（生物化学与分子生物学专业论文）sirna特异性及脱靶效应的研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权 浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口 ，在年解密后适用本版权书。 不保密口 。 学位论文作者签名磁乞 日期：7 矽f 夕年弓月y r 目 指导教师签g 喽翥+ - j 霪誊j 参 日期：矽。年 肜r 日 浙江理工大学硕士学位论文 尚弘理大学 硕士学位论文 s i r n a 特异性及脱靶效应的研究 作者姓名赵德尧 学科( 专业)生物化学与分子生物学 指导老师 郭江峰教授 丁先锋副教授 所在学院生命科学学院 提交日期二零零九年十二月 中国杭州 浙江理工大学硕士学位论文 z h e j i a n gs c i t e c hu n i v e r s i t y m a s t e rd i s s e r t a t l o n s t u d yo fs i r n as p e c i f i c i t ya n do f f - t a r g e te f f e c t s d e y a oz h a o p r o f e s s o rj i a n g f e n gg u o a s s o c i a t ep r o f e s s o rx i a n f e n gd i n g c o l l e g eo f l i f es c i e n c e s ，z h e j i a n gs c i t e c hu n i v e r s i t y d e c 2 0 0 9 h a n g z h o u ，c h i n a 浙江理工大学硕士学位论文 分类号： udc ： 密级： s i r n a 特异性及脱靶效应的研究 论文答辩日期7 啪一墨一7 仝 答辩委员会主席垄塞蔓幺硷蔓丝 论文评阅人丝2 鲞：墨型缝 磁盘凌丝 猹屋盏燃 答辩委员会成员避至盔幽碰 盏蒸压刻碰 经盗塑燃 课题来源 r n a 干扰的特异性研究及其 在小核酸制药中的应用 ( 国家自然科学基金) 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r i n g ，r n a i ) 是指进化保守的小干扰r n a ( s m a l l i n t e r f e r i n gr n a ，s i r n a ) 介导的抑制靶基因表达的现象。主要通过降解靶标m r n a 从而抑制目标蛋白合成的转录后调控，有效抑制基因表达。参与这一过程的作用 因子是s i r n a ( 约2 1 2 3 n t ) ，作为关键的媒介与r i s c 蛋白在细胞质中结合，进而特 异性的降解靶标m r n a 。由于s i r n a 的这种特性可以抑制致病基因的突变位点， 因此s i r n a 被广泛希望于作为新一代的生物临床治疗药物。 r n a 干扰过程中，s i i 斟a 和m r n a 特异结合能够使得靶基因沉默。但研究 证实，s i r n a 还可以与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，这种现象称为s i r n a 的脱靶效应。 s i q u a n t 系统以双荧光报告检测技术为基础，是一种检测s i r n a 抑制活性的 高通量检测工具。在s i q u a n t 中引入s i r n a 的靶位点，s i r n a 的沉默效率可以通 过荧光报告基团的活性直接反映出来。 s i r n a 的沉默特异性和脱靶效应是其作为临床应用，特别是在选择性沉默 s n p 突变基因过程中遇到的关键问题。然而，目前尚没有设计等位基因特异性 s i r n a 的可行性指导原则。本论文以基于s i q u a n t 的双荧光报告系统为主要检测手 段，使用2 0 条s i r n a s 和相应的2 4 0 条错配靶序列，以s i r n a 的4 、1 2 和1 7 三 个位点为例，发现s i r n a 的错配容忍模式是由其错配位点决定的，在不同位置具 有不同的错配容忍模式，并且不受周围序列的影响。本论文进一步使用2 0 条 s i r n a s 和相应的2 6 0 条错配靶序列对s i r n a 的错配模式进行了全面研究，建立了 s i r n a 各碱基在各位点的错配容忍模式图谱。 根据上述得到的s i r n a 各碱基各位点错配容忍规律，将错配位点放置在 s i r n a 高敏感区域，从而实现将完全匹配与单碱基错配选择性地沉默，即通过人 为设计等位基因特异性s i r n a 来有效抑制突变治病的等位基因而对正常基因的影 响达到最小。本论文设计抑制p i k 3 c a 基因的两个致病突变位点的特异性s i r n a ， 成功地对p i k 3 c a 基因的两个致病突变位点进行了选择性沉默。 本论文建立的s i r n a 错配容忍模式可以为等位基因特异性s i r n a 的设计提供 可行的规律，选择性的基因沉默对治疗因s n p 导致的疾病具有重大价值，为s i r n a 浙江理工大学硕士学位论文 作为临床治疗药物研究提供有力的技术支持。 