（物理化学专业论文）基于植物组织的酚电化学传感器研究.pdf

中文摘要 一、基于丝瓜组织的酚电化学传感器 采用无机粘土材料l a p o n i t e 壳聚糖杂化材料固定丝瓜组织匀浆，构筑了一种检 测酚类物质的组织传感器。酚浓度的电化学检测采用安培法，丝瓜组织修饰电极控 制的电位为一o 2 v ( 相对于饱和甘汞电极s c e ) 。由于l a p o n i t e 在水溶液中容易发 生溶胀，可形成疏松多孔的结构，同时其具有化学惰性、较好的吸附能力和层间阳 离子交换能力，使得丝瓜组织成功地固定在载体材料中。构筑丝瓜组织电极的最适 参数为：l a p o n i t e c h t 的质量比为2 ：l ，固定载体与丝瓜组织匀浆体积比为l ：4 ，电 极上组织匀浆用量为5p l 。组织电极在溶液p h 5 5 、温度2 5 、工作电位一0 2 v 时 对儿茶酚表现了最好的电流响应。研究了该组织传感器对四种酚类化合物的响应特 性，结果表明：儿茶酚、苯酚具有明显的电流响应，而间甲基苯酚和对氯苯酚几乎 没有响应；固定化丝瓜组织中的多酚氧化酶对儿茶酚、苯酚的表观米氏常数胪 分别为3 4 8 m m 、2 9 0 5m m 。 二、基于马铃薯组织的儿茶酚电化学传感器 纳米碳酸钙由于具有较大的比表面积、较高的表面能、较好的生物相容性，可 作为生物分子的良好载体材料。红外光谱、扫描电镜研究表明，纳米碳酸钙壳聚 糖杂化材料能够很好地将马铃薯组织固定玻碳电极上，制成了灵敏高、选择性好的 儿茶酚传感器。该组织电极对儿茶酚表现出快速、灵敏的电流响应( 灵敏度为1 3 9 1 4 m am 。1 c m 2 ) ，而对问甲基酚、对氯苯酚、苯酚的响应非常低( 仅为儿茶酚响应的 3 以内) ，从而实现了儿茶酚的选择性测定。马铃薯组织传感器测定儿茶酚线性检 测范围为4 4 9 x 1 0 击到4 x f o m ，的，检测下限为5 x 1 0 。7 m ( 当信噪比为3 ：1 时) ，固 定化马铃薯组织中的多酚氧化酶对儿茶酚的表观米氏常数为1 0 0 5m m 。同时，本 文对组织传感器构筑和使用的最适条件进行了详细的研究。 2扬州大学硕十学位论文 三、基于蘑菇组织的酚传感器及抑制作用研究 多酚氧化酶在蘑菇中的含量很高，利用蘑菇组织可构筑高灵敏的酚类组织传感 器。本论文以l a p o n i t e 壳聚糖杂化材料为固定载体，以蘑菇组织匀浆为敏感元，在 玻碳电极上成功构筑了蘑菇组织传感器。采用红外光谱、扫描电镜对生物电极的组 成、形貌以及载体与生物材料之间的相互作用进行了研究，电化学测量采用传统的 三电极体系、计时安培方法。在优化的制作条件和使用条件下，该蘑菇组织传感器 表现出一些优异的分析特性：高的灵敏度( 对儿茶酚8 8 6 6 2m am 。c m 之) ，低的检 测限( 4 9 9 x 1 0 培m ) ，高的稳定性。该组织生物传感器对四种酚类化合物均有明显的 响应，其检测灵敏度大d , j l 顷序为：儿茶酚 苯酚 对氯苯酚 间甲基酚，对儿茶酚、 苯酚、对氯苯酚和间甲基苯酚的表观米氏常数分别为0 2 2 8 5 m m 、0 9 5 8 8 1m m 、 0 3 5 6 1 6m m 和0 2 4 8 5m m 。研究了苯甲酸对固定化蘑菇组织中多酚氧化酶的抑制作 用，结果表明该抑制作用符合竞争性的抑制模型。 陈巍林：基丁：植物组织的酚电化学传感器的研究3 a b s t r a c t 1 an o v e la m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rb a s e do ns p o n g ec u c u m b e rt i s s u e h o m o g e n a t ef o r t h ed e t e r m i n a t i o no fp h e n o l i cc o m p o u n d s - 一 ac o m p o s i t em a t r i xc o n s i s t i n go ft h ei n o r g a n i cl a p o n i t ea n dc h i t o s a n ( c h t ) w a s u s e df o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fs p o n g ec u c u m b e rt i s s u eh o m o g e n a t et of o r man o v e l b i o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fc a t e c h 0 1 a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o no fc a t e c h o lw a s e v a l u a t e db yh o l d i n gt h et i s s u e - h o m o g e n a t ee l e c t r o d ea t 一0 2 v ( v e r s u ss c e ) d u et ot h e l a p o n i t e ss p e c i