（生物化学与分子生物学专业论文）pts2诱导hela细胞凋亡及其分子机制的研究.pdf

摘要摘要双吡硫翁( 2 ，2 - - - , t t 啶n 一氧化物二硫，p t s 2 ) 是羟基吡1 症硫酮类化合物众多衍生物中的一种，具有高效的抗菌和抗真菌活性。p t s 2 在i l 盏床上作为抗菌剂、杀虫剂和抗真菌药物而被广泛应用。本研究发现p t s 2 具有诱导h e l a 细胞凋亡的作用，并对其分子机制进行探讨。为阐明p t s 2 的促凋亡作用，在p t s 2 作用于h e l a 细胞后，应用h o e c h s t3 3 2 5 8和d a p i 染色，荧光显微镜检测观察其染色质形念；应用m t t 法检测细胞活力；应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验结果表明p t s 2 可诱导h e l a 细胞凋亡，且呈剂量和时间依赖型。细胞色素c 在细胞凋亡的线粒体通路中发挥重要作用。c a s p a s e ，3 是凋亡下游信号通路中重要的蛋白酶，细胞色素c 从线粒体释放可激活c a s p a s e 3 。为证实细胞色素c 和c a s p a s e 3 在p t s 2 诱导h e l a 细胞凋亡的作用，w e s t e m 印迹检测结果显示p t s 2 可导致细胞色素c 从线粒体释放，c a s p a s e 3 可被激活，其下游底物p a r p 亦发生剪切，且对p t s 2 呈现时阃和剂量依赖型。有报道称m a p k 信号通路参与化疗药物对肿瘤细胞的作用过程，我们分析了j n k i 2 、e r k l 2 和p 3 8 在p t s 2 诱导h e l a 细胞凋亡中的作用，结果显示e r k i 2 和p 3 8 明显被激活，而j n k i 2 激活不明显。应用p 3 8 抑制剂s b 2 0 3 5 8 0减少了h e l a 细胞的凋亡并抑制了细胞色素c 的释放，c a s p a s e 3 的激活，以及p a r p 的剪切。应用e r k l 2 抑制剂p d 9 8 0 5 9 则引起相反的作用，揭示其在p t s 2诱导h e l a 细胞凋亡过程中发挥了抗肿瘤作用。我们的研究首次证实p t s 2 具有抗肿瘤作用，细胞色素c 、c a s p a s e 3 以及p a r p 参与了p t s 2 诱导h e l a 细胞凋亡的作用过程，e r k l 2 和p 3 8 在此过程中发挥了相反的作用。关键词：p t s 2 ：凋亡；e r k l 2 ；p 3 8va b s t r a c ，ra b s t r a c td i p y r i t h i o n e ( 2 ，2 - d i t h i o b i s p y r i d i n e 一1 ，1 - d i o x i d e ，p t s 2 ) ，o n eo fap y r i t h i o n ed e r i v a t e s ，h a sb e e nn o t e df o ri t sh i g h l yb a c t e r i o c i d a la n df u n g i c i d a la c t i o n p t s 2w a su s e da sb a c t e r i c i d e s ，p e s t i c i d e sa n df u n g i c i d e i n t h i ss t u d yw es h o w e dt h ea p o p t o t i ce f f e c ta n di t sm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fp t s 2o nh e l ac e i l s t oc h a r a c t e r i z et h ec e l la p o p t o s i si n d u c e db yp t s 2 ，m o r p h o l o g ya n dc h r o m a t i nc o n d e n s a t i o no ft h ec e l l sw e r ed e t e c t e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yu s i n gh o e c h s t3 3 2 5 8a n dd a p is t a i n i n g c e l lv i a b i l i t yw a sd e t e r m i n e db yu s i n gm t ta s s a y f u r t h e r m o r e ，f l o wc y t o m e t r i ca n a l y s i sw a sp e r f o r m e d a l lt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp t s 2i n d u c e dh e l ac e l ld e a t hi nad o s ea n dt i m ed e p e n d e n tm a n n e lc y t o c h r o m ecp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nm