（食品科学专业论文）红曲霉产色素相关基因的克隆及功能研究.pdf

i l i i iiii ii ii i i i iii iiiii y 1812 6 8 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 保辐 如需保密，解密时间 立口口罗年力月；o 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：矸左香 时间：w 年妓月为日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名： 导师签名：j 溉触 签名日期： 年月 日 签名日期：2 们钇年似月夕日 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i i 缩略语表v i 第一章文献综述l 1 红曲霉研究1 1 1 红曲霉的重要代谢产物1 1 1 1 红曲色素l 1 1 2 莫内可啉k 3 1 1 3y 氨基丁酸4 1 1 4 其它代谢产物4 1 2 红曲霉的分子生物学研究5 1 2 1 红曲霉的分类5 1 2 2 红曲霉基因文库的构建一6 1 2 3 红曲霉遗传转化方法的研究6 1 2 4 红曲霉功能基因的研究7 2 真菌功能基因的研究方法及其应用8 2 1 基因、基因组与功能基因组学8 2 2 基因的功能及其研究内容：9 2 3 基因功能的研究策略9 2 3 1 正向遗传学策略9 2 3 2 反向遗传学策略1 0 2 4 基因功能的研究方法1 0 2 4 1 理化诱变方法1 0 2 4 2 限制性内切酶介导的整合技术l o 2 4 3 转座子标签技术1l 2 4 4 原生质体转化1 l 2 4 5 基因敲除1 2 2 4 6r n a 干涉：1 2 2 4 7 农杆菌介导的t - d n a 转化技术：1 3 2 5 其它方法17 2 5 1 生物信息学在研究基因功能中的应用1 7 2 5 2 表达序列标签l7 2 5 3 基凶表达连续分析法18 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 2 5 4 表达谱基因芯片18 2 5 5 蛋白质组学1 9 2 6 结语19 3 本课题研究目的意义及主要研究内容1 9 3 1 研究目的与意义1 9 3 2 主要研究内容2 0 第二章红曲霉t - d n a 转化库的构建及色素突变子的性质分析2 l l 材料2 1 1 1 菌种21 1 2 主要仪器设备及试剂2 2 1 2 1 主要仪器设备2 2 1 2 2 主要试剂及配制方法2 2 1 2 3 酶及试剂盒2 3 1 3 培养基2 3 2 方法2 4 2 1 根癌农杆菌介导t - d n a 转化红曲霉的基本步骤2 4 2 1 1 红曲霉对潮霉素的敏感性实验2 4 2 1 2 红曲霉孢子的制备2 4 2 1 3 根癌农杆菌的活化及诱导培养2 4 2 1 4 红曲霉孢子与根癌农杆菌的共培养2 4 2 1 5 转化子的筛选2 5 2 2 转化子的性质研究2 5 2 2 1 转化子的p c r 鉴定2 5 2 2 2s o u t h e r n 杂交鉴定转化子t - d n a 拷贝数：2 6 2 2 3 转化子的形态观察2 7 2 2 4 转化子的稳定性研究2 7 3 结果与分析。2 7 。3 1 农杆菌介导的红曲霉t - d n a 转化库的建立2 7 3 1 1 红曲霉对潮霉素的敏感性实验2 7 3 1 2t - d n a 转化库的建立：2 7 3 2 转化子的p c r 鉴定2 8 3 3t - d n a 拷贝数的s o u t h e r n 杂交分析2 8 3 4 色素突变子的形态观察2 9 3 4 1 菌落形态观察2 9 3 4 2 显微结构观察3 2 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 3 5 色素突变子的遗传稳定性研究3 5 4 小结与讨论3 6 4 1 红曲霉t - d n a 转化库的构建3 6 4 2 红曲霉转化子的分化。3 6 4 3 关于遗传稳定性的研究3 7 第三章色素突变子主要代谢产物的分析测定3 8 1 材料3 8 1 1 菌株3 8 1 2 主要仪器3 8 1 3 主要试剂3 8 2 方法3 9 2 1 红曲的制备3 9 2 1 1 米饭培养基3 9 2 1 2 红曲的制备3 9 2 2 红曲色素的分析3 9 2 2 1 色价测定及吸收峰扫描3 9 2 2 2 色素成分的薄层色谱分析3 9 2 2 3 红曲色素组分的紫外可见分析4 0 2 3 红曲中m o n a c o l i nk 的测定4 0 2 3 1m o n a c o l i nk 标准曲线4 0 2 - 3 2 红曲中m o n a c o l i nk 的提取及其测定4 0 2 4 红曲中g a b a 的测定4 0 2 4 1g a b a 标准曲线4 0 2 4 2 红曲中g a b a 的提取及测定4 l 2 5 红曲中桔霉素的测定4 1 2 5 1 桔霉素标准曲线4 1 2 5 2 红曲中桔霉素的提取及其测定4 1 3 结果与分析4 2 3 1 红曲色素的分析4 2 3 1 1 色价及其u v - v i s 扫描分析4 2 3 1 2 红曲色素薄层层析分析4 4 3 2 红曲中m o n a c o l i nk 含量的测定4 9 3 3 红曲米中g a b a 含量的测定5 