（制糖工程专业论文）米蛋白肽功能黄酒的研究.pdf

摘要 摘要 黄酒是我国的民族特产，与啤酒、葡萄酒并称为世界三大古酒，享有“国酒”之美誉。 在生活水平曰益提高的今天，为了满足快节奏的人们对健康、自然的生活的追求，功能 保健黄酒就成了当今黄酒的发展方向。本课题以资源丰富、价格便宜的米渣蛋白为原料， 研究了米蛋白肽的酶解制备工艺及米蛋白肽功能黄酒的生产工艺、功能性和稳定性。 相对质量大于5 0 0 0 的高分子蛋白是造成黄酒非生物不稳定的主要因素，而相对分 子质量小于1 0 0 0 的肽可以稳定的存在于黄酒中。以米渣蛋白为原料，选用五种蛋白酶 分别进行单一酶和复合酶水解制备黄酒适用肽的研究。结果表明，选择不同的酶对蛋白 肽得率有较大的影响，不同的酶得到的水解液的肽浓度具有最高值。经过s a s 软件响 应面程序的优化，碱性蛋白酶水解条件为：p h 7 5 9 、温度5 5 6 4 、时间1 7 8 7 1 m i n 、加 酶量4 8 4 ，此时肽得率为3 8 2 0 。经h p l c 分析表明，最佳水解条件下得到的米蛋白 肽9 0 以上相对分子质量小于1 0 0 0 ，完全可以满足黄酒适用肽的需要。 采用绍兴加饭酒的实验室改良工艺酿制黄酒，以酒体中肽浓度和酒的感官评定结果 为评价指标，发现肽在黄酒后酵期间添加时，损失率最小，最适添加量为干糯米质量的 1 5 ，酿制的黄酒有理想的肽浓度和风味口感。经过8 5 、2 0 r a i n 的煎酒，米蛋白肽黄 酒自然存放2 0 天后，没有出现变质现象。米蛋白肽功能黄酒和对照样黄酒的相对分子 质量分布图谱图谱显示，酒中9 0 的肽的相对分子质量都在1 0 0 0 以下。 由r p h p l c 图谱法计算样品对a c e 的抑制率，得出米蛋白肽功能性黄酒中的功能 肽对a c e 抑制率为6 0 0 1 。以米蛋白肽黄酒对a c e 的抑制率为评价指标，通过热稳 定性实验、光照稳定性实验和体外消化稳定性实验，发现米蛋白肽黄酒在不同温度、光 照的条件下稳定性较好，而胃蛋白酶的水解作用会对其活性造成一定的影响，但经过胃 蛋白酶、胰蛋白酶的水解作用后，产物仍然有近5 0 的抑制率。 关键词：肽，酶解，功能性，a c e ，黄酒 a b s t r a c t a b s t r a c t r i c ew i n e ，ak i n do fc h i n e s et r a d i t i o n a lw i n e ，i saf a m o u sw i n ei nt h ew o r l da n dt r e a s u r eo f c h i n a r i c ew i n ei sc h i n a sn a t i o n a ls p e c i a l t yp r o d u c t s ，a n db e e r , w i n ea n dc a l l e dt h et h r e em a j o r a n c i e n tw i n e si nt h ew o r l d ，e n j o yt h e ”w i n ec o u n t r y ”r e p u t a t i o n i n c r e a s i n gt h es t a n d a r do f l i v i n g t o d a y ，i no r d e r t om e e tt h ef a s t p a c e dp e o p l e sh e a l t ha n dt h ep u r s u i to fl i f e ，f u n c t i o n a lh e a l t h yr i c e w i n eh a sb e c o m et o d a y sw i n ed i r e c t i o no fd e v e l o p m e n t i nt h i sa s s a y ，r i c ed r e gw a su s e da s s u b s t r a t et op r o d u c ea c e i n h i b i t o r yp e p t i d e ，a n dt h ei m p o r t a n tp a r a m e t e ro fe n z y m eh y d r o l y s i so f r i c ed r e g ，t h ea d d i n gw a yo fp e p t i d e ，b r e w i n gt e c h n i c a lp r o c e s so ff i c ew i n er i c hi np e p t i d e ，t h e f u n c t i o no ft h er i c ew i n e w e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d t h ep o l y m e rp r o t e i nt h a tt h er e l a t i v em o c u l a rw e i g h ti sm o r et h a n5 0 0 0i st h em a i nf a c t o ro f t h en o n - b i o l o g