（环境工程专业论文）铬污染土壤微生物多样性分析及crvi还原细菌特性研究.pdf

中文摘要 摘要 我国频繁出现严重的铬污染事件，铬渣等因素造成的土壤铬污染成为环境工 作者们亟待解决的问题。相较于传统的治理方法，铬污染土壤的微生物治理方法 具有不产生二次污染，在不影响原有土壤生态环境条件下原位修复等优势，逐渐 成为研究者们所青睐的治理方法。但由于起步较晚、受土壤环境影响较大、作用 机理尚不明确等因素，技术尚未完全成熟，未得到大规模应用。 为探究铬污染土壤中，铬对微生物种群结构的影响程度及方式，同时采用 b i o l o ge c o p l a t e t m 和p c r t g g e 技术，对比分析其单一碳源利用情况和微生物物 种丰富度。此外，从污染土壤中筛选鉴定出l 株c r ( v i ) 还原能力相对较强的菌株。 在实验室中通过改变环境因子，确定出其最佳的还原条件，为该菌应用到实际工 程中提供了控制参数。最后还对1 号菌株还原物质进行了分离和处理，初步分析 其还原机理。 b i o l o ge c o p l a t e t m 和p c r - t g g e 实验结果表明：所选取的铬渣污染土壤中存 在某些还原菌，土壤生物多样性得到一定程度地恢复，但生物多样性仍低于未污 染土壤。且群落结构变化，优势种群也发生了改变。 从铬渣污染土壤中分离得到7 株c r ( v i ) 还原菌，其中1 号菌还原能力最强，其 余均能耐受一定浓度c r ( v i ) ，并将其还原。1 号菌经鉴定为革兰氏阳性杆菌， 1 6 s r d n a 鉴定结果为蜡样芽胞杆菌。该菌培养2 6 h 后进入稳定期，能维持3 0 h 左 右，有利于c r ( v i ) 还原。温度为3 5 ，p h = 5 时，c r ( v i ) 还原率最大，且在不同初 始p h 值含铬溶液中反应2 4 h 后，溶液p h 值却近于7 。其还原能力和还原速率随 细胞浓度成正相关，随溶液初始c r ( v i ) 浓度增大而降低。初始c r ( v i ) 浓度达到 5 0 0 m g l 时，1 号菌几乎丧失c r ( v i ) 还原能力。 通过s e m 观察发现，1 号菌在含有c r ( v i ) 的培养基中培养，细胞表面明显吸 附了一些物质。细胞不同组分中，胞外分泌物的c r ( v i ) 还原效果最好，最终能将溶 液中的c r ( v i ) 完全还原；细胞膜碎片次之。胞外分泌物中含有具有c r ( v i ) 还原能力 的还原酶和普通代谢产物。而胞内分泌物中其还原作用的是还原酶。细胞膜上可 能存在某些官能团，能与c r ( v i ) 发生配位反应进而减少液体中可溶性的c r ( v i ) 。1 号菌休眠体不具备c r ( v i ) 还原能力，说明该菌c r ( v 1 ) 还原过程与细菌的其他生理机 能密切相关。 关键词：铬污染，多样性，c r ( ) 还原菌，还原特性 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，s e v e r ec h r o m i u mp o l l u t i o ni n c i d e n t sh a v eo c c u r r e df r e q u e n t l yi n c h i n a t oe n v i r o n m e n tw o r k e r s ，c h r o m i u mc o n t a m i n a t e ds o i l ，c a u s e db yc h r o m i u m r e s i d u ea n do t h e rf a c t e r s b e c o m eap r o b l e mt ob es o l v e d c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a l m a n a g e m e n tm e t h o d ，b i o r e m e d i a t i o no fc h r o m i u mc o n t a m i n a t e ds o i lw i t h n os e c o n d a r y p o l l u t i o n ，a n dw i t hi ns i t ur e m e d i a t i o nw h i c hd o e sn o ta f f e c tt h eo r i g i n a ls o i le c o l o g i c a l e n v i r o n m e n tc o n d i t i o n s ，h a sg r a d u a l l yb e c a m et h et r e a t m e n ta p p r o a c h e sf a v o r e db yt h e r e s e a r c h e r s h o w e v e r , d u et os t a r tl a t e l y , i m p a c to ns o i le n v i r o n m e n t ，a n du n c l e a ro f t h e