i t o c h o n d r i a la p o p t o s i sp a t h w a y c y t o c h r o m ecr e l e a s i n gf r o mm i t o c h o n d r i aa c t i v a t e sc a s p a s e 一3 ，a l li m p o r t a n td o w n s t r e a me f f e c t o ri na p o p t o s i sp a t h w a y w ee x a m i n e dw h e t h e rp t s 2t r e a t m e n tw o u l dl e a dr e l e a s eo fc y t o c h r o m eca n da c t i v i a t i o no fc a s p a s e 一3 t h er e s u l t sf r o mw e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tp t s 2i n d u c e dr e l e a s eo fc y t o c h r o m eca f t e rp t s 2t r e a t m e n ti nat i m ea n dd o s ed e p e n d e n tm a n n e r c a s p a s e - 3a n dp a r pw e r ec l e a v a g e da f t e rp t s 2t r e a t m e n ti nat i m ea n dd o s ed e p e n d e n tm a n l i e r ,i tw a sr e p o r t e dm a p k sw e f ei n v o l v e di na c t i o no fc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g s w ea n a l y s e da c t i v a t i o no fj n k l 2 ，p 3 8a n de r k l 2i np t s 2t r e a t e dc e l l s e r k l 2a n dp 3 8w e r em a r k e d l ya c t i v a t e db yp t s 2 ，b u tj n k i 2a c t i v i t i o nw a sh a r d l yd e t e c t e d s u p p r e s s i o no fp 3 8a c t i v i t i o nb ys b 2 0 3 5 8 0r e d u c e da p o p t o s i so fh e l ac e l l sa n da l s op r e v e n t e dr e l e a s eo f c y t o c h r o m ec c l e a v a g eo f c a s p a s e - 3a n dp a r pi n d u c e db yp t s 2 b u ts u p p r e s s i o no fe r k i 2b yp d 9 8 0 5 9s h o w e da l lo p p o s i t ee f f e c t ，w h i c hi n d i c a t e dt h ea n t i a p o p t o t i ce f f e c to f e r k l 2a c t i v a t i o ni np t s 2i n d u c e dh e l ac e l l sa p o p t o s i s o u rs t u d yf i r s td e m o n s t r a t e st h a tp t s 2p o s s e s s e sa n t i t u m o ra c t i v i t y , c y t o c h r o m ecc a s p a s e s - 3a n dp o l y ( a d p - r i b o s e ) p o l y m e r a s e ( p a r p ) a r ei n v o l v e di np t s 2i n d u c e dh e l ac e l la p o p t o s i sa n de r k i 2a n dp 3 8p l a yo p p o s i t ee f f e c to np t s 2i n d u c e dh e l ac e l la p o p t o s i s k e y w o r d s ：d i p y r i t h i o n e ；a p o p t o s i s ；e r k l 2 ；p 3 8v l学位论文独创性声明本人郑重声明：1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名：堕童：日期：! ：二2 1学位论文使用授权声明本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文迸入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编八有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。