（食品科学专业论文）交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）CHS菌株产碱性蛋白酶的研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文 中文摘要 ! 篡曼鼍皇糖曼皇篡篡暑鼍群i 一一 i i ii l l l i 中文摘要 采集逡云港海域的贝类、海水、深海鱼类、海底沉积伤等撵最，筛选产城性虽自黪的菠株。 从分离到的2 1 7 株细随中，获得2 3 株碱性蛋白酶酶活高的菌株，对其中两株海洋细菌c h s 羊ns y 菌株进行生理生化乖 1 6 s r d n a 序列分析，韧步浆定为交替假单胞菌。以c h s 和s y 两株菌为出发 麓株，看秀究它们发酵产碱性蛋鑫酶静条评，并分离攥纯了e 隔菌株产生的碱性蛋白酶，初步研究 了萁酶学，嚏质。 c h s 和s y 菌株最适产酶发酵条件为：1 5 ，2 4 h ，种龄1 6 h ，2 5 接种量，摇床转速1 8 0 r m f n ： c h s 菌株起始p h 为9 0 ，s y 菌株为o h 8 0 。葡萄糖，蛋内胨砖两菌株发酵产酶较好的碳、氮源。 c h s 菌株发酵液经离心、硫酸铵盐析、透析、离子交换屠祈和分子筛层析后，酶的比活由 5 9 4 u m g 搂裹裂8 6 0 8 u m g ，提离了1 4 s 倍，翻牧攀为3 + 2 4 。在s d s - p a g e 上显示一条带，选电 泳纯，由s n s p a g e 初测分子量为5 6 9 k d a 。 对c h s 菌株碱性擞向酶的性质研究表明，酶最适作用温度为4 0 ，最适作用洲为1 0 。0 ，在 4 0 c 保温3 0 m i n 酶活下降约5 0 ，热稳定性较菱，在p h 8 。0 11 0 有较鲥的稳定性。蹦s f 能强烈 捧每# 酶漪滔性，褥e d t a 和t a a 对该酶的撺制俸蠲不太明驻。e a ? + 、c u ”对酶有一定激活作翊，a g + 对酶蠢抑制作用：酶对乙醇和鼹素鸯较强魄抗性，对睦漏育一定抗性，s d s 对其窍搀铡 乍躅。 关键词：海洋细菌，雯替骰单胞菌，碱性摄自龋 a b s t r a c t 2 1 7b a c t e r i u ms t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o ms e a w a t e r , f i s h e s ，s h e l l sa n ds e d i m e n ti nl i a n y u n g a n gs e a a r e a ，f r o mw h i c h2 3s t r a i n sw i t hh i g hp r o d u c t i o no fa l k a l i n ep r o t e a s ew e l n es e l e c t e d t h r o u g h p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i s t r ye x p e r i m e n t sa n d1 6 s r d n as e q u e n c ea n a l y s i s ，t h et w om a r i n eb a c t e r i a s t r a i n sc h sa n ds y , w e f u r t h e ri d e n t i f i e da sp s e u d o a l t e r o m o n a s t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h e a l k a l i n ep r o t e a s ep r o d u c t i o no fc h sa n ds yw e r es t u d i e d a n dt h ea l k a l i n ep r o t e a s ep r o d u c e db yc h s w a sp u r i f i e da n di t sp r o p e r t i e sw e r es t u d i e da sw e l l t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o ra l k a l i n ep r o t e a s es e c r e t i o no fc h sa n ds yw e r e ：1 5 。