a c t i o nm e c h a n i s me c t ，t h et e c h n o l o g yi sn o ty e tf u l l ym a t u r e ，a n dl a r g e s c a l e a p p l i c a t i o n s t oe x p l o r et h ee x t e n ta n dm a n n e rc o m i n gf r o mc h r o m i u m o nm i c r o b i a lc o m m u n i t y s t r u c t u r ei nt h ec h r o m i u mc o n t a m i n a t e ds o i l ，c o m p a r a t i v ea n a l y s i st h es i n g l ec a r b o n s o u r c eu t i l i z a t i o na n dm i c r o b i a ls p e c i e sr i c h n e s st h r o u g hu t i l i z i n g t h e b i o l o g e c o p l a t e t ma n dp c r t g g et e c h o n o l o g i e s i na d d i t i o n ，ac r ( v i ) r e d u c t i o nb a c t e r i a w h i c hh a sr e l a t i v e l yh i g hr e d u c t i o na b i l i t yw a si s o l a t e da n di d e n t i f i e d f o rp r o v i d i n gt h e c o n t r o lp a r a m e t e r si np r a c t i c a le n g i n e e r i n ga p p l i c a t i o n ，g e tt h eo p t i m u mr e d u c t i o n c o n d i t i o n si nt h el a bt h r o u g hc h a n g i n ge n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s f i n a l l y , t h er e d u c i n g s u b s t a n c e so fn o 1s t r a i nw a ss e p a r a t e da n dp r o c e s s e d ，a n dp r e l i m i n a r ya n a l y s eo ft h e r e d u c t i o nm e c h a n i s mw a sd o n e b i o l o ge c o p l a t e t ma n dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) - t g g ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o wt h a t ：t h e r ea r es o m er e d u c i n gb a c t e r i ai nt h es e l e c t i o no fc h r o m i u mr e s i d u e c o n t a m i n a t e ds o i l a l t h o u g ht h eb i o d i v e r s i t yo fc h r o m i u mr e s i d u ec o n t a m i n a t e ds o i lh a d g e tb a c kac e r t a i ne x t e n t ，b i o d i v e r s i t yi s s t i l ll e s st h a nn o tc o n t a m i n a t e ds o i l w h a t 、s m o r et h ec o m m u n i t ys t r u c t u r ea n da d v a n t a g ep o p u l a t i o n sh a v ea l s oc h a n g e d 7r e d u c i o nb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mc h r o m i u mr e s i d u ec o n t a m i n a t e ds o i l ， a m o g n gt h e m ，t h er e d u c t i o na b i l i t yo f n o 1s t r a i nw a ss t r o n g e s ，a n dt h er e s tc a nt o l e r a t e a n dr e d u c tac e r t a i nc o