l i作者签名：立垒塾：日期：瘟基竺前苦刚百恶性肿瘤是威胁人类生命的恶性疾病之一。掘世界卫生组织统计，全世界每年约有7 0 0 万人死于恶性肿瘤。目前，恶性肿瘤的死亡率仅次于心血管系统疾病而居第二位，因此癌症的预防和治疗将是一个十分艰巨的任务，抗癌治疗以及寻求有效的抗癌药物f 益迫切。5 0 年代初合成的l 一羟基一2 一吡啶硫酮( p y r i t h i o n e ，p t ) 及其吡啶环上取代的某些衍生物对多种细菌和真菌有强效抑制作用，作为高效广谱的防霉抗菌剂在国内外广泛应用。p t 衍生物钠盐( s p t ) 和锌栽( z p t ) 是目前研究的较多的毗啶硫酮类化合物，最近有研究表明s p t 对体外培养的传代c n e - 2 ，h e l a 等人体恶性肿瘤细胞和原代人胚肾，肺细胞均有显著抑制作用，而z p t 可导致细胞凋亡，在对鼠胸腺细胞，鼠脾淋巴细胞的实验中，z p t 可导致4 0 6 0 凋亡率。2 ，2 - - 二吡啶n 一氧化物二硫( 2 ，2 - d i t h i o b i s p y r i d i n e - l ，l - d i o x i d e ，d i p y r i t h i o n e ，以下简称p t s 2 ) 继承了p t 良好的抗细菌和抗真菌活性，可抑制真菌、酵母、霉菌和细菌的生长。但另有研究表明p t s 2 对l 1 2 1 0 细胞及k 5 6 2 细胞具有杀伤作用。以上研究提示p t 类衍生物在发挥抗菌和抗真菌的同时可能还具备一定的抗肿瘤作用。本实验研究了p t s 2 对h e l a 细胞所发挥的作用，并且对其作用的分子机制进行了迸一步的探讨。光学显微镜观察发现，p t s 2 使h e l a 细胞形态发生明显的变化，细胞数量下降，贴壁程度下降，细胞变圆并漂浮：h o e c h s t 3 3 2 5 8 d a p l 染色后，荧光显微镜观察发现h e l a 细胞核体积缩小，荧光染色增强，染色质呈致密浓染的块状或颗粒状荧光，有凋亡小体形成，从而在形态学上提示p t s 2 可诱导h e l a 细胞发生凋亡。m t t 法检测细胞活性结果显示h e l a 细胞的增殖活性对p t s 2 呈时间和剂量依赖型降低。应用流式细胞仪检测显示p t s 2 使h e l a 细胞的凋亡率叨显高于对照组。以上研究充分说明了p t s 2 具有诱导h e l a 细胞发生凋亡的作用c a s p a s e s 是具有保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在凋亡过程中具有枢纽作用，作为c a s p a s e s 的主要执行者，c a s p a s e 一3 被普遍认为是细胞调亡中关键的蛋白酶，可导致d n a 损伤和p a i 强剪切。8 9 k d 的p a r p 的蛋白水解片段的出现提示了c a s e p a s e 的激活及凋亡的发生。c y t o c i l r o m ec 是第一个被鉴定的从线粒体释放的细胞凋亡分子，在凋亡过程中可以导致c a s p a s e 一3 的激活。w e s t e r n 印迹分析显示，前苦p t s 2 可引起e y t o c h r o m ec 释放、e a s p a s e 3 激活以及p a r p 的剪切，且呈现剂量依赖型和时闻依赖型增加。以上实验研究说明c y t o c h r o m ec 、e a s p a s e 3 及p a r p参与了p t s 2 诱导的h e l a 细胞的凋亡。m a p k s 是真核细胞信号系统中介导细胞反应的重要信号通路，参与了细胞生长、死亡、周期、炎症和应激反应等多种细胞过程的调控，尽管e r k 、j n k和p 3 8 信号通路均参与应激导致的凋亡，但它们对凋亡过程有着不同的作用。一些研究表明e r k 信号通路的激活增加了死亡阈值，促进了细胞的生存：抑制e r k信号通路则增加了癌细胞或正常细胞对凋亡的敏感性，这些研究表明了e r k 的抗凋亡作用。p 3 8 通常作为前凋亡因子，p 3 8 的激活导致c y t c 从线粒体的释放，c a s p a s e 的激活以及p a r p 的剪切。最近有研究显示e r k l 2 和p 3 8 参与了抗肿瘤药物引起的肿瘤细胞的凋亡。本实验研究发现，e r k i 2 、p 3 8 被p t s 2 所激活，而j n k i 2 与p 3 8 和e r k l 2 相比作用不明显。为了进一步证明p 3 8 和e r k l 2在p t s 2 诱导的h e l a 细胞凋亡中的作用，我们使用了p 3 8 信号通路和e r k | 2信号通路的特异性磷酸化抑制刹，m t t 和流式细胞仪检测结果显示p 3 8 信号通路抑制剂s b 2 0 3 5 8 0 能阻止细胞的凋亡；而e r k l 2 信号通路抑制剂p d 9 8 0 5 9 却增加了细胞的凋亡。w e s t e r n 印迹分析显示由于p 3 8 抑制剂s b 2 0 3 5 8 0 导致c y t o c h r o m ec 的释放，c a ：s p a s e 3 的激活，以及p a r p 的剪切被阻断：而e r k i 2抑制剂p d 9 8 0 5 9 则产生了相反的作用。