0 3 4 红曲中桔霉素含量的测定5 0 4 小结与讨论5 2 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 4 1 红曲霉主要代谢关系的研究5 2 4 2 红曲霉形态发育与次生代谢产物的关系5 3 第四章色素突变子t - d n a 位点侧翼序列t a i l p c r 扩增及其扩增片段的功能分析 ：5 1 ； l 材料5 5 1 1 菌株5 5 1 2 酶与主要生化试剂5 5 1 3 培养基5 5 2 方法5 6 2 1t a i l p c r 扩增t - d n a 插入位点侧翼序列5 6 2 1 1 基因组d n a 的制备5 6 2 1 2t a i l - p c r 的循环条件及反应体系一5 6 2 1 3t a i l p c r 产物纯化5 8 2 2p c r 产物的连接、转化及测序5 9 2 2 1 连接5 9 2 2 2 大肠杆菌感受态的制备5 9 2 2 3 转化5 9 2 2 4 阳性转化子的鉴定6 0 2 2 5 测序6 0 3 结果与分析：6 0 3 1 引物的设计6 0 3 2 色素突变子t - d n a 插入位点侧翼序列的t a i l p c r 及扩增序列分析6 2 3 2 1t a i l p c r 扩增6 2 3 2 2 扩增产物的测序及其功能分析6 3 4 小结与讨论6 5 第五章8 0 5 。色素突变子t - d n a 插入位点侧翼e d n a 序列的分离及其功能验证6 7 l 材料6 7 1 1 菌株与质粒。j 6 7 1 2 主要试剂。：6 7 1 3 农杆菌介导的转化所需试剂及培养基6 7 1 4 引物序列6 8 1 5 主要仪器设备_ 6 9 2 方法6 9 2 1 红色红曲霉m 一7 总r n a 提取6 9 2 2 3 r a c e 扩增8 0 5 突变子d n a 片段3 末端的e d n a 序列6 9 华中农业人学2 0 0 7 届博学位业论文 2 2 1r t - p c r 扩增3 末端第一条e d n a 链6 9 2 2 2p c r 扩增3 末端e d n a 双链7 0 2 35 r a c e 扩增8 0 5 4 d n a 片段5 方向的e d n a 序列7 1 2 3 15 方向e d n a 序列的扩增7 1 2 3 25 末端e d n a 序列的扩增7 2 2 4e d n a 片段的拼接及功能分析7 4 2 5 预测的8 0 5 y t b , 4 的r g s 编码区的敲除7 4 2 5 1 对应于e d n a 序列的长d n a 片段的p c r 扩增7 4 2 5 2 重组敲除载体的构建- 7 4 2 5 3 农杆菌介导的t - d n a 转化红曲霉7 6 3 结果与分析。7 7 3 1 对应于8 0 5 。d n a 片段的全长e d n a 的扩增7 7 3 1 18 0 5 。d n a 片段的3 末端e d n a 序列的扩增( 3 r a c e ) 7 7 3 1 28 0 5 。d n a 片段的5 r a c e 扩增7 8 3 2e d n a 序列的拼接与分析：8 l 3 3 敲除载体的验证8 5 3 3 1 目标d n a 片段的p c r 扩增8 5 3 3 2 重组质粒p c 8 0 5 的构建与鉴定8 5 3 3 3 重组质粒p c 8 0 5 s 的构建与鉴定一8 6 3 3 4 含p c 8 0 5 s 的农杆菌e h a l 0 5 的p c r 鉴定8 7 3 4 含p c 8 0 5 s 的农杆菌e h a l 0 5 转化红曲霉m 7 及转化子的验证“一8 8 3 4 1 发生同源重组的转化子的筛选8 8 3 4 2 发生同源重组的转化子的p c r 验证8 9 4 小结与讨论8 9 第六章结论与展望9 1 l 结论9 1 2 展望9 1 3 论文创新点9 2 参考文献。9 3 j i i 【调j 1 0 5 附录l 测序结果1 0 6 附录2 攻读学位期间发表文章11 l 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 中文摘要 红曲霉( m o n a s c u ss p p ) 是我国传统的食用和药用微生物，在我国已有上千年的应 用历史。它能分泌产生色素、莫呐可啉类( m o n a c o l i n s ) 物质、y 氨基丁酸 “a m i n o b u t y r i ca c i d ，g a b a ) 、麦角固醇和丰富的水解酶类等多种有益代谢产物，是 生产食品发酵剂、着色剂、保健食品、药品或其原料的重要微生物资源。目前，国 内外对红曲霉菌种的分类、选育、代谢产物分离纯化及发酵条件的研究较多，而有 关红曲霉的分子生物学研究才刚刚起步。g e n b a n k 检索结果查见，与红曲霉相关的 核酸序列大部分是研究分类和亲缘关系的，有关功能基因的研究很少，而关于红曲 霉产色素基因的研究尚未见报道。 近年来，利用根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 介导t - d n a 转化真菌获得突 变体的方法成为寻找和鉴定新基因的有效手段。本课题采用根癌农杆菌介导的 t - d n a 转化法建立了包含51 0 0 多株转化子的红曲霉转化子库，从转化子库中筛选 得到了2 4 株菌落颜色发生了明显变化的色素突变子，并对其菌落形态及显微结构、 潮霉素抗性稳定性及主要代谢产物的分泌能力等进行了分析。