c ， 2 4 h o u r s ，2 5 i n o c u l a t i o na m o u n t ，1 8 0r m i no fs h a k i n gf l a s kc u l t u r e ；t h eo p t i m a li n i t i a lp hf o rc h s w a s9 0a n d8 0f o rs y t h eo p t i m u mc a r b o ns o u r c ew a sg l u c o s ea n dp e p t o n ea st h eo p t i m u mn i t r o g e n s o u r c e t h ea l k a l i n ep r o t e a s ef r o ms t r a i nc h sw a sp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r es u p e m a t a n tb yc e n t r i f u g a t i o n ， h o m o g e n e i t y b ya m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，d i a l y s i s ，i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h es p e c i f i ca c t i v i t yo ft h ee n z y m ew a sr a i s e df r o m5 9 4 u m g 1t o 8 6 0 8 u m g - 1 ，w h i c hw a s1 4 5t i m e st h a to ft h ec u l t u r es u p e r n a t a n tw i t hay i e l do f3 + 2 4 t h ep u r i f i e d e n z y m es h o w e do n ep r o t e i nb a n do ns d s p a g ea n di t sm o l e c u l a rw e i g h tw a se s t i m a t e dt ob ea b o u t 5 6 qk d a 。 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ef o ri t sc a s e i nh y d r o l y s i sw a s4 0 ca n d1 0 0a si t so p t i m u mp h i tk e e p s s t a b l eb e t w e e np h8 t ) - 1 1 0 。w h e ni n c u b a t e da t 娟f o r3 0 m i n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yd e c r e a s e da b o u t 5 0 ，w h i c hs h o w e di t sl o wt h e r m o s t a b i l i t y t h ea c t i v i t yo ft h ep r o t e a s ew e r ei n h i b i t e ds t r o n g l yb y p m s f ，b u tw a sn o ti n h i b i t e db ye d t a a n di a a i o n sc a 2 a n dc u 2 + w e r ei t sa c t i v a t o r f o rt h ea c t i v i t y o ft h ee n z y m e ，w h i l et h ee n z y m ew a si n h i b i t e di n t e n s e l yb ya g + t h ee n z y m ew a sf a i r l ys t a b l e 证t h e p r e s e n c eo fe t h a n o la n du r e a ，a n dr e s i s t a n tt ot w e e n 一2 0 ，e i t h e r f u r t h e r m o r es d si n h i b i t e di t sa c t i v i t y k e yw o r d s ：m a r i n eb a c t e r i a ，p s e u d o a l t e r o m o n a s ，a l k a l i n ep r o t e a s e i l 独创性声明 ￥7 7 4 4 4 2 本久声羁掰呈交靛谂文建我个入在簿簿攒簿下遴行懿矫究工豫及取褥熊磷究成 巢。尽戏所知，除了文中特别加以标注和数谢的地方外，论文中不织食其他人已经发 袭藏撰写过韵研究成果，也不包吉为获得中国农业大攀葳其它教育机构的学位或诞书 翁镬璃过数材瓣。与我一藏互作豹同志澎零磷炎所擞豹经俺嚣献均融在论文中终了嚷 确熬说臻并表示了谢意。 研究生签名： 曲暂 时间：舯5年3 月，7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学校有权保匿 送突论文静复印件和磁盘，允许论文被套阐和倍窝，可疆采溺影印、缩印戚扫籀等复 制手段保存、汇编学位论文。弱意中萄农娩大攀哥戳翅不同方式在不藏媒体上发袭、 健攒学经论文鹣全部渡部分内容。 揍 密黪挚陵谂史在熬密磊癜遵守娅络浚 骚究生签襄 筒，鹊 黜裘一妓 嚣孪闰：弘盼岁年3 胃f 7 离 i 弱乃 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 海洋与海洋生物技术 第一章文献综述 海洋占遗球表面的7 1 ，是生命最初的发源地。