（微生物学专业论文）gordona+terrae+c6中苯并噻吩脱硫基因的克隆及功能鉴定.pdf

舢j 川j | j j | j j j j 川删 17 9 8 0 6 8 c l o n i n g a n df u n c t i o n a li d e n t i f i c a t i o n o fb e n z o t h i o ph e n e - d e s u l f u r i z i n gg e n e nj ，1-j，、， i r o m “o r d o n at e r r a ec i j i b y l is h a n s h a n s u p e r v i s e db y p r o f e s s o rl i ur u 1 i n c o l l e g eo f l i f es c i e n c e s ，n a n k a iu n i v e r s i t y ， t i a n j i n ，3 0 0 0 71 ，p r c h i n a m a y ，2 0 0 8 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：李彻明严 5 0 0 莎，年箩月) 锣日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在卿与年解密后适用 本授权书。 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： l 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) ! 秘密一i - l o 年( 最长l o 年，可少于1 0 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 二。? ，i 。，? ，i ? 一一一，。? i 。，。 一 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：硷毋鄙分 d d 罗年岁月够日 摘要 摘要 油品燃烧时，其中的硫化物转变成硫氧化物，形成酸雨污染环境。柴油中 含有各种有机硫化物，其中有些用传统的物理化学脱硫方法很难去除，如二苯 并噻吩( d b t ) 、苯并噻吩( b t ) 及其衍生物。对生物脱硫( b d s ) 的研究主要以d b t 为模式化合物。相对来说，对b t 的降解机理及基因的研究较少。 将d b t 脱硫菌株r h o d o c o s s u se r y t h r o p o l i sd s 3 的d s z a 、d s z b 、d s z c 和d s z a b c 基因分别转入b t 脱硫菌株g o r d o n at e r r a ec 6 中，构建了工程菌株g t e r r a ed r a 、 g t e r r a ed r b 、g t e r r a ed r c 和g t e r r a ed r a b c 。其中g t e r r a ed r a 和g t e r r a e d r b 在以d b t 为唯一硫源的培养基中几乎不生长，无法降解d b t ；而g t e r r a e d r c 同表达完整d b t 脱硫酶的g t e r r a ed r a b c - - 样，在以d b t 为唯一硫源的培 养基中生长良好，亦能降解大部分d b t ( 8 4 ) 。这表明催化b t 和d b t 前两步 脱硫反应的b t 单加氧酶和d b t 单加氧酶是负责底物识别的关键酶，催化b t 和 d b t 后两步脱硫反应的酶功能相似。r h o d o c o s s u se r y t h r o p o l i sd s 一3 中的d b t 脱硫 基因与g o r d o n at e r r a ec 6 中的b t 脱硫基因具有较高的同源性。 应用兼并p c r 技术等方法从戈登氏菌g o r d o n at e r r a ec 一6 中克隆了b t 脱硫 酶基因b d s a 、b d s b 和b d s c 。其中，b d s a 与d s z a 的同源性为9 9 ( 1 3 6 3 1 3 6 6 ) ； b d s b 与d s z b 的同源性为9 9 ( 1 0 9 2 1 0 9 8 ) ；b d s c 与d s z c 的同源性为9 8 ( 1 2 3 9 1 2 5 4 ) 。b d s a 、b d s b 和b d s c 的模拟三维结构分析表明，b d s a 与d s z a 、 b d s b 与d s z b 的三维结构基本一致，其功能可能相似。b d s c 与d s z c 的三维结 构有一定的差别，它可能是整个途径中用于识别底物的关键酶。 将b d s a b c 分别转入大肠杆菌中进行表达，b d s a 、b d s b 和b d s c 分子量分 别为4 8 k d 、3 8 k d 和4 5 k d 与氨基酸分析结果一致。