研究结果说明p 3 8 和e r k l 2 的激活是p t s 2 诱导h e l a 细胞凋亡所必需的，p 3 8 和e r k i 2 在此过程中产生了相反的作用，p 3 8 成为细胞凋亡过程中的上游信号分予，而e r k l 2 则起到了保护细胞免于凋亡的作用。笫一部分第一部分文献综述第一章吡啶硫酮类化合物的相关研究进展1 9 4 3 年，s h w 发现由黄曲霉所产生的曲霉酸有抗菌活性，后对其吡啶环通过引入不同侧链合成了一系列化合物。5 0 年代初合成了l 一羟基一2 一吡啶硫酮( p y r i t h i o n e ，p t ) 及其吡啶环上取代的某些衍生物。已有研究表明p t 衍生物对多种细菌和真菌有强效抑制作用，作为高效广谱的防霉抗菌剂在国内外广泛应用。作为外用抗菌剂对治疗皮肤癣菌病，痤疮，脂溢性皮肤病和止痒去头屑有满意的效果【h 】。图1 ：p t 的化学结构1p t 衍生物钠盐( s p t ) 和锌盐( z p t )1 1 生物活性1 1 1 抗菌和抗真菌作用p t 与吡啶环上被甲基、乙氧基或溴取代的某些衍生物对卡介苗、金黄色葡萄球菌和肺炎杆菌有显著抑制作用。s p t 对体外会黄色化脓微球菌、绿脓杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌等1 7 种细菌均有不同程度的抑制作用，【5 l 对革兰氏阳性菌的抑制作用强于对革兰氏阴性菌。z p t 对革兰氏阳性菌的抑制作用强于对革兰氏阴性菌，对细菌既有较强的抑制作用，也有较强的杀灭作用。【6 】；参0筘一部分s p t 和z p t 也有强效、广谱抗真菌活性。对l o 种真菌与益康唑对比试验表明，除石膏样小孢子菌外，s p t 对其余9 种真菌的抑制作用均强于盏康哗【”。徐寿香等人比较了z p t 、硝酸咪康哗和水杨酸对体外白色念珠菌、红色毛癣菌、烟曲菌和新型隐球菌的抑制作用，对这4 种真菌z p t 的抑菌活性均比水杨酸强，除新型隐球菌外，对其余3 种真菌的抑制作用也强于硝酸咪康唑1 8 j 。1 1 2 抗细胞、抗肿瘤及免疫抑制作用s p t 在0 o l 1pg m l 浓度下对体外培养的传代c n e 2 ，r a j i ，p 3 h r l ，h e l a等人体恶性肿瘤细胞和原代人胚肾、肺细胞均有显著抑制作用，接触后1 2h 细胞大量脱落死亡，生长曲线明显下降。低浓度时主要影响细胞有丝分裂和细胞结构中的模相部分，高浓度时破坏全部细胞结构，呈细胞毒性，作用与时间和s p t 浓度呈正相关【引。最近有研究表明z p t 可导致细胞凋亡，在对鼠胸腺细胞，鼠脾淋巴细胞，人r a m o s b 细胞以及人j u r k a t t 细胞的实验中，z p t 可导致4 0 一6 0 凋亡率。s p t 齐i j 量依赖地减轻小鼠免疫器官胸腺和脾脏的重量，明显抑制绵羊红细胞诱导小鼠溶血素形成、- - i f i 基氯苯( d n c d ) 诱导豚鼠迟发性皮肤超敏反应和植物血凝素( p h a ) 诱导大鼠淋巴细胞转化，表明对体液与细胞免疫均有抑制作用，但效力不及环磷酰胺和地塞米松1 0 1 。动物实验表明，s p t 矛i z p t 毒性均较低，z p t的毒性高于s p t 。1 2 临床应用s p t 有搽剂、水剂和霜剂等多种剂型。国内10 的s p t 霜剂( 吡硫霉净霜) 己生产上市。1 0 0 例癣病患者用s p t 搽剂涂擦患处2 3 天，治愈率7 5 ，总有效率达9 1 ，无严重不良副反应，仅2 例出现皮肤过敏。因s p t 水中稳定性差，贮存6 个月后s p t含量降- 至- 8 0 ，故只适合作为医院制剂使用【i “。s p t 霜剂疗效同搽剂，s p t 水剂疗效与霜剂相近。z p t1 9 6 4 年获美国f d a 新药批准，临床应用有乳剂和霜剂。吡啶硫酮锌盐( z p t ) 是研究的较多的一类p t 衍生物，具有去头屑作用，具有抑制细胞异常生长和抗微生物作用，渗透力较强，并能延缓头发衰老、减少脱发、推迟自发产生的时问。因此，z p t 广泛应用于皮肤清净剂，还可作为高级洗发香波去屑止痒剂使用i 1 2 】。同时，它还是一类重要的有机化工中间体，广泛应用于医药、染料、催4编一部分化等诸多化工领域。此外。还可用于切削油，压延油，冷却循环水的杀菌防腐。农业上可作为果树、棉花、麦子和蔬菜等的有效杀菌剂及植物生长调节剂等。含羟基毗啶硫酮锌( z p t ) 的抗头皮屑产品多在商场和理发店罩销售，如海飞丝、雅芳等去屑沈发剂。羟基吡啶硫酮的含- - s h 基衍生物极易发生自身氧化，如2 ，2 - 二毗啶n 一氧化物二硫( 2 ，2 。一d i t h i o b i s p y r i d i n e l ，1 - d i o x i d e ，d i p y r i t h i o n e ，以下简称p t s 2 ) 就是由p t o 经修饰后二聚化形成的。分子式为c i o h g n 2 0 2 5 2 ，分子量为2 5 2 3 l ，为消毒剂。物理状态为浅褐色结晶粉剂，熔点是2 0 5 。c ，具有良好的可溶性。在正常条件下性质稳定，易潮湿。n f p a 等级：健康一2 ，可燃性一0 ，反应性0 。有关p t s 2 的研究国内尚不多见。据报道二聚体p t s 2 继承了p t 良好的抗细菌和抗真菌活性，p t s 2 可抑制真菌、酵母、霉菌和细菌的生长。