（分析化学专业论文）双浊点萃取技术在毛细管电泳分离分析中的应用.pdf

南开大学硕士学位论文摘要 摘要 本硕士毕业( 学位) 论文共分为三个部分，包括绪论、双浊点萃取技术和 毛细管电泳联用分离检测环境水样中的苯酚和间硝基苯酚、双浊点萃取一毛细管 电泳分离检测拟南芥突变体内的吲哚乙酸和吲哚丁酸。 第一章为绪论部分。综述了浊点萃取技术和双浊点萃取技术的发展概况和 基本原理；详细总结了毛细管电泳技术的发展概况、基本原理以及分离模式； 讨论了双浊点萃取技术的未来发展方向。 第二章研究了双浊点萃取技术和毛细管电泳联用分离检测环境水样中的苯 酚和间硝基苯酚。本文将双浊点萃取用于毛细管电泳分析苯酚和间硝基苯酚的 样品前处理。优化了双浊点萃取过程的p h 值，t r i t o nx - 1 1 4 用量和n a c l 用量等 萃取条件。研究了缓冲溶液的硼酸盐浓度、p h 值和电压对分离度和迁移时间的 影响，得到了最佳分离实验条件。使用5 0 m m o l l 硼酸缓冲溶液( p h9 5 ) 做缓冲 溶液，分离电压1 8 k v ，检测波长为2 1 0 n m 时，苯酚和间硝基苯酚在8 m i n 内得 到了良好的分离测定。 第三章采用双浊点萃取一毛细管电泳分离检测拟南芥突变体内的吲哚乙酸 和吲哚丁酸。利用多数植物激素的两性，即酸碱条件不同时的溶解度不同，实 现双浊点萃取；同时利用双浊点萃取技术消除基体干扰。利用毛细管电泳高的 分离效率实现植物激素的有效分离。本工作考察了毛细管电泳分离的最优条件； 在最优条件下研究了影响双浊点萃取的基本因素，包括酸碱度、表面活性剂的 种类和用量及电解质的用量。最后用拟南芥突变体作为实际样品进行了检测。 使用1 0 m m o l l 的n a h 2 p 0 4 缓冲溶液( p h 5 0 ) 做缓冲溶液，分离电压2 0 k v ，检测 波长为2 1 7 n m 时，吲哚乙酸和吲哚丁酸在6 m i n 内得到了良好的分离测定。 关键词：双浊点萃取毛细管电泳苯酚间硝基苯酚拟南芥吲哚乙酸吲哚丁 酸 南开大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t l i st h e s i sc o n s i s t so ft h r e ec h a p t e r s ，i n c l u d i n gt h ei n t r o d u c t i o n ，p h - m e d i a t e d d u a l - c l o u dp o 硫e x t r a c t i o na sap r e c o n c e n t r a t i o na n dc l e a n - u pt e c h n i q u ef o rc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sd e t e r m i n a t i o no fp h e n o la n dm - n i t r o p h e n o l ，p h m e d i a t e dd u a l - c l o u d p o 血e x t r a c t i o na s ap r e c o n c e n t r a a t i o na n dc l e a n - u pt e c h n i q u ef o r c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sd e t e r m i n a t i o no fl a a a n di b ai na r a b i d o p s i st h a l i a n a i nc h a p t e ro n e ，t h ed e v e l o p m e n t sa n dt h eb a s i ct h e o r i e so fc l o u dp o i n te x t r a c t i o n a n dd o u l - c l o u dp o 血e x t r a c t i o nw e r er e v i e w e d t h ed e v e l o p i n gh i s t o r y , b a s i ct h e o r y a n ds e p a r a t em o d ew e r ed e s c n q ) e di nd e t a i l i nc h a p t e rt w o ，an o v e lp h m e d i a t e dd u a l - c l o u dp o 缸e x t r a c t i o n ( d c p e ) t e c h n i q u e f o rp r e c o n c e n t r a t i o na n dd e a n - u po fp h e n o la n dm - n i t r o p h e n o li sp r o p o s e db e f o r e c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n a l y s i s 1 kt