关键词：s i r n a ，特异性，脱靶效应 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t r n ai n t e r f e r i n g ( r n a i ) i sa ne v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e dp r o c e s sw h e r es m a l l i n t e r f e r i n gr n a ( s i r n a ) s p e c i f i c a l l yr e p r e s s e st h ee x p r e s s i o no ft a r g e tg e n e s t h e e f f e c t o r so ft h i sp r o c e s sa r es i r n ad u p l e x e s ( a p p r o x i m a t e l y21 2 3 n t ) t h a ta r ek e y i n t e r m e d i a r i e si nt h es p e c i f i cd e g r a d a t i o no ft a r g e tm r n af o l l o w i n gi n c o r p o r a t i o ni n t o t h er n a - i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ( r o s e ) i nt h ec y t o p l a s m a s i r n a sa r ew i d e l ye x p e c t e dt ob e c o m en e x tg e n e r a t i o no fb i o l o g i c a lt h e r a p e u t i c s ， a n dt h e ya r ei n i t i a l l ya n t i c i p a t e dt op l a yam a j o rr o l ei nt r e a t m e n to fd i s e a s e si n v o l v i n g s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) w h e r ed i s c r i m i n a t i o na g a i n s ts i n g l en u c l e o t i d e v a r i a t i o nb e t w e e nw i l d - t y p ea n dm u t a n ta l l e l e si sd e m a n d e d i nr n ai n t e r f e r e n c e ，s i r n a sc a ns i l e n c et a r g e tg e n e ss p e c i f i c a l l yb yb i n d i n g c o r r e s p o n d i n gm r n a b u tr e c e n tr e s e a r c h e sc o n _ f i r mt h a ts i r n a sa r el i k e l yt oa c to n n o n t a r g e tg e n e sa n dd e g r a d et h e m t h i si ss o c a l l e d “o f ft a r g e te f f e c t s ” s i q u a n ti sar e p o r t e r - b a s e ds i r n av a l i d a t i o ns y s t e mt h a tp r o v i d e sar a p i da n d p r e c i s ea p p r o a c ht oe v a l u a t ei n d i v i d u a ls i r n a i nh i g h t h r o u g h p u tm a n n e lt h ee f f i c a c y o fas i r n ac o u l db er e a do u tb ym e a s u r i n gt h ea c t i v i t yo far e p o r t e re n z y m e ，o fw h i c h t h em r n aw a st a g g e db yas h o r ts e q u e n c er e p r e s e n t i n gt h et a r g e ts i t eo ft e s t e ds i r n a s i l e n c i n gs p e c i f i c i t ya n do f ft a r g e te f f e c t sa r ec r i t i c a li s s u e si nt h et h e r a p e u t i c a p p l i c a t i o n so fs i r n a ，p a r t i c u l a r l yi nt h et r e a t m e n to fs i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) d i s e a s e s h o w e v e r ，n og e n e r a l l ya p p l i c a b l eg u i d e l i n e sa r ea v a i l a b l ef o rt h e d e s i g no fs u c ha l l