n c e n t r a t i o no fc r ( v l ：) t h en o 1s t r a i nw a sg r a m p o s i t i v e b a c t e r i a ，a n d16 s r d n ai d e n t i f i c a t i o nr e s u l t sd e m o n s t r a t e di tw a sb a c i l l u sc e r e u s t h e n o 1s t r a i ne n t e rs t a t i o n a r yp h a s ea f t e rc u l t u r e d2 6 ha n dm a i n t a i n3 0 h ，w h i c hw a s b e n e f i tt ot h ec o n d u c to fh e x a v a l e n tc h r o m i u mr e d u c t i o nr e a c t i o n w h e nt e m p e r a t u r ei s 3 5c e n t i g r a d ea n dp hi s5 ，t h er e d u c t i o nr a t eo fc r ( v i ) g e tm a x m u m m o s ti m p o r t a n to f a l l ，p hv a l u en e a r7a f t e r2 4 hi nd e f f e r e n ti n i t i a lp ho ft h ec h r o m i u m c o n t a i n i n g 1 l l 重庆大学硕士学位论文 s o l u t i o n t h er e d u c t i o nr a t eo f n o 1s t r a i ni sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o fc e l l s ，w h i l ei tr e d u c e 诵t ht h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fc r ( v i ) w h e ni n i t i a lc r ( v i ) c o n c e n t r a t i o ng e t5 0 0m g l ，t h en o 1s t r a i nl o s sc r ( v i ) t h er e d u c t i o na b i l i t y o b s e r v e db ys e m ，t h ec e l ls u r f a c eo fn o 1s t r a i nw a s s i g n i f i c a n t l ya b s o r b e ds o m e s u b s t a n c e si nt h e c u l t u r ec o n t a i n i n gc r ( v i ) t h er e d u c t i o na b i l i t yc o m p a r e dt h ed i f f e r e n t c o m p o n e n t so ft h ec e l l ，t h ee x t r a c e l l u l a rs e c r e t i o ni sb e s t ，w h i c hw a sa b l et or e d u c t c r ( y i ) c o m p l e t e l yr e s t o r e ；f o l l o w e db ym e m b r a n ef r a g m e n t s f u r t h e re x p e r i m e n t sf o u n d t h a te x t r a c e l l u l a rs e c r e t i o nc o n t a i ns o m eo fc r ( v i ) r e d u c t a s ea n dm e t a b o l i t e s w h i l e i n t r a c e l l u l a rs e c r e t i o nr e d u c t i o ni sr e d u c t a s e i na d d i t i o n t h e r em a yb es o m ef u n c t i o n a l g r o u p so nt h ec e l lm e m b r a n e ，a n dt h e yi n v o l v e di nc o o r d i n a t i o nr e a c t i o nw i t hc r ( v i ) ， a n dt h e nr e d u c es o l u b l ec r ( v i ) i nl i q u i d t h ed o r m a n c yb o d yo fn o 1s t r a i nd o e sn o t h a v et h ea b i l i t yo fc r ( v i ) r e d u c t i o n ，i n d i c a t i n gt h a t t h eb a c t e r i ad o e sn o th a v ea n i n d e p e n d e n td e f e n s es y s t e ma n dc r ( v i ) r e d u c t i o np r o c e s si sc l o s e l yr e l a t e dt oo t h e r p h y s i o l o g i c a ，1f u n c t i o n so fb a c t e r i a k e y w o r d s ：c h r o m ep o l l u t i o n ，d i v e r s i t y , c r ( v i ) r e d u c i n gb a c t e r i a ， r e s t o r ec h a r a c t e r i s t i c s i v 1绪论 1 绪论 1 1 研究背景 土壤与大气、水并列为人类环境的三大要素，几乎所有的污染都会进入土壤【l 】。 在工业革命以后，随着自然界中铬的人为输入( 如铬被广泛的应用在铬镀、抗氧 化合金( 如不锈钢) 、皮革制造和染色等行业领域中) ，这种富集效应快速增加。 目前，我国重金属污染正由大气、水体向土壤污染转移，而土壤的污染势必导致 大气和水体污染的进一步加剧，所以我国的土壤重金属污染己进入一个“集中多 发期”，其程度已经影响到耕地质量、食品安全甚至人的身体健康【2 】。近年来，国 内报道的多起重金属污染事件，使得学者们对重金属污染及污染的治理给与了高 度的重视。2 0 1 1 年，云南曲靖一化工厂发生铬污染致数万立方水水质变差、牲畜 接连死亡。铬渣及铬渣堆放引起的土壤铬污染已经成为环境研究者亟待解决的问 题。 土壤重金属污染是指由于人类活动，土壤中的微量有害元素在土壤中的含量超 过背景值，过量沉积，进而引起的含量过高现象。污染土壤的重金属主要包括汞 ( h g ) 、镉( c d ) 、铅( p b ) 、铬( c r ) 和类金属砷( a s ) 等生物毒性显著的元素，以及有一 定毒性的锌( z n ) 、铜( c u ) 、镍( n i ) 、锡( s n ) 、钒( v ) 等元素。这种沉积的源头可能来 源于工业废弃物的堆放、污水厂污泥的排放、垃圾填埋产渗滤液向土壤中的渗透、 农作物化肥不合理的施加及水体或大气中含重金属微粒沉降等【3 】。 1 2 铬污染现状及危害 1 2 1 铬元素及铬污染 铬( c r ) ，原子序数2 4 ，原子量5 1 9 9 6 1 ，在地壳中的丰度为0 0 1 1 ，居第1 7 位。自然界中不存在游离态的铬，排除人类活动的作用，铬元素主要由岩石风化 而在土壤中堆积，在自然环境中铬通常以两种稳定价态存在，即c r ( i i i ) 和c r ( v i ) ， 有时会有中间态c r ( i v ) 矛ic r ( v ) 出现，但它们极不稳定【4 】。土壤中的c r ( v i ) 主要以 c r 0 4 2 + 和h c r 0 4 + 形式存在。c r ( i i i ) 以c r 3 + 、c r ( o h ) 2 + 、c r ( o h ) 2 + 、c r ( o h ) 3 、c r ( o h ) 4 。、 c r ( o h ) 5 2 - 形式存在。 铬污染主要是指由工业活动引起的c r ( v i ) 大量排放造成的水体或土壤污染。 污染土壤中的铬来源有：铬盐生产排放的铬渣引起堆放处周围土壤污染；大 气沉降引起的土壤铬污染，其来源是能源、冶金、运输和建筑材料生产产生 的粉尘；利用制革、冶金、电镀等行业污染排放的污水灌溉引起的土壤铬污 染；农药化肥的使用1 5j 。环境中的c r ( i i i ) - l - 5c r ( v i ) 会互相转化，所以近年来国内 重庆大学硕士学位论文 标准更倾向于限定土壤中铬的总含量，而不仅仅只是测定c r ( v i ) 含量。 1 2 2 铬的毒性机理 铬的毒性与其存在形式有关，通常认为金属铬毒性最小，c r ( i i i ) 毒性很低，而 c r ( v i ) 毒性最大。因为人体吸收途径不同，例如人体胃肠道对c r ( i i i ) 的吸收为1 左右，对c r ( v i ) 的吸收是c r ( i i i ) 的3 5 倍【6 i 。同时，c r ( v i ) 的生物毒性约比c r ( i i i ) 要高1 0 0 0 倍，是强致突变物质，美国的环境保护机构( u s e p a ) 已将其认定为是 严重危害人类健康的17 种化学物质之一f ”。相比较而言，营养学家认为c r ( i i i ) 作 为胰岛素的催化剂，是人体重要的微量元素之一。虽然这种说法还在存在争议， 但是，目前的实验证明酶或者辅酶中没有c r ( i i i ) 可以结合的生物分子【8 】。因此，与 c r ( i i i ) 相比，c r ( v i ) 更易渗入细胞，而后在细胞内还原为c r ( i i i ) 而构成终致癌物， 故其毒性大于c r ( i i i ) 。 