i c a li n s t a b i l i z a t i o no ff i c ew i n e ，a n dt h ep e p t i d eg o tl e s st h a n10 0 0r e l a t i v em o c u l a r w e i g h tw o u l db ee x i s ti n t h er i c ew i n es t e a d i l y r i c ed r e gw a sh y d r o l y z e db ys i n g l ea n dc o m p l e x p r o t e a s er e s p e c t i v e l yi n5k i n d so fp r o t e a s e sf o rp e p t i d e su s e di nr i c ew i n e t h eh y d r o l y t eo b t a i n e d b ya l c a l a s e2 4 lp r o t e a s es h o w e dt h eh i g h e s ta c t i v i t y , a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f h y d r o l y s i so f r i c ed r e gw a sd e t e r m i n d e db ye x p e r i m e n tt ob e ：p h = 7 5 9 ， e s 】= 4 8 4 ，t = 1 7 8 7 1 m i n ，t = 5 5 6 4 ( 2 t h ey i e l do f p e p t i d ew a s3 8 2 n i n ep e r c e n to f t h ep e p t i d eg o tl e s se l a t i v em o c u l a rw e i g h tt h a n 10 0 0a n dc o u l dc o m p l e t e l ym e e tt h en e e do ff i c ew i n e r i c ew i n ew a sb r e w e da c c o r d i n gt ot h ei m p r o v e ds h a o x i n gf l e ew i n et e c h n o l o g yi nl a b o r a t o r y a n dt h ep e p t i d ec o n c e n t r a t i o na n dw i n es e n s o r ye v a l u a t i o na r eu s e da se v a l u a t i o ni n d e x t h e p e p t i d e sa d d e da f t e rf o r e f e r m e n t a t i o np e r i o dw a s f o u n dh a dt h es m a l l e s tl o s sr a t e t h eo p t i m u m a m o u n tt oa d dt or e a c ht h ep e r f e c tc o n c e n t r a t i o no ft h ep e p t i d ea n dt h eb e s tt a s t ea n df l a v o ri st h e 1 5p e r c e n to f q u a l i t yo fg l u t i n o u sr i c e a f t e r8 5 c ，2 0m i no fs t e r i l i z a t i o n , r i c ew i n es t o r e d2 0d a y s i nn a t u r a le n v i r o n m e n tr e s u l t e di nt h es a t i s f i e do f b a c t e r i c i d a le f f e c t t h e r ew a sc h a r a c t e r i s t i cp e a k i nm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o np a t t e r n sb o t hf r o mf u n c t i o n a lr i c ew i n er i c hi np e p t i d ea n dt h e c o n t r o la b o u t2 4 0d a , a n d9 0p e r c e n to ft h ew i n e - m e t e rp e p t i d er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tw e r el e s s t h a n1 0 0 0 t h er p h p l cm e t h o dr e s u l t e di nt h ea c ei n h i b i t i o nr a t ea b o u tt