e l e - s p e c i f i cs i r n a s i nt h i sp a p e r , t h ei s s u ew a sa p p r o a c h e db yu s i n g a r e p o r t e r - b a s e da s s a y w i lap a n e lo f2 0s i r n a sa n d2 4 0v a r i o u s l ym i s m a t c h e dt a r g e t r e p o r t e r s ，w e f i r s td e m o n s t r a t e dt h a tt h em i s m a t c h e sw e r ed i s c r i m i n a t e di na p o s i t i o n - d e p e n d e n to r d e r , w h i c hw a sh o w e v e ri n d e p e n d e n to ft h e i rs e q u e n c ec o n t e x t s u s i n gp o s i t i o n4 t h , 1 2 t ha n d17 t ha se x a m p l e s ag e n e r a lm o d e lw a sf u r t h e rb u i l tf o r m i s m a t c hd i s c r i m i n a t i o na ta l lp o s i t i o n s u s i n g2 6 0a d d i t i o n a lr e p o r t e r c o n s t r u c t s s p e c i f i c a l l yd e s i g n e dt oc o n t a i nm i s m a t c h e sd i s t r i b u t e de v e n l ya l o n g t h et a r g e tr e g i o n s o fd i f f e r e n ts i r n a s t h i sm o d e lw a ss u c c e s s f u l l ye m p l o y e dt od e s i g na l l e l e s p e c i f i c s i r n a st a r g e t i n gd i s e a s e c a u s i n gm u t a t i o n so fp i k 3 c ag e n ea tt w os n ps i t e s 1 浙江理工大学硕士学位论文 _ - - - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - 一 b s e r v e dt o f u r t h e r m o r e ，c o n f o r m a t i o n a l d i s t o r t i o no fs i r n a t a r g e td u p l e xw a so c o r r e l a t ew i t ht h ec o m p r o m i s eo fg e n es i l e n c i n g i ns u m m a r y , t h e s ef i n d i n g sc o u l d d r a m a t i c a l l ys i m p l i f yt h ed e s i g no fa l l e l e - s p e c i f i cs i r n a sa n dm i g h ta l s op r o v i d eg u i d e t oi n c r e a s et h es p e c i f i c i t yo ft h e r a p e u t i cs i r n a s k e y w o r d s ：s i r n a ，s p e c i f i c i t y , o f f - t a r g e te f f e c t 4 浙江理工大学硕士学位论文 目录 l 文献综述1 1 1r n a i 的研究历史及概况1 1 2r n a i 的作用机制3 1 2 1 转录后沉默机制4 1 2 2 基因组甲基化机制7 1 3r n a i 技术应用8 1 3 1 研究基因功能8 1 3 2 疾病治疗9 1 4s i r n a 的脱靶效应9 1 5 基于s i q u a n t 的双荧光报告检测技术。1 3 1 6 研究目的及研究内容1 7 2 实验方法与材料l8 2 1 质粒构建18 2 1 1 寡核苷酸片断退火配对18 2 1 2 靶位点与载体连接1 8 2 1 3 转化l8 2 1 4 菌落p c r 阳性克隆鉴定1 9 2 1 5 选取阳性克隆1 9 2 1 6 提取质粒1 9 2 1 7 质粒测序。2 0 2 2s i r n a 及靶位点设计2 1 2 3 细胞培养与转染2 2 2 3 1h e k 2 9 3 细胞培养2 2 2 3 2 铺板2 3 2 3 3 转染2 3 2 4 荧光活性测定2 4 2 5n o r t h e r nb l o t 2 5 3 结果与分析2 6 3 1s i r n a 错配容忍模式由碱基所处位置决定2 6 3 2s i r n a 各位点单碱基错配容忍图谱2 8 3 3 设计等位基因特异性s i r n a 3 2 4 总1 2 ；3 5 参考文献3 6 致谢4 0 附j 录4l 附录l 主要实验试剂及仪器。