海洋鼹全球生命支持系统的一个重要组成 帮分，也楚一静有韵于实臻社会经济可持续发震的宝贵财富。海洋其有丰富的生物多样性，是最 丰富蛇生物遗传基因库，这是生物技术取之不尽的派泉。海洋生甥资潦丰富，秘类繁多，冀生糍 多样性远远超过陆地生物的多样性，据统计有1 0 0 万一2 亿种+ 海洋资源是人炎生存和发展的宝贵 财富。入类正面临着食品短缺、陆地资源匮乏、环境污染加剧，疑难病的治疗等问题开发海洋 餐源是解凌人类器藕褥久嵇澎涨、资源氟缺、环境怒纯的重簧途径之一，己成为箨国经济发腱的 羹耍战略之。 6 0 年代开始出现了现代的“海洋开发热”。从海洋开茇的聂大方面海洋微生物资源开发、 海洋矿产资源开发、海洋化学资源开发、海洋动力资源开发和海洋空间瓷源开发来看，海洋微生 锈楚海洋开发最活跃的区域，海洋徽生物资源的价值是难以估量的( 郝建华，2 0 0 3 ) 。 海洋生物羔程技术兴起子本世纪鞠年代，楚海洋耋物举一门薪菇的研究领域( 张士壤等， 1 9 9 7 ) 。海洋生物技术( m a r i n eb i o t e c h n o l o g y ) 是以海潍生套车车学必基础，裂鼹海洋生物髂系拳l 工程学原理改良海洋生物遗传特性，开发生物制品眷【1 保护海洋环境的综合性科学技术。它主要包 括海洋生物的基因丁二程、细胞工程、蛋白质r 程、发酵二i ：程、生化工程和单克隆抗体技术。随着 海洋生镑接术静发蓑，寻找海洋生秘密潦，并将海洋微生物的育用产物加以充分利用，是科研二r ： 谗者嚣要抓紧鳃决的| 丑题( 张士璀，2 0 0 1 ) 。 1 。2 海洋微篷物资源 1 。2 海；攀微生狻疑英特惑 海港擞生物的定义至今滏糟争议，幂进一般认为，分离爨海洋，正常嚣海求身生妖，弗霹在 鬻营养、低温条件下盎长的徽愈物可视为严格的海洋微生物。有些分离自海滞，箕缘长不一定需 簧海拳，但霹产不弱予陵遗擞雯耪嚣投瓣纺或援鸯莱数特臻熬生莲性矮掘盐霹董受性、液纯璩鼹等， 也可视为海洋擞生物( 郝建华，2 0 0 3 ) 。搬票蠛人类对陵缝资源戆羚发蠢经；窭攫静话，那么海洋 对于入类。仍然番撮多方嚣是季睾秘的；海洋徽嫩饕楚海洋生黪的重要戒受，太们r 对海洋擞生物静 了解远远落后予陆地徽难物。海洋生物资源率寓、种粪繁多，海洋微生物种类几乎靓括所有的微 激糖粪裂；蓊海洋中霞寝l 左蠢戆墩嫩境裟手 裹鉴定。固就，海洋缴生鐾蒸奉主_ 琵一块寒嚣曩 驰处女她。 疰海洋徽生物孛，簇蕈臌辩鞠嚣蛰为主婺靛鲤蘸攥，黄杼蘸熬数嚣巍眈较大，艇丝簿辑、球 拟酵母、隐球酵懈等悬主要的酵母菌，还有霉敲和放线菌端。臌然不同的海域主要的鹾类不闷， 越龆琶籀了j k 乎鞭有匏微生物糖类。嚣到嚣嚣壤蠢1 5 0 0 雾释海洋激燕耪被避孝亍7 深入麓磷究。 串固农照丈攀域士学位论文鼙一牵文献综述 舞曼曼喜嘲- 拦, i , l l l ,i, i i l l ii l l ! 牌鼍曼甍 由f 漱洋环境的特殊饿，物种间密切的生态关系e | ；i 此海洋微生物中在物种、基因组成、 代谢系统、獍体骑簿等方嚣蒸毒多样性，锫慧特豫麴特熊。蓠先海洋羰羹物其有多秘多撵麴特豫 性麓，鲡辩簸、| | 6 拿碱、耐寒、耐高溢、辩低滋、耐离篷；船毙合成、运氮、浮游、环境治理帮清 污等能力等。海洋细蓊多为鞲兰氏掰往越，稚运动。海洋徽生秘普遍其眷慕些特殊作用耥生物活 性物质，且就活性物质不间予来自陆地微生物的，活性一般也超过陆地微嫩物的。最近避研究发 瑰，姨簿线遮斡f 蓑等海洋生壤中势蔫盘靛大蕊涯性携矮蜜鼯上是由海绵莛生瓣擞生锈黪产生照。 海洋微生物一般具有较高静辩艟缝，培养辩簧有一定鹩鏊浓度；培棼蘧魔较低，一般在2 0 鞍f 。 分离秘鉴定海洋徽生物的方漶与一般陆生徽生物的不同。阻前一直认为海洋微生物难于培养和鉴 剐，因而对其产物的研究媳谢作为。近来，海洋微生物石嚣熬技术取得了羹大的发展。主骐商甄方 嚣：萁一起熔莽鼓寒，铡魏荣耀穗释臻舞法使分寒率大大提裹，美黧f e n l c a l 教授获瑗3 0 0 m 深戆 细蓝在1 0 1 3 k p a ( 一个大气媛) 一f 彀麓熊妖：其二跫采嬲耨靛分子生镪攀鉴定技术，铡粥基露 1 6 s r r n a 方法解决了许多分裳学的难题( 淤义国，2 0 0 2 ) 。利用这些新技术，科学家们很快发现了 大量新的荣种e 这一技术也健海洋微生物的研究收蘸非浅。荧匡科学家孵搬逆，谯海洋罐平方荚 足裁缝发现十雾耱耨的徽生豹；舞毽诗，瓣瓣番9 5 9 6 鞑土靛海洋徽生戆溺泰嫒谈谖( 耩隶藏莓， 2 0 0 3 ) 。 1 2 。2 海滞微生物淤源的刹甩 二一i - 擞鳃丸卡年代辍寒歙海洋徽鸯镌爱瑷了备鞠箍瓣麓豫学乏或壁秘攀上寄塞义懿次缎袭 瀚产物，有德研作为黢麓药物的先导他台物戚作为生命科学醛础研究的工媳。如头孢菌潦c t 它 惩由海洋囊浆势离霉斡。述蠢豫l e 。p t o s i n s 黎e o r i o l i n s 等擒太爨缨难p 3 辨瓣$ - 1 8 0 。懿夔蘑掘聪 辐利囊文学海洋疆究稼瓣f e n i c a l 等，辍船熊滗痒鼹1 0 0 0m 海深分囊到一拣海洋莲，献审获褥一 蘩筑静蓊媳走繇癌蘸懿继濂霉索秘撬溪繁，爨密强撬蕊溪链鞠撬b 1 6 - f i o 嚣毪素瘸潘灌，鼙羹要 的是这一蒹捌的夫环内酯述能抑制凡种包括八的免疫缺捅瘸海( h i v ) 在内的病毒c 林永成等， 2 0 0 3 ) 。 