在大肠杆菌中共表达d s z x 和b d s ( a b c x ) ( 净a 、或b 、或c 、或a b 、或b c 、或a c 、或a b c ) 以检测相 应酶在功能上的互补性。结果同样证明了b d s a 与d s z a 、b d s b 与d s z b 的功能 可能相似。b d s c 与d s z c 可能是整个途径中用于识别底物的关键酶。 利用红球菌一大肠杆菌穿梭载体p r h k l 将b t 降解菌g o r d o n at e r r a ec 6 的脱 硫基因b d s a 、b d s b 、b d s c 和b d s a b c 分别转入d b t 降解菌r e r y t h r o p o l i sd s 一3 中， 构建了工程菌株r e r y t h r o p o l i sc r a 、r e r y t h r o p o l i sc r b 、r e r y t h r o p o l i sc r c 和 摘要 尼e r y t h r o p o l i sc r a b c 。其中，足e r y t h r o p o l i sc r c 和兄e r y t h r o p o l i sc r a b c 能以 b t 为硫源生长，其他菌株无法利用b t 。在抗生素的选择压力下，传代1 0 次后重 组质粒p r c c 仍能拙e r y t h r o p o l i sd s 3 中稳定存在；而在g o r d i n at e r r a ec 6 中传 代6 次后就逐渐丢失。可见，尼e r y t h r o p o l i sc r c 的稳定性高于g t e r r a ed r c ，对 于以后的应用有更大的潜力。 关键词：生物脱硫b d s a b c 二苯并噻吩苯并噻吩 i i a b s t r a c t a b s t r a c t s u l kc o m p o u n d si no i la r er e l e a s e da ss u l f u ro x y a c i d sd u r i n gc o m b u s t i o na n dc a u s e e n v i r o n m e n t a lp r o b l e m ss u c ha sa c i dr a i n d i e s e lo i lc o n t a i n sv a r i o u so r g a n o s u l f u r c o m p o u n d s ，8 0 m eo fw h i c hh a v eb e e nr e p o r t e dt ob ed i f f i c u l tt or e m o v eb yt h e c o n v e n t i o n a lp h y s i c o c h e m i c a ld e s u l f u r i z i n gm e t h o d ，i n c l u d i n gd i b e n z o t h i o p h e n e ( d b t ) ，b e n z o t h i o p h e n e ( b t ) a n dt h e i rd e r i v a t e s m o s tr e s e a r c ho nb i o l o g i c a l d e s u l f u r i z a t i o ns y s t e m s ( b d s ) u s e sd b to ra l k y l d b t sa st h em o d e lc o m p o u n d i n c o n t r a s t ，l i t t l ei sk n o w na b o u tb t - d e s u l f u r i z i n gb a c t e r i a t h ed b t d e s u l f u r i z i n gg e n e ，d s z a ，d s z b ，d s z ca n dd s z a b c ，c l o n e df r o m r h o d o c o s s u s e r y t h r o p o l 如d s - 3 w e r ei n t r o d u c e di n t o b t - d e s u l f u r i z i n g s t r a i n g o r d o n at e r r a ec - 6t oc o n s t r u c tr e c o m b i n e ds t r a i n sg t e r r a ed r a ，g t e r r a ed r b ， g t e r r a ed r ca n dg t e r r a ed r a b c g t e r r a ed i 乙a n dg t e r r a ed r bc a nn o t l i v ew i t hd b ta st h es o l es u l f u rs o u r c e ；n e v e r t h e l e s s ，g t e r