w oa n a l y t e sb e c o m eh y d r o p h o b i ci n a c i d i cs o l u t i o nb u ta r ed i s s o l v e di n t oa l k a l i n es o l u t i o n s o ，p h m e d i a t e dd c p ef o r p r e c o n c e n t r a t i o no ft h et w oa n a l y t e si n c l u d e st w os t e p s ，w h e r et h et a r g e t sa r e t r a n s f e r r e di n t os u r f a c t a n t - r i c hp h a s ei nt h ef i r s ts t e pa n db a c k - e x t r a c t e di n t oa q u e o u s p h a s ei nt h es e c o n ds t e pt h r o u g hp h m e d i a t i o n 1 1 1 ea q u e o u sp h a s ei ss u b j e c t e di n t o e l e c t r o p h o r e t i ec a p i l l a r ya ss a m p l e b e c a u s et h ec o n c e n t r a t i o no ft r i t o nx _ 1 1 4i nt h e f i n a la q u e o u ss o l u t i o na r e rd c p ei so n l ya r o u n dc r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n , t h e a d s o r p t i o no fs u r f a c t a n to nt h ec a p i l l a r yi n n e rw a l la n di t sp o s s i b l ei n f l u e n c e0 nt h e s a m p l ei n j e c t i o na n ds e p a r a t i o ni nt r a d i t i o n a lc p ea r ee l i m i n a t e d i na d d i t i o n , t h e o t h e rh y d r o p h o b i co rh y d r o p h i l i ci n t e r f e r i n gs p e c i e sa l er e m o v e dt h o r o u g h l yb y d c p e ，r e s u l t i n g i n s i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n ti na n a l y s i ss e l e c t i v i t y b a s e l i n e s e p a r a t i o no fp h e n o la n dm - n i t r o p h e n o lw a sr e a l i z e db yc e i na6 0c m 7 5 心皿i d f u s e d - s n i c ac a p i l l a r ya t18k vu s i n g5 0m mb o r i ca c i db u f f e rs o l u t i o n ( p h9 5 ) e n h a n c e m e n tf a c t o r so f2 4 0a n d2 2 5a r eo b t a i n e df o rp h e n o la n dm - n i t r o p h e n o l , r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ed e t e c t i o nl i m i t sa r e2 o xlo - 6t o o ll - 1f o rp h e n o la n d2 5 xl0 - 6t o o ll - 1 f o r m - n i t r o p h e n 0 1 t h ep r o p o s e dm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no f t w oa n a l y t e si ns p i k e dw a t e rs a m p l e s i nc h a p t e rt h r e e ，p h - m e d i a t e dd u a l - c l o u dp o 缸e x t r a c t m na sap r e c o n c e n t r a t i o na n d 南开大学硕士学位论文 a b s 仃a c t c l e a n - u pe c h n i