a lp r o p e r t i e s ，s u c ha sh i g hp o r o s i t yd u et oe a s ys w e l l i n go fl a p o n i t ei n a q u e o u ss o l u t i o n s ，c h e m i c a li n e r t i a ，b e t t e ra d s o r p t i v i t 5a n dg o o da n i o n i ce x c h a n g e a b i l i t yb e t w e e nl a y e m ，t h es p o n g ec u c u m b e rt i s s u eh o m o g e n a t ew a sw e l li m m o b i l i z e di n t h ec o m p o s i t em a t r i x c o n s t r u c t i n gt h i st i s s u eb i o s e n s o rh a st h eo p t i m u mp a r a m e t e r s b e i n ga sf o l l o w s ：t h em a s sr a t i oo fl a p o n i t et oc h t ( w w ) w a s2 ：l ；t h ev o l u m er a t i oo f t h ei m m o b i l i z e dc a r r i e rt ot i s s u eh o m o g e n a t e ( v v ) r a t i ow a s1 ：4 ；t h et i s s u eh o m o g e n a t e a m o u n td e p o s i t e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ew a s5 9 1 t h et i s s u eb i o s e n s o rs h o w e da n o p t i m u mc u r r e n tr e s p o n s eu n d e r t h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：t h ep ho ft h ep h o s p h a t eb u f f e r s o l u t i o nw a s5 5 ，t e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e da t2 5 ( 2 ，t h ea p p l i e dp o t e n t i a lw a ss e ta t 一 0 2vt h er e s u l t sf r o mt h em e a s u r e m e n t so ff o u rp h e n o l i cc o m p o u n d sd e m o n s t r a t e d ： c a t e c h o la n dp h e n o lh a v eo b v i o u sc u r r e n tr e s p o n s e ；h o w e v e r , 1 1 0c u r r e n tr e s p o n s ew a s d e t e c t e df o rm - c r e s o la n dp - c h l o r o p h e n 0 1 a na p p a r e n tm i c h a e l i sc o n s t a n t so f p o l y p h e n o l o x i d a s ei ni m m o b i l i z e ds p o n g ec u c u m b e rt i s s u ea r e3 4 8 m ma n d2 9 0 5m mf o rc a t e c h o l a n dp h e n o l ，r e s p e c t i v e l y 4 扬州人学硕十学位论文 2 ab i o s e n s o rb a s e do np o t a t ot i s s u eh o m o g e n a t ef o rt h ed e t e r m i n a t i o n o fp h e n o l i cc o m p o u n d s t h ec a l c i u mc a r b o n a t e n a n o p a r t i c l e sh a v el a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e a ，l a g e rs u r f a c e e n e r g y , a n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , s o i ti sa g o o d i m m o b i l i z e dm a t e r i a lf o r i