h es a m p l e t h ef u n c t i o n a l p e p t i d ed e r i v e df r o mr i c ew i n eg o tt h ea c ei n h i b i t o r yr a t eo f6 0 01p e r c e n t t h ea c ei n h i b i t o r y r a t ew a su s e da st h ee v a l u a t i o ni n d e x r i c ew i n er i c hi np e p t i d eh a dh i g ht h e r m o s t a b i l i t ya n d s t a b i l i t yu n d e rl i g h tb ym e a n so f t h e r m a ls t a b i l i t ye x p e r i m e n ta n di l l u m i n a t i o ne x p e r i m e n t t h e h y d r o l y z a t i o no fp e p s i na f f e c t e da c ei n h i b i t o r yr a t eo f t h ep e p t i d e ，b u ta f t e rt h eh y d r o l y z a t i o no f t h ep e p s i na n dt r y p s i nt h ep r o d u c ts t i l lh a dn e a r l y5 0p e r s e n to fi n h i b i t i o nr a t e k e y w o r d s ：p e p t i d e ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，a c e ，f u n c t i o n a l ，r i c ew i n e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是奉人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 彳她 日 期：稻_ 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南 大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档 的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 瀚对 气c 溉 丝! 垒篁 日 期： 噬垒：f ! 第一章绪论 1 1 黄酒概述 第一章绪论 “十月获稻，为此春酒”，在三千多年前已把十月间收获的稻谷乘农闲时制造春天的酒 了，由于大多数品种酒的颜色黄亮，故俗称黄酒i l 】。黄酒( c h i n e s e r i c e w i n e ) 是以稻米、黍米、 玉米、小米、小麦等为主要原料，经蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、 勾兑而成的酿造洲2 1 。它是中国历史最悠久的传统酿造酒。是世界三大古酒之一，据考证黄 酒起源于龙山文化时期，距今有5 0 0 0 多年历史。在古代的文献广雅的料器篇中就有“醌” 的字样，而“醌法”所酿造的酒就是原始的加饭黄洲3 1 。作为中华民族的特有酒种，它酒性柔 顺，酒体丰满，酒味醇厚，体现了华夏民族的内在敦厚、寓刚于柔的文化精神。它以美妙 的色泽，丰富的营养，独特的滋味而著称于世1 4 】。它氨基酸含量丰富，种类达1 8 种之多， 人体必需氨基酸含量最全，居各种酿造酒之首，其发热量高，营养成分主要有糖、肽、氨 基酸等低分子浸出物，还有b 族维生素、矿物质，易为人体消化吸收，是营养价值极高的 食品之一p j 。它又可一酒多用，既可饮用又可药用，还具有烹饪调味和美容等功能。由于酒 度低、耗粮少，符合当今世界饮酒风尚的发展潮流，被世人誉为“中华第一味”、“东方名酒”【6 】， 特别是绍兴酒，以其独特的工艺，上乘的质量，醇厚的风味成为我国黄酒的代表，曾多次 荣获国际金奖，产品远销三十多个国家和地区，在国际上享有很高的声誉。 黄酒按照生产方式分可分为三类，第一，淋饭酒。指将蒸熟的米饭采用冷水浇淋进行 冷却，因此得名：第二，摊饭酒，指将蒸好的米饭摊开进行冷却；第三，喂饭酒，指在黄 酒的发酵过程中分批加饭，进行多次发酵酿造而成的黄酒。喂饭酒的特点是：喂饭可以给 酵母不断供给新鲜营养，从而使酵母处于持续旺盛状态，使原料中淀粉分批进行糖化和发 酵，有利于控制发酵温度，增加酒的醇厚感，减少苦味。在黄酒的生产中也有采用摊饭法 和喂饭法相结合的方法进行生产的，如寿生酒、乌衣红曲酒等。在黄酒的分类中，如以糖 化发酵剂来分，可分为红曲酒( 乌衣红曲酒) 、麦曲酒、小曲米酒三大类；如以原料来分， 分为福米酒、粳米酒、釉米酒、黍米酒和玉米酒等i _ 7 1 。