q u ef o rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sd e t e m l i n a t i o no fi n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d o a a ) a n di n d o l e 一3 - b u t y r i ca c i d ( i b a ) i na r a b i d o p s i st h a l i a n a b a s e l i n es e p a r a t i o no f i a aa n di b aw a sr e a l i z e db yc ei na6 0c m 7 5 岬i d f u s e d s i l i c ac a p i l l a r ya t2 0 k vu s i n g1 0m mn a h 2 p 0 4b u f f e rs o l u t i o n ( p h5 0 ) e n h a n c e m e n tf a c t o r s o f 4 0 5a n d 4 3 4a l eo b t a i n e df o ri a aa n di b 八r e s p e c t i v e l y 1 1 把d e t e c t i o nl i m i t sa r e5 0 x1 0 r 6 m o ll - if o ri a aa n d3 7 x10 r 6m o ll 1f o ri b a 1 1 1 ep r o p o s e dm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l y a p p f i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f t w oa n a l y t e si na r a b i d o p s i st h a l i a n as a m p l e s k e y w o r d s ：d u a l - c l o u dp 0 血e x t r a c t i o n , c a p i l l a r ye l c c t r o p h o r e s i s ，p h e n o l , 静 n i t r o p h c n o l , a r a b i d o p s i st h a l i a m , i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d ，i n d o l e 一3 一b u t y r i ca c i d 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的e p , b u 本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：名咖 卿年万月2 男日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：枷弗 夕7 年万月) 髟日 f 南开大学硕士学位论文 第一章 第一章绪论 1 1 毛细管电泳 1 1 1 毛细管电泳的发展概况 毛细管电泳技术( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 的发展历史悠久，多数学者 认为其起源可以追溯到1 9 4 2 年m a r t i n 的工作，他用称为置换电泳( 现在称为等 速电泳) 的方法分离了4 种有机酸【i j o 后来，e v e r a e r t s 等人【2 l 在出版的刊物中提 出了在毛细管中进行电泳分离的基本原则。1 9 6 7 年瑞典的科学家h j e r t e n 提出了 毛细管区带电泳，这成为毛细管电泳正式发展的标志【3 1 。他用壁涂甲基纤维素的 3 m m 内径石英管进行电泳分离，令管子绕轴旋转，但这种操作非常麻烦，难以 实用。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a e s e 4 使用7 5 微米内径的熔融石英晶体毛细管柱， 用荧光检测器实现了多种组分的分离，成为毛细管电泳发展史上的一个里程碑。 1 9 8 4 年t e r a b e ( 5 1 将胶束引入毛细管电泳，开创了胶束电动毛细管色谱。1 9 8 5 年 h j e r t e n 等人【6 】把传统的等电聚焦方法引入到毛细管电泳的分离。1 9 9 0 年 k a n i a n s k y 等人 7 1 采用稀样品场放大进样，实现了样品的在柱浓缩，开辟了低浓 度进样新技术，从而大大提高了区带检测的灵敏度。 在我国，1 9 8 4 年竺安先生指导研究生率先开展了毛细管电泳技术的研究， 做了大量的工作i s - 1 0 】。 随着1 9 8 8 年第一台商品化的毛细管电泳仪问世以来，毛细管电泳技术在世 界范围内得到了快速发展。