m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so ff t i ra n ds c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ( s e m ) i n d i c a t e dt h a tt h ep o t a t ot i s s u eh o m o g e n a t ec a nb ew e l li m m o b i l i z e d o nt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d eu s i n gl a p o n i t e c h i t o s a nc o m p o s i t e ，w h i c hf o r m e da h i g h s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yb i o s e n s o rt od e t e c tt h ec a t e c h 0 1 t h i st i s s u eb i o s e n s o rh a saf a s t a n ds e n s i t i v ec u r r e n tr e s p o n s et oc a t e c h o l ( s e n s i t i v i t yi s1 3 9 1 4m am 。1 c m 2 ) ，b u tl o w r e s p o n s et om - c r e s o l ，p h e n o l ，p - c h l o r o p h e n o l ( 1 e s st h a n3 o fc a t e c h 0 1 ) t h e r e f o r e ，t h i s b i o s e n s o rh a sag o o ds e l e c t i v i t yt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc a t e c h 0 1 t h ep o t a t ot i s s u e b i o s e n s o rp r o v i d e dal i n e a rr e s p o n s et oc a t e c h o lo v e rac o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m4 4 9 1 0 6t o4 0 0 1 0 5w i t had e t e c t i o nl i m i to f5 0 0 1 0 一ma ts no f3 t h ea p p a r e n t m i c h a e l i sc o n s t a n to ft h ee n z y m e - c a t a l y z e dr e a c t i o nf o rp o l y p h e n o lo x i d a s ef r o mp o t a t o t i s s u eh o m o g e n a t ei s1 0 0 5m m i na d d i t i o n ，w es t u d i e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h e c o n s t r u c t i o na n du s eo ft h i sp o t a t ot i s s u eb i o s e n s o ri nd e t a i l s 3 d e v e l o p m e n to f am u s h r o o mt i s s u e h o m o g e n a t eb i o s e n s o ra n d i n v e s t i g a t i o no ft h ei n h i b i t i o ne f f e c t d u et ot h eh i g hc o n t e n to fp o l y p h e n o lo x i d a s ei nm u s h r o o m ，w eb u i l tah i g h l ys e n s i t i v e b i o s e n s o rb a s e do nt h em u s h r o o mt i s s u e i nt h ew o r k ，w eh a v eu s e dt h el a p o n i t e c h i t o s o n c o m p o s i t et oi m m o b i l i z et h em u s h r o o mt i s s u eh o m o g e n a t eo nt h eg l a s s yc a r b o n e l e c t r o d et of a b r i c a t eab i o s e n s o r u s i n gt h ef t i ra n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t oc h a r a c