r a ed r cc a nd e s u l f u r i z e 8 4 d b ta sg t e r r a ed r a b cw i t hc o m p l e t ed b t d e s u l f u r i z i n gg e n e t h cr e s u l t s s h o w e dt h a td b t m o n o x y g e n a s ea n db tm o n o x y g e n a s e ，c a t a l y z e dt h ef i r s tt w os t e p s o fd b ta n db to x i d a t i o n ，r e s p e c t i v e l y , w e r et h ek e ye n z y m e sr e s p o n s i b l ef o r s u b s t r a t e - r e c o g n i t i o n ，h o w e v e r , t h ee n z y m e sc a t a l y z e dt h el a s tt w os t e p sh a dt h e s i m i l a rs u b s t r a t es p e c i f i l i t y b d s a 、b d s ba n db d s cf r o mb t - d e s u l f u r i z i n gs t r a i ng o r d o n at e r r a ec - 6w e r e c l o n e db yd e g e n e r a t ep c r t h eh o m o l o g yb e t w e e nb d s aa n dd s z a ，b d s ba n dd s z b ， b d s ca n dd s z cw e r e9 9 ( 1 3 6 3 1 3 6 6 ) ，9 9 ( 1 0 9 2 1 0 9 8 ) ，9 8 ( 1 2 3 9 1 2 5 4 ) ， r e s p e c t i v e l y t h ea n a l y s i so fp r e d i c t e d3 ds t r u c t r u eo fb d s a b d s ba n db d s cs h y w e d t h a tt h e r em a y b et h es a m ef u n c t i o nb e t w e e nb d s aa n dd s z a ，b d s ba n dd s z b ，w h i c h h a ds i m i l a r3 ds t r u c t u r e ；b d s ca n db d s c ，w h i c hh a dd i f f e r e n t3 ds t r u c t u r e ，w e r et h e k e ye n z y m e sr e s p o n s i b l ef o rs u b s t r a t e - r e c o g n i t i o n 功eb d s a b cw a se x p r e s s e di n 应c o l i r e s p e c t i v e l y 功em o l e c u l a rw e i g h to f b d s a ，b d s ba n db d s cw a s4 8 k d ，38 k da n d4 5 k d ，r e s p e c t i v e l y , a c c o r d i n gw i t ht h e r e s u l to ft h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea n a l y s i s d s z xa n db d s ( a b c - x ) ( x = a ，o rb ，o rc ， i i i a b s t r a c t o ra b ，o rb c ，o ra c ，o ra b c ) w e r ec 0 一e x p r e s s e di nec o l it od e t e r m i n et h e f u n c t i o n a la s s o c i a t i o no fr e l e v a n tf f l l z y m e 1 1 1 er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r em a y b et h e s a m ef u n c t i o nb e t w e e nb d s aa n dc l s z 八，b d s ba n dd s z b ；b d s ca n dd s z cw e l et h ek e y e l l l z y m e sr e s p o n s i b l ef o rs u b s t r a t e - r e c o g n i t i o