按酒中的含糖量分，可分为干黄酒， 酒中的含糖量小于1 5 o g l ( 以葡萄糖计，以下同) ；半干黄酒，酒中的含糖量在1 5 1 - 4 0 0 0 l 之间；半甜黄酒，酒的含糖量在4 0 1 1 0 0 o g l 之间，b 苯乙醇含量不小于6 0 m g l ；甜黄酒， 酒中糖份含量在4 0 1 1 0 0 o g l 之间，p ，苯乙醇含量不小于4 0 m g l 。其典型代表为绍兴元红 酒、加饭酒、善酿酒、香雪酒和众多地方特色名品。此外，在黄酒同一品类中，还有众多 花色品种，大致可分为低度黄酒、气泡黄酒、果味型黄酒、滋补型黄酒、花香型黄酒、蔬 菜型黄酒和功能性黄酒等【8 一1 0 1 。 1 1 1黄酒的特点和用途 1 1 1 1 传统的饮料酒 黄酒作为低度、营养、保健型的酿造酒，非常适合当今人们对饮料酒消费需求变化的 1 江南大学硕十学位论文 趋势。因此，黄酒业只要开发出适合市场需要的产品，并做好市场导向宣传，必将引起更 多消费者的关注，并最终为黄酒消费营造出一种时尚、健康的氛围。 1 1 1 2 黄酒独特的药用价值 黄酒素和医药有关，据汉书食货志中记载：“酒，百药之长”，黄酒既是药引子， 又是丸散膏丹的重要辅助材料。本草纲目上说黄酒能气通血脉、厚肠胃、润皮肤、散湿 气、养脾气、扶肝、除风下气、热饮甚良、能活血、味淡者利小便。在中医处方中常用黄 酒浸泡、炒煮、蒸炙各种药材，借以提高药效。如黄酒泡制中药，能使药性移行于酒液中， 服后有助于胃肠对药物的吸收，迅速的把中药成分运行至全身以引。就是在科学发达的今 天，许多中药仍以黄酒泡制。本草纲目详细记载的6 9 种可以治疗疾病的药酒，均以黄 酒制成。最近，也有日本科学家研究指出，适量饮用黄酒对延缓人脑细胞的衰老具有重要 作用。 1 1 1 3 黄酒的烹饪调味价值 除了具有丰富的营养和药用价值之外，黄酒还可用作烹调佐料，它具有祛腥、去膻、 解腻、增香、添味等功效，是一种非常理想的烹饪调味用酒。目前，几乎所有的宾馆、饭 店、酒楼烹饪时都要用到料酒，而且基本上采用黄酒，高档次的星级饭店则直接采用陈年 绍兴加饭酒。嘉善黄酒之所以在上海大市场占据着重要的地位，原因在于他们首先占领了 上海人的厨房。 1 1 1 4 黄酒的营养保健功能 黄酒是一种低度营养型酒，黄酒的酒精含量因品种而异，一般在1 0 - 1 8 ( v ，以 下同) 之间，适量饮用不会发生酒精的毒害作用。此外，黄酒中微量元素也很多，可测出 的有1 8 种以上，如k 、n a 、c a 、m g 、p 等常量元素和c u 、z n 、f e 、m n 、c o 、g e 、i 等微 量元素。黄酒中微量元素以f e 含量较高，其中的f e 呈易被人体吸收的形态，长期饮用可 改善机体缺f e 症状：黄酒中c a 、p 等元素含量高，有利于人体对c a 、p 等元素的吸收，尤 其对于缺c a 的老年人来说，黄酒是一种最理想的低度酒精饮料；黄酒中含有的s e 是一种 天然的肿瘤抑制剂；z n 是人体中2 0 4 种酶的活性成分，是维持人体正常生命活动的关键因 子，z n 在酒中以配合物态有机z n 的形式存在，具有极高的生物利用率，能发挥重要的保 健作用；m n 对调节中枢神经和内分泌系统有重要作用，同时，它也是抗衰老的关键因子。 此外，黄酒中还含有特殊生理功能和营养作用的g e 和i ，这两种元素在抗机体氧化、抗衰 老、防治癌症及预防心血管等方面有显著作用【1 4 1 。现研究发现黄酒中含有丰富的氨基酸、 酚类物质、含量较高的功能性低聚糖、丫氨基丁酸( g a b a ) 和生物活性肽等功能性物剧”l 。 1 1 1 5 丰富的酚类物质 酚类物质被认为具有清除自由基，防止心血管病、抗癌、抗衰老等生理功能。黄酒中 的酚类物质来自原料( 大米、小麦) 和微生物( 米曲霉、酵母) 的转换，特别是由于发酵 周期长达1 0 0 天左右，小麦带皮发酵，麦皮中的大量酚类物质溶入酒中，因而酒中的酚类 物质含量较高。表1 - 1 中列出的是浙江古越龙山陈酒的部分酚类物质的含量【l 们。 1 1 1 6 含量较高的功能性低聚糖 功能性低聚糖难以被人体消化，在摄入后很少或根本不产生热量，但能被肠道中的有 益微生物双歧杆菌利用，促进双歧杆菌增殖，改善肠道的微生态环境，促进b 族维生素的 2 第一章绪论 合成和钙、镁、铁等矿物质的吸收，提高机体免疫力和抗病力，能分解肠内毒素及致癌物 质，预防各种慢性病及癌症，降低血清中胆固醇及血脂水平【1 7 】。 表1 - 1 古越龙山陈酒中的酚类物质含量 t a b 1 - 1p h e n o l sc o n t e n t si ng uy u el o n gs h a hr i c ew i n e 种类 含量( r a g l ) 儿茶素 表儿茶素 芦丁 槲皮素 没食子酸 原儿茶酸 绿原酸 咖啡酸 p 香豆酸 阿魏酸 香草酸 黄酒( 以浙江绍兴古越龙山为例) 中功能性低聚糖异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的含 量分别为3 1 4 、3 9 6 、0 1 4 l 。其来源分两部分：一是支链淀粉的酶解。黄酒以糯米为原 料，糯米的淀粉几乎全部是支链淀粉，淀粉酶对它的分支点不易切断，因而在酒中残留的 分支低聚糖较多；二是麦曲中微生物分泌的葡萄糖苷转移酶通过转糖苷合成。 