在此基础上，采用 t a i l p c r 分离到8 株色素突变子t - d n a 插入位点的左侧序列，并应用r a c e 技术 克隆得到了一株色素突变子8 0 5 。t - d n a 插入位点的c d n a 全长序列，采用基因敲除 ( g e n ek n o c k o u t ) 技术对其功能进行了验证。具体研究结果如下： 1 转化子库的构建及色素突变株的筛选 通过优化农杆菌0 t u m e f a c i e n s ) 介导的t - d n a 转化红曲霉的条件，构建了包含 51 0 0 多个转化子的转化子库。t - d n a 的p c r 验证结果表明，随机挑选的6 0 株转 化子均含有t o d n a 插入片段。2 4 株随机挑选的转化子的s o u t h e m 杂交结果表明， t - d n a 单拷贝插入率为7 0 8 。通过对转化子菌落形态的观察，筛选得到5 3 株形态 发生明显变化的转化子，其中2 4 株为菌落颜色发生显著变化的色素突变子，其编号 分别为1 8 9 。、1 9 2 。、5 3 3 。、6 3 5 。、7 3 3 。、8 0 5 。、9 5 9 。、1 1 3 2 。、1 1 6 4 。、1 2 6 3 。、1 2 9 5 。、2 0 6 6 。、 2 6 0 6 。、2 8 8 7 。、3 1 0 8 。、3 2 5 7 。、3 7 1 5 。、3 7 4 2 。、4 0 8 1 。、4 0 9 6 。、4 5 9 1 。、4 6 9 8 簟、4 9 6 3 。和 4 9 6 8 。色素突变子连续传代培养5 代后，除7 3 3 、1 1 3 2 。、3 7 1 5 和4 5 9 1 并外，其它 2 0 株色素突变子均能在潮霉素抗性培养基上稳定生长，潮霉素抗性稳定性达8 3 3 。 2 色素突变子产红曲色素、m o n a e o l i nk 、g a b a 和桔霉素的分析 采用u v - v i s 、t l c 、h p l c 等方法对上述2 0 株潮霉素抗性稳定的色素突变子 的固态发酵产物红曲的色素( 包括色价、吸收波长、色素组分) 、m o n a c o l i nx 、g a b a 和桔霉素的产生情况进行了分析。结果表明，与出发菌株相比，色素突变子产代谢 产物的能力都发生了不同程度的变化。 在产色素方面，色素突变子9 5 9 。的色价最高，达27 1 2 ，是出发菌株m 7 色价 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 12 2 8 的2 2 倍；1 2 6 3 。的色价最低，仅为2 0 ，只有出发菌株m 一7 色价的o 0 1 倍。另 外，色素突变子红曲乙醇萃取液的u v v i s 扫描图谱和色素组分也发生了显著的变 化。在产m o n a c o l i nk 方面，突变子4 0 8 1 。红曲的含量最高，达l6 0 1 1 x g g ，而出发 菌株m 一7 红曲的含量低于0 1 肛g 。在产g a b a 方面，突变子1 2 6 3 # 红曲含量最高， 达6 1 8 3 9i _ t g g ，是出发菌株m 74 3 6 3i t g g 的1 4 2 倍；6 3 5 # 红曲的含量最低，只有 1 5 6 1u g g ，约为出发菌株m 7 的0 3 3 倍。在产桔霉素方面，突变子6 3 5 。红曲的含 量最高，达1 5 4 5 7 “g 倌，是出发菌株o 7 5 t g g 的2 0 6 倍；1 2 9 5 。含量最低，为o 1 0 “g ，为出发菌株的0 1 倍。 比较上述2 0 株色素突变子产色素和桔霉素的情况，可将其分为4 类：第一类， 色价和桔霉素都升高的，包括6 3 5 、9 5 9 。、116 4 。、2 0 6 6 。、2 6 0 6 。、2 8 8 7 。、4 0 8 1 。和4 6 9 8 4 共8 株；第二类，色价和桔霉素都降低的，包括8 0 5 。、1 2 9 5 。、3 7 4 2 。和4 9 6 8 。共4 株； 第三类，色价降低而桔霉素含量升高的，包括1 8 9 。、1 9 2 。、1 2 6 3 。和4 9 6 3 。共4 株； 第四类，色价升高而桔霉素降低的，包括5 3 3 。、3 1 0 8 。、3 2 5 7 4 和4 0 9 6 。共4 株。从上 述四类突变子中挑选出6 3 5 。、1 1 6 4 。、2 6 0 6 。、8 0 5 。、1 2 9 5 。、1 8 9 。、1 2 6 3 。、4 9 6 3 。、5 3 3 。 和3 2 5 7 。共1 0 株代表性菌株，作为研究红曲霉产色素相关基因的材料。 3 色素突变子t - d n a 插入位点侧翼序列t a i l p c r 扩增及扩增片段功能分析 采用t a i l p c r 法对上述l0 株色素突变子t - d n a 插入位点的侧翼序列进行了 扩增，得到了6 3 5 4 、1 1 6 4 。、2 6 0 6 4 、8 0 5 。、3 2 5 7 、1 8 9 、4 9 6 3 。和5 3 3 4 共8 株突变子 t - d n a 插入位点左侧的d n a 序列，扩增的d n a 片段长度介于5 0 0b p 13 0 0b p 之 间。f a s t a 比对分析表明，8 0 5 。