n t h cb d s a b cw a si n t r o d u c e di n t o 足e r y t h r o p o l i sd s 一3r e s p e c t i v e l yt oc o n s t r u c t t h er e c o m b i n a n ts t r a i n 足e r y t h r o p o l i sc r a ，尼e r y t h r o p o l i sc i m ，r e r y t h r o p o l i s c r ca n d 足e r y t h r o p o l i sc r a b cb yt h er h o d o c o c c u s - e c o l is h u t t l ev e c t o r , p r h k l t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 尼e r y t h r o p o l i sc r ca n dr e r y t h r o p o l i sc r a b c c o u l dg r o w w i mb ta st h es o l es u l f u rs o u r c e ，n o tr e r y t h r o p o l i sc r aa n dr e r y t h r o p o l i sc r b w i t l lt h es e l e c t i o np r e s s u r eo fa n t i b i o t i c s ，r e c o m b i n a n tp l a s m i dp r c cc o u l de x i s t s t a b l yi n 尼e r y t h r o p o l i sd s 一3a f t e r10g e n e r a t i o n s ，w h i c hw a sl o n g e rt h a nt h el o s t a f t e r6g e n e r a t i o n si ng o r d o n at e r r a ec - 6 k e y w o r d s ： b i o d e s u l f u r i z a l i o n ( b d s ) b d s a b c b e n z o t h i o p h e n e( b t ) d i b e n z o t h i o p h e n e ( d b t ) i v 目录 目录 第一章前言1 第一节燃料油脱硫的必要性。l 1 1 1 化石燃料中的含硫化合物1 1 1 2 燃料油的含硫量标准4 第二节燃料油脱硫的方法5 1 2 i 加氢脱硫( h y d r o - d e s u l f u r i z a t i o n ，l i d s ) 5 1 2 2 非加氢脱硫工艺( n o n h y d r o d e s u l f u r i z a t i o n ，n h d s ) 6 第三节生物脱硫的原理及研究进展7 1 3 1d b t s 的生物脱硫原理及研究进展7 1 3 2b t 的生物脱硫原理11 第四节生物脱硫的分子生物学进展1 2 1 4 14 s 途径脱硫酶的酶学特征1 2 1 4 2b t 脱硫途径的相关酶一1 5 第五节b d s 的可行性和经济性1 5 第五节研究目的及内容1 6 1 5 1 研究目的及意义1 6 l ，5 2 技术路线1 7 第二章b t 与d b t 脱硫酶的功能互补性分析1 8 第一节引言18 第二节实验材料1 8 2 2 1 菌株18 2 2 2 质粒1 9 2 2 3 培养基19 2 2 4 主要仪器一2 0 v 目录 第三节实验方法2 0 2 3 1 抗生素的配制2 0 2 3 2 红球菌基因组d n a 的提取和纯化2 0 2 3 3 聚合酶链式反应2 2 2 3 4d n a 的酶切与连接2 4 2 3 5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化2 4 2 3 6 大肠杆菌质粒的提取。2 5 2 3 7 戈登氏菌感受态的制备2 6 2 3 8 工程菌脱硫活性分析2 7 第四节结果与讨论2 8 2 4 1 红球菌基因组d n a 的提取2 8 2 4 2 戈登氏菌中表达载体的构建2 9 2 4 3 戈登氏菌感受态的制备及电转化。3 l 2 4 4 重组质粒p r d y 在戈登氏菌中的表达及活性分析3 2 第五节本章小结3 6 第三章b t 脱硫基因的克隆及序列分析3 7 第一节引言3 7 第二节实验材料3 7 3 2 1 菌株3 7 3 2 2 质粒3 8 3 2 3 培养基一3 8 3 2 4 主要试剂3 9 3 2 5 主要仪器3 9 第三节实验方法4 0 3 3 1 戈登氏菌基冈组d n a 的提取和纯化4 0 3 3 2 聚合酶链式反应、连接、转化4 l 第四节实验结果4 2 3 4 1g o r d o n at e r r a ec 6 基因组d n a 的提取4 2 v i 目录 3 4 2 以d s z a b c 的引物克隆b d a a b c 4 2 3 4 3b d a 基因保守序列的克隆4 3 3 4 4l 序列的扩增4 6 3 4 5b d s b 的克隆4 7 3 4 6 兼并引物p c r 技术扩增胁a 基因。