t t e 等提出了一种利用构建蛋白质序列的系统发生特征来进行蛋白 质距细胞定位预测的方法 4 6 】。m o r t 等使用s m a r t 4 7 域来预测细胞质， 细胞外和细胞核蛋白 4 8 1 。p r e d i c t n l s 算法利用核蛋白数据集专门进行核 蛋白的预n 0 4 9 。科学家进步提出一种利用蛋白质功能域结合最近邻方 法的算法并在r e i n h a r d t 和h u b b a r d 数据集上验i 正 5 0 1 。l u 等提出的 p r o t e o m e a n a l y s t 算法是一种基于s w i s s p r o t 关键字和同源蛋白质注解 的预测算法 5 1 1 。与此相近的的方法有n a i r 和r o s t 在2 0 0 2 年提出的 l o c k e y 5 2 年1 1l o c h o m 5 3 算法。p s i x 是一个比较新的算法，它利用了 贝叶斯刚络和i n t e r p r om o t i f s 来预测十种亚细胞定位 5 4 1 。 f i v )1 9 9 2 年提出的p s o r t 是最早的亚细胞定位预测算法之。p s o r t 利用氨 基酸组成，n 端定位信号序列，以及m o t i f 等综合的方法来进行预n 5 5 。 这种方法使用一系列的基于先验知识的“如果一就”规则对1 4 种动物和1 7 种植物亚细胞定位进行预测。p s o r t 的扩展包括：p s o r ti i ( 对决策规 则作出了改变) 【5 6 和p s o r t - b ( 专门对细菌蛋白进行预测) 5 7 。e s l p r e d 是一个利用r e i i l l a a r d t 和h u b b a r d 数据集和s v m 分类器的算法。它结合了 双氨基酸组成和p s i b l a s t 分数作为特征 5 8 。d r a w i d 和g e r s t e i n 提出 一种算法结合了序列m o t i f 矛t l 全局序列特性( 比如等电位点和表面组成) ， 以及m r n a 的表达量 5 9 1 。他们的方法使用了贝叶斯预测模型并且在酵母 基因组上进行测试。m i t o p r e d 是一个专门预测线粒体蛋白质的算法， 它结合了p f a m 域 6 0 】和氨基酸组成 6 l 】。 大部分以上介绍的算法都以服务器的方式提供在线预测服务。表1 列出了算法以 及对应的网址。 现在已有的预测算法列用户来说有三个主要的区别：1 基于不同的生物机理 构建模型，2 能够预测不同的亚细胞定位数，3 具有不同的预测精度。预测模型 可以非常简单，比如仅仅基于全局氨基酸组成，也可以比较复杂比如给予先验知 识的p s o r t 算法模型。不同算法能够预测的亚细胞定位数的区别非常大，有的 只能预测很少的几类亚细胞定位，而有的可以预测几乎所有定位。预测精度既包 括总的预测精度，也包括对不同细胞定位的预测精度。通常的情况是一种预测 算法刘有的定位预测精度很高，而对其他的就相对低点儿。而且，大部分算法使 噩白质亚细胞定位方法研究和刚络预测平台构建第一章绪论 用了不同的训练数据集和训l 练算法，这给公平地比较各种算法带来了一定的困 难。 基于定位信号序列的预测算法，比如t a r g e t p 和i p s o r t ，通常都只预测四 种植物和三种非植物亚细胞定位( 少的定位数量) ，不过它们有相对高的预测精 度。但是，值得指出的是其中有两种分类，s p 利其他，并不是特定的亚细胞定 位。s p 类包含了至少6 种亚细胞定位，其他类包括了至少3 种亚细胞定位。只 有当得到的预测结果是叶绿体或者线粒体的时候，才能对输入序列给出一个确定 的亚细胞定位预测。而在这种情况下，用户甚至可以考虑使用像m i t o p r e d 这 种更加专门的预测器，以得到对线粒体蛋白质更高的预测精度。