4 l 附录2 实验所用靶位点片断序列4 3 5 浙江理工大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1r n a i 的研究历史及概况 1 9 9 0 年，j o r g e n s e n 1 】将合成粉红色素酶的相关基因通过转基因方法导入牵牛花 内，目的是加重牵牛花的粉红色。实验结果相反，浅红色的花朵没有加重，反而开出 了白色的花朵。深入研究得知，导入的外源色素酶基因并没有表达为粉红色素。相反 地，外源基因抑制了牵牛花相关色素基因的正常表达。这种由外源基因的导入造成的 基因表达抑制现象最初被确认是发生在转录后水平，所以被称为“转录后基因沉默” ( p o s tt r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) ，也称为“共抑制 ( c o s u p p r e s s i o n ) 。 r n a 干扰( i 矾ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 这一说法是在研究线虫时提出的【2 5 1 。1 9 9 5 年， g u o 等【2 】将线虫基因的反义r n a 注入线虫体内，以此来抑制该基因并研究其功能。将 被研究基因m r n a 的反义r n a 注入到线虫体内，该反义r n a 明显抑制了m r n a 的 正常翻译，被研究基因的表达受到抑制；令人费解的是，当他将正义r n a ，即与被研 究基因m r n a 相同的r n a 注入到线虫体内时，得到的结果竟然与反义r n a 相同， 两者同样可以抑制目的基因的表达。 s e n s er n a ，- - - a n t i s e n s er n a 嘛 w i l dt y p ew i l dt y p e d o u b l e - s t r a n d e dr n a 翟霍 n 图1 - 1 在线虫生殖腺注射单链和双链u n c - 2 2r n a 后引起的表型变化i 引。u n e - 2 2 基因编码肌原纤 维蛋白，基因活性减弱可以引起线虫剧烈的抽搐运动。注射单链r n a 未引起线虫表型变化。注射 双链的u r i c 2 2r n a 后，线虫抽搐剧烈。 f i g u r e1 - 1p h e n o t y p i ce f f e c ta f t e ri n j e c t i o no fs i n g l e - s t r a n d e do rd o u b l e - s t r a n d e du r i c - 2 2r n a i n t o l ，5 3 1 9 9 8 年，f i r e 等【4 】对这一现象进行了深入的研究，实验发现导入反义和正义的 r n a 均能抑制基因表达。但相比而言，直接导入双链r n a ( d s r n a ) 能够更强烈地抑制 目的基因表达。如图1 1 所示，在线虫生殖腺注射单链和双链u n c 2 2r n a ，双链r n a 引起的线虫抽搐现象更为显著。图1 2 显示，在线虫生殖腺注射双链的m e x - 3r n a 比 注射单链的反义m e x - 3r n a 引起的表型变化更明显。这种由d s r n a 介导的特定基因 表达抑制现象被称为r n a i 现象。 从上述实验结果可以发现p t g s 和r n a i 具有相同的本质，均可称为“转录后r n a 沉默 。因此“r n a i ”、“p t g s ”、“c o s u p p r e s s i o n 和“r n as i l e n c i n g 几乎是同义词。 但由于长期以来对线虫r n a i 的研究较为深入彻底，r n a i 成为转录后基因沉默的代名 词。紧接着更多的实验发现在果蝇、拟南芥等地等生物以及大小鼠等哺乳动物和人体 浙江理工大学硕士学位论文 内都存在着r n a i 现象【5 1 。越来越多的研究表明r n a i 是真核生物中一种普遍存在的现 象，与真核细胞内重要新陈代谢过程紧密相关嘲。 1 2r n a i 的作用机制 早期的实验认为r n a i 的作用机制主要是降解或者抑制内源m r n a 3 1 ，越来越多 的研究表明，r n a i 不仅仅是降解或抑制这一种作用方式。w a s s e n e g g e r 等7 】认为在植 物中，d s r n a 可引发基因组内靶基因区域甲基化。在果蝇和真菌体内，r n a i 现象还 可以通过改变染色质的结构而影响基因的表达【8 】o 图l - 3r n a i 细胞内处理机制。鲫。( 1 ) d i c e r 酶和r i s c 复合物降解外源性的病毒r n a 。( 2 ) 转座子和 d n a 重复序列转录本消除。( 3 ) 细胞内小r n a 介导的蛋白合成抑制。( 4 ) r n a i 介导的转录后抑制。 3 5 3 浙江理工大学硕士学位论文 ( 5 ) 外源性s i r n a 导入细胞内产生的转录后抑制。 