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容， 是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升 水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。 1 1 2 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳又称毛细管电分离法( c e s m ) 或高效毛细管电泳( 肿c e ) ，是 一类以毛细管为分离通道，离子或荷电离子以高压直流电场为驱动力，在电场 中按其淌度或分配系数不同进行快速分离的新型液相分离分析技术。如图1 1 所 南开大学硕士学位论文第一章 示h 1 ，样品在电解液中泳动，根据物质的荷质比差异来进行分离，比值愈大 分离得愈快。 图1 1 毛细管电泳的基本原理示意图嗣。 毛细管电泳中一个非常重要的概念是电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w , 简称 e o f ) ，毛细管电泳区别于其它一些分离分析技术的优点都得益于电渗流的存在 电渗流指的是体相溶液在外加电场作用下整体朝一个方向运动的现象。它对毛 细管电泳分离的主要作用有正负两个方面。正面作用是增加分离速度、减少了 分离时间和使得正负电荷物质同时分离；负面作用是减少了分离的有效距离， 电渗流的波动性极大地影响了迁移时间的重复性。电渗流在毛细管电泳分离中 的作用如图1 2 所示【l 】： 南开大学硕士学位论文第一章 o v e p ( a ) + v e 。一一 渗_ o - _ 吖e p + v e o 。十 e o f 图1 2 电渗流在毛细管电泳分离中的作用示意卧】。 1 1 3 毛细管电泳的分离模式 经典的毛细管电泳技术的分离模式包含毛细管区带电泳、毛细管胶束电动 色谱、毛细管凝胶电泳、等电聚焦毛细管电泳等【1 l 】。 毛细管区带电泳( c z e ) ：采用普通的分离缓冲溶液，如磷酸盐或硼酸盐缓 冲溶液，使用空的且未涂层的毛细管作为分离通道，这类技术称为毛细管区带 电泳。它是毛细管电泳中最基本的操作模式，实验条件包括缓冲溶液浓度、p h 值、电压、温度、改性剂( 乙腈、甲醇等) 。因为中性物质在电场作用下随电渗 流移动因而中性物质之间无法实现分离。毛细管区带电泳具有分离方便、快速、 样品用量小的特点，在无机离子、有机物、氨基酸、蛋白质及各种生物样品的 测试中有着广泛的应用。毛细管区带电泳要求缓冲溶液具有均一性，毛细管内 各处具有恒定的电场强度。毛细管区带电泳是最基本也是最常见的一种操作模 式，应用范围最广，可用于药物 1 2 - 1 3 、氨基酸 1 4 - 1 7 、多种蛋白质 1 s - 2 2 1 以及肽 2 3 - 2 6 1 的分析。 毛细管胶束电动色谱( c c ) ：在分离缓冲溶液中添加超过临界胶束浓度 的表面活性剂，使用空的毛细管作为分离通道，这一类技术称为毛细管胶束电 动色谱。它在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂作为胶束相，是一种基于胶束 增溶和电动迁移的新型液相色谱技术。在电场作用下，胶束相也会沿着毛细管 作定向移动，我们把这个移动的胶束固定相称为“准固定相。毛细管胶束电动 色谱利用溶质分子在水相和胶束相分配的差异实现分离。对于中性粒子，由于 它们本身的疏水性的不同，与胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力大，保 留时间长；反之，保留时间短。最常用的表面活性剂是十二烷基硫酸钠( s d s ) 南开大学硕士学位论文 第一章 另外，各种阴阳离子表面活性剂和环糊精等添加剂使得本法有相当大的选择余 地。它的应用范围也十分广泛，如：水溶性和脂溶性维生素的分离【2 刀，芳香碳 氢化合物的分离 2 s - 3 0 ，药物的手性分离 3 1 - 3 3 1 等等。 毛细管凝胶电泳( g c e ) ：如果在毛细管内填充具有线状缠结聚合物结构的 物理凝胶，使样品中各组分通过净电荷的差异和分子大小差异双重机制得以分 离，这一类分离模式称为毛细管凝胶电泳。被分离物质通过装入毛细管的凝胶 柱时，按照各自分子的体积大小逐一分离，它主要用于蛋白质、核苷酸片段的 分离，已被认为是生命科学基础和应用研究中有力的分析工具。最常用的凝胶 是聚丙烯酰胺。聚合物的孔穴大小取决于单体与交联剂的比例，增加交联剂的 量可以得到小孔穴凝胶。它可以实现淌度接近，但分子大小和形状不同的物质 如生物大分子蛋白质1 3 4 - 3 6 ，d n a 3 7 - 4 1 1 的分离。与传统的凝胶电泳类似，它按照 分析物相对分子质量的大小而实现分离。 等电聚焦毛细管电泳( c i e f ) ：如果毛细管两端的储液池使用不同p h 值的 缓冲溶液，那么在电场的作用下，在毛细管内就会产生沿毛细管分布的p h 值梯 度，对于象蛋白质、肽类这样的两性分析物会集中在自己等电点的p h 区域而实 现分离，这种分离模式称为毛细管等电聚焦电泳。毛细管等电聚焦电泳广泛用 于蛋白质、肽类这样的两性物质的分离【4 2 卅，已成功用于等电点仅差0 0 0 1 的物 质的分离。 