仅仅基于定位信 号的预测器模型要面临更加复杂的情况，因为并刁i 能保证输入的蛋白质序列包含 定位信号序y t j 6 2 。 表1 蛋白亚细胞定位预测网站 名称w e b 地址 n n p s l h t t p ：w w w d o e m b iu c l ae d u e a s t r i d a s t r i dh t m l p r e d i c t n l s h t t p ：c u b i c b i o c c o l u m b i ae d u d r e d i c t n l s t a r g e t ph t t p ：v o g w c b s d t u d k s e r v i c e s t a r g e t p s e c r e t o m & h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c es ；s e c r e t o m e p s u b l o c h t t p ：f7 w 目mb i o i n f ot s i n g h u a e d uc n s u b l o c s i g n a l ph t t p ：w 矾v c b s d t u d k s e r v i c e s s i g n a p c e l l o h t t p ：c e l 0 1 f e n c t u e d u t w l o c n e t a n d l o c t a r g e t h t t p ：w w w r o s t l a b 。r g s e r v i c e s l o c t a r g e t e s l p r e d h t t p ：w wi m t e c h f e s i n r a g h a v a e s l p r e d p r o t e o m e h t t p ：w w w c s u a l b e r t a c a e b i o i n f o p a s u b i n d e xh t m l a n a l y s t n u c p r e d h t t p ：w w w s b c s u s e e m a c c a ll r n u c p r e d i p s o r t h t t p ：h c i m sa - t o k y o a cj p i p s o r t m i t o p r e d h t t p ：m i t o p r e ds d s c e d u m i t o p r o t h t t p ：i h g g s f d e i h g m i t o p r o t h t m l p l o c b t t p ：? f g e n o m e j p s i t p 、o c ? b t m l p r e d o t a r h t t p ：g e n o p l a n t e i n f o i n f o b i o g e n f r p r e d o t a r p r e d i c t n l sh t t p ：c u b i c b l o c c o l u m biae d u p r e d ic t n l s c h l o r o p h t t p ：w 、wc b s d t ud k s e r v i c e s c h l o f o p l o c s v m p s i h t t p ：b i o i n f o i m a t i c su s t c e d uc n 1 0 c s v n l p s i 1 0 c s v m p s i p h p 基于总体氨基酸组成的预测算法在其能够预测的蛋白质亚绌胞定位种类上 监白质生| | | 胞定位力法研究和网络预测平台构建 第一章绪论 有很大的区别，而其内含的生物原理相当简单，这也有可能是为制么r e i n h a r d t 和h u b b a r d 的数据集被后来那么多方法使用的原因。