薄嚣擞燕黪簸产投黪秘瓣，毒热稳定黢懿鞭砉叠熬辩，辩罄藏海洋擞奎秘枣发褒释精熬壤聚 耱簿黧魏，矮静潜在懿巍雾案主藏纯零溶穗羲聚瓣懿律麓。毪凑骶瀑魏类魏绫簿洚鳃蓥 1 l t e r o m o n a ss p s t r a i no m 7 分离的适冷儿丁威酶( c o l d a d a p t e dc h i t i n a s e ) ( h i d e y u k io r i k o s h ie t 采，2 0 0 3 ) ，羧海洋酵母菰( d e b a r y t a m y c e s h a n s e n i i ) 帮8 m a r i r t e c y a n o b a c t e r i u m s y n # c h o c o c c z * s 警 蛾7 8 0 3 静恣蠲趣氧琵赣壤像瓣u p e m x i d e d i s m u t a s e e n z y m e ) ( h e m a n d e z - s a a v e d r a n y e ta l ，1 9 9 8 ) c h a d dh ee la t ，1 9 9 6 ) ；h o y o u x 等2 4 ) 0 1 攀簌南疆分离蘩拣p s e u d o a l t e r o m o n a sh a l o p t a n k t i s ，获褥 低温b 一半乳糖酱酶( h o y o u xae ta l 。2 0 0 1 ) ；适冷海洋弧菌a b e 一1 ( v t b r i os p s t r a i na b e ”1 ) 产戆a t p 藩( a t p a s e ) ( h a t a s h i m a a e t a l ，1 9 9 6 ) ；还截拳聚糖酪( x y l o s 嬉) + 翳雅素薅，a l p h a - n a o s h y d r o t a s # 秘t h i o s u l f a t e * o x i d i z i n ge n z y m e ，t e t r a t h i o n a t er e d u c t a s e ，a n dt h i o s u t 纽t er e d u c t a s e 、溶蒲酶、 骚赫酶、缝瓣鬣酝簿、逮冷蒸撼黢酶等等( w h i l e d g m 锻舔，1 9 8 3 ；s u g a n o ￥c ta l ，1 9 9 4 ：h o u s t o n e ta l ，2 0 0 4 ) ，脊魑在工业一匕已生产，到造了照大的经济效擞 帮鬻海洋擞熊羲嚣瓣晨然帮会或簿鹰纛莛海洋彀靛翡瓣爨瓣一枣麓葵方瓤。魏醴零献簿嶷豢 泌分毒毽了鞯勰濑类静潮落；敷色魏鬣海洋缨瓣中劳离接凝型 穗自乳诧裁辩鳓藩。蒯崩海洋擞生 ： 中国农业大攀硕士学位论文 第一章文献综述 爱曼曼崮舅皇篁冀寰量甍鼍詈邕曼群曼曼崮皇皇舞舞曼曼嘲鼍詈鲁拦皇量鼍鼎詈舅蔓鲁曼鼍螂曼曼嬲, , t t l l l ti i 簟皇曼酵 物处理海洋环境污染也取得了很大的进腥而这些应用多是由一些极端微生物所具有的适艨某些 极端环境的特性所决定的。 扶一鎏耐盐帮嗜盐缅蓠中麓现的缩麓视紫红旗和生物塑辩也将会裁电子计算视制造，生物传 感器及乡 秘体内绘癸豹安全材料孛奄翳应明( 转永戏等，2 0 0 3 ) 。 1 2 3 交替假单胞菌 交替镁单貔蓥援楚1 9 9 5 年由g a u t h i e r 等人提整建立酌，是鹚a t t e r o m o n a s 辫分幽来的一个 新属。交替假单胞菌属目翦包括1 3 个弛，具体毂发育关系见圈t - 1 。交替瑕单腿薤楚一类孳兰氏 阴性、无芽孢、生鞭毛、需氧的海洋细菌，g + c 含量在3 7 5 0 m o i ，生睦需要海水，生妖温度在2 0 左右，氧化酶阳性利俐糖类能力差，主要以葡萄糖作为碳源( g a u t h i e rge ta 1 1 9 9 5 ) 。 辫1 - i 麝营辍鼙艟藏系娥发育装蒜 f i g l lp h y i o g e n e t i er e l # i o n s h ；p s 嘴p s e u d o a ! t e t r a ss 娜i e s h o l m s t r o m 簿2 0 0 2 年磅究剽建p s e u d o a l t e r o m o n a s 耀r 海囊抗污终( h o l m s t f o mc a r o t aeta l 3 中国农业大学颟士学位论文 第一章盘献综述 2 0 0 2 ) 。x i u - l a nc h e n 等人从1 ，8 5 5 m 深海沉积物中分离得嗜冷菌p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 ， 产m c p o l 翱m c p 一0 2 霹种缀自酶；m c p - 0 1 是一丝氨酸蛋彝酶，分子鬟6 0 。7 k d a 。最适作用温度为 3 0 3 5 ，l ( i l i 和分爨为0 1 8 帮3 9 i k j m o l ，熟稳定髋低，4 0 傈澈l o m i n 活力f 酶7 3 ，是 典型的低潞强自酶：m c p 一0 2 属中温金属蛋白酶，分子量3 6 k d a 摄适作用温度为5 0 5 5 。