1 1 4 毛细管电泳的发展方向 目前，国际上的毛细管电泳研究侧重于实际应用，应用研究的内容也是多 方面的，其中最富特色的是蛋白质的分离、糖分析、d n a 测序、手性分离、单 细胞分析等等。 毛细管电泳方法的发展同样也是多方面的，其中建立新的分离模式和联用 技术最为突出。比如建立了列阵毛细管电泳( c a e ) 、芯片式毛细管电泳( c c e ) 及亲和毛细管电泳( a c e ) 等。 1 1 5 毛细管电泳的优缺点 毛细管电泳技术作为一种重要的分离分析技术其优点是显而易见的【4 刀，我 们总结如下： 4 南开大学硕士学位论文第一章 1 高效，理论塔板数一般在1 0 5 1 0 6 片米间。 2 快速，几十秒至十几分钟完成分离。 3 微量，进样所需的体积可以小到l g l ，消耗体积在l 5 0 n l 之间。 4 多模式，可根据实际需要选用不同的分离模式且仅需要一台仪器即可完 成分离。 5 样品对象广，可实现无机离子，有机小分子，生物大分子到细胞的分离 分析。 6 自动，毛细管电泳技术在目前的分析方法中是自动化程度最高的分离方 法。 7 浓度检出限好。 但是在学者们多年的实践中，毛细管电泳技术也暴露出了诸多缺点。比如 传统样品( 如固体样品、污水样品等) 无法直接进样，必须经过预处理后才能 对毛细管进样。基于此人们发展了浊点萃取技术。 1 2 浊点萃取技术 1 2 1 浊点萃取技术的发展概况 浊点萃取技术( c l o u dp o i a te x t r a c t i o n , c p e ) 是近年发展起来的一种新型分 离技术，主要是利用表面活性剂溶液的增溶和分相实现溶质的富集和分离。在 低浓度下检测复杂基质中的分析物是一直以来困扰分析化学家的一个问题。这 个问题的解决就是基于浊点萃取技术的出现。 浊点萃取技术可以上溯到1 9 7 6 年，w a t a n a b e 等人【4 8 】首次介绍了浊点萃取技 术是一种新的可以替代有机溶剂的有前途的分离和萃取技术，他们认为与传统 的液一液萃取过程相比，浊点萃取无需使用大量的有机溶剂，易于操作，商业表 面活性剂对环境的影响较小而且成本较低，能够保护被萃取物质的原有特性( 如 生物大分子的活性) ，同时能够提供很高的富集效率和萃取效率，是一种新型的 环境友好的分离技术，具有很好的工业应用潜力。他们的工作介绍了采用浊点 萃取技术以疏水配合物的形式预富集金属离子，取得了显著结果。 后来更多的学者采用浊点萃取技术提纯蛋白质。到1 9 8 2 年浊点萃取技术理 5 南开大学硕士学位论文 第一章 论的雏形【4 9 】已经形成，至1 9 8 5 年浊点萃取技术理论已经发展地较为完善了【5 0 】 之后人们又对经典的浊点萃取分析方法进行了几次改变，自动化的方法也引入 到这种技术中。 浊点萃取技术发展至今已被广泛地应用于多个领域： 一、在金属元素分析中的应用。浊点萃取技术最早是由h i r o t o 5 1 用于金属离 子的测定的，他用p o n p e2 7 5 作为表面活性剂研究金属离子的萃取，并从水中富 集了z n 2 + 。作为痕量元素分离富集的一种手段，浊点萃取技术在分析化学中得到 广泛应用，通过表面活性剂对样品中痕量金属离子进行分离和预富集，再结合 火焰原子吸收分光光度法( f a a s ) 、石墨炉原子吸收分光光度法( g f a a s ) 、等离 子发射光谱( i c p ) 、及紫外一可见分光光度法( u v m s ) 等分析方法或与多种检测 技术联用，实现了环境样品中痕量金属离子的准确测定。后来也有将其与色谱技 术( 高效液相色谱h p l c 和毛细管电泳c e ) 联用进行金属离子的分离、富集和形态 分析的报道【5 2 蚓。 二、在生物样品分析中的应用。浊点萃取技术可用于分离膜蛋白、酶、动 植物和细菌的受体，还可与色谱法联用替代硫酸铵分级法作为纯化蛋白质的最 初步骤。b o r d e r l 5 5 1 最早将浊点萃取技术用于生物学领域，用非离子表面活性剂 t r i t o nx - 1 1 4 成功分离出乙酰胆碱酯酶、噬菌调理素、细菌视紫红质、细胞色素c 氧化酶等内嵌膜蛋白，其操作步骤较为简单。应用浊点萃取技术分离纯化蛋白质 已可实现规模化操作，m i n u t h 等人【5 6 】成功进行了胆固醇氧化酶的浊点萃取的中 试研究，取得了较理想的效果，虽然他们采用的方法耗时较长( 约2 0h ) ，但是此方 法投资少、劳动强度低，萃取效率及浓缩因子与实验室制备结果极为类似。 三、在环境有机分析中的应用。浊点萃取技术广泛应用于p a h s 【5 7 - 6 l 】、 p c b s 6 2 、有机磷杀虫剂f 6 3 - 6 4 、藻毒素【6 5 】、酚类【6 6 】、氯酚类吲、有机毒物分离分 析【6 8 - 8 1 】等的测定。其中p a h s 是最常用的指标化合物，而其它的几类首批控制持 久性有机污染物( p o p s ) 以及目前的新型有机污染物，如溴化阻燃剂、环境内 分泌干扰物等较少涉及；非离子型表面活性剂在浊点萃取中研究最深入，而阳 离子表面活性剂研究相对薄弱。 四、在食品工业中的应用。目前在食品工业中，人们主要是用该技术来萃 取生物大分子和一些物质分析检测的预处理【8 2 】。 另外，该技术在临床治疗药物监测【8 3 。8 刀、中药成分提取【8 3 - 8 9 】分离分析等方面 均有报道。 