t e r i z e t h e c o m p o s i t i o n ，t h em o r p h o l o g yo ft h el a p o n i t e c h i t o s o n c o m p o s i t e ，a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec a r r i e ra n db i o m a t c r i a l s t h ee l e c t r o c h e m i c a l m e a s u r e m e n t sw e r ep e r f o r m e dw i t hac o n v e n t i o n a lt h r e e - e l e c t r o d e s y s t e ma n d 陈巍林：基丁植物组织的酚电化学传感器的研究 5 a m p e r o m e t r i cm e t h o d u n d e ro p t i m i z a t i o no ft h ef a b r i c a t i o na n du s i n gc o n d i t i o n so ft h e b i o s e n s o r , t h i st i s s u eb i o s e n s o re x p r e s s e da ne x c e l l e n ta n a l y t i c a lp e r f o r m a n c e ：h i g h s e n s i t i v i t y ( 8 8 6 6 2m am 1 c m f o rc a t e c h 0 1 ) ，l o wd e t e c t i o nl i m i t ( 4 9 9 10 。8 m ) ，a n dg o o d s t a b i l i t y t h et i s s u eb i o s e n s o rh a so b v i o u sr e s p o n s et od if f e r e n tp h e n o l i cc o m p o u n d s ，t h e o r d _ e _ t _ o fs e n s i b i l i t yi sa s f o l l o w s ：c a t e c h o l p h e n o l p c h l o r o p h e n o l 朋c r e s 0 1 t h e a p p a r e n tm i c h a e l i sc o n s t a n t sa r e0 2 5 6 ，o 15 7 ，0 0 4 3 ，0 0 6 3a n d0 0 3 m mf o rc a t e c h o l ， p h e n o l ，p c h l o r o p h e n o la n d 聊- c r e s o l ，r e s p e c t i v e l y i nt h i sr e p o r t t h ei n h i b i t i o no f p o l y p h e n o lo x i d a s e ，a r i s i n gf r o mm u s h r o o mt i s s u e h o m o g e n a t ei m m o b i l i z e di n l a p o n i t e c h i t o s a nc o m p o s i t e ，w a si n v e s t i g a t e du s i n gb e n z o i ca c i d t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h i si n h i b i t i o ni saq u a s i r e v e r s i b l ec o m p e t i t i v et y p e 扬州大学硕十学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究 成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研 究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声 明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 幻耱揿 签字同期：沙户年厂月，矿f t 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本 人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。 学位论文作者签名：7 毫撬毋水 签字日期：砂7 口年占月i 口f i 导师签名： 签字日期：矿卜年易月c 。日 6 第一章序言 多酚氧化酶( p o l y p h e n o lo x i d a s e ，p p o ) 在动物、植物、真菌和细菌体内普遍 存在的一种金属酶 1 1 ，1 8 8 3 年y 0 曲i d 从同本的漆树汁液变硬发现其与某种活性相关， 直- 至u 1 9 3 8 年，k e i l i n d 和m a n n g 从蘑菇中提取并纯化了多酚氧化酶，将这类酶称 之p o l y p h e n o lo x i d a s e t 2 , 3 】。