这组数据具有很高的序列同 源性( 9 0 以上) ，实质上所有在这组数据集上的方法得到的预测结果都差不多， 只有小的差别。甚至一些方法精度比另一些好的原因只是因为他们使用了不同的 交叉验证数据。 基于序列数据同源性的预测算法在某些情况下非常准确。这类方法原理是找 到那些有特定亚细胞定位的蛋白质的同源蛋白质。这种方法的缺点是，当输入蛋 白质序列找不到同源序列的时候，预测器只能随机猜蛋白质的亚细胞定位。其实， 相同的情况在蛋白质结构预测算法中也存在。高的序列同源性往往代表蛋白质有 着相似的结构和功能，但是却不一定代表它们有相同的亚细胞定位。 综合的预测方法通常能够预测很多的亚细胞定位。当对输入蛋白质序列了解 不多的时候，选择综合方法是比较合适的。 机器学习方法在构建亚细胞定位预测算法模型上起到了很重要的作用，是这 个领域中使用频率很高的方法。在预测精度越来越高的情况下，仔细研究那些被 误预测的蛋白质将是很有意思的工作，这些蛋白质可能给蛋白质不同的亚定位通 路研究提供线索。还有一个需求是常常更新数据集和预测模型。以r e i n h a r d t 和 h u b b a r d 数据集为例，这个数据集足从s w i s s p r o t3 3 0 版( 5 2 2 0 5 个序列和 1 5 7 7 5 个亚细胞定位注解) 中提取的。而新的s w i s s p r o t4 4 1 版中包含有 1 2 2 7 5 0 个序列数据和8 0 5 6 2 个亚细胞定位注解。因此，新的算法应该尽量使用 更新的数据集。 总的来说，理解和预测蛋白质的亚细胞定位是一个近年来无论实验还是计算 都发展很快的研究领域。而这个领域中一个挑战是把实验得到的生物现象转化为 合理的计算模型，另一个挑战是预测具有多定位的蛋白质 6 3 】 6 4 。蛋白质亚细 胞定位是个非常活跃的研究领域，而日彳艮有可能为正在发展的系统生物学作铺路 的工作 6 5 1 。 1 2 本文研究内容 驱细胞定位是蛋白质的项重要功能特性，但是目前公共数据库中大量原始 蛋白数据缺乏确定的亚细胞定位信息。传统实验测定方法的速度慢、代价高，己 蛋白质亦细胞定位方法研究和劂络预测平台构建 第一南绪论 经不能满足对海量的生物信息进行处理的需要；而基于机器学习的预测方法可以 提供快速、自动的蛋白质亚细胞定位，特别适用于高通量大规模的基冈组序列标 注分析，因此有必要发展能提供准确、高效的蛋白亚细胞定位预测算法。对于现 有蛋白质亚细胞定位预测算法，前文已经做出了比较洋细的介绍。目前常用的特 征均存在些缺点。首先，氨基酸组成不包含序列的顺序信息，冈此一些对分类 有用的信息，在计算组成的过程中丢失了；另外这些特征也不包含如进化信息和 蛋白结构等信息。因此，我们从引入新特征的角度出发，尝试使用p s i b l a s t 的p r o f i l eq 1 所包含的信息作为特征，取得了很好的效果。对于机器学习算法， 我们则使用最新的支持向量机技术，以确保在相同特征下获得最好的分类效果。 随着网络技术的发展与普及，越来越多的生物信息学预测方法。，都通过网络 的方式向国际同行提供o n i n e 预测服务和资源共享，这也是检验我们所设计的 预测算法是否成功的最好途径。因此，有必要将我们亚细胞定位中算法的研究成 果，通过构建w e bs e r v e r 的方式具体实现，以利于学术交流和预1 1 1 匣务。 本文首先对由生物实验验证的生物蛋白质定位知识进行了总结和归纳，充分 学习和理解了蛋白质亚细胞定位的生物原理，力图找出能够将生物原理转化为能 够提高预测精度的计算算法( 第二章) ；然后对用到的生物信息学计算方法进行 了介绍( 第三章) ；最后提出了一套自己的蛋白质亚细胞定位预测算法l o c s v m d s i ， 并基于此算法开发出了相应的w e bs e r v e r ( 第四章) 。 