6 南开大学硕士学位论文第一章 1 2 2 浊点萃取技术的基本原理 浊点萃取技术是由于一些表面活性剂的胶束水溶液被加热或冷却至一定温 度时出现混浊，放置一段时间或离心之后分成两相( 表面活性剂相和水相) 。若 施以相反的温度作用，则两相消失，再次形成均一溶液。此现象得以发生的温 度就是浊点温度，基于此现象实现分离的方法就是浊点萃取，也称胶束媒介萃 取( m i c e l l a rm e d i a t e de x t r a c t i o n , m m 巳) 【9 田。 胶束的形成过程如图1 3 所示【9 l 】： a ) l 三三j 咎 0 q 囊j 憾事 k 爿炯 舭_ 叫 燃潦避 永移 永器 藜 w ：自啊嚣。帅l 岫i 的n 乞删n a 帕m 妇蛔n 啊l l 蚺奠嘲一 b ) 图1 3 浊点萃取技术中胶束的形成过程示意图【9 l 】。 表面活性剂是两性分子，其两端分别是截然不同的疏水端和亲水端。离子 基一端连接着很长的碳氢化合物长链( 可能是线性的、枝状的或包含芳香环的) 7 南开大学硕士学位论文第一章 表面活性剂具有头部亲水和尾部疏水的特点。疏水部分在水溶液中聚集成 核，亲水部分向外张开形成胶束。通常，当其水溶液浓度增加到临界胶束浓度 ( c r i t i c a lm i c e n a rc o n c e n t r a t i o n ，c m c ) ，表面活性剂剧烈聚合成具有胶体尺寸的 分子聚合体。分子聚合体最重要的优点在于其对不同特征、不同性质的溶质具 有良好的溶解能力。表面活性剂根据其类型不同，溶液条件不同，胶束形态各 异，如圆形、椭圆形、圆柱形等【叼。平时应用表面活性剂性质最多的是它的增 溶作用，很多微溶于水或不溶于水的物质与表面活性剂结合后溶于水。浊点萃 取法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质浊点现象。 一个均一的表面活性剂水溶液在外界条件( 如温度) 变化时，因为引发相分离而 突然出现浑浊的现象叫做浊点现象，此时的温度叫做浊点温度( c p ) 。静置一段 时间( 离心) 后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂富集相( 约占总体积的 5 ) ；另一相为水相( 胶束浓度等于临界胶束浓度) 。外界条件( 如温度) 向相反方 向变化时，两相便消失，再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜 蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂富集相，亲水性物 质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取 方法就是浊点萃取。 非离子型表面活性剂的胶束溶液在浊点温度时分成含待萃取化合物的表面 活性剂相和水相。然而，浊点萃取过程中相分离的原理至今仍不是很清楚。有 人指出相分离是由于温度升高时引起胶束聚合体数目的增加，从而引起胶束尺 寸的增加【9 3 】。也有人认为相分离是由于胶束间相互作用的改变引起的【舛】，在低 温下它们互相排斥，而在高温环境中则相互吸引。还有人指出【9 5 】，温度升高时， 水的介电常数降低，其对表面活性剂疏水部分的溶解度很低，引发胶束外层发生 脱水作用。 目前，最常用的相分离引发方法是改变温度。在复杂体系中，由于盐、碱、 酸、聚合物和其它表面活性剂等的共存效应，浊点温度会略微发生改变嗍，也 就是说，通过选择性地加入一些添加剂，可以人为地控制浊点温度。对于一些 双离子型的表面活性剂，浊点现象也同样存在【9 6 】。非离子型和双离子型表面活 性剂最大的不同在于前者在浊点温度以上发生相分离，而后者则需要冷却至浊 点温度以下嗍。最近研究表明，一些阴离子型的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠 ( s d s ) 、十二烷基苯磺酸钠( s d b s a ) 、十二烷基磺酸钠( s d s a ) 和二一( 2 一乙基己基) 磺化琥珀酸钠( 气溶胶o t ) ，在高浓度盐酸环境中，室温下也可以发生浊点现象 南开大学硕士学位论文 第一章 嗍，可能是由于大量氢离子的存在，使得阴离子质子化，从而转化为非离子型 表面活性剂，继而发生浊点现象。 浊点萃取的原理示意图如图1 4 所示州： 圈1 a 浊点萃取原理示意圈口 。 12 3 浊点萃取技术的优缺点 浊点萃取技术已经在很多领域得到广泛应用，它与传统的液一液萃取技术相 比有如下优点阻1 ”】： 1 通过改变表面活性剂的类型及实验条件，该技术能有效地萃取、浓缩不 同类型的物质，并有很好的分离效果； 2 操作简单，避免了使用大量的有机溶剂，且使用的表面活性剂的毒性小 用量少价格低廉； 3 萃取分离后不需要蒸除溶剂，减少了萃取物的损失，使检测结果更为精 确： 4 作为分析的前处理，表面活性剂具有与色谱的流动相怠好的相溶性，在 不干扰检测时可直接进样； 5 便于大规模的生产操作。 这些都说明它是一种极具前景的萃取技术。 