i 广1 l l l i ：i ； ； il t c 知2 一 未- e 黼椭c o m p k s 搽昨x e s 曲基蛐k a n d c a r b o h y d r a t e s 。2 - h y d r o x y a c i d sp e p t i d e s ，u n d 玉b i o l o g i c a j c o n 肇l e 熄s ：嬲嚣嚣型文嗍蝣舱s 加m c )c r ( v ) + c r ( v ) 写生c 州i ) + c r ( t y ) c r ( r v ) + c r ( i v ) 一c 哙，) + c r ( n d 黧纛n a d ( p ) h 互n a d ( p ) c r ( v ) 4 - c r ) * c k v l ) + c r ( 1 1 1 ) c r ( v i ) + c r ( 1 1 ) - c r ( v ) + c r ( m ) ( e ) 燃h 2 0 2 + s s ：0 + h 2 0 p e r o x i d e s o f a m i n o a d d s - r o o h + s ，s = o + r o h p r o t e i n s a n dl i p i d s h y p o c h l o r i t e c i o 一+ s 。s = o + c l 一 然缫j r = f e v = 0 + s s = o + f e h f o 雌o f + s _ 啼 + ” m e t a “o e n z y 惴旅o + s s ：o + m o - o 、o w h e r es i sas u b s t r a t e ) ( a ：c r 的氧化还原反应；b ：各种氧化态的稳定复合体；c ：c r 各价态间可能的反应； d ：主要的还原物质；e ：主要的氧化性物质) 图1 1c r ( v i ) 在生物系统中的氧化还原反应 f i g1 1 a no v e r v i e wo fc r ( v i ) r e d o xc h e m i s t r yi nb i o l o g i c a ls y s t e m s 2 + 工 妊骚 1 绪论 c r ( v i ) 对细胞产生毒性的机理目前还未有明确的定论。有的学者认为，对人类 而言，c r ( v i ) 可以在胎盘上积累，削弱婴儿在母体内的成长1 7 j 。因为铬进入生物体 后，极易同一些大分子物质结合，导致其失去活性，如酶的活性中心、蛋白 质上的巯基、核酸上的碱基等，最终导致生物体病变或死亡。同时，铬进入 生物体后不易随代谢排除，会在生物体内积累，并和金属巯蛋白、类金属巯 蛋白、甘氨酸、牛磺酸等结合，产生对微生物有毒害作用的物质或使这些蛋 白质失活5 1 。 研究人员认为，c r ( v i ) 毒性与氧自由基机制有关【3 l ：需氧生物在将0 2 还原到 h 2 0 的过程中，会产生氧自由基( 0 2 - - ) ，它本身具有毒性并能生成其它毒性物质， 如过氧化氢和羟基自由基( 0 h 一) 等。c r ( v i ) 进入细胞后可能发生各种歧化反应或 归中反应，最终被还原成c r ( i i i ) 复合物，其在生物体内可能的相互转化过程及相应 的氧化还原物质如图1 1 所示。在细胞中免疫反应和氧化还原反应信号传输过程中 会形成h 2 0 2 ，或有些酶系统也能产生h 2 0 2 ，在中性水溶液中若周围存在h 2 0 2 的 情况下，c r ( i i i ) 复合物可以被氧化成c r ( v i ) ，或某些c r ( i i i ) 复合物的氧化反应会导 致具有遗传毒性的c r ( v ) 中间体被稳定化。因而这种c r ( i i i ) 复合物+ h 2 0 2 系统将对 d n a 和蛋白质造成广泛的氧化损伤1 8 j 。其次，膜内脂质双分子层中的不饱和脂肪 酸链容易因过氧化作用而分解，造成整体膜的破坏，致使膜透性增大，离子漏失。 b肋蚓cs 舱s + d n a - i 9 0 b s r t e r a a n k d s b c i n d i r ( 1 l ( n ) - g - d n a 文石1 h 2 0 c r ( v ) l 扣v ， c r ( i v 卜d n a c r ( 1 。，卜。n a 二! ! 。曼芝h 三。n a 旦z 。c “卜。n a 一0 0 拍删哟 h c r ( 1 1 1 ) - - d n a b l n ( ：h n a 图1 2 c r ( v i v ) 复合物对d n a 形成氧化损伤的主要途径 f i g1 2 m a i np a t l l w a y si nt h eo x i d a t i v ed n a d a m a g eb yc r ( v i v ) c o m p l e x e s a v i v a 等人认为，c r ( v i ) 的毒性属于诱发型基因毒性，它基于w e t t e r h a h n 、s 重庆大学硕士学位论文 的摄取还原模型。