蛋白质亚细胆定位方法研究和网络预测7 r 台构建 第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 2 1 真核细胞的细胞器 根据进化程度与结构的复杂程度，可将细胞划分为原核细胞( p r o k a r y o t ，ic c e l l ) 和真核细胞( e u k a r y o t i cc e u ) 两大类。 原核细胞的基本特点是：( i ) 没有细胞核，核区( 类核) ，遗传信息量小， 遗传信息载体多为一个环状d n a 构成；( 2 ) 没有分化为以膜为基础的具有专门结 构与功能的细胞器。原核生物的特征是体积较小，直径o ，2 l o u m ；进化地位较 原始，在3 0 3 5 亿年前就出现；在地球上的分布广度与适应性比真核生物大得 多。代表性的原核生物有：细菌、蓝藻、支原体、螺旋藻( 人类的未来的蛋白质 食物新来源) 等。 、 与原核细胞相比，真核细胞最主要的区别是：( 1 ) 核细胞以膜系统的分化 为基础，首先分化为两个独立的部分核与质，细胞质内又以膜系统为基础分 隔为结构更精细、功能更专一的细胞器。( 2 ) 编码结构蛋白质与功能蛋白质的基 因数大大增多，遗传信息重复序列与染色体多倍性的出现，遗传信息的复制、转 录与翻译装置和程序也相应复杂，转录和翻译有严格的阶段性与区域性。原始真 核细胞大约在1 2 1 6 亿年前出现，现存的种类繁多，有些真核细胞极为原始， 如涡鞭毛虫( 甲藻) ，真核生物包括大量的单细胞生物或原生生物，全部多细胞 生物。凡是真核细胞构成的有机体统称为真核生物。 真核细胞的基本结构体系：真核生物是以生物膜的进一步分化为基础，使细 胞内部构建成许多更为精细的具有专门功能的结构单位。真核细胞虽然结构复 杂，但是可以在亚显微结构水平划分为3 大基本结构体系：以脂质及蛋白质成 分为基础的膜系统结构：以核酸一蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统结构； 由特异蛋白质分子构成的细胞骨架体系。这些由生物大分子构成的基本结构均 是在5 l o n m 的较为稳定的范围之内。这三种基本结构体系构成了细胞内部结构 紧密、分工明确、智能专一的各种细胞器，并以此为基础而保证了细胞生命活动 具有高度程序化与高度白控性。 真核细胞的细胞器主要包括： 篮白质钏胞定位方法研究和网络预测1r _ 台构建第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 细胞核( n u c l e u s ) ：由双层核膜包围，膜上有核孔，核内有核4 - ( n u c e o l u s ) ， 其余的部分为染色质( c h r o m a t i n ) ，d n a 就包含在染色质中。在细胞分裂前，染 色质会凝聚成染色体( c h r o m o s o m e ) 。 - l t t l l g 质( c y t o p l a s m ) ：指细胞膜内除细胞核以外的成份。对于一个真核细胞 来说，其细胞质又包括液态的细胞质基质( c y t o p l a s m i，各种细胞器和c m a t r i x ) 各种内含物。细胞质基质也称为胞质溶质( c y t o s 0 1 ) ，为细胞质内除细胞器和内 含物以外的、较为均质和半透明的胶质物质，在为各种生化反应提供适宜环境和 维持细胞内环境稳定性等方面具有非常重要的作用。 内质网( e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ) ：一般真核细胞中都有内质网，只有少数 高度分化真核细胞，如人的红细胞以及原核细胞中没有内质网。在电镜下可以看 到内质网是一种复杂的内膜结构，它是由单层膜围成的扁平囊状的腔或管，这些 管腔彼此之问以及与核被膜之间是相连通的。内质网按功能分为糙面内质网 ( s m o o t he r ) 和光而内质蕊 ( r o u g he r ) 两类。