目前也有报道申称不同肤色的人种中p t s 2 都可经由皮肤吸收。另有研究表明p t s 2 对l o细胞及k 5 6 2 细胞具有杀伤作用，提示其具备一定的抗肿瘤作用 1 4 l 。op t o参考文献s h +s h -s s0op t op q - $ 2图2 ：p t s 2 的化学结构lo1s h a we s ，b e r n s t e i n j ，l o s e ek ，e ta 1 a n a l o g so f a s p e r g i l l i ca c i di v s u b s t i t u t e d2 - b r o m o p y r i d i n en o x i d e sa n dt h e i rc o n v e r s i o nt oc y c l i ct h i o h y d r o x a m i ca c i d s ja mc h e ms o c ，19 5 0 ，7 2 ( 9 ) ：4 3 6 2 4 3 6 45第一部分2p a n s yf e ，s t a n d e rh ，k o e r b e rw l ，e ta 1 i nv i t r os t u d i e sw i t hl - h y d r o x y 2 - ( t h ) 2 p y r i d i n e t h i o n e p r o cs o ce x pb i om e d ，1 9 5 3 ，8 2 ( 1 ) ：1 2 2 1 2 43f a m e rd a ，k a t zle p r o c e s sf o rp r o d u c i n gs o d i u ma n dz i n cp y r i t h i o n e u s a( i n t c i c 0 7 d 2 1 3 8 9 ) u sp a t e n t4 3 9 6 7 6 6 1 9 8 3 0 8 0 24b l a c o wn w w a d ea m a r t i n d e lt h ee x t r ap h a r m a c o p o e i a ：2 8 r d l o d o n ：t h ep h a r m a c e u t i c a lp r e s s ，1 9 8 2 5 0 0 5 1 05 薛广波，张子福，徐炳祥吡硫酮钠对痢疾杆菌的抗菌作用中国医院药学杂志，1 9 8 6 ，6 ( 5 ) ：2 2 2 36m o er a ，k i r p a nj ，l i n e g a rc r t o x i c i t yo f h y d r o x y p y f i t h i o n e t o x i c o la p p lp h a r m a c o l ，1 9 6 0 ，2 ( 2 ) ：1 5 6 1 6 07 张传世，孙海涛，王高松吡硫霉净抗真菌试验及临床治疗观察第二军医大学学报，1 9 8 4 ，5 ( 3 ) ：2 3 3 2 3 58 徐寿香，黄巧玲，章胜东国产吡噻旺锌体外抗真菌作用的初步观察现代应用药学，1 9 9 5 ，1 2 ( 2 ) ：3 9 4 09 王宗锐，唐慰萍，黄书伟等筑氧毗啶钠抗人癌细胞及胚胎组织细胞作用的体外试验湛江医学院学报，1 9 8 5 ，3 ( 2 ) ：1 5 9 1 6 31 0 王宗锐，冯仕苏，唐慰萍等2 一毓基一n 一氧化吡啶钠的抗肿瘤及抑制免疫作用中国药理学通报，1 9 9 2 ，8 ( 2 ) ：1 3 1 1 3 41 1 顾纪龙，张炯毗硫霉净搽剂的研制及疗效观察现代应用学，1 9 9 3 ，1 0 ( 6 ) ：2 9 3 01 2 吴鸿选译抗头皮屑香波一吡啶硫酮锌用作有效处理剂的观测日用化学工业译丛，19 8 7 ，9 ( 3 ) ：5 0 5 213w e d i g ，j h a n dm a i b a c h ，h i p e r c u t a n e o u sp e n e t r a t i o no fp t s 2i nm a n ：e f f e c to fs k i nc o l o r ( r a c e ) j a m a c a d d e r m a t o l ，19 81 5 ：4 3 3 4 3 8 1 4k o n d o h ，m ，t a s a k i ，e ，t a k i g u c h i ，m ，h i g a s h i m o t o ，m ，w a t a n a b e ，y ，e ta 1 a c t i v a t i o no fc a s p a s e 一3i nh l - 6 0c e l l st r e a t e dw i t hp y r i t h i o n ea n dz i n c b i 0 1 p h a r m b u l l 2 0 0 5 ，2 8 ：7 5 7 7 5 9 6第一部分第二章细胞凋亡的相关研究进展1 细胞凋亡的概念1 9 7 2 年k e r r 等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 的概念。a p o p t o s i s 一词来源于希腊文，指叶片从树上凋落之意。细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。