这个模型中关键的因素是：1 ) 可溶性铬酸盐通过阴离：子通道， 或不可溶的化合物( 如p b c r 0 4 ) 通过吞噬作用，使得c r ( v i ) 通过主动运输进入细 胞中；2 ) c r ( v i ) 在细胞内的还原形成能够损伤d n a 的c r ( v ) 或c r ( i v ) 中间体形式， 或；阿机化合物基团形式；3 ) 转化成不易移动的形式，包括高遗传毒性的 d n a c r ( i i i ) p r o t e i n 或d n a c r ( i i i ) d n a 交叉链；4 ) c r ( v i ) 在细胞表面还原形成相 对稳定的c r ( v ) 附着在糖蛋白骨架上【8 】。d n a 的损害包括：单键断裂、无碱基位 点、c r ( i i i ) d n a 交叉链路，这些结果被认为是暴露在c r ( v i ) 环境中细胞致癌的主 要因素。在c r ( v i ) + 还原剂+ 0 2 或c r ( i i i ) 复合体+ h 2 0 2 系统中，带有过氧或超过氧 配体的c r ( v i v ) 复合体很有可能是导致d n a 损伤的活性物质，因为c r ( v d 不能直 接与分离的d n a 反应。c r ( v i v ) 复合体更偏向于直接与d n a 反应，一部分可能 的反应途径如图1 2 所示。 s i l v e r 等人发现，c r ( v i ) 通过细胞膜上的硫酸盐运输渠道被摄取【9 】。在正常的 生理环境下，c r ( v i ) 自发的与细胞内的还原物质( 例如：抗坏血栓盐和谷胱甘肽) 发生反应，生成中间体c r ( v ) 或c r ( i v ) ，最终形成c r ( i i i ) t 1 0 1 。c r ( v ) 通过个电子 氧化还原反应循环生成c r ( v i ) 并运输氧电子。这个过程中形成的活性氧容易生成 d n a 蛋白复合体。c r ( i v ) 将与细胞物质相结合，阻止其正常的生化功能。在环境 中，c r ( v 1 ) 污染将改变土壤微生物群落结构。c r ( v i ) 进入细胞的途径如图1 3 所示。 图1 3c r ( v i ) 进入细胞的主要途径 f i g 1 3 m a i np a t h w a y so fc r ( v i ) e n t e r i n gi n t r a c e l l u l a r 通常细胞内的c r ( v i ) 禾l j 用还原剂并接受一个电子生成c r ( v ) 及大量的r o s 4 1 绪论 ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 活性氧) ，r o s 易和d n a 蛋白结合生成复合体，正是这 种r o s 使c r ( v i ) 具有了生物毒性。c r ( i i i ) ) l 乎不能渗透过细胞膜，所以c r ( v i ) 的 毒性几乎是c r ( i i i ) 毒性的1 0 0 0 倍。因为c r ( i i i ) 的不溶性促使其沉淀和去除，故将 c r ( v i ) 通过生物转化还原成c r ( i i i ) 被认为是污染水体中c r ( v i ) 的一种去除方法。 c r ( v i ) 也可以通过其他非特异性阴离子通道进入细胞，在酶和其他还原物质的 作用下还原成c r ( i i i ) 。还原型谷胱甘肽( g s h ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 是已知 的细胞内能直接影响c r ( v i ) 还原成c r ( i i i ) 的还原物质。g s h 在c r ( v i ) 还原中所扮 演的角色可能是产生d n a 损坏的媒介，也可能具有致癌作用。c r ( v i ) 减少得同时 会形成活性氧( r o s ) ，通过氧化或h a b e r w e i s s 型反应，将会导致d n a 的损伤和 脂质过氧化。通过g r 酶c r ( v i ) 直接还原成c r ( v ) q b 间体。这个反应过程中将形成 超氧化物，并导致细胞的损伤。铬减少得过程中，g r 酶的活性明显受到抑制，这 在红血球、肝细胞、造骨细胞已经得到证明。g r 受抑制将导致细胞内储藏物质中 g s h 的消耗。这种消耗的影响因素包括：c r ( v i ) 直接还原的过程中，g s h 通过氧 化形成二聚物的氧化型谷胱甘肽( g s s g ) ；与c r ( v i ) 结合形成c r - g s h 复合体；由 于g r 受抑制，g s h 形成有缺陷的g s s g 。当细胞内g s h 水平受到威胁，细胞将 会产生一个有效的适应性反应，为了尽可能的维持g s h 。这种适应性反应的成分 之一快速上调谷氨酸半胱氨酸连接酶( g c l ) 。g s h 是细胞中重要的化学保护剂， 并涉及多重细胞的信号通道i l 。 1 3 我国及发达国家对土壤中铬的控制标准 随着土壤重金属污染的加剧，世界各国对土壤铬的环境安全标准和最大浓度 做了相应规定，而我国也将土壤铬的环境质量标准分为三级( g b l 5 6 1 8 1 9 9 5 ) 【1 2 1 ， 如表1 1 和表1 2 。 