s m 9 9 1 3 以产m p c 0 l 为主。后来应用性试验显示，喷涂s m 9 9 1 3 低温蛋白酶m c p 一0 1 的冷冻肉制品和海产 品在0 c 黠存6 天后，风昧撬于中温蛋岛瓣处理斡样品( x i u l a nc h e ne ta l ，2 0 0 3 ；h a i - l u nh e e ta t ，2 0 0 4 ) 。s u n o g l e e 等飙p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s t r a i n a 2 8 中分离铡有鳃藻活力静胞外蛋自 酶( s u n * o gl e ee ta l2 0 0 0 ) 。国内对交替假单胞菌的研究较少熊鹏钧等对交替假单胞菌d y 菌株 产内切葡聚糖酶的性质进行了研究及基因克隆。褚艳分离筛选山产琼胶酶的交替假单胞蘸c y 4 菌 株_ 并进行了发酵条俘的健豫+ 磐润簸等胰l k 援分离到一橡其撬黪癌活性鹣交替镶萃跪藏( 营懑鬏 等，2 0 0 2 ) 。 1 3 碱性爱白酶的研究 碱瞧援囱酶( a l k a l i n ep r o t e a s e ) 最翠发现于猪袋脏中，是一类最邋p h 在9 l l 范阑肉的蛋 白酶，在p f 碱性范同内水解蛋白质肽键，比中性蛋白酶有更大的水解熊力并具有脂酶活性，因 而成为商晶酶制剂中应_ 【 j 最广、产量最大，也是研究比拔深入的一类蛋囱酶。碱性蛋囱酶广泛存 在于细莲、教线蓥年 l 真蘸申( h u i z e ta l + 2 0 0 4 ：o k u d a me t a l ，2 0 0 4 ；a d i n a r a y a n a k e t a l ，2 0 0 3 ) ， 其串疆芽豫杼菠藏性蛋自鹣豹研究最为广泛和深天，微生物碱性蛋自酶在酶制裁市场占奇穰大毙 例t 在洗涤剂，去垢剂行业占三分之二的份额( g u p t are ta l ，2 0 0 2 ) 。1 9 4 5 年瑞士dr _ j a g g 等人 在地衣芽孢杆菌中发现了这种酶。碱性蛋内酶无论在揭示生命奥秘的坐化、生理、医学等领域， 还是在求褥入类生存秘发鹱躯保健、农簸、食瑟和拜缝等方瑟都奏+ 分震耍戆意义。馘瞧蛋囊酶 燕商品蛋窭l 酶中应耀最广、产量最大的一炎蛋白酶，这种酶可用于铷革、丝绸、医药、食品和生 物化学试剂等领域，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤剂( 薛林贵，1 9 9 7 ) 。 。3 城性蛋白酶斡类溅： k e a y ( 1 9 7 2 ) 将不同细菌产纳碱性蛋白酶分为三种类型： a 型( c a r l s b e r 型) 轱革楞菠碱燃壁彝酶：由短小势豫抟莲、她表芽豫鞣嫠生产的瓣，其性 壤与c a f l s b e r g 碱性蛋囱酶麴瞧震一致。邀嶷蘩椽是产生藏犍燕自酶黪援爨薅。 b 型( n o v o 墅楼孳秘麓蛋自酶：盎轱孳辑莛淀辨糖纯变秘及皴攀括蘑n b r r 3 4 1 1 掰产生， b p n 或n o v o 性枯草碱性萤囱酶相一致，这擞德除产生碱性蛋自酶还产生中性蛋白酶。 c 型( 辫洋低温碱性蛋巍酶) ：由海港装辑产生，妇夔强a t c c 8 6 7 、黄海黄耪蓥等。盎予海洋 艇物孱娥黪环壤，使这释缀蕊产生弱域馁擞爨蕊也其骞举藏蜘 生矮。 j a c o b s 艇y r s 等1 9 8 5 ) 玖建表芽懋毒荦蘩( b a c i t b & st i c h e n i f o r m i s ) 书对c a d s b e r g 溅瞧鬣鑫酶 进行了兜陵、测序和表达研究( j a c o b s m y r se ta l ，1 9 8 5 ) 。j a m e s 等( 1 9 8 3 ) 从枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s m ) 中竞隆到了s u b t i l i s i n 碱往鬣爨溱基嚣。 a 搿秘8 瑶甄嚣谯髓枣1 镶梅穰摇遐，簸惩反瘟澄嶷5 0 - 5 5 ，瓣簇巾瀑拣蛋爨酶。毽一簸获 中国农业大学硕土学位论文 第鬻文献综述 为，c a r l s b e r 型碱性蛋囱酶比n o v o 型的好，它在洗涤剂溶液中有较大的稳定性，且其酶活力较高。 毽诧萤弱丧失生成芽穗的能力，掰罐在傈存过程中簧不断遴行平教分离帮选育ta b c 三鼙碱性 蛋白酶谯免疫分析上没有交叉反应。冤法用抗原抗体分析来区别同一种a 型b 型碱性蛋白酶。 i 3 2 碱性蛋白酶的用途 蛋白酶的用途非常广泛主要在清沽剂和食品t ：业，在皮革处理和生物补救方面的应用越来 越广泛，在铡魏等1 鼗瞧有重要豹蠲途。 1 3 2 i 在生物技术领域，该辩用在棱酸纯化过程中娥白质( 包括核酸酶类) 的去除，因为在核 酸提取中，蠲鬻自酶永解法去滁蛋自蔟携方法条件温帮，大大优于肖祝溶黼链理方法，可避免剪 切力对天然d n a 完整性的破坏( 刘成墨等，2 0 0 2 ) 。 1 。3 2 2 蟊冀； 化工 用在洗涤业和化妆品的生产和开发是蛋向酶主要应用。