根掘起源、性质和生物学意义可将细胞死亡分为两种不同的类型，即凋亡( a p o p t o s i s )或称程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e t h ) 和坏死( n e c r o s i s ) 。静者是一种受基因调节的自主控制过程，在生物个体发育和生存中起着非常重要的作用：而坏死则是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。在体内，两者最大的区别是前者不能引起机体炎症反应，而后者则可以引起炎症反应。因此在生理和绝大多数病理条件下的细胞死亡都呈现凋亡或程序性细胞死亡的典型特征。凋亡与细胞坏死的区别是：l 染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；2 凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩得染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内容物释放，故不会引起炎症；3 线粒体无变化，溶酶体活性不增加；4 内切酶活化，d n a 有控制降解，凝胶电泳图谱呈梯状出现在凋亡细胞早期，而d n a 片断化只是偶然的以依赖s e r 蛋白酶的方式出现在细胞坏死晚期；5 凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。由于细胞凋亡在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，且其对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，并成为目前生命科学界最为热门的话题之一川。2 细胞调亡的分子机制胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子( t n f r ) 受体基因超家族，其胞外部分都有一富含半胱氨酸的区域，胞质区有一由同源的氨基酸残基构成的结构，有蛋白水解功能，称“死亡区域”。“死亡区域”使死亡信号得以进一步传递启动凋亡。死亡受体与配体结合后使受体胞质区的“死亡区域”相互聚集，并与特异的接头蛋i 刍( a d a p t o rp r o t e i n ) 的“死亡区域”( 与死亡受体的死亡区域类似的结构) 相聚集，在接头蛋白的作用下，第一部分c a s p a s e - 8 ( 和c a s p a s e 一1 0 ) 聚集，最终形成大分子复合物凋亡酶体( a p o p t o s o m e ) 。凋亡酶体中豹c a s p a s e - 8 ( c a s p a s e l o ) 能通过自身切割转变成有活性的c a s p a s e 酶，进而切割c a s p a s e 3 酶原产生c a s p a s e 3 ，引起凋亡【2 1 。2 2 细胞调亡的线粒体通路2 2 t 线粒体的细胞调亡分子( 1 ) 细胞色素c ( c y t c lc y t c 是第一个被鉴定的线粒体的细胞凋亡分子。在正常细胞中c y t c 位于线粒体内、外膜之日j ，在电子呼吸传递链中超重要作用。但是当细胞被诱导凋亡时，c y t c 却可以从线粒体释放进入细胞质，启动c a s p 髂e 活化i 孤。活化过程的第一步为c y t c 与a p a f - 1 结合。a p a f - 1 是第一个哺乳动物细胞q l t e d - 4 同源物。它含有3 个不同的结构域：c 硒( c 嘲) a s er e c r u i t m e n td o m a i n ) 结构域、c e d 4 同源物结构域( 含有核苷酸结合序列) 及1 2 1 3 个w d 4 0 重复区【4 1 。j 下常情况下，尽管a p a f 0 1 含有核苷酸结合位点，但其结合a t p 或d a t p 的能力很弱。趔a p a f - 1 与c y t c 结合，a p a f - i结合a t p 或d a t p 的亲和力至少提高1 6 倍，其原因可能是c y t c 与a p a f - 1 的结合导致a p a f - 1 构象变化，从而打7 1 ：t a p a f - i 的核苷酸结合位点，或者c y t c 与a p a f - l 的结合进一步稳定t a p a f - i 与a t p 或d a t p 的结合。但是a p a f 1 与c y t c 的结合本身并不需要a t p 或d a t p l ”。a p a f - l c y t c 复合物与a t p d a t p 的结合激发其多聚化从而形成凋亡体( a p o p t o s o m e ) 6 1o 因此凋亡体是多个a p a f - l c ”c 复合物的多聚体。在凋亡体上，a p a f - l 的c a r d 结构域向外暴露，以吸引同样具有c a r d 结构域的c a s p a s e 一9 前体到凋亡体上来。c a s p a s e 一9 前体结合到凋亡体上后将引起自活化( a u t o a c t i v a t i o n ) 。只有结合在凋亡体f 的c a s p a s e 一9 才能有效地切割和活化下游的效应c a s p a s e ，如c a s p a s e 一3 川。