f i g u r e1 - 3c e l l u l a rp r o c e s s e sd e p e n d e n to nt h er n a im a c h i n e r y l 3 1 t h ed i c e ra n dr i s cc o m p l e x e s p l a yac e n t r a lr o l ei nt h ed e s t r u c t i o no fi n v a d i n gv i r a lr n a ( 1 ) ，t h ee l i m i n a t i o no ft r a n s c r i p t sf r o m m o b i l ee l e m e n t s ( t r a n s p o s o n s ) a n dr e p e t i t i v ed n a ( 2 ) ，t h eb l o c ko fp r o t e i ns y n t h e s i sb r o u g h ta b o u t b ys m a l lr n a sg e n e r a t e dw i t h i nt h ec e l l ( 3 ) ，a n dt h er n a i m e d i a t e ds u p p r e s s i o no ft r a n s c r i p t i o n ( 4 ) t h em a c h i n e r yi sa l s ou t i l i z e dw h e ns i r n ai si n t r o d u c e di n t ot h ec e l le x p e r i m e n t a l l yt oi n h i b i t t h ea c t i v i t yo fs p e c i f i cg e n e s ( 5 ) t h ef i g u r ei ss c h e m a t i c ，a n dt h ed i c e ra n dr i s cc o m p l e x e sc a n v a r yd e p e n d e n to uc e l l u l a rp r o c e s s 图1 3 简要说明了r n a i 在细胞内的生成及作用机制。s i r n a 来源于外源r n a 、 病毒r n a 或转座子重复序列。与s i r n a 功能相似的m i c r o r n a ( m i r n a ) 由内源性基因 经d i c e r 酶剪切生成。生成后的s i r n a 或m i r n a 在细胞质内与r n a 诱导的沉默复合 物( r n ai n d u c e ds i l e n c ec o m p l e x ，r i s c ) 结合并识别靶位点。s i r n a 或m i r n a 与靶 m r n a 结合后可抑制m r n a 翻译，或降解m r n a ，或改变细胞染色质的结构从而抑 制m r n a 转录 1 2 1 转录后沉默机制 h a m m o n d 等【9 j 将d s r n a 注入果蝇胚胎的细胞溶解物内，m r n a 的稳定性明显下 降，降解速度加快。实验证明，从r n a i 诱导的果蝇细胞系中分离出来的效应物，具 有使m r n a 降解的能力。 f i r e 等【4 】对沉默复合物识别底物的机制作出推测和研究，d s r n a 引发的衍生物具 有“导向”作用，能够引导r i s c 复合物接近内源靶m r n a 。2 0 0 2 年，g r e g o r y 等【1 0 】 在转基因植物中发现存在一种约2 5 n t 的r n a 。在病毒侵染的植物叶片组织提取物内 也存在约2 5 n t 的r n a ，证实都具有降解m r n a 的活性吣1 2 1 。 r n a i 的转录后沉默机制，如图1 4 所示，首先d i c e r 酶剪切d s r n a 为s i r n a 。 s i r n a 的出现是r n a i 及其他基因沉默现象的重要特征。然后，s i r n a 通过与r i s c 共同发挥作用，使沉默复合物识别并抑制或降解靶m r n a 1 0 1 。 浙江理工大学硕士学位论文 d s r n a s l r n a m r n a _ 0 一n - ， t - 图l - 4s i r n a 转录后沉默机制1 3 i 。经d i c e r 剪切生成的s i r n a 在r i s c 复合物指引下结合到靶 m r n a 上并剪切，造成m r n a 降解。 f i g u r e 1 - 4t h er n ai n t e r f e r e n c e p m c 懿s a n dt h eb i o c h e m i c a lm a c h i n e r yi n v o l v e d l 3 1 d o u b l e - s t r a n d e dr n ai sc u ti n t os h o r tp i e c e s ( s i v a ) b yt h ee n d o n u c l e a s ed i c e r t h ea n t i s e n s e s t r a n di sl o a d e di n t ot h er i s cc o m p l e xa n dl i n k st h ec o m p l e xt ot h em r n as t r a n db yb a s e - p a i r i n g t h er i s cc o m p l e xc u t st h em r n as t r a n d ，a n dt h em r n ai ss u b s e q u e n t l yd e g r a d e d s i r n a 与a 9 0 2 蛋白结合至靶位点，降解或抑制靶m r n a 的翻译。图1 5 给出了 两种s i r n a 介导的m r n a 降解模式。