1 1 1 7 富含重要的抑制性神经递质t - 氨基- r 酸( g a b a ) 丫- 氨基丁酸( g a b a ) 是一种重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有降低血 压、改善脑功能、增强长期记忆、抗焦虑、高效减肥及提高肝、肾机能等生理活性。黄酒 ( 以浙江绍兴古越龙山为例) 中g a b a 含量高达3 4 8 m g l ，是富含g a b a 的保健饮品。g a b a 来自原料和微生物( 酵母、曲霉菌、乳酸菌等) 的合成。 g a b a 能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到降低血压的目的。据 报道，黄芪等中药的有效成分即g a b a ；g a b a 还能提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，使脑细 胞活动旺盛，促进脑组织的新陈代谢和恢复脑细胞功能，改善神经机能。医学上，g a b a 对脑血管障碍引起的症状，如偏瘫、记忆障碍等有很好的疗效，同时用于尿毒症、睡眠障 碍的治疗药物中l l 引。此外，日本研究者以富含g a b a 的食品进行医学试验，结果显示对老 年痴呆等症状有显著的改善效果。谢广发等【1 9 】发现，正常植物体中g a b a 的含量为 3 2 0 0 m g k g ，而古越龙山绍兴黄酒中含量为1 6 7 3 6 0 m g l ，说明古越龙山绍兴黄酒是一种 比较理想的富含g a b a 的保健饮品。 1 1 1 8 无可比拟的生物活性肽 近年来的研究表明，以数个氨基酸结合而成的肽具有比氨基酸更好的吸收性能，而且 许肽具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的生理功能，如促钙吸收、降血压、降胆固醇、 镇静神经、免疫调节、抗氧化、清除自由基、抗癌等作用。 3 殂 舛 鹋 鲍 m 悸 为 钉 h 弱 弘 4 l 1 o o 0 3 0 0 l 2 江南大学硕士学位论文 黄酒中的肽含量是其它任何酒都无可比拟的。对古越龙山中的肽类组分进行提取纯化 和降血压、降胆固醇的体外活性试验，发现酒中含具有活性很强的降血压生物活性肽和降 胆固醇生物活性肽，初步鉴定出其组成及序列分别为g l u s e r - g l y - p r o 和c y s - g l y - g l y - s e r 。 同时研究发现，黄酒中肽的种类较多，有待进一步提取纯化，并进行功能试验和序列测犁2 0 j 。 1 1 2黄酒的发展方向 黄酒是我国的特产，享有酒中之瑰宝、“国酒”之美誉。黄酒是低耗粮、低酒度、高营 养的酿造酒，具有食疗和药用价值，国家也用从量征税的方法，即每吨黄酒征消费税2 4 0 元，来促进黄酒产品上水平、上档次、上价格，来支持倡导黄酒的发展。可以说，黄酒符 合酒类市场的消费趋向，其发展前景十分广阔。 随着我国人民经济收入水平的提高，追求健康、美容、加强膳食营养，从营养性逐步 走向保健性，要求产品新颖有特色具个性，有文化内涵，不仅局限于口感好和有营养，而 且要求有第三种功能，即调节人体生理活动机能、增加人体免疫功能是当今的时尚，要让 消费者在接受他的同时，如同接受一种文化、一种寄思、一种情绪，让功能保健黄酒内蕴 价值，成为人们生活的精神要素，成为企业形象的一部分。近几年随着我国加入w t o ，在 国际国内酒业市场产品竞争十分激烈的形势下，一些甜型黄酒( 国家原名优产品也不幸免) 逐渐受到冷落，干型、半干型、半甜型黄酒尚有一定的消费市场，但也仅限于成熟的老市 场。功能性黄酒的崛起，受到业内人士关注，受到消费市场的青睐，开发功能保健黄酒， 既是企业产品调整结构的需要，也是国际国内酒市场总体发展的需要，更是现代消费市场 需求趋势和消费时尚，因此说，功能保健黄酒是黄酒发展的方向。 所谓功能保健黄酒，一般是以黄酒为基酒，以蒸馏酒( 白酒、食用酒精) 、发酵酒( 黄 酒、清酒、葡萄酒) 为载体、溶媒，与营养丰富、功能性强的药食两用的植物、动物、矿 物、昆虫等及功能成分含量高的物质，采用现代高新生物技术，改进原料配伍，添加有益 因子，更新生产工艺，优化产品口感，使之适合各种人群需要的“原材料型”和“功能强化型”， 并在产品风格上保持黄酒特征的功能保健型黄酒。根据有关国内功能黄酒新产品的开发信 息，大致有以下几种类型1 2 。 1 1 2 1 添加植物( 中草药) 提取液的保健功能黄酒 古代药酒方中，不少都用中草药与黄酒搭配。选择国家规定的药食同源中的中草药， 除酿造发酵外，尚有浸泡法( 冷浸法、热浸法) ，煎煮调兑法，热回流法，渗透滤法，萃取 勾兑法，蒸馏法等。民间多使用的是冷浸法，虽比较简便易行，易于操作，但有效成分利 用率不高，技术含量低。 1 1 2 2 用新特原料酿制黄酒 近几年国内外发现了许多新、特酿就原料，如苦荞麦( 据分析测试含芦丁) 等，对调 节血糖和降低血脂起作用。黑糯米( 含大量花青素、强心甙等滋补物质) ，有开胃补血、益 智美容、明目养神、减肥祛病、防衰抗癌的作用。螺旋藻、微量元素硒、芦荟( 草本植物) 、 蚂蚁、蜜蜂等，把这些物质分别提取加到黄酒中，或分别与粮谷一起发酵，酿成功能性酒。 1 1 2 3 强化、营养、保健黄酒 在黄酒中，加入独特的营养物质，如复合维生素、特殊氨基酸、微量矿物元素，红曲 4 第一章绪论 中提取的莫奈克林k 等特殊物质，以及其它功能物质，如在黄酒中直接添加低聚异麦芽糖、 低聚果糖等，制成“双歧因子”保健黄酒，具有促进人体肠道有益菌生长的功效。 