糙面内质网上所附着的颗粒是核糖 体，它是蛋白质合成的场所。因此糙面内质网最主要的功能是合成分泌性蛋白质， 膜蛋白以及内质网和溶酶体中的蛋白质。所合成蛋白质的糖基化修饰及其折叠与 装配也都发生在内质网中。其次是参与制造更多的膜。光面内质网上没有核糖体， 但是在膜上却镶嵌着许多具有活性的酶。光面内质网最主要的功能是合成脂类， 包括脂肪、磷脂和甾醇等。 核糖体( r i b o s o m e ) ：核糖体是蛋白质合成的场所，它是由r r n a 和蛋白质 构成的，蛋白质在表面，r r n a 在内部，并以共价键结合。核糖体是多种酶的集 合体，有多个活性中心共同承担蛋白质合成功能。而每个活性中心又都是由一组 特殊的蛋白质构成，每种酶或蛋白也只有在整体结构中才具有催化活性。每一细 胞内核糖体的数目可达数百万个，游离核糖体合成细胞质留存的蛋白质，如膜中 的结构蛋白；而附在内质网上的核糖体合成向细胞外分泌的蛋白质，合成后向 s - e r 输送，形成分泌泡，输送到高尔基体，由高尔基体加一1 2 、排放。 高尔基体( g o l g ia p p a r a t u s ) ：由一系列扁平小囊* 1 1 4 , 泡所组成，分泌旺盛 的细胞，较发达。在电镜下得到确认的高尔基体是由单层膜田成的扁平囊和小泡， 成堆的囊并不像内质网那样相互连接。在一个细胞中高尔基体只有少数几堆，至 多不过上百。( 1 ) 是细胞分泌物的最后加工和包装的场所，分泌泡通过外排作用 蛋白质钏脏定位方法研究和网络预测平台构建第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 排出细胞外；( 2 ) 能合成多糖，如粘液、植物细胞的各种细胞外多糖。 溶酶体( 1 y s o s o m e s ) ：溶酶体是由由高尔基体断裂产生，单层膜包裹的小泡， 数目可多可少，大小也不等，含有6 0 多种能够水解多糖、磷脂、核酸和蛋白质 的酸性酶，这些酶有的是水溶性的，有的则结合在膜上。溶酶体的p h 为5 左右， 是其中酶促反应的最适p h 。根据溶酶体处于完成其生理功能的不同阶段，大致 可分为：初级溶酶体、次级溶酶体和残余小体。溶酶体的功能有二：一是与食物 泡融合，将细胞吞噬进的食物或致病菌等大颗粒物质消化成生物大分子，残渣通 过外排作用排出细胞；二是在细胞分化过程中，某些衰老细胞器和生物大分子等 陷入溶酶体内并被消化掉，这是机体自身重新组织的需要。 线粒体( m i t o c h o n d r i a ) ：线粒体具有双层膜结构，外膜是平滑而连续的界 膜；内膜反复延伸折入内部空间，形成嵴。内外膜不相通，形成膜腔。光镜下， 线粒体成颗粒状或短杆状，横径o ，2 u m 8 u m ，细菌大小。线粒体是细胞内产生 a t p 的重要部位，是细胞内动力工厂或能量转换器。线粒体具有半自主性，腔内 有成环状的d n a 分子和7 0 s 核糖体，它们都能自行分化，但是部分蛋白质还要 在胞质内合成。 叶绿体( c h l o r o p l a s ) ：高等植物叶绿体外形如凸透镜，具有双层膜结构，两 膜间没有联系。在叶绿体内部存在复杂的层膜结构，它悬浮于基质中，这些层膜 又叫类囊体( t h y l a k o i d s ) ，与叶绿体内膜可能无联系。类囊体也是双层膜结构，呈 扁盘状。类囊体通常是几十个垛叠在一起而成为基粒( g r a n a ) ，类囊体膜上有光 合作用的色素和电子传递系统。在绿色植物和藻类中普遍存在的叶绿体是光合作 用场所。同时叶绿体也有自己特有的双链环状d n a ，核糖体和进行蛋白质生物 合成的酶，能合成出一部分自己所必需的蛋白质，因此叶绿体内共生起源假说为 许多人所认可。 微体( m i c r o b o d i e s ) ：含有酶的单层膜囊泡状小体，与溶酶体功能相似，但 所含的酶不同于溶酶体。微体在短时间内帮助多种物质转换成别的物质。