国外在2 0 世纪7 0 年代就已经开始对多酚氧化酶的分子结 构、细胞组织定位、生理功能以及进化过程等相关领域进行了详细的研究。我困从 2 0 世纪末才开始对部分植物的多酚氧化酶进行相关研究，前人对节果、香蕉、荔枝、 甘薯、马铃薯、茄子等植物组织o 】中多酚氧化酶的酶学特性研究表明：不同种类 或同一种类的不同品种的植物，甚至在同一品种内的不同部位的多酚氧化酶都具有 不同的物理或化学特性。 1 1 多酚氧化酶 1 1 1 多酚氧化酶的结构 多酚氧化酶是自然界广泛存在的一种铜蛋白，植物和真菌体内的多酚氧化酶是 一种含有( i i i ) 型铜中心的金属酶，这与软体动物中具有运氧功能的血蓝蛋白( h c ) 相似【1 ，它们也是这种铜蛋白己知的三种中研究的比较广泛的两种【1 2 】。铜蛋白根据 活性中心的铜主要分三类：i 型铜蛋白( 蓝铜蛋白) 、i i 型铜蛋白( 非蓝铜蛋白) 和 i i i 型铜蛋白( 没有e p r 信号) 【b 】。i 型铜蛋白是分子内发生配体与其它类型铜的电 子转移形成的，具有顺磁性以及小的超精细偶合常数；i i 型铜蛋白，在可见光谱中 没有明显的吸收，有电子顺磁共振( e p r ) 信号，顺磁性，它的分子吸光系数和超 精细偶合常数与一般的铜( i i ) 配合物相近；i i i 型铜蛋白，在3 3 0a m 附近有强的 吸收光谱，由于两个铜原子彼此呈反强磁性相互作用i l4 1 。其中i i 型和i i i 型铜蛋白形 成一个独特的三核位点去结合氧分子，并将其还原成最后的电子接受体【l5 1 。 陈巍林：基于植物组织的酚电化学传感器的研究7 1 1 2 多酚氧化酶的类型 多酚氧化酶是一种氧化还原酶( 氧化还原酶e c 1 1 4 1 8 1 ) ，一般分为两大类： 单酚氧化酶和双酚氧化酶，也可以这样分两类【1 6 】：漆酶和儿茶酚氧化酶，习惯上又 把儿茶酚氧化酶称为儿茶酚酶、酪氨酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶或甲酚酶，它与 漆酶有很明显的区别。漆酶可以催化的底物种类很多，可催化单酚、三酚、邻和对 位二酚甚至氨基酸。 如果按照酶的催化底物可以分为：酪氨酸酶，酚酶，儿茶酚氧化酶，儿茶酚酶， 单酚氧化酶，邻苯二酚氧化酶和邻酚酶【1 7 9 1 。 1 1 3 多酚氧化酶的生理作用 多酚氧化酶在脊椎动物的黑色素形成以及果蔬的褐变等生理过程中发挥着重 要的作用 2 0 - 2 1 】，该酶用铜离子作为辅助因子在有氧气情况下，参与生物体内的氧化 还原反应，将单酚羟基化成二元酚，再将二元酚氧化成醌 2 2 1 。邻苯二酚经过接下来 的一系列的酶反应和非酶反应聚合形成黑色素。尽管多酚氧化酶在真菌体内的，卜理 作用还没有完全清楚，但是黑色素的形成与尘贿系统的分化以及孢子的产生、致病 真菌的毒性和受损害后的组织保护修复有很大关系【2 ”6 1 。 在哺乳动物体内，多酚氧化酶与皮肤、眼睛、耳朵以及头发中的黑色素【2 7 瑚1 的 形成有很大的关系，从而起到保护生物体防止紫外辐射的伤害。在低等有机体内， 黑色素形成一种具有保护作用的聚合体，它们组成最基本的反应来阻止化学、辐射 以及有毒离子对生物体的伤掣2 9 1 。 多酚氧化酶在植物体内的具体作用不是很清楚，但是已有证据显示其在反对病 原体以及食草动物上起到很大作用p o j 。在高等植物体内，多酚氧化酶有防止昆虫和 微生物袭击的作用，调节受伤的创口并在受伤部位形成保护作用的痂【3 1 3 3 1 ，同时也 是叶绿体内的氧气清除剂【3 4 】，甚至在甜菜红色素的合成中也离不开多酚氧化酶的参 加3 1 。3 2 ，3 5 。3 7 1 。总之多酚氧化酶在新陈代谢中发挥了很大的作用，例如呼吸作用、中 间代谢、氧化还原反应电位的调节、抗生素作用以及创伤的愈合【1 9 】等。事实上，不 8 扬州人学硕十学位论文 管植物受到的是生物性的创伤还是非，生物性的创伤，此时植物体内的多酚氧化酶的 活性都是最大的3 8 。9 1 。 1 1 4 多酚氧化酶的分布和定位 多酚氧化酶大量的存在于植物和真菌体内1 7 - 1 9 , 4 0 。4 1 1 ，是d i 核基因编码，在细胞质 中合成，通过一定方法转运至质体内而成为具酶活性的形式【掩4 2 1 。在高等植物体内， 多酚氧化酶与类囊体膜结合在一起，大量的分布在叶绿体的类囊体膜以及其他的质 体细胞器上【4 3 1 。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究认为多酚氧化酶可能仅存在于 质体中，缺乏质体的组织或细胞就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞，虽然有质 体却任没有多酚氧化酶，但是有质体的组织可能也没有多酚氧化酶，如c 4 植物的高 粱( s o r g h u mi n t r a n s ) 微管束鞘细胞、保卫细胞和棉花( g o s s y p i u mh i r s u t u m ) 下胚轴的一 些细胞层】。