这两种降解模式都是s i r n a 在a 9 0 2 蛋白的指 引下剪切m r n a 。但具体在剪切m r n a 时所处的细胞内区域以及剪切后m r n a 片断 的去向两种模式各有特点。较为公认的是s i r n a 与a 9 0 2 蛋白在细胞质内将m r n a 剪 5 ，5 3 譬国 浙江理工大学硕士学位论文 切，5 j 片断在内涵体内降解，a 9 0 2 蛋白引导3 片断在p - b o d y 内降解后重新利用( 图 1 - 5 a ) 。另一种模式认为s i r n a 与m r n a 同时进入p b o d y 并降解m r n a ( 药i - 5 b ) 。 b 三移罗一蛳一 掌 k o o 摹k _ _ - - 、一- 一- 一， o o 图1 5 由r n a i 介导的两种m r n a 降解模式3 1 。( a ) ：长双链r n a 由d i c e r 酶剪切，同时由t r b p 回收a 9 0 2 蛋白，a 9 0 2 蛋白与剪切形成的s i r n a 识别靶m r n a 。剪切后的靶m r n a5 端片断在 内涵体内降解，a 9 0 2 蛋白随3 ，端片断在p - b o d y 内降解后重新释放到细胞质内再次利用。) ：靶 m r n a 进入p - b o d y 。s i r n a 与r i s c 复合物在p - b o d y 内识别并剪切降解靶m r n a 。 f i g u r e1 - 5t w om o d e lf o rr n a i - m e d i a t e dm r n ad e g r a d a t i o n l 3 i ( a ) ：l o n gd o u b l e - s t r a n d e dr n a 6 ，s 3 浙江理工大学硕士学位论文 i sc l e a v e db yd i c e r , w h i c hr e s u l t si nt h er e c r u i t m e n to fa 9 0 2b yt r b p a 9 0 2c l e a v e st h ep a s s e n g e r s t r a n ds i r n a ，t h e na s s o c i a t e sw i t ht a r g e tm r n a o nc l e a v a g eo ft a r g e tm r n a ，t h e5 f r a g m e n ti s d e s t r o y e db yt h ee x o s o m e w h i l et h e3 f r a g m e n ti st r a n s p o r t e dt op - b o d i e st ob ed e g r a d e d b yx r n l d e g r a d a t i o no ft h e3 f r a g m e n tr e l e a s e sa 9 0 2t ot h ec y t o p l a s mt oo n c ea g a i na s s o c i a t ew i t ht a r g e t m r n a ( b ) ：m r n aa s s o c i a t e si np - b o d i e sd u et or c k , w h i c ha l l o w sa 9 0 2a n dr i s ct oa c t i v e l y s a m p l et a r g e t sf o rh y b r i d i z a t i o nw i t ht h es i r n a u p o nh y b r i d i z a t i o n ，t h et a r g e tm r n a i sc l e a v e d a n df r a g m e n t sa r ed e g r a d e da uw i t h i np - b o d i e s 1 2 2 基因组甲基化机制 r n a i 的作用方式不单表现为转录后水平的沉默( p t g s ) 。还存在另一种作用方式， 主要表现为s i r n a 与染色质作用促使靶基因启动子区域甲基化，抑制目的基因转录， 即在转录水平上将目的基因沉默( t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，t g s ) 。研究表明，t g s 不及p t g s 稳定，也不具备可遗传性【1 3 _ 15 1 。 图1 - 6r n a i 在染色体水平的沉默机制隅1 5 i 1l 翳 浙江理工大学硕士学位论文 f i g u r e1 - 6t h em e c h a n i s mo fr n a i - d e p e n d e n tc h r o m a t i ns i l e n c i n g l 3 l s l 在裂殖酵母sp o m b e 中，s i r n a 以正常常染色体基因为靶点形成异染色质。s i r n a 与形成异染色质所必需的各种因子是在聚集于着丝点配对处，改变正常染色体的构型 以此来抑制目的基因转录【1 3 - 1 4 1 。s c h r a m k e 等通过外源导入针对u r a 4 + 基因的s h r n a ， 使裂殖酵母p o m b e 中的u r a 4 + 基因沉默。在基因沉默的同时观察到异染色质的形成。 