过氧化 物酶体( p e r o x i s o m e s ) ，是存在于动植物细胞的一种微体，其中所含的一些酶可将 脂肪酸氧化分解，产生过氧化氢。乙醛酸循环体( g l y o x i s o m e ) 存在于富含脂类的 植物细胞中，其中一些酶能将脂肪酸核油转换成酶，以供植物早期生长需求。 液泡( v a c u o l e ) ：在成熟的活的植物细胞中经常都有一个大的充满液体的中 篮白质弧细胞定位方法研究和网络预测平台构建第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 央液泡，是在细胞生长和发育过程中由小的液泡融合而成的，是单层膜包围的充 满水液的泡。液泡中含有无机盐、氨基酸、糖类以及各种色素等代谢物，甚至还 含有有毒化合物，并处于高渗状态，使细胞处于吸涨饱满的状态。 细胞骨架( c y t o s k e l e t o n ) ：在真核细胞的细胞质中普遍存在由蛋白质纤维组 成的三维网架结构一细胞质骨架，蛋白质纤维包括有微管、微丝和中问纤维三种， 它们通过磷酸化和去磷酸化而具有自装配和去装配功能，这也是信息传递过程。 细胞质中各种细胞器、酶和很多蛋白质都是固定在细胞质骨架上，使之有条不紊 地执行各自的功能。细胞质骨架网络系统对于细胞形态构建，细胞运动，物质运 输，能量转换，信息传递，细胞分化和细胞转化等起着重要的作用。 鞭毛、纤毛和中心粒( f l a g e l l u m ，c i l i u m ，c e n t r i o l e s ) ：细胞表面的附属物， 功能是运动。鞭毛和纤毛的基本结构相同，主要区别在于长度和数量。鞭毛长但 少，纤毛短，常覆盖细胞全部表面，两者的基本结构都是微管。基部与埋藏在细 胞质中的基粒相连。中心粒结构与基粒相似，埋藏在中心体中，许多微管都发自 这里。 胞质溶胶( c y t o s 0 1 ) ：细胞质中除细胞器以外的液体部分。富含蛋白质，占 细胞内的2 5 5 0 ；含有多种酶，是细胞代谢活动的场所；还有各种细胞内含物， 如肝糖原、脂肪细胞的脂肪滴、色素粒等。 2 2 蛋白质在细胞中的定位 根据蛋白质的定位可以将其大致分为两类：膜结合型和非膜结合型蛋白质。 每一类都能继续划分，这取决于蛋白质是否与细胞中特定的结构或特定类型的膜 结合。 胞质( 或呵溶的) 蛋白质不定位在特定的细胞器中。它们在胞质中合成，并 留在原处以独立的活性中心形式作用于胞质中的代谢物。 大分子的结构可能定位在胞质中的特定位点；例如，中心粒结合的部位最 终成为有丝分裂纺锤体的极。 核蛋白必须由合成位点穿过核膜转运到核内。 胞质细胞器含有在胞质中合成并专一转运到( 和穿过) 细胞器膜的蛋白质， 例如，到线粒体或( 在植物细胞中) 到叶绿体( 一些线粒体和叶绿体蛋白质在细胞 美白质细胞定位方法研究和网络预测平台构建第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 器内合成) 。 胞质中含有一系列的膜结构，包括内质网，高尔基体，内吞体和溶酶体。 这就是“网状内皮系统( r e t i c u o e n d o t h e l i a ls y s t e m ) ”。定位在这些部位的 蛋白质插入_ 硇j g r 膜上，然后被高尔基体中的转运系统转运到它们特定的位点。 细胞分泌的蛋白质转运到质膜再穿过它到达外部胞间。它们合成起始与结 合在网状内皮系统的蛋白质相同，但穿过了整个系统而不是停在系统中的特定位 点。 非膜结合型蛋白质在核糖体中合成后被释放到胞质中。一些蛋白质以准可溶 的形式游离于胞质中；另一些蛋白质与胞质中的大分子结构结合，例如微丝 ( f j l a m e n t ) 、微管( m i c r o t u b u l e ) 和中心粒( c e n t r i o l e ) 等。这种类型也包括核蛋 白( 通过核孔进入核内) ，合成这种蛋白质的核糖体有时被称为“游离( f r e e ) 核糖 体”，因为它们与膜分离。