摄白酶怒洗涤剂常用的添加荆，洗衣 粉中蚩秘酶的翊鼙约占整个市场的2 5 。1 9 1 3 年出现了第一个加酶制晶“b u m u s ”，它是由n 砒c 岛 和胰腺的粗提物组成。1 9 5 6 年出现了第一个含有细菌酶的清沽剂b 1 0 - 4 0 。1 9 6 0 年n o v o 公司开发 了a l c a l a s e ，是由缝衣芽孢杆菌产生，龋名为b i o t e x 。后来g i s t - b r o c a d e s 生产了 m a x a t a s e 的清洁剂。用于洗涤荆的蛋白酶一般要求在较低温度一f 具有高活性，抗有机溶刺， 与清洁荆中的赘台剂、氧纯荆相容：耐高p h 环境。在化妆晶方面，主要作用是能够促进老化角 质层的除去、增强洗净效果、溶解角梭防治粉刺的形成等( 钱卫平等，1 9 9 6 ) 。 1 3 ，2 ，3 皮革_ 工业 皮革的处理包括浸泡、脱泡、洗涤、制革等几个过程。我们知邀皮毛的主要成分是蛋爨类物 质，传统的皮革处理方法涉及宵毒的化学物质，会引起污染和污水处理等问题。蛋白酶作为化学 处理的替代品鼹示了其巨大的优越性，不仅挞焘了皮革的质擞还减少了环境污染，绦短了生产鳆 周期，也降低了能源的消耗。n o v o 公司生产了三种畿自酶a q u a d e r m 、n u e 、p y r a s e 分别用于 皮革砖4 佧麴浸泡、脱毛期洗涤二 彦。 i 3 2 4 食品工业 蛋巍酶是食器工业痘用最，。泛的瓣，它魃够提麓食最熬菇震、稳定性、霹溶瞧等。蛋舞薅应 用于食晶工业宵以下的优点：来源于微生物，易实现= e 业化生产；一般不含有有毒物质；需酶量 少，袈搏涅秘；反应完戏后酶蜜荔灭淫。蛋爨酶的瘟耀麸吉找靛已嚣戆，在奶酪割据、蠢惫辔l 终、 水解大照和肉类软化等方面常常使用。奶制品工业中摄白酶的应用主要是奶酪的制作，在奶酪制 作中酶翁主要功能是承瓣特殊戆驻键产生餐酶蛋鑫耱大麓煞羧。凝薅由于j l 孝酪蛋鑫瓣裹寝祷吴 性在奶酪制作中有极好的效果。由微生物产生遗传安垒的蛋白酶将可以替代奶制品中的凝乳酶。 1 9 8 8 年第一个麓缀d n a 产生懿凝襞酶s l 入到奶醛铡俸串。蠢能车季( 6 e n e n c o r ) 国辩公司鬟离了 a s p e r g i l l u sn i g e rv a l , ；a w a m o r i 产生凝乳酶的产凝而达到商业应用的水平。现在他们的重组凝乳酶 产箍正等待奶酪互监弱傻角许鳟证( 辞建牮，2 0 0 3 ) 。 在面包行业，由于面粉中岔有不溶解的谷慑白影响了做出的面包质量，；噩过添加蛋自酶可 戳修饰夺麦豁爨蠢，搀糍瑟龟懿震鼙。另羚蛋良酶还藏少瑟滋豹混台辩闫、增耱丽龟的产蘩、增 加面团的筋度和延展性。 中国农业大掌硕士学位论文 第一章嫩献练述 另外在擞制品工业中蕊自酶被用于水解大豆蛋白提趣其功能，也臆用_ ；l 二蛋白质的较饮料茅“ 食疗食锈中，粪莲采源黪躐馁帮中瞧蛋自醚农夫豆酱躲剃俸审起到重要憝撵建。 1 3 ，2 5 露舞工韭 援白黪攘暇药上躲应用主要楚基手窀能对病理条 牛下静蛋癌静分孵麓力；糖鹱汾鬻氏蓊 ( s e r r a t i a m a r c e s c e n s ) 产生的一种众属援巍麟s m p 被用作消炎药：c o n i d i o b o l u s c o r o n a l l s 产生的 蠛性摄皂酶褂= | 美取鼹动爨缨骢壤姜审所嫒瑙豹蔟岛素。 l ，3 2 61 9 9 4 年豹舀率专利撤遂了一种新的海洋耐盐蛋囱酶。最适p h 为9 5 1 0 0 ，潞魔5 0 5 5 ，宓萎5 魄e l 呈现最大潜性，分予壁为4 ，o o o d a ，豸辩解死类豹是篓，赢用子海洋污染处理。 。3 3 嚣悫癸藏蠖蛋鑫熬磷突懿逛嚣 溅睦赞巍酶最遗佟耀滞一般为9 0 - 1 0 ，0 ，主要应孀予加酶洗涤箭：豫，在食晶、翻裁、丝 绸等工业也宙广泛 l 臆途。嬲坶5 0 年代殍贻魄嘉产碱矬擞囱酶萤椿，帮弋末上海洗涤彝珏r 选 窍窭撼袁努稳抟藩2 7 0 9 ，7 0 霉鼗孛溪辩擎浚耩选壤臻炎蕊建育漱短枣蓐稳栝鏊2 8 9 翻2 0 9 。我 鞫舀前稻予碱饿蛋白酶的垒产菌和研究对象主要怒枯草棼穗杆菌、地农芽搠杆菌及矮小芽孢杆 麓，始2 7 0 9 港农芽孢杼掰辩| 1 2 1 3 缝衣劳张杆菌，嗜碱性短小芽孢秆谢( a l k a t i p h i l i cb a c i l l u s p u m i t l u s ) b 4 5 等e 我国皇1 9 7 8 年开始搀广碰掰，髫藤糖酶洗涤赛约占惑洗涤裁藩1 0 - 1 5 氅，1 9 8 9 苹生产洗涤粼矮蛋鑫瓣强一2 0 万遘，疆翦奎产瘫矮嚣多。邂华来我蓬秘孥搀者越碱缝辍鑫藩生 产进静了不懈韵探讨。邱秀激等人1 9 8 0 年对：业鞠短小棼孢杆菌2 0 9 产的碱性蛋白酶斑 行了部 分缝亿，弗对酶豹性旗和应糟谶行了研究。1 9 8 8 年又飙土样中筛选到一株媾碱性短小芽孢杆菌 r l1 5 t 经选育袋摄一椽高产、拣产碱性蛋黩酶变异株t ? , 4 5 ，经发酵条箨繇究酶溪力遮1 8 0 0 u r a i 这割垒国最麓承平。辕子躐等将撩穗淫蛋螽簿生产蘩2 7 0 9 遴簿诱变毒转，获褥变雾椿c 1 2 1 3 ，簿 产璧撬商了4 0 。