突变子d n a 扩增序列与烟曲霉( l s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) a f 2 9 3 的g 蛋白信号调节子( r e g u l a t o r f o rg p r o t e i ns i g n a l i n g ，r g s ) 功能域 的同源性达8 4 ；其它7 株突变子的t - d n a 插入位点侧翼的d n a 序列未发现有 功能明确的相似性序列。突变子5 3 3 。、l1 6 4 。和2 6 0 6 4 的d n a 扩增片段已经登陆 g e n b a n k ，登陆号分别为d q 8 6 1 3 3 6 、d q 8 6 1 3 3 8 和d q l 3 3 7 。 4 红曲霉g 蛋白信号调节子的功能验证 以突变子8 0 5 。扩增序列的b l a s t 比对分析结果为依据，设计特异性引物，采用 r a c e 技术，扩增得到了对应于该d n a 序列的20 1 2b p 的c d n a 序列。o r _ f f i n 工 具分析显示，其包含的最长开放读码框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r e ) 为l8 5 1 b p ，推 衍得到包括了r g s 和2 个d e p ( d i s h e v e l e d ，e 9 1 1 0 ，p l e e k s t r i n ) 3 个结构域在内的氨 基酸序列。以r g s 结构域两侧的d n a 序列为同源臂，采用基因敲除( g e n ek n o c k - o u t ) 技术对其功能进行了初步研究。研究结果表明，8 0 5 。突变子t - d n a 插入位点的基因， 即编码红曲霉f l b a ( f l u f f yf o rb r l a ) 的序列对红曲霉色素分泌具有正调节作用。 关键词：红曲霉；农杆菌介导的t d n a 转化库：色素突变子；t a i l p c r ；r a c e ； f l b a 基因；基因敲除 a b s t r a c t m o n a s c u ss p p ，ak i n do ff u n g i ，u s e di nf o o dp r o d u c t i o na n dt r a d i t i o n a lm e d i c i n ef o ra t h o u s a n do fy e a r si nc h i n a ，h a sb e c o m ea ni m p o r t a n tm i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e sd u et oi t s p r o d u c t i o n o fm a n yk i n d so fm e t a b o l i t e s ，s u c ha sm o n a s c u sp i g m e n t ，m o n a c o l i n s ， y - a m i n o b u t y d ca c i d ( g a b a ) ，e r g o s t e r o l a n d h y d r o l y a s e ，w h i c ha r e u s e d 嬲f o o d f e r m e n t a t i o ns t a r t e r ，f o o dc o l o r a n t ，f u n c t i o nf o o da n dt h ei n g r e d i e n t so r a n dr a wm a t e r i a l s o fm e d i c i n e a tp r e s e n t ，t h ei n v e s t i g a t i o na b o u tm o n a s c u ss p p w a sf o c u s e do ni t s c l a s s i f i c a t i o n ，b r e e d i n g ，m e t a b o l i t e si s o l a t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st oi m p r o v e u s e f u lm e t a b l i t e s ，b u tt h es t u d yo nm o l e c u l a rb i o l o g yo fm o n a s c u ss p p i sa tt h e b e g i n n i n gs t a g e i tw a sf o u n dt h a tm o s to ft h es e q u e n c e sr e l a t e dt om o n a s c u ss p p i n g e n b a n kw e r eu s e d a sc l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h eh o m o l o g y , f e ww e r e f u n c t i o n a lg e n e s u n t i ln o w ，t h e r ew a sn or e p o r ta b o u tt h eg e n e ( s ) i n v o l v e di nm o n a s c u s p i g m e n ts y n t h e s i