5 0 3 4 7 兼并引物p c r 技术扩增b d s c 基因。5 3 3 4 8b d s a b c 全长的扩增5 6 3 4 9b d s a 的保守性分析和三维结构预测5 6 3 4 1 0b d s b 的保守性分析和三维结构预测5 7 3 4 1 lb d s c 的保守性分析和三维结构预测5 9 第五节本章小结6 1 第四章b t 、d b t 脱硫基因在大肠杆菌中的表达及功能分析6 3 第一节引言6 3 第二节实验材料6 3 4 2 1 菌株6 3 4 2 2 质粒一6 4 4 2 3 培养基6 5 4 2 4 主要试剂。6 6 4 2 5 主要仪器6 6 第三节实验方法6 6 4 3 1 聚合酶链式反应、d n a 的酶切、连接与转化6 6 4 3 2 克隆基冈的表达6 7 第四节结果与讨论6 9 4 4 1r e r y t h r o p o l i sd s 一3 中d b t 脱硫酶基冈的克隆及表达6 9 4 4 2g o r d i n at e r r a ec 6 中b t 脱硫基因的克隆与表达7 2 4 4 3d s z 与b d s 在大肠杆菌中的共表达及功能互补性分析7 4 第五节本章小结7 6 第五章高效脱硫菌株的构建7 7 v i i 目录 第一节引言7 7 第二节实验材料一7 7 5 2 1 菌株。7 7 5 2 2 质粒7 8 5 2 3 培养基。7 8 5 2 4 主要仪器。7 9 第三节实验方法7 9 5 3 1 聚合酶链式反应、d n a 的酶切和连接7 9 5 3 2 大肠杆菌感受态的制备、转化及质粒的提取7 9 5 3 3 红球菌感受态的制备8 0 5 3 。4 工程菌脱硫活性分析8l 第四节结果与讨论8 2 5 4 1 红球菌中表达载体的构建8 2 5 4 2 兄e r y t h r o p o l i sd s - 3 感受态的制备及电转化8 3 5 4 3 工程菌株的生长特性分析8 4 5 4 4 工程菌株无细胞抽提物酶活性分析一8 6 5 4 5 工程菌株脱硫活性分析8 6 第五节本章小结8 8 第六章结论与展望8 9 第一节结论8 9 第二节展望9 0 致谢9 l 参考文献9 2 个人简历9 9 第一章前言 第一章前言 第一节燃料油脱硫的必要性 化石燃料，亦称矿石燃料，是一种碳氢化合物或其衍生物，是除了食品以 外人类最重要的能量来源，我们生活中所需能源的8 5 来自于化石燃料。化石燃 料所包含的天然资源有煤炭、石油和天然气，其中石油占能源消费量的4 0 ，煤 炭占2 4 ，天然气占2 2 。 化石燃料中含硫化合物的燃烧形成硫氧化物，对健康、环境和经济都产生 不利的影响。在硫氧化物中，s 0 2 的数量多，并飘浮于低空大气层。而且，s 0 2 能导致硫酸盐气溶胶的形成。气溶胶颗粒的平均直径为2 5 岬，能进入肺中，导 致呼吸系统疾病【l 刁。s 0 2 还能与空气中的水反应生成酸雨或酸雾，加快历史建筑 的侵蚀；它还能转移到土壤中损害植物叶子，降低湖水的p h 值及缓冲能力，进 而危及哺乳动物( e p a ，2 0 0 6 ) 。 硫的去除对装备氮氧化物( n o x ) 催化剂的新型发动机的产生也是重要的。 因为，燃料中的硫形成的硫酸盐能毒害催化剂。硫酸盐是高度热稳定的，并能 结合还原形式的催化剂。因此，降低了还原形式n o x 在空间上的可用性，使其丧 失催化能力。 1 1 1 化石燃料中的含硫化合物 原油里的主要元素是碳和氢，分别占8 3 - 8 7 和1 l 1 4 。此外还含有少量的 硫( o 0 6 - - - 8 ) 、氮( o 0 2 1 7 ) 、氧( o 0 8 , - - - 1 8 ) 以及微量金属元素( 镍、钒、铁、 铜) 等。除碳氢外，硫是石油中最丰富的元素。高密度原油含有较多的硫化物。 馏分的沸点越高含有的硫化物就越多p ，4 j 。原油中的平均硫含量从0 0 3w t 到 7 8 9w t 。原油中的含硫化合物通常有两类：无机硫化物和有机硫化物。无机 硫化物包括单质硫、h 2 s 和f e 3 s 4 。这些化合物可以溶解或悬浮的形式存在。原油 中的有机硫化物主要是硫醇类、硫醚类、二硫化物和噻吩( 见图1 ) 。其中，芳 香化合物像二苯并噻吩( d i b e n z o t h i o p h e n e ，d b t ) 及其衍生物是最重要的组分， 因为它们的沸点高( 超过2 0 0 ) 及在常压分馏塔中难脱耐5 ，6 】。这些含硫有机化 第一章前言 合物在原油加工过程中不同程度地分布于各种馏分油中。对于汽油馏分而言， 含硫化合物以硫醇、硫化物和单环噻吩为主，其主要来源于流化床催化裂化 ( f l u i dc a t a l y t i cc r a c k e ，简称f c c ) 汽油。