r n a i 与异染色质形成可能的作用方式如图1 - 6 所示，这个过程首先是组蛋白的赖氨酸 甲基化，然后s w i 6 结合另一个异染色质蛋白c o h e s i n 。最终所有形成异染色质的关键 组分在s i r n a 引导下于u r a 4 + 部位聚集。实验发现【i5 1 ，酵母内的小r n a 对细胞分裂 起着至关重要的作用，它促使染色体中心粒周围正常形成异染色质。可以推测r n a i 作用于异染色质并促进其聚集，从而促进细胞分裂。m o c h i z u k i 和t a v e m a 1 6 - 1 7 】对四膜 虫的研究肯定了上述假设的异染色质形成模式。 1 3r n a i 技术应用 由于r n a i 对基因的抑制作用，该技术已经快速应用于多个领域。目前r n a i 主 要集中在研究基因功能和疾病治疗两方面。 1 3 1 研究基因功能 r n a i 作为基因功能研究的一种新工具存在以下优势：操作简单，可行性高： 基因敲除技术要求对所研究的基因序列要有详细的认识比较费时费力，r n a i 能迅速 而方便地使某个基因失去功能；比反义r n a 技术和同源共抑制更有效，更容易产生 功能丧失或降低突变。 用r n a i 技术进行基因组功能研究，首先进行基因测序，然后根据序列设计相应 的s i r n a ，将各种人工设计合成的外源s i r n a 转染至个体细胞内，观察个体表型改变， 根据形态变化大致确定被抑制基因的功能。 p a d d i s o n 等【1 9 之2 1 运用r n a i 技术对生物体进行诸如细胞分裂、胚胎发育、生殖发 育等功能基因的筛选，已寻找出参与生物体发育调控的关键基因。m a e d a 等【2 3 】利用 r n a i 技术对线虫进行高通量基因功能分析，对线虫多个基因的功能有了更深入的认 识。h a r b o r t h 等【2 4 1 应用r n a i 技术筛选得到1 3 个对细胞生长分化起主要作用的功能基 因。 随着各种模式生物和人类基因组测序的完成，基因功能的研究远远落后于大量序 列所提供的信息，研究和发现基因功能成为越来越紧迫的任务。因此r n a i 技术具有 浙江理工大学硕士学位论文 的各项优点使其成为基因组学研究的强有力工具。 1 3 2 疾病治疗 r n a i 是外源性d s r n a 诱发的m r n a 水平上的基因沉默机制，这一突破性研究 开创了人类疾病治疗的新天地。目前应用r n a i 技术在病毒感染性疾病和肿瘤治疗中 的应用研究较为广泛深入。 对甲肝病毒、丙肝病毒、登革热病毒、s a r s c o v 等病毒治疗方面的研究表明， r n a i 都是一种非常有力调节病毒基因表达的工具【2 5 五7 l 。 s h a r p 掣2 s l 设计合成了针对h i v 的s i r n a ，抑制h i v 病毒的复制能力。 c d 4 是h i v 病毒识别宿主细胞内的主要受体，l e e 等【2 9 1 发现，针对c d 4 设计导 入a n t i c d 4s i i 矾a 有效地抑制了h i v 病毒的感染能力。 r n a 是生物体内最重要的物质基础之一，与d n a 和蛋白质一起构成生命的基础 框架。越来越多的研究证明，r n a 不仅仅是将遗传信息从d n a 传递给蛋白质的载体 角色，在生物体的各种生命活动调控中都发挥着不可替代的作用。r n a i 最主要的功 能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。人们对小 r n a 的深入研究必将大大推进基因功能的研究，更为各种病毒性疾病和肿瘤等疾病的 根治，开辟新的治疗途径。s i r n a 与r n a i 的研究与应用，具有极其重要的理论和实 际意义，它必将对生物学和医学的发展产生深远的影响。 1 4s i r n a 的脱靶效应 脱靶效应是指在r n a i 过程中，s i r n a 在与靶m r n a 结合并不完全配对的现象( 图 1 7 ) 。s i r n a 各碱基在与靶m r n a 发生部分错配的情况下同样起到抑制效果。 在s i r n a 发现的早期，人们认为r n a i 需要s i r n a 和靶m r n a 在序列上完全匹 配才能实现【3 0 1 。直到2 0 0 3 年，j a c k o n 等【3 l 】使用基因芯片技术研究人体细胞内s i r n a 介导的基因沉默特异性质，结果出人意料地发现不同的s i r n a 均能引起同一基因直接 沉默( 图1 8 ) ，即s i r n a 对其不完全匹配的m r n a 也具有抑制作用。 l o 5 3 浙江理工大学硕士学位论文 f i g u r e1 - 8e x p r e s s i o np r o f i l i n gr e v e a l ss i r n as e q u e n c e - s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n s l 3 l i s i x t e e nd i f f e r e n ts i r n ad u p l e x e st a r g e t e dt ot h ei g f l rc o d i n gr e g i o nw e r eu s e df o rg e n es i l e n c i n g a s t e r i s k si n d i c a t et h ei g f l rs i r n ad u p l e x e st h a tr e d u c ep r o t e i nl e v e l