1 1 2 4 美容黄酒 以黄酒为酒基，再添加适当的香味物质，调制成浴用黄酒，此酒非常时尚，在日本、 香港、东南亚有广阔市场。 1 1 2 5 果类饮料酒 以水果，如桔子、香蕉、苹果、梨、桃、椰子、醋栗、猕猴桃、金樱子等果类榨汁调 糖发酵，或配粮谷协同发酵，酿成果香味米酒，也可用鲜榨果汁与黄酒直接调配。 1 1 2 6 花果香系列酒类 以花粉、柠檬、乌梅、桂花、茉莉、草药、香料和酸类、甜类调味液，调配成需要的 香气和口味黄酒。 1 1 2 7 蔬菜系列黄酒 蔬菜中有许多具有营养和保健作用的品种，如胡萝卜、洋葱、姜、蒜、南瓜、芹菜、 苦瓜等，可将它们分别混合或单独制成汁液再与粮谷类加糖化发酵剂发酵，或菜汁单独处 理与黄酒调配成低度饮料酒。 1 1 2 8 海产品营养型、功能型黄酒 海藻类：海带、裙带菜、海蕴、紫菜等。海产品类：海龙，海马、贝壳、虾、牡蛎等。 海产品中含有有益的矿物元素、维生素等特殊营养成分，可以酿制成具有特殊功能及营养 作用的黄酒。 目前，市场上已出现了不少功能保健黄酒的成功范例。浙江古越龙山绍兴酒股份有限 公司在传统优质绍兴酒生产工艺的基础上，采用生物工程技术，添入了桂圆、莲子、枸杞 子等有效成分并经五年贮存，打造成备受市场青睐的“状元红”酒；上海金枫酒业有限公司 开发的“石库门”上海老酒，采用陈年黄酒，在生产工艺中，添加了蜂蜜、枸杞、姜汁等多 种营养物质，主打上海中、上层消费者市场，取得了很好的成效；上海冠生园华光酿酒药 业有限公司是最早推出营养、保健型黄酒的，如“华佗牌”十全大补酒，该酒以绍兴加饭酒 为基酒，配以人参、白术、当归、黄芪等十余味药材，用特种工艺提制，其酒味美、滋补 功效显著。烟台张裕葡萄酒酿酒公司利用即墨老酒为基酒配以中草药及动物鞭，生产的“至 宝三鞭酒”和“金鸡铁树酒”有滋阴壮阳、补肾健脾的功效，每年出口量也很大。 改革开放以后，我国的黄酒有了很大的发展，产量不断增加，企业生产规模不断扩大， 科技水平也有了很大的提高，古老的手工作坊式的传统旧工艺逐渐被现代化的工厂所取代。 但是受“南黄北白”消费格局的限制，我国的黄酒生产和消费区域主要集中在南方的江浙、 福建、上海一带。虽然黄酒的市场现在也发展到了全国，但是其他省市的黄酒产量只占全 国黄酒总产量的1 5 ，由此严重影响了黄酒的销量瞄锄1 。加入w t o 有利于市场的开拓， 我国的黄酒市场有着更广阔的前景。随着人们消费习惯的改变和对产品质量要求的提高， 黄酒要迅速发展，也面临着一些急待解决的问题。随着时代的发展，人们的口感已经发生 了变化，逐步趋向低酒精度，清爽自然已成为主流，而传统黄酒浓度高，用曲量大，强调 口感醇厚骨架硬，我们应在继承传统的基础上，把生物发酵领域的最新科技成果应用到黄 酒的技术创新中来，实现黄酒酒体及e l 感向现代化黄酒的转变。本课题创造性的将具备多 s 江南大学硕士学位论文 种活性功能的米蛋白肽与中国的“国粹”黄酒相结合，开发出一种适合多种人群饮用的肽功 能性黄酒。该酒具备护肝、抗疲劳、抑制酒后血压升高、增强免疫力等多种保健功能，是 一种迎合当今社会崇尚健康、追求自然的生活理念的高档保健酒。它的问世将一改黄酒长 久以来“土气”、“老气”的形象，带给黄酒“自信、高雅、有品位、懂生活”的现代气息，必将 为黄酒市场的开拓和黄酒产业的进一步发展起到重要的作用。 1 2 生物活性肽研究概述 近年来，蛋白质所具有的特殊生理活性越来越引起人们的关注，这就是所谓的蛋白质 第三功能。现已发现源于食物蛋白的一些特殊序列具有抗氧化、降血压、调节血清中血脂 水平、抗癌、提高免疫力等功能【2 和2 6 1 ，对于功能活性肽的研究成为当今研究的热点。 生物活性肽( b i o a c t i v ep e p t i d e s ) 是指那些具有特殊生理功能的肽类，不仅易消化吸收， 而且还具有多种人体代谢和生理调节功能，如促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血 压、促进矿物质吸收等作用。按其来源可分为天然存在的活性肽、蛋白质酶解活性肽和化 学合成的活性肽。其中，天然存在的活性肽包括肽类抗生素、激素以及在各种组织、骨骼、 肌肉、免疫系统、消化系统、中枢系统中存在的活性肽，这些活性肽的缺点是含量少，或 提取比较困难。化学人工合成费时费力，成本昂贵。因此采用酶解蛋白的方法来生产生物 活性肽是一种比较合理的途径【2 7 1 。在酶解蛋白的方法中，生物活性肽一般从细菌蛋白质、 植物蛋白质或动物蛋白质的水解中获得，通常为相对分子质量比较小的肽片段。 关于生物活性肽的功能性的相关研究已进行了很多。据研究，酒精在血液中消失的速 度为1 0 0 2 0 0 m g k g 体重h ，一个7 5 蚝体重的健康成人每1 5 h 能够代谢7 5 - 1 5 9 乙醇。而科 学家反复证明，过量酒精对人体有害，对肝脏最为严重，对胃肠道、胰腺、心脏、肾脏等 也会造成不同程度的损害【2 矾。孙冀平、沈蓓英1 2 9 】认为生物活性肽能提高血液中丙氨酸和亮 氨酸浓度，产生稳定n a d + ，从而加速酒精在体内的代谢，有效降低血液中乙醇浓度，从而 起到解酒和保护肝脏的作用。此外，谷氨酸、脯氨酸和精氨酸也对酒精代谢有影响l j 们。 