s i nr e c e n ty e a r s ，a l le f f i c i e n tm e t h o dt of i n da n di d e n t i f yn e wf u n c t i o ng e n e sw i t h a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e dt - d n at r a n s f o r m a t i o n h a sb e e nd e v e l o p e da n d w i d e l yu s e d i nt h i sp a p e r , at r a n s f o r r n a n tl i b r a r yo fm o n a s c u sr u b e rb ya g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sm e d i a t e dt - d n at r a n s f o r m a t i o nw a sc o n s t r u c t e da n dm o r et h a n 510 0 t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d f r o mt h el i b r a r y , 2 4c o l o r p r o d u c i n gm u t a n t s ，w h i c hw e r e m a r k e d l yd i f f e r e n tf r o mt h eo r i g i n a ls t r a i nm - 7i np i g m e n tp r o d u c t i o n ，w e r es e l e c t e d ，a n d t h ec o l o n ym o r p h o l o g i e s ，m i c r o s c o p i cs t r u c t u r e s ，t h es t a b i l i t i e st oh y g r o m y c i nr e s i s t a n c e a n dt h ea b i l i t i e st op r o d u c ed i f f e r e n tm e t a b o l i t e so ft h em u t a n t sw e r ea n a l y z e d a f t e rt h a t ， f l a n k e dt - d n as e q u e n c e so f8c o l o r - p r o d u c i n gm u t a n t sw e r ei s o l a t e db yt h e r m a l a s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ，a c c o r d i n gt ot h eb i o i n f o r m a t i o no fi s o l a t e ds e q u e n c e s ，a c o m p l e t ee d n as e q u e n c eo fc o l o r - p r o d u c i n gm u t a n t sn a m e d8 0 5 。w a sc o l o n e dw i t ht h e m e t h o do fr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d f i n a l l y , t h ef u n c t i o no ft h es e q u e n c ef r o m 8 0 5 w a si d e n t i f i e db yg e n ek n o c k o u t t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa r e 弱f o l l o w s ： 1t h ec o n s t r u c t i o no ft r a n s f o r m a n tl i b r a r ya n ds e l e c t i o no fc o l o 卜p r o d u c i ngm u t a n t s t h et r a n s f o r m a n tl i b r a r yo fm o n a s c u ss p p ，c o n t a i n i n gm o r et h a n510 0t r a n s f o r m a n t s w a sc o n s t r u c t e d t h er e s u l t so fp c ra m p l i f i c a t i o no ft r a n s f o r m a n t sb ya g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s m e d i a t e dt - d n at r a n s f o r m a t i o ns u g g e s t e dt h a ta 1 1o ft h eg e n o r n i cd n a o f 6 0r a n d o m l ys e