这些效应c a s p a s e 的活化可以导致细胞凋亡过程中的一系列形态和生化特征，如染色质凝聚、d n a 片段化、核膜崩解、磷脂酰丝氨酸的外翻等等。( 2 ) s m a c d i a b l os m a c d i a b l o 是2 5 k d 的线粒体蛋白，在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质s , 9 1 。s m a c 是由核基因编码的，其n 端有5 5 个氨基酸的线粒体定位序列。当s m a c 蛋白被转运进入线粒体后，这段序列被切去以形成成熟的s m a c 蛋白。这段定位序列的切割使成熟的s m a c 蛋白产生一个新的n 基端，这个n 基端的前面第一琊分4 个氨基酸a l a - v a l p r o i i e ( v a p i ) n - i 以与l a p s ( 凋亡抑制蛋白) 的b i r 结构域结合【1 0 1 。( 3 ) 调亡诱导因子( a p o p t o s i si n d u c i n gf a c t o r , a i f )凋亡诱导因子a i f 是一个5 7 k d 黄素蛋白，与细菌氧化还原酶相似。它定位于线粒体双层膜问区。当稠亡被诱导后，a i f 可以从线粒体转位进入细胞核，直接导致染色质凝集和大片段d n a 降解( 5 0 k b ) 【”1 ，a i f 的这些效应是不依赖于c a s p a s e 一和其自身的氧化还原酶活性的i 幢1 。2 2 2 细胞凋亡的线粒体途径的调节细胞线粒体c y t c 及其它凋亡分子的释放受b c l 2 蛋白家族的调控。b c l 2 是一个很大的蛋白家族，又可分为两个亚族一抗凋亡亚族和促凋亡亚族。其中促凋亡亚族可以促进或诱导线粒体凋亡因子的释放，而抗凋亡亚族成员可以抑制该过程。b c l 一2 蛋白含有4 个同源结构域，依次命名b h l 、b h 2 、b h 3 、和b h 4 。所有b c l 2 家族成员均含有1 个或多个b h 结构域。其中b h 3 结构域是一段具双歧性的螺旋，可介导家族蛋白l ，日j 的相互作用。在b c l 一2 蛋白家族中，有些成员仅含有b h 3结构域。在正常情况下这些蛋白定位于细胞的非线粒体组份，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，从而导致线粒体中凋亡因子的释放。2 2 3 细胞调亡过程中线粒体的正常功能丧失线粒体是真核细胞能量代谢的中心，因此细胞凋亡过程中对线粒体损伤的最直接结果是其j 下常功能的丧失。例如，因为c y t c 是唯一具水溶性的电子传递链组份，c y t c 的释放显然可使电子传递中断，a t p 产生受阻，同时线粒体也不能维持其正常的膜电位。在电子传递链中，c y t c 负责将电子f l j c y t c 还原酶( 复合物i i i )传向c y t c 氧化酶( 复合物) 。在复合物上，氧原子可接受电子，生成h 2 0 。因此c y t c 的释放可使线粒体产生更多活性氧自由基和过氧化脂1 1 4 , 1 5 | 。在凋亡细胞中，线粒体a t p 的合成下降，细胞质中a y p 含量下降，而a d p含量上升，线粒体膜间隙磷酸肌酸浓度上升。这些现象都可以被b c l 。x ( l ) 高表达逆转i 1 6 1 。因此，似乎b c l x ( l ) 抗凋亡的重要机制之一是维持线粒体的稳态。例如b c l x ( l ) n t 维持线粒体外膜两侧的代谢转换，因此促进细胞存活。2 3c a s p a s e 家族与细胞调亡目前认为细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活第一部分的主动性细胞死亡过程。对线虫的研究表明c e d 3 基因的激活为线虫细胞凋亡所必需，其后在人类发现的与c e d 3 基因高度同源的c a s p a s e 家族，在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。c a s p a s e 家族在讵常情况下，均以酶原形式存在于细胞内，均含有q a c x g ( x 为r 、q 或g ) 血肽序列、p r o d o m a i n 和酶作用域。有人认为p r o d o m a i n 的长短与其在e a s p a s e瀑布中的位置有关1 1 8 】。2 4c a s p a s e - 3 与细胞调亡哺乳动物细胞中发现的c a s p a s e 家族的1 0 个成员中，普遍认为c a s p a s e - 3 是细胞调亡中关键的蛋白酶，根据g e n b a n k 人类e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g ) 提供的信息，用p c r 方法，f e m a n d e s a l n e m r i 等于1 9 9 4 年在人j u r k a tt 细胞系首次克隆出c a s p a s e 3 基因并证明其与i c e 有同源性，分为c p p 3 2n 、c p p 3 2 岱，两者的阅读框均出8 3 1 个核苷酸组成。编 l j j 2 7 7 个氨基酸，相对分子质量约为3 2 1 0 3 【1 9 i 。