（分析化学专业论文）油炸食品中酚类抗氧化剂的高效液相色谱法测定.pdf

摘要 摘要 抗氧化剂是国家允许但限量使用的食品添加剂剂，准确监测食品中抗氧化剂的情况 十分必要。本文论述了抗氧化剂的研究进展及其分类，以及酚类抗氧化剂在油炸食品中 的作用机理和各国允许添加的抗氧化剂种类，综述目前食品中抗氧化剂的测定方法。 采用反相高效液相色谱法测定油炸薯条中p g 、t b h q 、b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 。 其中p g 、t b h q 用5 0 甲醇( 体积分数1 的冰醋酸) 作流动相，b h a 、4 h r 、b h t 、 2 2 4 6 用8 0 的甲醇作流动相，检测波长为2 8 0 啪，纯甲醇提取样品中p g 、t b h q ；甲 醇：二氯甲烷= 9 ：l ( v v ) 提取b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 。相关系数在o 9 9 8 3 0 9 9 9 6 之间，检出限为1 op g 2 0 肛g ，标准偏差在o 2 1 5 3 0 之间，平均回收率均在 8 5 以上。 研究了一系列油炸小食品中b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 的检测；在此色谱条件下， 标准偏差为1 1 4 5 9 0 ，平均回收率均在8 0 以上。检出另一种常用的抗氧剂特丁 基对苯二酚( t b h q ) ，5 种小食品均含t b h q ，不影响4 种物质的分离。 关键词高效液相色谱法酚类抗氧化剂油炸薯条油炸小食品 a b s t r a c t a b s t r a c t a n t i o x i d a n t sa r ef o o da d d i t i v e sm a ta r eu e s dl i m i t e d l yb yo u rn a t i o nl a 心a n di ti s i m p o r t a i l tt om o n i t o rt 1 1 es i t u a t i o no fa n t i o x i d a i l t si nf o o d t h i sa r t i c l ed i s c u s s e dt h er e s e a r c h p r o g e s s 、c l a s s i f i c a t i o no fa n t i o x i d a n t s ，a n dd i s c u s s e dm e c h a n i s mo fp h e n 0 1 i ca i l t i o x i d a l l t s u s ei i l 伍e df o o d ，锄dd i s c u s s e d t y p e so fa n t i o x i d a n t sm a t a r ep e r n l i t t e db ys o m e c o u n t r i e s m e i ls u m m a r i z e dt h ee x i s t i n gm e t h o d st h a ta r eu s e di nt e s t i n ga n t i o x i d a n t si nf o o d p g 、t b h q 、b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6c o n t e n ti n 伍e dp o t a t ow a sd e t e m l i n e db yr e v e r s e p h a s e h i 曲p e r f o m l a n c e “q u i dc h r o m a t o 黟a p h y 5 0 m e t h a n 0 1 w a t e “1 a c e t i ca c i d ， v o l u m er a t i o ) w a su s e da st h em o b i l ep h a s ei np ga j l dt b h q ；8 0 m e t h a n o lw a su s e da st h e m o b i l ep h a s ei nm eg r o u pb h a 、4 h r 、b h ta i l d2 2 4 6 ，t l l ed e t e c t i o nw a v el e n 啦w a s2 8 0 i i n l t 1 1 em e t h a n o lw a su s e dt 