但是任何分析方法都不是十全十美的，浊点萃取技术在有上述优势的同时 也存在一些缺点唧】： 制备及工业级浊点萃取法分离后生物大分子与表面活性剂的分离仍需改 进。表面活性剂不适宣进入气相色谱，液相色谱质谱联用系统，造成了该方法 的局限性，相关去除表面活性剂的有效技术仍待开发，将其与0 c m s ，l c - m s u 薹 h 凶则 薹。 南开大学硕士学位论文 第一章 联用进一步降低检出限，提高准确度。同时表面活性剂与待测物的作用机制尚 不清楚，有待进一步阐明。 对于多组分体系的高选择性分离是未来浊点萃取技术研究的重点。但是作 为一种新兴的分离及样品前处理方法，浊点萃取技术在理论基础和应用方面都 有许多研究仍需深入，与其他检测仪器联用进行分析的手段也需不断改进，例 如表面活性剂所具有的粘性以及测定时产生气泡，均会对试验信号的连续性和 稳定性产生负面影响。另外，浊点萃取技术与气相色谱的联用没有得到充分的 发展，而气相色谱分析是一种应用范围广、检测器种类多、分析结果灵敏的检测 方法。 只有确定浊点萃取的反应机理，提高其应用范围，才将会极大的促进该技 术的发展及普及。 浊点萃取作为前处理方法结束后常规的分析方法是将含萃取物的表面活性 剂相直接进样于h p l c 、h a 、c e 等分析仪器。但浊点萃取作为样品前处理方法 有一个缺点，即常用的表面活性剂在紫外区域有很强的背景吸收。为克服这一 弊端，有人采用电化学检测器 1 0 2 - 1 0 3 检测，也有人采用荧光检测器 1 0 9 1 0 5 检测， 还有的选用在u v 检测区无吸收的表面活性剂 1 0 6 或c n e m 型表面活性剂；或者改 变h p l c 的分析条件，调节洗脱液组成，使分析物先流出，表面活性剂留在固定 相上 1 0 7 1 。 另外，在分析血液和其它生物样品时，会有共萃取物( 如：血清蛋白等) 与被测物同时被萃取。此时可用乙腈沉淀及硅烷化玻璃纤维过滤除去共萃物【l o s 最近几年，随着毛细管电泳技术的发展，浊点萃取技术作为毛细管样品前 处理方法已有很多报道1 1 0 9 - 1 1 0 。由于表面活性剂胶束相易吸附在毛细管壁上，造 成分析迁移时间增大、电泳分离效率下降，重现性很差。在分离缓冲液中加入 阳离子表面活性剂可减少胶束的吸附，然而这样做却缩短了毛细管柱的使用寿 命。传统的做法是在表面活性剂富集相中加入有机溶剂，如甲醇、乙腈稀释浊 点相；用有机溶剂反萃取分析物出来。但这样做易对环境造成污染，不利于环 境保护。 鉴于浊点萃取技术的上述缺点，我们提出了双浊点萃取( d u a lc l o u dp o i n t 1 0 南开大学硕士学位论文 第一章 e x t r a c t i o n ) 的概念，双浊点萃取技术可以在一定程度上克服浊点萃取技术的上 述缺点。 1 3 双浊点萃取技术的结论和未来展望 1 3 1 双浊点萃取技术的结论 双浊点萃取是指在样品的预富集过程中执行了两次浊点萃取。第一次浊点 萃取过程与传统的浊点萃取相同，即表面活性剂加入到含有待分析物的水溶液 中，创造条件使待分析物为疏水形式或可以和配体形成疏水化合物的形式。然 后在恒温水浴中恒温，接着进行离心。这时待分析物和其它的疏水性干扰物质 都被萃取入表面活性剂富集相。与传统浊点萃取不同的是我们这时并没有直接 进样，而是又进行了第二次浊点萃取，我们取表面活性剂富集相，创造条件使 其中的待测分析物为亲水形式，经过恒温和离心之后，待测分析物由表面活性 剂富集相转移到水相。这时可直接进样。 双浊点萃取的过程如图1 5 所示【l l l 】： g 呻a nc o m p l e x e s y d r o p h o b i cs p e c i e 8 e t a l - p nc o m p l e x e s y d r o p h i l i cs p e c i e s 图1 5 双浊点萃取的过程示意图 1 1 1 1 。 h y d r o p h o b i cs p e c i e s m e t a l - p a nc o m p l e x e s 双浊点萃取与传统的浊点萃取相比有如下的优势： 1 通过双浊点萃取消除了传统浊点萃取中表面活性剂的干扰； 2 提高了方法的选择性。第一次浊点萃取消除了亲水的干扰物，第二次浊 点萃取消除了疏水的干扰物； 3 与毛细管电泳等仪器联用，经过简单的样品处理获得了较低的检出限。 二 南开大学硕士学位论文 第一章 4 实现毛细管电泳等仪器的在线富集。双浊点萃取的产物是离子型的，在 电场作用下迁移速度大，我f j j n 用其进入不同p h 的缓冲溶液时迁移速度的降低 实现毛细管电泳的在线富集。 1 3 2 双浊点萃取技术的未来展望 双浊点萃取技术是浊点萃取技术的延伸，在一定程度上克服了浊点萃取的 一些不足。双浊点萃取可以和h p l c 、f i a 、c e 等分析仪器联用，并可以考虑表 面活性剂的回收利用。 