有些蛋白质从核糖体上释放后停留在胞质中；为了转 运到其专 的位点，还需要一个适当的信号，可以使其组装为大分子结构或被转 运系统识别。将蛋白质转运到核内也需要蛋白质巾的一段短序列。这些“核定位 信号( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l ) ”使蛋白质能穿过核孔。一种决定转运到 过氧化物酶体的信号是一段很短的c 端序列。 将蛋白质插入或使其穿过一个膜的过程叫做蛋白质转运( p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n ) 。蛋白质与膜结合可以有两种途径： ( 1 ) 线粒体和叶绿体蛋白质在游离核糖体上合成；释放到胞质后它们在n 端 的长。2 5 个氨基酸的序列被细胞器膜上的受体( r e c e p t o r ) 识别，使其结合在膜上。 由于这一过程发生在蛋白质合成之后所以称为翻译后转运( p o s tt r a n s l a t i o n a l t r a n s l o c a t i o n ) 或简称后转运。 ( 2 ) 网状内皮系统的蛋白质在合成时进入内质网。这个过程叫做共翻译转运 ( c o t r a n s a t i o n a lt r a n s l o c a t i o n ) 或简称共转运。由于在这些蛋白质的合成过 程中核糖体是与内质网结合的，在细胞的膜片段上可以找到，所以有时将它们称 为“膜结合型”。 使用n 末端序列共转运到e r 或后转运到线粒体或叶绿体的蛋白质具有共同的 特点。n 末端序列在转运过程中被切除。在n 末端序列中含有个前导序列 ( | | e a d e r ) ，在成熟的蛋白质中不存在。含有前导序列的蛋白质称为前体蛋白质 蛋白质细胞定位方法研究和网络预测。i 。台构建 。第二章蛋白质亚细胞定位的生物学背景 ( p r e p r o t e i n ) ，是成熟蛋白质的前体。 通过n 末端前导序列与膜结合的蛋白质需要一系列信号作用才能到达最终的 目的地。以网状内皮系统为例，蛋白质的最终定位取决于它在内质网和高尔基体 中是如何被引导的。前导序列本身可将蛋白质定位到膜上；这种相互作用使蛋白 质穿过膜进入内部。对于一个膜上的蛋白质来说，还需要另个信号使其停留在 膜内。进入特定的目的地还需要其它的信号。 有一些信号是定位在膜系统任何部分都需要的。这些信号一般都采取短的氨 基酸序列的形式，但也有其它形式的信号。遵守“默认途径( d e f a u l tp a t h w a y ) ” 的蛋白质经过e r 进入高尔基体，再到达质膜。定位在e r 上的蛋白质在c 末端具有 四聚体肽( k d e l ，提供使其从高尔基体回到e r 的信号) 。使蛋白质进入溶酶体的信 号是一种共价修饰：增加特定的糖残基。 2 2 1 翻译后的跨膜转运依赖引导序列 线粒体和叶绿体都能合成其所有的核酸及部分蛋白质。线粒体只合成、1 0 种 细胞器蛋白质；叶绿体合成5 0 种蛋白质。胞质中合成的细胞器蛋白质与胞质蛋 白质一样由游离核糖体合成，随后必须将其转运到细胞器中。 以后转运过程进入线粒体及叶绿体中的许多蛋白质，都含有前导序列 ( l e a d e r ) 负责细胞器外膜对蛋白质的识别。如图8 1 0 所示，前导序列介导前体及 细胞器膜之间的相互作用。蛋白质穿过膜，前导序列被位于细胞器的蛋白酶切掉。 进入线粒体及叶绿体的蛋白质的前导序列一般是亲水的，由一段不带电荷的氨基 酸组成，中间隔着一些碱性氨基酸，不含有酸性的氨基酸。不同前导序列同源性 很少。前导序列中缺少同源性表明可能蛋白质的二级或三级结构或这一区域的性 质必定与其识别有关。 前导序列中存在一个细胞器蛋白质定位的所有信息。将个细胞器蛋白质的 前导序列与个胞质蛋白质连接就可检验前导序列的功能。这个实验通过构建一 个杂和基因来完成，之后它将被翻译为杂和蛋白质。通过这种实验已经证明，有 儿种前导序列能独立的将任何连接的序列定位到线粒体或叶绿体中