m i g h o r e s a m o u rd 【3 1 】等人已从大米蛋白和小麦蛋白的蛋白酶水解物中分离中获得了多种免 疫调节肽，这些肽可以刺激巨噬细胞和多核细胞的吞噬作用，具有免疫调节作用。但是有 关这类免疫活性肽的生理机制目前还不很清楚，尚需进一步深入研究。研究人员 3 2 - 3 7 1 还发 现，多种植物蛋白的酶解产物都有着不同程度的a c e 抑制性。 - 一 1 2 1肽a c e 抑制性的研究概况 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是存在于人体血管内皮细 胞内的一种酶，它在血压调节方面起着重要的作用，当其受到抑制时血压就会降低。基于 这种机理合成的降血压药物有卡托普利c a p t o p r i l 、依那普利e n a l a p r i l 、赖诺普利l i s t i n o p r i l 等，这些药物己被广泛地应用于临床【3 引，但是这类药物具有作用时间短，停药后血压易反 弹等缺点，而且人工合成药物吸收排泄速度快，会引起咳嗽，丧失味觉，肾脏损伤及血管 神经性水肿等副作用【3 9 1 。降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，它们共 同的突出优点是对高血压患者可以起到降压作用，对血压正常的人无降压作用【4 们。说明其 6 第一荤绪论 对正常状态下的肾脏、血管的作用很小，具有安全性高，无毒副作用的特点。除降压功能 外，往往同时具有免疫促进、减肥及易消化吸收等生理功能。所以从天然蛋白中提取的a c e 抑制肽( 或称降血压肽) 作为一种新的降压药物越来越受到人们的广泛关注，目前己从牛 奶蛋白【4 、人乳酪蛋白m 】、玉米蛋白【4 3 1 、胶原蛋白，4 5 1 、大豆蛋白【4 6 1 、鱼贝类蛋白【4 7 5 0 】 等食物蛋白的酶解产物或发酵制品中分离得到了各种不同的血管紧张素转换酶抑制剂 ( a c ei ) 。随着对其作用机制、生理效果及制备方法研究的进一步深入，来源于食物蛋白 质的降血压肽将显示出良好的应用前景。表1 - 2 为部分食物来源的a c e 抑制活性肽及氨基 酸一级结构。 表1 2 部分食物来源的a c e 抑制活性肽 t a b 1 - 2k i n d so f a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o mf o o d 食物蛋白 氨基酸一级结构 乳酪蛋白 a l a o v a l - p r o - t y r - p r o - g l u - a r g ， t h r - t h r - m e t - p r o - l e u - t r p ， 大豆蛋白 米糠蛋白 玉米蛋白 沙丁鱼 p h e p h e v a l - p r o - p h e p r o - g l u - v a l p h e - g l y - c y s l e u - p r o ，a s p g l y i l e - a l a - p r o - a s n - t y r , v a l - a l a p r o - a l a - g l y - t h r - t y r p h e ， g l u - g l u - c y s p r o - c y s - a l a - a s n - c y s - c y s - g l y - g l y p r o - p r o v a l h i s t y r - l y s s e r - p h e - i l e - l y s - g l y - t y r - p r o - v a l - m e t l e u l y s - v a l - g i 嗣a l l y s - g l n t y r 1 2 2a c e 对血压的调节作用 a c e 是一种含锌二肽羧基肽酶，相对分子质量为1 2 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 ，在人体组织及血浆 中广泛存在，主要存在于血管内皮细胞内，在肺毛细血管细胞含量最为丰富。血管紧张素 转化酶在人体血压调节过程中起重要的生理作用：一方面，将血管紧张素i ( a n gi ) 转换 为血管紧张素i i ( a n gi i ) ；另一方面，它能使降压物质舒缓激肽降解成片段，使之失 活，从而使血压升高。体内的肾素血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ，r a s ) 和激 肽释放酶激肽系统( k a l l i k r e i n k i n i ns y s t e m ，k k s ) 对血压的调节作用如图1 - 1 所示f 5 1 】： 肾素- 血管紧张素系统( r a s ) 是体内重要的血压调控系统，直接参与血管收缩、代谢 及交感神经的调节，是高血压主要的侯选原因之一。r a s 由血管紧张素原( a n g i o t e n s i n o g e n , a g t , a n g ) ，血管紧张素酶( 肾素、r e n i n ) 、a c e 及血管紧张素酶原( a t r ) 组成。