1 2 南开大学硕士学位论文 第一章 1 4 参考文献 【1 】陈义毛细管电泳技术及应用北京：化学工业出版社2 0 0 6 【2 】林炳承毛细管电泳导论北京：科学出版社1 9 9 6 【3 】h j e r t e ns f r e ez o n ee l e c t r o p h o r e s i s c h r o m a t o g r r e v ，1 9 6 7 ，9 ：1 2 2 - 2 1 9 【4 】j o r g e n s o njw ，l u k a c skd z o n ee l e c t r o p h o r e s i si no p e nt u b u l a r 百a 鼹c a p i l l a r y a n a l c h e m ，1 9 8 1 ，5 3 ：1 2 9 8 1 3 0 2 【5 】t e r a b ss ，o t s u k ak ，i c h i k a w ake ta 1 e l e c t r o k i n e t i cs e p a r a t i o n sw i t hm i c e l l a rs o l u t i o n sa n d o p e n - t u b u l a rc a p i l l a r i e s a n a l c h e m ，1 9 8 4 ，5 6 ：111 11 3 【6 】h j e r t e ns h i g h - p e r f o r m a n c ee l e c t r o p h o r e s i s ：e l i m i n a t i o no fe l e e t r o e n d o s m o s i sa n ds o l u t e a d s o r p t i o n j c h r o m a t o g r ，1 9 8 5 ，3 4 7 ：1 9 1 - 1 9 8 【刀k a n i a n s k yd ，m a r a kj d e t e r m i n a t i o no fs o r b i ca c i di nf o o d - p r o d u c t sb yc a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i si nah y d r o d y n a m i c a l l yc l o s e ds e p a r a t i o nc o m p a r t m e n t j c h r o m a t o g r ，1 9 9 0 ， 4 8 9 ：1 9 1 2 0 6 【8 】陈义，竺安红细胞的毛细管区带电泳生物化学与生物物理进展，1 9 9 0 ，1 7 ：3 9 0 - 3 9 3 【9 】z h u 凡c h e ny h i g h - v o l t a g ec a p i l l a r y7 o l l ee l e c t r o p h o r e s i so f r e db l o o dc e l l s j c h r o m a t o g r ， 1 9 8 9 ，4 7 0 ：2 5 1 2 6 0 1 0 】陈义，竺安扁形毛细管区带电泳中国科学，b 辑，1 9 9 1 ，6 ：5 6 1 5 6 7 【11 】杨万龙，李文友仪器分析实验北京：科学出版社2 0 0 8 ，2 9 8 - - , 3 0 0 【1 2 】l i ujj ，l isp ，w a n gyt o p t i m i z a t i o nf o rq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ff o u rf l a v o n o i d si n e p i m e d i u mb yc a p i l l a r yz o n ef l e c t r o p h o r e s i sc o u p l e dw i t hd i o d ea r r a yd e t e c t i o nu s i n g c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n j c h r o m a t o g r a ，2 0 0 6 ，l1 0 3 ：3 4 4 - 3 4 9 【1 3 】j i a n gtf ，l vzh w a n gyh s e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fc h a l c o n e sf r o mc a r t h a m u s t i n c t o r i u sl a n di t sm e d i c i n a lp r e p a r a t i o nb yc a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s j s e p s c i ，2 0 0 5 ， 2 8 ：1 2 4 4 1 2 4 7 【1 4 】赵艳芳，赵亮，明永飞等配体交换毛细管区带电泳拆分未衍生化氨基酸分析化学， 2 0 0 6 ，3 7 ：$ 8 7 - $ 9 0 【1 5 】程燕，白敏，石运伟等手性氨基酸的毛细管电泳拆分研究分析测试学报，2 0 0 6 ，2 5 5 2 - 5 5 【1 6 】r o d r i g u e zj ，b e 麟jj ，c a s t a n e d ag v e r yf a s ta n dd i r e c tc a p i l l a r yz o