0e x 仃a c tp ga 1 1 dt b h q ，t 1 1 em e m a n 0 1 - m e m y l e i l ed i c h l o n d e ( 9 ：1 v o l u m er a t i o ) w a su s e dt oe x t r a c tb h a 、4 h r 、b h ta n d2 2 4 6f 如mf h e d p o t a t o ；t h ec o r r e l a t i o n c o e 筒c i e n tw a sb e t w e e no 9 9 8 3 o 9 9 9 6a l l dt h ed e t e c t i o n1 i m i tw e r e1 op g 儋2 o 肛g ，t h e a v e m g e c 0 v 嘶e sw e r ea l la b o v e8 5 ，a n dt h er e l a t i v es t a i l d a r dd e v i a t i o n sw e r eo 21 5 3 0 b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6c o n t e n ti ns m a l l 衔e df o o dw a sd e t e n n i n e db yr e v e r s ep h 嬲e h i 曲p e r f o 姗a 芏1 c el i q u i dc h r o m a t o 伊印h y 1 1 1t h ec a t o 聊h i cc o n d i t i o n ，t h ea v e r a g e r e c o v e r i e sw e r ea l la b o v e8 0 ，a n dm er e l a t i v es t a l l d a r dd e v i a t i o n sw e r e1 14 5 9 0 ，a n o t h e rc o m m o n l yl l s e dd e t e c t i o na n t i o x i d a n tt b h q 5s p e c i e so fs m a l lf o o dc o n t a i n t b h q ，d o e sn o ta 行e c tt h es e p a r a t i o no ff o u rk i n d so fs u b s t a i l c e s k e y w o r d sh i g l lp e r f o 衄a i l c el i q u i dc h r o m a t o 聊h yp h 髓o l i ca n t i o x i d 觚t s f r i o dp o t a t os m a l lf r i e df o o d i i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：董之缝日期：捌年厶月丘日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密飞u ( 请在以上相应方格内打“ ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为 的学位论文，是我个人在导师( 幸洹剧 ) 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：盔壹堑日期：丑年厶月五日 作者签名：董益日期：趟年上月上日 导师签名：4 奎主兰扯 日期：珥年厶月上日 第1 章前言 第1 章抗氧化剂的研究进展 摘要：综述了什么是食品抗氧化剂及抗氧化剂的作用；抗氧化剂的种类、研究进展和各 国允许添加的现状；酚类抗氧化剂在油炸食品中的作用机理及检测方法的研究进展。 关键词：食品添加剂酚类抗氧化剂高效液相色谱法食品油炸食品 1 1抗氧化剂的定义及其作用 2 1 世纪的今天，随着经济的发展，人类社会进入一个完全的商品社会。超市里各种 各样的预包装食品很多都经过油炸或添加了油脂，同即食食物相比，其有更高的过氧化 值。主要有几方面原因：随着贮藏期的延长，油脂过氧化程度加深，即使是真空或惰 性气体包装，食品组织也有溶解氧；很多食品企业在预包装油炸食品加工过程中反复 使用油煎炸，尤其是一些小食品企业在油炸工艺阶段不断向旧油中加入新油；一些食 品在货架期结束后，通过重新返工回到货架上。一定量的活性氧参与了机体生理活动的 某些有益环节，如凝血酶原的合成、胶原蛋白的合成、机体内的解毒功能以及核糖苷酸 的还原等【】。