肾素能 将血管紧张素原( a n g ) 水解释放出十肽的血管紧张素i ( a n gi ) 。a c e 是r a s 系统的关 键酶，a n gi 是a c e 的底物，a c e 能切下a n gi 羧基末端的二肽( h i s l e u ) ，使之变成血 管紧张素i i ( a n g i i ) 。在正常条件下，a c e 是a n g i i 生成的限速因素，a c e 的活性决定了 a n g i i 产率。a n g i i 是r a s 系统中最主要的生物活性成分，是强有力的血管平滑肌收缩物 质，按单位计算，升压作用比去甲肾上腺素( n o r e p i n e p h r i n e ) 强l 叫o 倍。它作用于血管 7 江南大学硕士学位论文 壁上的受体使周围小动脉和i j 毛细血管平滑肌直接收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体 肾脏对n a + 、k + 的重吸收，引起血量和钠潴留量增加，使血压升高。而其前体a n g 和a n gi 则无活性。k k s 系统中的激肽如舒缓激肽( b r a d y k i n i n ) 的主要作用是作用于血管内皮的缓 激肽受体促进一氧化氮和前列腺素等血管扩张因子的释放，促进血压下降。在k k s 系统中， a c e 能使激肽失活，使k k s 系统处于抑制状态，导致血管收缩血压升高。 血管 r a sk k s 图1 - 1 降血压肽的降压机理 f i g 1 - 1p r e s s u r er e d u c t i o nm e c h a n i s mo fa n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s r a s 和k k s 系统在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压 十分重要。r a s 产生具有升压作用的a n gi i ，k k s 产生具有降压作用的舒缓激肽【5 2 1 。r a s 与k k s 的平衡失调被认为是高血压发病的重要原因之一。由于a c e 在r a s 和k k s 系统 中对血压调节起重要作用，抑制a c e 活性对降低血压有积极的影响，因而寻找更有效的 a c e 抑制剂一直是高血压药物研究中的热点课题。 1 2 3a c e 抑制肽的作用机制 降血压肽是一类a c ei ，通过抑制a c e 活性而起到降血压的作用。1 9 6 5 年，f e r r e i r a 从巴西毒蛇的毒汁中分离出一种肽类的物质，能够增强舒缓激肽的作用，故将其称为缓激 肽增强因子。后来又发现这种肽类物质有抑制a c e 的作用，使a n gi 转变为a n g i i 的过程 发生障碍。1 9 7 1 年，o n d e r i 等人合成了b p f s 成分之一的壬肽抗压素，这是第一个用于临 床的a c ei 。研究发现，a c e 是一种金属肽酶，含有两个结合z n 2 + 的位点，即所谓“必须 结合位点”。此外，还含有一个或几个“附加结合点( o b l i g a t o r yb i n d i n gs i t e ) ”。z n 2 + 结合位 点是a c e 催化反应的活性基团所在部位。包括降血压肽在内的各种a c ei 的共同作用是与 a c e 活性部位的z n 2 + 结合，使之失活。a c ei 与此基团结合的强度及与附加结合点结合的 数目决定了a c ei 作用的强度和持续时间。降血压肽是对a c e 活性区域亲和力较强的竞争 性抑制剂，它们与a c e 的亲和力比a n gi 、舒缓激肽更强，而且也较不容易从a c e 结合 区释放，从而阻碍a c e 催化水解a n gi 成为a n g l i 以及催化水解舒缓激肽成为失活片段的 第一章绪论 两种生化反应过程，起到降血压的作用【5 3 】。 1 2 4a c e 抑制肽的构效关系 1 9 6 5 年f e r r e i r a 首次从南美洲蝮蛇( b o t h r o p sj a r a r a e a ) 的毒液中发现了a c ei ，它能 够抑制舒缓激肽酶从而增强血管舒激肽的活性，所以被称为缓激肽增强因子( b r a d y k i n i n p o t e n t i a t i n gf a c t o r s ，b p f s ) p4 。，这引起了世界各国研究者们极大的兴趣，而后日本学者从 亚洲蝮蛇的毒液分离出具有类似活性的a c ei 【5 5 】，我国学者从浙江蝮蛇、江西蝮蛇的毒液 中也分离出类似活性的a c ei1 5 6 1 。其中已发现的蛇毒a c ei 的氨基酸序列如表l - 3 所示： 通过对蛇毒a c ei 结构的分析发现，它们有一个共同的特点：n 未端为焦谷氨酸 ( p y r o g l u t a m i ea c i d ) ，c 未端为脯氨酸，其降血压的功能主要是通过与a c e 的竞争性抑制 实现的，但通过饲喂动物发现，它对正常动物血压没有任何影响。 表1 3 天然蛇毒a c e 抑制剂 t a b 1 - 3a c ei n h i b i t o r sf r o mn a t l l r a ls n a k ev e n o m 注