l e c t e dt r a n s f o r m a n t sw e r ei n s e r t e db yt - d n a t h er e s u l t so fs o u t h e r nb l o t r e v e a l e dt h a tt h es i n g l e - c o p yr a t eo ft - d n ai n t ot h eg e n o m i cd n ao f2 4r a n d o m l y s e l e c t e dt r a n s f o r m a n t sw a s7 0 8 b ym o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n ，5 3p h e n o t y p em u t a n t s f r o mt h el i b r a r yw e r es e l e c t e d ，a m o n gw h i c h ，t h e r ew e r e2 4c o l o r p r o d u c i n gm u t a n t sa n d 华中农业大学2 0 0 7 届博学位业论文 t h e i rc o d e sw e r e1 8 9 。，1 9 2 4 ，5 3 3 。，6 3 5 。，7 3 3 。，8 0 5 。，9 5 9 ，11 3 2 。，11 6 4 。，1 2 6 3 。， 1 2 9 5 。，2 0 6 6 。，2 6 0 6 。，2 8 8 7 。，3 1 0 8 。，3 2 5 7 。，3 7 1 5 。，3 7 4 2 。，4 0 8 1 。，4 0 9 6 栉，4 5 9 1 撑， 4 6 9 8 。，4 9 6 3 。a n d4 9 6 8 。r e s p e c t i v e l y a f t e rf i v er o u n d so fc o n s e c u t i v ei n c u b a t i o n ，e x c e p t 7 3 3 。，113 2 。，3 715 4 a n d4 5 91 t h er e s to fc o l o r - p r o d u c i n gm u t a n t sc a ng r o wo nt h ep d a c o n t a i n i n g2 0 1 x g m l o fh y g r o m y c i na n dt h es t a b l er a t et o h y g r o m y c i n gr e s i s t a n c e a m o u n t st o8 3 3 2a n a l y s i so fm o n a s c u sp i g m e n t ，m o n a c o l i nk ，y - a m i n ob u t y r i ca c i da n dc i t r i n i no f r e df e r m e n t e dr i c ep r o d u c e db yc o l o r - p r o d u c i n gm u t a n t s t h ec o n t e n t so fm o n a s c u sp i g m e n t ，m o n a c o l i nk ，t - a m i n ob u t y r i ca c i da n dc i t r i n i no f r e df e r m e n t e df i c e ( r f r ) p r o d u c e db y2 0s t a b l ec o l o r - p r o d u c i n gm u t a n t s ，w e r ea n a l y z e d b yu v - v i s 、t l ca n dh p l c t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h em u t a n t sm e t a b o l i t e sd e s c r i b e d a b o v ew e r ed i f f e r e n tf r o mt h o s ep r o d u c e db yt h eo r i g i n a ls t r a i nm - 7 i nt h ea s p e c to fp i g m e n t ，r f ro f9 5 9 。w a so ft h e t h eh i g h e s tp i g m e n t v a l u ea n d a m o u n t e dt o2712 ，w h i c hw a s2 2t i m e st h a to fm 一7 ，w h i l et h ep i g m e n t v a l u eo f12 6 3 4 w a st h el o w e s ta n dw a s2 0 ，w h i c hw a sj u s to 01t i m e st h a to fm - 7 i na d d i t i o n ，t h e u v - v i ss p e c t r u ma n dp i g m e n tc o m p o n e n t so f7 0 o fe t h a n o ls o l u t i o no f