表1 1我国土壤环境质量标准中总铬的限值( m g k g ) t a b l e l 1t h el i m i t e dc o n c e n t r a t i o no f t o t a lc h r o m i u ma c c o r d i n g t ot h ee n v i r o m e n t a lq u a l i t ys t a n d a r df o rs o i l ( m g k g ) 注：一级标准，为保护区域自然生态，维持自然背景的土壤环境质量的限制值；二级标准， 为保障农业生产，维护人体健康的土壤限制值；三级标准为保障农林业生产和植物正常 生长的土壤临界值。 重庆大学硕士学位论文 表1 2 一些发达国家对土壤中铬的限制浓度( m g k g ) t a b l e l 2t h el i m i t e dc o n c e n t r a t i o no f c h r o m i u mi ns o i li nl i s t e dc o u n t r i e s ( m g k g ) 由表1 2 可以看出，多数发达国家更重视土壤q b c r ( i i i ) 和c r ( v i ) 浓度的限制，相 比较而言，：我国土壤环境质量标准只对总铬的含量有明确规定。实际上，由于不 同结合态的铬对环境的生物毒性不同，总铬的含量并不能真正体现铬对环境的危 害程度。 1 4 铬污染土壤的治理方法 1 扯1 铬污染土壤的传统治理方法 对于重：金属污染土壤的治理和修复，通常采用两种方式：一是将污染物从土 壤中完全去除；一种是将土壤中污染物影响如毒性、水溶性等较大的价态，采用 物理、化学或生物方法转化成其他影响较小的价态，力求使之固定或沉淀，减小 生物可利用性，不再随自然界的循环而扩大污染范卧”】。非生物的传统治理方法 如表1 3 所示，每种方法各有利弊，但总体而言，治理方法耗资庞大，并可能造成 二次化学污染。 表1 3 传统治理方法比较 t a b l e1 3t h ec o m p a r i s o no ft r a d i t i o n a lt r e a s u r e m e n tm e t h o d s 6 1 绪论 电动修复法【1 9 】在污染土壤两侧施加直 流电压形成电场，根据 污染物所带电荷性质以 及孔隙流体流动方向， 污染物向阳极或阴极转 移，聚集在电极附近的 污染物通过电镀处理或 者抽取到地面上进行处 理，从而清洁污染土壤。 成本低，操作简单， 去除效率高，并且对 土壤结构及周围的 景观、建筑影响较 小：规模越大，它的 去除效率就越高。特 别是在水力学压力 很难推动清洗液或 菌液在土壤间隙中 流动而使得传质过 程受到很大的抑制 情况下，强化传质优 势更加明显。 易发生聚焦效应：如 果在土壤内发生p h 的突变，则向阴极迁 移的c r 3 + 离子会在 土壤中沉淀下来，除 效率受限制。 7 重庆大学硕士学位论文 1 4 2 铬污染土壤的生物法 表1 3 中的措施存在一定的缺陷和局限性，都未能成为较为理想的土壤铬污染 治理措施。国内外研究人员开始倾向于寻找在不破坏土壤生态环境、且能保持土 壤结构的情况下，原位治理重金属污染的新途径。生物治理法来修复铬污染土壤， 其优点在于：生物修复法具有安全、费用低廉等优点。近二十年来，逐渐成为科研 工作者们所j 苛昧的治理手段。常用的生物修复铬污染方法如表1 4 所示。 表1 4 生物修复铬污染土壤方法列举 t a b l e1 4b i o r e m e d i a t i o nm e t h o d so fc h r o m i u mc o n t a m i n a t e ds o i l 1 5 微生物修复铬污染土壤研究现状 1 5 1 微生物解毒c r ( v i ) 的作用机理 目前，微生物去除c r ( v i ) 的作用机理大致可分为两种，生物吸附法和生物还 原法。用微生物吸附法去除环境中c r ( v i ) ，主要应用于废水中c r ( v i ) 的去除，而 应用于去除土壤中c r ( v i ) 的研究较少。 微生物还原c r ( v i ) 是一个复杂的生物化学过程，通常伴经过多种还原途径。 目前，关于微生物还原c r ( v i ) 的机理大致有两种：一是间接还原，即代谢产物还 1 绪论 原反应，是指通过微生物的代谢产物还原c r ( v i ) 川。二是直接还原，即酶促还原， 是指微生物通过自身的生理活动直接将c r ( v i ) 还原为c r ( i i i ) e 引。其还原机理根据菌 种好氧与否有所不同。 好氧菌还原c r ( v i ) 机理 在氧气存在条件下，细菌的c r ( v i ) 还原通常都会经过2 到3 步，在生成稳定 的终产物c r ( i i i ) 之前，c r ( v i ) 还原成中间物质c r ( v ) 或者c r ( i v ) 。到目前尚不清楚， c r ( v ) 还原成c r ( i v ) 以及c r ( i v ) 还原成c r ( i i i ) 是自发反应还是酶进行调节。生物体 储备的n a d h 、d a d p h 和电子作为c r ( v i ) 还原反应的电子供体【7 】。 最早报道的c r ( v i ) 还原酶来源于假单胞菌【2 。i s h i b a s h i 等人从p s p u t i d a p r s 2 0 0 0 菌株中纯化得到可溶性的c r ( v i ) 还原酶【2 引。