其实高粱微管柬鞘细胞在发育的早期就没有多酚氧化酶活性，具体原 因还不明确。总之含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一 定在含有质体的植物组织中。 1 1 5 多酚氧化酶的分子量 不同种植物、同一植物体的不同部位以及同一部位的多酚氧化酶多基因家族的 不同，成员的分子量不同。多酚氧化酶的前体约6 0 - , , 7 1k d ，成熟多酚氧化酶约4 0 - - 6 8 k d t 4 5 1 ，已经从植物体内提取出来的大多是分子量大约在5 5 - 6 0k d a f 拓- 4 7 】，从植物体 中提取的多酚氧化酶已知的分子量有：苹果中的分子量是5 7k d a ，扁豆中的是 5 8 k d a ，马铃薯中的是5 7 6 0 k d a ，西红柿( l y c o p e r s i c o ns p ) 中的是5 7 6 2 k d a ，咖啡中 的是4 5 6 7 k d a ，鳄梨中的是5 8 5 6 6 5 k d a t 4 8 5 0 1 。 1 1 6 多酚氧化酶的诱导性和潜伏性 多酚氧化酶通常是以非活性态存在于类囊体中，它的酚底物存在于液泡中，只 有当组织损伤后这种空间隔离被打破，引起亚细胞区域化改变时才被激活，此时多 酚氧化酶才会表现出其的酶活性4 ，5 。在植物中多酚氧化酶以潜伏的状态存在，紧 陈巍林：基丁植物组织的酚电化学传感器的研究 9 密的结合在叶绿体膜上。潜伏念的多酚氧化酶通常在成熟、衰老或者胁迫的条件下， 因为膜受伤害而活化，同时会导致其活性的增强。从形成方式上来讲，可以将多酚 氧化酶分为两种：组成型多酚氧化酶和诱导型多酚氧化酶。其中组成型的多酚氧化 酶在植物细胞内本身存在的，不需要靠诱导来形成【5 2 。5 3 1 。而诱导型的多酚氧化酶需 要经过某些诱是因素的诱导才能形成，这些诱导因素有外界病原物( 真菌细菌的感 染) 、生理胁迫、机械损伤、信号分子( 如水杨酸、茉莉酸甲酯币i i c a m p ) 【4 】，甚至 周围受伤害和虫害的植物所释放的物质【5 4 , 5 5 】等，这些因素可以诱导多酚氧化酶的表 达或者增加它的m r n a 的稳定性。 植物中的潜伏态的多酚氧化酶可以因尿素、脂肪酸、去垢剂1 5 6 】、胰岛素、蛋 白酶【5 7 瑚】、胰液烈5 9 1 和酸碱性变化【删等刺激而活化。这些因素一般是通过增溶作用， 同工酶的互变，修饰作用( 分子间二硫桥的作用) ，糖基化作用，结合酚类配糖物 1 6 1 - 6 2 1 ，去除多酚氧化酶结合的抑制子f 6 3 】，酶蛋白的水解 删等来改变酶构象从而达到 活化潜伏念的多酚氧化酶。几乎所有活化因素对多酚氧化酶的活化都是通过采用不 同的方法来解除对酶的活化中心的屏蔽来实现的。 1 1 7 多酚氧化酶的研究意义 多酚氧化酶在有氧的情况下，能将单酚催化氧化成邻苯二酚( 甲酚酶单酚酶的 活性e c 1 1 4 1 8 1 ) ，接下来邻苯二酚继续氧化成相应的醌( 儿茶酚双酚酶的活性 e c 1 1 0 3 1 ) 6 5 - 6 8 】。这引起了研究多酚氧化酶活性的兴趣，研究认为多酚氧化酶可 以运用到l d o p a 的合成上，合成可以代替儿茶酚和l d o p a 的产物去协助帕金森综 合症的治疗【6 9 7 1 1 。有些邻酚类的衍生物可以作为很好的化学试剂应用，以及药物合 成的引物7 2 1 。同时多酚氧化酶在含有酚类化合物的废水的处理上发挥很大的作用 【7 3 】 o 考虑到高选择性、连续性以及操作简单等优势条件，生物传感器就拥有检测化 合物独一无二的优势。尤其是基于多酚氧化酶的生物传感器，全面的体现了检测酚 的多种好处。由于多酚氧化酶是在有氧条件将酚催化氧化成邻醌，所以基于电化学 检测方法的各种生物传感器可以分两种：第一种是检测实验中氧的消耗1 7 4 - 7 6 】，第二 l o 扬州大学硕十学位论文 种是直接或间接检测产生还原态的邻醌【7 7 - 9 0 。后一种转换模型体现的主要优势在 于，在很低的酚浓度下可以增强生物传感器的灵敏度。后者在酶学氧化和电化学还 原之间循环，随着安培电流法检测酚的出现，这样就产生了安培电流传感器【9 l 】。 1 2 生物传感器的简介 传感技术是当今社会科学技术飞速发展的一个重要标志，它与通讯技术、计算 机技术并称为现代信息产业的三大支柱【9 2 1 。而生物传感器就是近几十年来发展起来 的一种新的传感器技术，它是多学科交叉渗透的一门高新技术，它是一种将生物敏 感元件( 固定化的生物分子) 的专一性与一个信号转换与测量器件相结合的分析装 置【9 3 1 。经过3 0 余年的不断发展，由于生物传感器的选择性好、灵敏度高、分析速度 快、成本较低、操作简单、携带方便以及可在线监测等特剧9 4 1 ，在生物、医学、环 境监测、航空航天、食品分析、药物分析以及军事等领域得到广阔的应用。目前围 内外已成功研制开发了检测激素、抗生素、农药的几种生物传感器，有的甚至已经 普及y t 9 5 1 。 1 2 1 生物传感器的工作原理以及基本组成 生物传感器与各种传统的物理和化学传感器的最大区别在于它的感受器中含 有生命物质。