郑铁警镰1 9 9 3 ) 避抒了摄燕c 1 2 1 3 蘩辘链鬣鑫薅嚣力斡硪寇，酶活办摄藤了 1 7 麟。薛秫赞，溺清平等( 1 9 9 7 ) 从2 8 份土样中筛选刹一楝嗜碱性蛾- 锭芽撒菌株( a l k a l i p h i l i c b a c i l l u sl i c h e n i f i m n i s ) 5 3 - a 6 ，辩羹嚣囊矮捧潞行菱台诱燮楚溪，软书选帮出了瓣煮瀑，辩虢酶 城链蛋白酶赛产籀撩，班龋液鹅予王鼗蛰产。绿上搿遴，蔑蓬碱缝爨爨辩驹磷褒爱麓摄撬，慧簿 趋势是对蓠漩碱毪稳定镶搿静爱螽酶裁常激碱佼蛋蠢瓣静耩褒，臻活力求警不鞭提燕a 麓饕蕊缝 d n a 技术的发腰，强自酶的餐臼质工程研巍也群展并取得了一嫩的成暴。对s u b t i t i s i n 斑向媛遗获 褥了藏羲健，瓣热，辩碱、巍磁涟戆突囊律裁云穗等，t 9 9 1 ) ；邈蠢效力予黉鑫酶蒸瓣翁簿选， 亮隆耧表达鸯藩黪蘸究漠义藩等，2 0 0 0 ；陈露撵，2 0 0 2 ；酃建华，2 0 0 3 ) 。薰然虢灏磷瓮帮生 产韵碱性燕囟瓣羽嚣力承乎不辑挺嵩，遐碱德蘩角懿静辩学瞧鹱识不兢潢燕辘涤要求* 主簧移在 常温和低温4 f 鹂活不高，瞅碱性和抗氯化憷艇替问题。犬媲模王业用碱性激黯酶主要依赖避鼹。 譬蓬舞耨魄，我嚣3 庭虢谯爨爨酶戆研究上黧枣一定骢黧鼹：一奏巍在孛瀑离瀑酶鸵酶滔辩醚 碱性、羲觌讫键蠢嚣戆羲怒；努一秀葱，斌我弱藏攘蛩囊酶抟缝鬻致磺究蕊竣胃玟番墩，我蠲主 蕊研究的怒黼温、中游碱性辍囟躯，这辩予碱蛙骚鱼懿主甏斑臻静洗涤数滚滚，藏髂琥穗建静 岗隈性。因为使用赢滏或巾漱碱性蛋白瓣时，螫迭到最佳的洗涤效果，洗涤鼹水要礁妒6 0 。 藤囊来承灏壤一麓舔程竣f ，洗涤辩必矮袋篪勰热静拳，遂在瓣常数雏潘串缀不方馁，瓣低 漩虢毽燕糖瓣整鞋透豢整一般程4 0 豁f ，在0 仍鸯畿催纯效攀秘一粪酶，弼孬键淡涤勰、 6 中国农韭大举颈士学位论文 第一章文献综述 饲料、皮革、食品加工等j l = 业有着中高温酶无法取代的优越性，也越来越受到人们的獯视。自七 十年代以来，世界上许多蜜验室在扶事低漩蛋白酶的硪炎，己跌海本、噫冷鱼类和典类簿榉箍中 得到产 氐瀑爱自酶豹蔷撩。在鑫本、欧潮与荚国，低溢摄爨酶已广泛溺于洗涤瑁晶的生产，国内 这方面的成用还很少。目前，国内市场洗涤剂用低温碱性缀白酶主要包括：p r o p e r a s ec t ( g e n e n c o r 公司，美国) 、s a y i n a s e4 o t ( n o v o 公司，丹麦) 等进口鼎牌。因此我国应充分利用有辅资源， 特别是海滞瓷漂，加强低瀑碱性蛋自酶的研究，缩小与国龄靛差距s 1 4 微嫩物低温蛋囱酶 i 。4 。 象滚蛋白酶豹生壤生往褥薤 主要脊四点：( 1 ) 酶的缴产温度低。低温蛋白酶由低濑菌产生。根搬m a r g s i nr 等( 1 9 9 1 ) 的 定义。通常把最适催化温度在3 0 。c 左右。般在4 0 c 以下，在o c 左右仍有一定催化效帮的酶称 为 鑫瀑酶。低瀑擞生物是豢麓在0 或接逡0 裁够生长。最裹生& 潺度舞2 0 或受抵鹣兹生物。 由此定义可以看出，低温蓊的最适生长溢魔一般都在2 0 4 c 以下。目前己研究的产低温筮臼酶的菌 株的最适生投温度都在2 0 以下，箕产蛋臼酶的最适温艘因菌而异。有的低丁菌的最适生长温度， 有的相同，裔的高于茁的最遥生长温度，倔都不超过2 0 。c 。( 2 ) 低温蛋白酶的最适酶作用温度低。 嚣靛扶 毳澈蘧中势寒弱熊缀囊酶戆最适酶渗潼度最羝豹麓2 0 ，毽大帮势黎为3 0 c 副4 0 。 般比中温蛋内酶的最适酶褥温度要低1 0 到2 0 c ，甚至3 0 ( 2 。( 3 ) 低温蛋白酶冉勺热稳定性差。 一般如果没有底物或c a 2 + 保护，在4 0 下保温l h ，酶活就丧失7 5 。目前发现几乎所有的低温蛋 自酶都对热敏感。( 4 ) 低漱蛋白酶的滋化能低。低温缀自酶的活化能一般要比中撼摄自酶低 挎一2 0 k j r a o l ( 陈秀兰等，2 0 0 1 ) 。 1 4 2 低温豫白酶的结构特征 羝瀑+ f 袋皂酶戆蘩构萼蛩挺与中蹇溢鼙缓下捂疆：，势予结梅毒疆显缮变纯，v o r o n o v1 9 鞋年羽 极谱法研究了在低温下酵母茁酒精脱氢酶嗣枯草芽孢秆菌畿白酶的结构，表明低温导致摄白分子 结构出现明驻的变化( v o r o n o vg t ，1 9 6 4 ) 。低温环境下，水的粘度明照增大，热运动盛藩降低。 在这样的环蟪下，由于热远幼的降低，酶与底物的结合以及酶分于构象的敬变都比中裹潍下爨难， 温度会显著彩豌酶与癫耪秘缝合。酶分子受在这样豹拜壤下有较蔫貔蠖织速率，盛矮搜分子结拇 变的更加黍顺以增加构象改变的速度。与中温酶相比，低温酶的共同特征是：盐桥的数缀减少， 疏水核内芳蒋环的相互作f l 减弱，脯氨酸( p r o ) 与精氨酸( a r g ) 残基数量减少，酶的疏水性减弱， 使酶与溶剂的檑互作用增强。这些结构豹改变都有利于酶分子柔顺性的堪烟。g i u l i og i a n e s e 等对 2 1 种不弱f l 巷低溢酶浆结秘遽行毙较分辑镶滋：在一螵疆土赣氧酸( l ￥s ) 鞠褥氨酸疆l a 替t 特氨酸 ( a r g ) 和豁氟酸( g l u ) ：酶在从热到冷的过程中，r 螺旋上缬氨酸( v a l ) 被丙氨酸( a l a ) 替 代。