s u z u k i 等人所得到的c r ( v i ) 还原酶来源于p s a m b i g u ag 1 。研究表明，这些还原酶的基因编码与v i b r i oh a r v e y i k c t c2 7 2 0 菌的硝基还原酶表现出同源的核苷酸序列( 5 8 ) 。p a r k 等人从风 p u t i d am k l 菌中分离出可溶性c r ( v i ) 还原酶c h r r 。c h r r 密码基因c h r r 来源于n p u t i d am k l 菌的基因组f 。a c k e r l e y 等人认为，c h r r 是一种二聚体结构的黄素蛋 白，在7 0 摄氏度时能催化c r ( v i ) 还原。y i e f 来源于e s c h e r i c h i ac o l i ，具有一个开放 的阅读框，位于e c o l i 染色体上没有特定的功能的片段部位，它与c h r r 有较高的 同源性。这些基因被克隆，并且编码的蛋白y i e f 在3 5 温度小对c r ( v i ) 的还原性 达到最大。a c k e r l e y 等人对c h r r 和y e i f 酶促还原反应进行比较发现，还原酶催 化c r ( v i ) 存在两种模式，即单电子传递和双电子传递。c r ( v i ) 通过还原酶c h r r ， 接受一个电子将c r ( v i ) 还原成中间产物c r ( v ) ，接着再和还原过程相应的辅酶上得 到两个电子生成c r ( i i i ) ，中间有c r ( i v ) 矛 1c r ( v ) 生成。虽然一些c r ( v ) 自发的再氧 化生成r o s ，但c r ( v i ) 的减少是通过c h r r 减少生成两个有害自由基的机会来促进 的【2 3 1 。 另一种模式是双电子传递：n a d h 得到4 个电子，y i e f 酶促进c r ( v i ) 直接还 原成c r ( i i i ) ，其中三个电子被c r ( v i ) 还原消耗，还有一个电子传递给活性氧自由基 r o s 。在c r ( v i ) 还原过程中由y i e f 生成的r o s 数量最少，因此它被认为是在c r ( v i ) 还原过程中比c h r r 更有效的还原酶。从b m e g a t e r i u mt k w 3 菌中分离的得到的 与膜相连的c r ( v i ) 还原酶以n a d h 作为电子供体，但其还原c r ( v i ) 的机理尚不清 楚。图1 4 说明在有氧条件下c r ( v i ) 的酶还原机理1 7 j 。 厌氧茵还原c r ( v i ) 机理 硫酸盐还原菌( s r b ) 在重金属还原领域得到广泛应用，其中也包括其对c r ( v i ) 的还原。例如：l o v l e y 等发现，9 v u l g a r i s 的c r ( v i ) 还原反应与可溶性细胞色素 c 3 有关。对于d e s u l f o m i c r o b i u mn o r v e g i c u m 菌，氢化酶( h y d r o g e n a s e ) 和细胞色 素c 可促进c r ( v i ) 还原。d e s u l f o t o m a c u l u mr e d u c e n sm i 1 也能利用c r ( v i ) 作为唯 重庆大学硕士学位论文 一的电子受体，最终将其还原。 c a r b o h y d r a t e s p r o t e i n s 。f a to f 地 图1 4 有氧和缺氧条件下c r ( v i ) 还原酶作用机理 f i g1 4 p l a u s i b l em e c h a n i s m so fe n z y m a t i cc r ( v i ) r e d u c t i o nu n d e ra e r o b i ca n da n a e r o b i c 可溶性酶和与细胞膜上的酶在厌氧条件下都能够控制c r ( v i ) 还原反应。与好 氧条件下分离得到的c r ( v i ) 还原酶不同，厌氧条件下c r ( v i ) 还原酶的活性与其无 所不在的电子传递系统有关，这种系统能够促进电子在呼吸链( r e s p i r a t o r yc h a i n s ) 上的传递。同时，c r ( v i ) 厌氧还原酶机理与细胞色素( 如细胞色素b 和细胞色素c ) 有密切关系。厌氧生物在c r ( v i ) 还原反应中的应用，使得原位生物转化c r ( v i ) 方 法变得很有潜力，因为只需要补充营养物质和调整物理环境就可以促进c r ( v i ) 还 原反应的发生。 w i e l i n g a ，等人发现，厌氧菌的物质新陈代谢产物，如s r b 生成的h 2 s ，在缺 氧环境下，是有效的c r ( v i ) 还原剂【2 4 1 。w a n g 和s h e n 认为，c r ( v i ) 的厌氧还原是 一种偶然的过程，并且对微生物的生长没有提供能量。但t c b o 和o b r a z t s o v a 后续 分离得到的一株s r b 菌