当待测物质进入生物活性单元( 如酶、细胞、d n a 、抗体、抗原等生 物膜) ，经过分子识别后，发生生物催化反应，产生的信息被相应的物理或化学换 能器转变成可定量处理的信号( 如电、声、光等) ，再经二次仪表放大并输出，从 而得出被分析物的信息【9 2 , 9 6 - 9 7 】。 生物传感器主要由两大部分组成：一部分是对被检测分子有识别能力的元件 ( 也就是敏感元) ，是将生物体的成份( 酶、抗原、抗体、d n a 、激素) 或生物体本 身( 细胞、细胞器、组织) 固定化在一器件上而得到；另一部分是信号转换器( 或 称为换能器) ，是将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成 可测量信号的装置，按照测量信号主要有电化学、场效应晶体管、热敏电阻、声波、 光纤等装置。当待测物与敏感元发生特异性作用后，所产生的物理或化学变化，通 陈巍林：基于植物组织的酚电化学传感器的研究i i 过信号转换器变为可以检测的电信号、光信号、声信号等，根据所测量的信号大小 与被测物浓度之间的线性关系，达到被测物分析检测的目的【9 8 1 。 1 2 2 生物传感器的分类以及特点 根据生物传感器中生物分子识别元件上的生物活性物质的类别可分为：酶传感 器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、d n a 传感器、细胞及细胞器传感器【叫： 根据生物传感器的信号转化器的不同可分为：电化学生物传感器、半导体生物传感 器、测光型生物传感器、测热型生物传感器、测声型生物传感器及压电生物传感器 等【9 3 】；除了上述的分类方法外，生物传感器还可以根据所监测的物理量、化学量或 者生物量来命名，如光传感器、热传感器、胰岛素传感器等，或者根据它们的用途 统称为免疫传感器、药物传感器等【蚓。 与传统的分析方法相比，生物传感器具有如下优点：( 1 ) 选择性好，由于生物 催化反应的特异性，使得生物传感器表现了良好的选择性，因而样品不需预处理， 测定时一般不需另加其它试剂。( 2 ) 生物传感器的体积小、便于携带。( 3 ) 响应 速度快、样品用量很少，同时且由于敏感元被固定化的，因而可以反复多次使用， 节约了生物试剂的用量，降低了成本。( 4 ) 生物传感器的成本测量较低，远低于 大型的分析仪器，同时可实现连续现场检测，因而可以推广【1 洲。( 5 ) 测量的准确 度较高，相对误差一般可达到l 以内。 1 3 生物活性物质的元件化 将识别特定化学物质的生物材料与转换器巧妙的组合一起就可以构成生物传 感器，但是这类生物材料大部分都是水溶性的，让其形成能再使用的元件形态才可 以。就是能有效保持生物材料活性的元件化方法，所采用的此方法也就是所谓的固 化方法【1 0 。元件方法大约有以下几种方法。 ( 1 ) 直接化学结合法：将电极表面用化学处理、修饰，再将生物功能物质以共价 【1 0 2 1 、配位等方式结合固定于转换器上。 ( 2 ) 架桥化固定方法：用多功能试剂( 如戊二醛) 与蛋白质分子相互结合，起着 1 2 扬州大学硕十学位论文 桥梁作用，将其固定在转换器上。 ( 3 ) 吸附法：在转换器上修饰上一层高分子材料、无机材料或生物材料，然后将 生物功能物质吸附在修饰膜上，制备成感应膜。 ( 4 ) 包埋法：将高分子材料与生物功能材料混合制各成感应膜j 再把它覆盖到转 换器上，就可以构成生物传感器了。也可以用电聚合高分子来固定，将簟钵和生物 功能物质同时混合于电解液，通电后单体在转换器表面聚合成高分子膜，从而将生 物活性物质包埋在生物膜中【1 0 3 1 洲。、 ( 5 ) 分子自组装固定方法：在电极表面，先修饰一层化合物，再通过分子问引力 进行自组装构成单分子层，然后通过自组装方法将生物活性物质和媒介体一层层的 修饰上去，组成传感器。 ( 6 ) 碳糊固定法：将生物活性物质用石蜡等溶剂调匀，加入石墨粉调制成糊状， 填充到玻璃管罩即可制备成碳糊电极【m 5 0 6 。 1 4 组织传感器 组织传感器是将动植物的组织、细胞固定在载体材料上，从而作为敏感元的生 物传感器【1 0 7 1 ，它利用天然组织中的酶的催化作用f 奶】，勘同组织内的其它生物分子 共同参与反应。组织是生物体内已经分化的细胞群，组织细胞内的酶的种类会比微 生物细胞内的酶的种类少，所以组织传感器的选择性有可能比微生物传感器要高 1 0 s o 1 9 7 8 年r e c h n i t z 矛u 用牛肝的组织切片成功地构筑了第一个动物组织传感器( 1 吲。 1 9 8 1 年k u r i y a m a 和r e c h n i t z 等首次成功的研究出第一个植物组织传感器，将南瓜 组织薄片与二氧化碳电极结合起来可以检测l - 谷氨酸0 1 。后来s m i t 等用黄瓜叶与 二氧化碳电极来测定l 半胱氨酸1 1 ，a m o l e d 用央克豆与氨电极组成测定尿素的植 物组织传感器【1 1 2 1 。 1 4 1 组织传感器的独特优点 组织传感器一般可以视为酶传感器的一种衍生物，其基本工作原理仍然是固定 陈巍林：基丁植物组织的酚电化学传感器的研究1 3 在组织中的酶催化反应，但它与酶传感器相比，具有一些独特的优点：( 1 ) 提出了一 种新的理念，即用自然界中的物质本身探测自然1 0 7 】；( 2 ) 省去了酶传感器中酶的分 离提取等复杂的过程，制作简单，价格低廉，使用寿命相对而言还比较的长；( 3 ) 还可以用于酶催化途径不清楚的体系上【1 1 3 】；( 4 ) 重建酶时，不需要额外添加辅助因 子【1 1 4 6 1 ，因为组织中时常含盔辅酶等物质和其他必须的生物成分。 