在f c c 汽油中存在的各种含硫化合物 见表1 1 ，苯并噻吩( b e n z o t h i o p h e n e ，s t ) 、噻吩和烷烃取代噻吩是f c c 汽油中主要 的含硫有机化合物，其中b t 占3 0 川。 r 趴h 孙卢h 8 硫醇类 r s r r 。r r s p hr 。p h 确s p h 硫醚类 r 8 s r p h s s r p h s s p h 二硫化物 7 2 睡吩 5 h 3 cc h 3 噻吩类 图l 。l 原油中的主要有机硫化物 4 。良d m d b r 表1 1f c c 汽油中硫化合物的分布及炼制油品要求 苯并噻吩( b e n z o t h i o p h e n e ，b t ) 、n o n p 、s i n g l e 3 和d i d 取代的苯并噻吩( b p 2 1 9 。c ) 是柴油中主要的噻吩化合物。佟明友等利用g c a e d 联用技术研究了不 同柴油中含硫化合物的含量、类型及分布，含硫化合物在7 种柴油中的含量及 分布如表1 2 所示。检测的7 种柴油中含硫化合物的类型主要包括硫醇、硫醚、 2 第一章前言 烷基( c 4 c d 噻吩、苯并噻吩及烷基( c l c 6 ) 苯并噻吩、二苯并噻吩及烷基( c l c o - - 苯并噻吩，其中以烷基苯并噻吩和烷基二苯并噻吩为含硫化合物的主要存 在形式【8 】。 表1 2 七种柴油中各种硫化物的含量( 单位：m g k g ) 3 第一章前言 续表1 2 七种柴油中各种硫化物的含量( 单位：m g k g ) 1 7 - d i m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e1 , 7 d m d b t 7 27 92 14 8 1 , 9 - d i m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e 1 9 - d m d b t 2 0 26 06 91 3 4 - - e t h y l 。6 - m e t h y b e n z o t h i o p h e n e 4 _ e ，6 m d b t3 5 3 2l9 044 55 5 2 ，4 ，6 - t r i m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e 2 ，4 ，6 - 1 m d b t5 37 62 4 6 5 75 5 4 0 2 ，4 ，8 - t r i m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e2 4 ，8 - 1 m d b t - 1 2 83 5 7 6 07 58 2 1 , 4 。6 - t d m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e1 , 4 ，d b t 一 3 22 9 44 25 4 1 , 4 , 7 - t r i m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e1 , 4 7 删d b t l33 7 一 - 2 2 l ，3 ，7 - t r i m e t h y l d i b e n z o t h i o p h e n e1 , 3 ，7 t m d b t 1 68 51 9 5 1 52 ll o u n k n o w n t o t a la m o u n t 4 4500000 7 8 7 88 8 6 91 1 7 1 05 6 3 66 4 4 97 6 4 11 2 6 1 1 1 2 燃料油的含硫量标准 石油的大量开采和使用对环境造成的污染日益受到关注，针对燃油所制定 的环境标准越来越严格，其中含硫量是主要限制指标之一。由于s 0 2 是以气体的 形式通过气流传播的，因此一个地方产生的s 0 2 能危及几千公里外的其他地区。 因此，控制的s 0 2 排放需要国际间的合作。自从1 9 7 9 年，加拿大，美国和部分欧 洲国家签署了几个协议以降低并监测s 0 2 的排放。大部分协议都是针对运输用燃 料，因为它是s 0 2 排放的主要来源。1 9 9 3 年，美国颁布大气清洁法正式禁止含硫 量高于5 0 0m g k g 的柴油的销售和供应。1 9 9 8 年，欧盟设定目标，2 0 0 0 年柴油的 硫含量不超过3 5 0m g k g ，从2 0 0 5 年开始，不超过5 0m 眺g 【9 】。加拿大和美国也 相继出台了相似的法令以减少柴油和汽油中的硫含量。新的硫含量控制规则于 2 0 0 6 年7 月1 日在加拿大和美国施行，道路用柴油和汽油的硫含量分别从5 0 0 m g k g 和3 5 0m g k g 降到了15m g k g 和3 0m g k g t o l 。美国2 0 10 年柴油中的最大硫含 量将是l om g k g 【i 。 1 9 9 8 年，我国柴油的含硫量标准为：优级品不大于2 0 0 0m 眺g ，一级品不大 于5 0 0 0m g k 誊眩】。