c a s p a s e 3 以其酶原形式合成，酶原n 端有一前区，与c a s p a s e 一8 、9 等起始型c a s p a s e 相比，c a s p a s e 3 及其他下游c a s p a s e 的前区较短，不合有死亡效应结构域( d e d ) ，必需在起始型c a s p a s e 被激活后才能进一步被激活1 2 0 l 。在c a s p a s e 3 酶原中存在一安全扣调节三肽，由a s p a s p a s p 组成，位于大、小亚基结合处可变形的环区中，凋亡发生时该三肽残基在胞质内被酸化裂解，在c a s p a s e 一3 的触发活化时起重要作用，因而它可能是整个凋亡级联反应的一个关键调节点【2 1 1 。c a s p a s e - 3激活时在a s p 位置切开，形成大、小亚基( 1 1 和8 ) ，同时去掉n 端的前区，进而t l 与t 3 结合成异二聚体( a 1 3 ) ，酶的两个活性位点于大、小亚基的结合部，异二聚体还将进一步通过次级键形成四级结构( a 邝) 2 发挥作用。正常情况下，胞质i 为e a s p a s e 3 以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡时才被激活为有活性的c a s p a s e 3 。f a s 介导的细胞凋亡中发现存在c a s p a s e 一3 的活化，丝氨酸蛋白酶抑制剂可同时抑制细胞凋亡和c a s p a s e 一3 的活化，s a u r e u s v 8 丝氨酸蛋白酶可特异地对p 3 位点进行切割，激活e a s p a s e 3 。近来z o u 2 2 】纯化并克隆出凋亡蛋白酶激活因子( a p a f s ) ，a p a f - 1 蛋白与线虫的c e d - 4 蛋白极为相似，线粒体释放的细胞色素c 与a d a f - 1 结合，从而诱发c a s p a s e - 3 激活。b c l - 2 则可抑制细胞色素c的释放，抑制c a s p a s e 一3 激活和细胞凋亡。2 5p a r p 与细胞调亡0第一部分p a r p 聚( a d p 一核糖) 聚合酶1 是一种非组蛋白染色体蛋白质，以高浓度存在于真核细胞中，约每5 0 个核小体存在一个酶分子。p a r p 被克隆并定位于1 号染色体q 4 1 q 4 2 ，编码人类p a r p 酶的e d n a 约长3 7 k b ，含有一个丌放阅读框架( a no p e n i n gr e a d i n gf r a m e ) 编码1 0 1 4 个氨基多肽，分子质量约为l1 3 0 0 0u ，有3 个功能域：n 术端4 6 0 0 0ud n a 结合域：2 2 0 0 0u 位于中部的自我修饰域：5 4 0 0 0u 羧基端催化域。在细胞受到外界损伤因素作用时，d n a 发生断裂，p a r p 结合到d n a 断裂口，其催化活性被激活，修饰受体蛋白( 这些蛋白在维持染色体结构和染色体相关蛋白功能方面均具有重要意义1 ，进而发生一系列级联反应，使细胞对外界刺激作出应答。p a r p 通过自我催化功能调节其与d n a 的结合，如果p a r p 自身核糖化，便因电荷排斥作用从d n a 断端脱落。p a r p 除在d n a 损伤修复中的重要作用，还参与核酸的代谢；染色体结构的调节：基因表达的调控；基因稳定性的维持及细胞凋亡的实施。当大量d n a 损伤得不到有效修复时，p a r p 的“细胞保护”功能便发生了变化。受损细胞越过d n a 损伤调控点，通过一种预定的自我破坏过程从生物体内清除，这个过程b 口细胞凋亡，凋亡过程一旦激发，p a r p 便会以底物的形式参与到细胞凋亡过程中，这作用形式，使细胞根据受损程度作出反应，损伤不严重时诱导细胞进入生长休止状态，修复损伤，以利于细胞功能的恢复；损伤严重时则放弃修复，使细胞进入凋亡。研究表明，化疗药物，y2 射线和烷化剂等诱导细胞凋亡时，恰好在d n a 梯状电泳出现之前p a r p 被水解为2 个片段( 8 9 0 0 0u 和2 4 0 0 0 u ) 。如果用特定的蛋白水解酶抑制剂保护p a r p 则d l n a 梯状电泳图谱不再出现，同时与凋亡相关的细胞形态学和生化学改变也不再发生。另外，用p a r p 的抑制剂3 氨基苯甲酰胺( 3 a b ) 作用于细胞，只能延缓n a d + 的消耗，不能推迟p a r p 裂解和d n a 片段化，这一现象表明p a r p 裂解可能是启动细胞凋亡的关键，或细胞凋亡过程中这种蛋白酶的水解是激活d n a 内切酶的必由之路。实验证实c a s p a s e 家族中的c a s p a s e - 3p a r p 的蛋白水解作用是细胞凋亡实施中的一个早期事件或前提条件。通过对c a s p a s e 3介导的p a r p 裂解进行抑制可有效减轻凋亡的发生。故p a r p 可通过c a s p a s e s 的裂解剪切参与凋亡的发生】。筘一部分3 细胞调亡的检测方法3 1 细胞凋亡的形态学检测3 1 1 光学显微镜和倒置显微镜未染色的凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。3 i 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形念学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的d n a 特异性