适冷酶外向结构的总体趟势是丙氦酸( a l a ) 和天门冬酰氨( a s h ) 明显增加，精氨酸( a r g ) 减少：在伊断叠结构缴氪酸( v a l ) 几乎耗冬( g i u l i og i a n e s e 班a l ，2 0 0 1 ) 。孙谧等j l 重黄海黄抒蓥 y s - 9 4 t 2 1 3 0 产静海洋 羲滠碱往蛋匀簿鬣麓酸痔到势辑箍黎，该酶由2 5 6 个氢基酸缀或氨基酸 7 中国农蝗太学疆士学位论文 第一牵文献综述 含量以亮氨酸( l e u ) 最高，酪氦酸( g r y ) 和异亮氯酸( i l e ) 最低。美国海洋碱性蛋白酶专利 产品a t c c 3 9 8 6 7 强天f 1 冬酝氯( a s n ) 禽量最离，丙氮酸( a l a ) 其次，谷氨酸( g l u 害量最低( 孙 谧等，2 0 0 1 ) 。l a u r e n tz e c c h i n o n 等研究认为，低温酶是通过部分或全部增加蛋白质结构的柔顺性 采实现降低活亿麓和提高反斑的效率，毽可塑性增加也可熊正是适冷酶热稳定性低的原因所在。 而适冷酶的这贱独特的特性对研究其稳定性、柔顺性和活性之间的关系，发掘这类酶在生物l 二程 各领域的更多作瑙具有重要的意义( l a u r e n tz e c c h i n o ne ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 4 3 低温豢自酶蓠种选裔和研究方法 哇l 予诋瀑强囊酶在海多 ：m 蝗 亍数枣蠢重要的痰鲻徐篷，嚣嚣靖它靛疆褒 毪越采越受劐霪褪。 随着生物技术的发展。低温蛋白酶的研究方法也越米越多。概括起来主要有以下几种： ( 1 ) 低瀣选育 低温选育炽最早采用的方法，也是壤常_ e l j 的方法。将从低温环境中采集的样品在低温条件_ f 避幸 壤舞、分撵、簿逡，得裂低温f 产蛋白酶的菡椿。这些蕴显然可缒都越 毳瀑菡，毽值褥注意 的是，它们所产的蛋由酶并非都是低温蛋白酶( b r e n c h l e y j e ，1 9 9 6 ) 。有些所产的氍自酶爆适酶 活湿度竟离达鞠( m a n a c h i n ipl e ta l ，1 9 9 8 ) ，莽盈热稳定好。m a r g e s i nr ，1 9 9 2 年黠姨冰河样 品分离的嗜碱、嗜冷菌b a c i l l u ss p 碱性蛋白酶纯化和性质研究表明，该酶最适作用温度6 0 ，最 透蠲1 1 0 ，分子量为2 7 k d a ，蕊产酶靛条释楚i 8 、p h l o ，0 ( m a r g e s i n r ，1 9 9 2 ) 。闽此，簧得到 产低温摄自酶的菌株，还需要进一步筛选。比较所产强自酶在不同温度下的酶活，以及酶的热稳 定往帮活 乏能等瞧矮，敲两籁选到产低温蛋自酶静骜株，再将蕴株进行诱变，提高低温蛋精酶的 产量。间时，对这些酶进行分离纯化，研究其生理生化性质，物理化学性质以及分子结构。以便 进一步了解低温蛋白酶豹谴纯祝蠲。这是一种胰自然羿中获得低温蛋自酶的最有效的方法。利用 这种方法已从冰川、南极、深海动物的消化邋等样品中筛选到许多低温蛋白酶菌株( 邱秀定等 1 9 9 1 ；孙谧等，2 0 0 0 ；曾瓶新筹，2 0 0 0 ；陈秀兰等，2 0 0 1 ；潲静等，2 0 0 1 ；张锐等，2 0 0 1 ；陈波 簿，2 0 0 2 ：吕明生等，2 0 0 4 ；林念炜等，2 0 0 4 ：m a r g e s i nre ta l ，1 9 9 1 ：s h i b a t ae ta l ，1 9 9 7 ：h o s h i n o t e a i ，1 9 9 k u l a k o v a l e ta l 。1 9 9 9 ：s c h i n n e r f e ta l 。1 9 9 2 ) 。 ( 2 ) 突变选蒋 由予生物技术韵笈鼹，对酶的结构与功畿的分析穗不再最难事。一些中潞蛋白酶与低瀛精白 懿的岸列与结掏已逐灏被霁渍楚。这必突变选窝低温鬣蛊酶焚定了基穰。嵇攀芽建杼莲素是黠擒 分析得煅清楚酌蛋自酶。对中澈的枯草努孢秆菌素基搦经过体外重组、体井随机突变与定点突变 等手段熬研究，己成功她榛到产低温鳖囊酶的菠椽。张云波等鞋黄海赞耔麓￥s - 9 4 1 2 - 1 3 0 越撩为 如发菌株。经强硝基瓤、硫酸二：乙酯、紫外和微波复俞诱变，获得了低温碱性蛋白酶高产稳定突 变拣￥s - 9 4 1 2 - 1 3 0 一s w - 1 0 4 ，酶遮为出发蓥拣豹1 6 倍，达2 3 2 0 u m l 2 0 测定( 张云波等，2 0 0 0 ) t ( 3 ) 低温碱性蛋翔酶的人。i ：进化藻囡i 糨技术 l 鑫滋耀壤微生物产生戆摄滚碱性萤癌酶在惩潼一f 较孛澄鞠离温碱牲蛋鑫辫其骞筻裹静瀵性， 在工业上具有广阔的满程应用价值，但是由于蒸热稳定性远避低于中温和高漱碱性谶自酶，也妨 磷其更广耀戆t 馥裹霸。镯她裁勰基因】：程技术，站低溢礁性爱自懿遴符竣遮，握藏稳定瞧，蒋 趣一条很好的策略。k u l a k o v al i u d r n i l a 等人从1 9 9 9