2 0 0 5 年我国生产的汽油、柴油要达到欧洲i i 类燃油标准，即汽 油的含硫量小于8 0 0m g k g ；柴油的含硫量小于5 0 0m g k g 。目前，世界主要国家 的车用柴油含硫量的标准均在5 0 0m e e x g 以下，未来将降至5 0m e c k g 以下。我国 中石化集团提出从2 0 0 3 年起在北京、上海和广州三大城市供应符合欧洲i i 类标准 的柴油，要求其含硫量小于3 0 0m g l ( g 。 4 第一章前言 第二节燃料油脱硫的方法 总的来说，有两种不同的方法用于降低硫氧化物的排放：燃烧前处理和燃 烧后处理。燃烧前处理比燃烧后处理具有更多的优点。废气处理可以使用燃烧 后处理的方法。然而这种方法是针对热的腐蚀性的流体，而且成本较高。对每 步处理的废气进行质量监测也较困难。而且，这种方法具有局限性，并不能处 理所有的样品。另一方面，无论之后进行何种形式的燃烧，化石燃料燃烧前处 理都能降低硫氧化物的排放。由于处理程序并不是很多，质量监测也更容易【l3 ，1 4 1 。 因此，目前主要采用的脱硫方法是燃烧前处理。 1 2 1 加氢脱硫( h y d r o - d e s u l f u r i z a t i o n ，h d s ) 一般来说，从化石燃料中脱除有机硫是困难的，因为只有某种化学键断裂 的时候，硫原子才能从有机分子中分离。这些化学键的断裂需要高温和高压。 目前一种对柴油中间馏分脱硫的工艺是加氢脱硫( h d s ) 。在h d s 中，硫化物 中硫原子在氢气存在下c o m o a 1 2 0 3 和n i m o a 1 2 0 3 催化下形成h 2 s 。h 2 s 再被空气 氧化成单质硫。根据烃的类型及脱硫程度，h d s 可以在2 0 0 - - 一4 2 5 和1 5 0 , - - - - 2 5 0p s i h 2 进行。为了达到低硫含量( 0 5m m ) 及其衍生物， 如2 ，27 d h b p 和2 ，3 d h b p 是h p b s i 的竞争性抑制剂，k i 值分别为0 2 8 ，2 ， o 4m m 8 9 1 。 最近关于d s z b 晶体的报道揭示了它的折叠结果( e c3 1 3 1 3 ) 。半胱氨酸 修饰剂和联苯中的羟基能抑制d s z b 。d s z b 的大小约为6 0 x 5 0 x 4 0a ，单体，椭 圆形，属于磷酸结合蛋白。活性位点包括c y s 和一个甘油分子。甘油主要负责 酶蛋白的稳定性。l e e 等即】描述了d s z b 的高级结构及可能的催化机制。 1 4 1 4d s z d d s z d 或黄素还原酶协同单加氧酶作用，r e r y t h r o p o l i s 中存在一种辅助蛋白， d s z d ，以n a d h 为还原剂将f m n 还原为f m n h 2 。体外、体内研究都表明d s z d 辅 助d s z c 和d s z a 发挥活性【8 5 射】。其它非r e r y t h r o p o l i s 来源的黄素还原酶也可以辅 助d s z c 和d s z a 发挥活性【8 4 , 9 2 。通过测定d s z d 氮末端序列获得了其编码的碱基序 列，舭e r y t h r o p o l i si g t s 8 中克隆- - j d s z d 基斟8 5 川。该基因位于r e r y t h r o p o l i s i g t s 8 的染色体上而不是像d s z a b c - - 样位于1 2 0 k b 的质粒上，它编码一个大约 2 0 k d a 的蛋白。插入失活该基因，宿主不但损失了黄素还原酶的活性，还损失了 d b t 脱硫能力。然而，对细菌在其它硫源中的生长没有影响。说明细菌没有其 它生理上必须d s z d 功能的地方。d s z d 缺陷型可以通过表达d s z d 基因恢复。过量 1 4 第一章前言 表达d s z d 或者其它黄素还原酶可以提高r e r y t h r o p o l i s ，e s c h e r i c h i ac o h 正9 3 】和 p s e u d o m o n a s 9 2 1 的脱硫速率。因此，在体内的脱硫反应中提供还原型黄素步骤也 是一个限速步骤。m c f a r l a n d 的研究表明：足e r y t h r o p o l i si g t s 8 的t h c e 也参与到 脱硫中；然而，t h c e 缺失株仍然具有脱硫活性，说明这种蛋白不是直接起作用m 。 1 4 2b t 脱硫途径的相关酶 目前，国内外还没有对b t 脱硫途径相关酶的酶学特征及编码基因的报道， 这一领域尚属空白。 第五节b d s 的可行性和经济性 有机硫化物可分为两类：能被h d s 脱除的和h d s 难以脱除的。为了达到 越来越低的含硫量标准，难熔硫也要被除去。h d s 可以除去难熔硫，但成本极 高，且需要高温高压。随着对燃料需求的逐年增加，残余的石油均为含硫量高 的粘胶性质，增加了脱硫的成本，迫切需要发展温和条件下的有效脱硫方法。 它能降低成本，节约脱硫过程中的能量消耗，产生的污染物质少。微生物脱硫 是一种极具潜力的途径，对h d s 处理过的燃料进行进一步处理