1 4 2 植物组织传感器与动物组织传感器的区别 植物组织传感器和动物组织传感器虽然都具备组织传感器的普通特征，但是它 们之间的区别还是较明显的，大约表现为以下几点【m 7 】： ( 1 ) 植物组织中的酶多在植物的非木质部，该部位纤维脆弱易于切片；而动物组 织制样相对困难。 ( 2 ) 植物组织一般在4 或者室温的环境下保存，这主要是要避免在植物组织内 形成大冰晶而丧失活性，动物组织通常在2 5 的低温贮存。 ( 3 ) 组织中生物活性物质的含量不同。一般情况下，动物组织内所含的酶浓度比 植物组织要高，所以动物组织的切片较薄，而植物组织切片相对的较厚。 ( 4 ) 动物组织处理比较烦琐，植物组织前处理比较简单，但植物生长有季节性， 所以对植物组织的取材有了一定的限制。 1 4 3 组织传感器的缺陷 虽然组织传感器在过去几十年的时间罩取得了可喜的成就，呈现出广阔的发展 前景。但从整体上说，传统的传感器的研究还存在以下问题：( 1 ) 选择性不好，组 织体内含有多种酶，因此选择性与纯酶传感器相比要差一些。( 2 ) 重现性需要提高， 组织传感器的敏感元受到组织的来源、保存过程等因素的影响，因此在使用组织传 感器的过程中需要随时校正。( 3 ) 使用寿命问题，需要尽可能的延长使用寿命。( 4 ) 响 应时间偏长，组织切片一般有一定的厚度，阻碍了物质的扩散，因而响应时间与一 般的纯酶制作的传感器相比要长一些。( 5 ) 机理不够明确，关于组织传感器的机理， 目前普遍认为还是基于酶学，但还不是很不深入，有待迸一步研究3 1 。 1 4 扬州人学硕十学位论文 1 5 组织传感器的元件化材料 固定化材料是生物传感器的重要组成部分，对传感器的分析性能有着很重要 的作用，固定化的生物物质的活性的保持与选择的材料和元件化方法有着直接的关 系。为了保持生物物质的活性和功能，就要求我们大力寻找高度亲水性、化学性质 稳定以及很好的生物相容性的固定材料。常用的元件化材料有无机材料、高分子材 料、生物高分子丝素蛋白、以及凝胶等f 7 】。吸附法大多数是以无机材料为载体， 例如活性炭1 18 1 、多孔玻璃1 19 1 、氧化铝【1 2 0 1 以及分子筛1 0 3 1 等。包埋法主要运用的足 天然的或合成的聚合物为主，女i n a f i o n i 】、聚丙烯酰胺1 2 2 1 、树i i 1 2 3 1 、聚乙烯醇 1 2 4 】、藻酸盐【1 2 5 1 。 本论文采用的固定化材料主要有：l a p o n i t e 、纳米碳酸钙( n a n o c a c 0 3 ) 、壳 聚糖( c h t ) ，下面主要介绍一下这三种材料的性质。 1 5 1l a p o n i t e 无机粘土材料内含有丰富的水分，因此她具有非常好的生物相容性，同时其多 孔性质为生物催化反应提供了良好的微环境【1 2 6 1 ，而无机粘土在合成时时，可以通 过控制合成条件和元素比例来调整其性能。l a p o n i t e 内含镁、锂、硅、钠等元素， 是一种无机阳离子交换粘土，分子式为： ( m 9 5 5 l i o 5 ) s i 4 0 1 0 ( o h ) 2 ( n a + o 7 3 n h 2 0 ) l a p o n i t e 的结构如图1 1 所示，由图看出：l a p o n i t e 由两层硅氧四面体之间央着 一层铝氧八面体构成晶层，四面体和八面体的顶端共享氧原子，且结构单元之间存 在静电作用。同晶形阳离子替代s i 或者a l 会使得粘土的板层问带有负电荷，需要 由反号离子来补偿，当带电层板表面积聚了反号离子后可形成扩散双电层。l a p o n i t e 吸附的反离子( 阳离子) 可以被同种类型的阳离子交换，其交换能力可以采用交换 离子的总量( c e c ，m e q 1 0 0 9 ) 来表示，该数值越大说明粘土具有较高的阳离子吸附 能力。 l a p o n i t e 粒子的平均大小是4 0n m x l on m ln m ，采用b e t 实验方法测得其比表 陈巍林：基于植物组织的酚电化学传感器的研究1 5 面积为3 5 0m 2 。l a p o n i t e 是一种溶解性能很好的无机粘土材料，它在水中能分散成 较浓的悬浮液。l a p o n i t e 在水中的浓度比较小时( 通常小于l o g1 - 1 时) ，其特有的 结构会被破坏导致分层现象，最后形成带负电的胶状悬浮液1 2 7 m 8 1 。由于l a p o n i t e 的特殊结构使其在水溶液中容易发生溶胀，从而容易产生疏松多孔的结构。这种疏 松的结构使得l a p o n i t e 具有较好的吸附能力，对大分子物质具有很强的吸附作用， 因此是非常好的固定生物分子的材料，我们实验室已采用该材料固定了多种酶，构 建了多种性能优良的生物传感器。 o o x y g e n eo rh y d r o x y l e a l u m i n i u m s i l i c i u m i n t e r n a le x c h a n g e a b l ec a t i