但过多的活性氧则会引起一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞和 分子结构的破坏，氧化的油脂会对机体造成损伤，甚至引起心脏病、癌变和衰老等疾病 【4 1 们，因此准确监测食品中抗氧化剂十分必要。 抗氧化剂是指能防止或延缓食品成分氧化变质的一类食品添加剂，其种类繁多，作 用机制比较复杂且各不相同，有的是阻断氧化反应链，破坏氧化过程，或者自身首先氧 化，降低食品体系的含氧量；有的是抑制阻止氧化酶的活性；也有的是络合铜铁等金属 离子，以消除其催化活性。抗氧化剂的作用在于防止或延缓食品氧化反应的进行，但不 能使食品发生氧化反应后复原，因此，抗氧化剂必须在氧化变质前添加。 抗氧化剂是一种食品添加剂，能防止食用油及含油食品变质，因抗氧化剂对自由基 合伙型态氧引起的机体损伤有干扰作用，而被公认是一种新的治疗途径，在预防医学领 域界，对抗氧化剂研究兴趣空前高涨m 】。食物氧化是食物腐败主要原因之一，特别 是在脂肪含量高的食品中。防止油脂酸败的方法有多种，如真空、充氮、添加抗氧剂、 使用除氧剂等。但真空与充氮都不易做到并维持，而除氧剂的使用方法还未根本解决。 采用适当的抗氧剂，只需微量就可以获得满意的效果，为此，在生产过程中常添加抗 河北人学理学硕f j 学位论文 氧化剂来防止或延缓食品变质，延长储存期【1 3 】。 多年以来，人们一直加入抗氧化剂来防止食物腐败，如今抗氧化剂广泛用来改善食 品保藏，开发能预防某些疾病或延长食品保存期的低毒、高效、新型抗氧化剂是非常值 得期待的。 1 2 抗氧化剂的作用机理及其分类 抗氧化剂是指能防止食品成分因氧化而导致变质的一类添加剂。主要用于防止油脂 及富脂食品的氧化酸败，以及由氧化所导致的褪色褐变以及维生素被破坏等。抗氧化剂 按来源分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂两大类。 1 2 1 抗氧化剂的作用机理 抗氧化剂的作用机理主要有： 1 2 1 1 自由基吸附剂 这类抗氧化剂能吸收氧化产生的自由基，阻断自由基链锁反应。将油脂被氧化产生 的自由基转变为稳定的产物，消除脂质氧化的自由基反应。自由基吸附剂如b h a ( 丁基 羟基茴香醚) 、b h t ( 二丁基羟基甲苯)、t b h q ( 特丁基对苯二酚)、没食子酸酯 ( 包括其丙酯新酯十二酯)、对羟基苯甲酸酯生育酚( 维生素e ) 、抗坏血酸及其衍 生物等。 一般情况下，空气中的氧首先与脂肪分子结合产生r o o 自由基，自由基吸收剂提 供氢给予体a h ，即将r o o 自由基吸附形成氢过氧化物：r o o + a h r o o + a 但 产生的a 自由基必须比r o o 自由基更稳定。实践证明，酚类抗氧化剂与脂类自由基 反应生成的自由基更稳定。 1 2 1 2 酶抗氧化剂 在生物体中，各类自由基将酯类化合物氧化并产生过氧化物。酶抗氧化剂黄质氧化 酶可以与产生的过氧化物作用生成超氧化物自由基0 2 ，0 2 自由基又被超氧化物歧化 酶作用形成过氧化氢。h 2 0 2 又被过氧化氢酶作用转变成氧和水。 1 2 1 3 氧清除剂 抗氧化剂除去食品中的氧，延缓氧化反应的发生。例如抗坏血酸能清除食品中的氧， 其本身被氧化成脱氧抗坏血酸。它与自由基吸收剂生育酚结合使用效果更佳。 1 2 1 4 金属离子鳌合剂 2 第1 章前言 油脂中包含微量的金属离子，特别是两价或高价态重金属离子。他们之问具有合适 的氧化还原势，可缩短自由基链锁反应引发期，加快酯类化合物的氧化速度。e d t a 柠 檬酸磷酸衍生物等能与金属离子起鳌合作用，因而阻止了金属离子的促酯类氧化作用。 1 2 2 抗氧化剂的种类 1 2 2 1天然抗氧化剂的来源、种类 目前开发的天然抗氧化剂一般是从植物中提取的具有抗氧化活性的物质，其主要包 括黄碱类化合物、单宁、酚酸类生物碱类、维生素、酶及蛋白质氨基酸等成分【1 4 】。例 如：灯盏花，黄芩，野葛等植物的提取物均可以有效地清除羟自由基，超氧离子【1 5 - 1 刀。 该类抗氧化剂具有来源广、抗氧化活性大、与机体亲和力强和安全性高等优点f 1 8 】。除此 以外，从中药中发掘新的原料来源也是我国开发新型抗氧化剂的优势所在【1 9 】。 抗氧化剂的有效成分的结构可分为黄酮类、茶多酚类、酚酸类等。我国被卫生部门 批准使用的天然抗氧化剂并不多，主要有：维生素e ( 生育酚) 、茶多酚、去甲二氢愈 创木酸等【2 0 五1 1 。 ( 1 ) 茶多酚 茶多酚系茶叶中特有的多酚类化合物，属于类黄酮类化合物，是儿茶素类、黄酮及 黄酮醇类、花色素类和酚酸及缩酚酸类多酚化合物复合体，其中羟基取代基作为质子供 体。茶多酚是一种纯天然抗氧化剂，具有优越抗氧化能力，我国卫生部已经批准茶叶天 然抗氧化剂为我国食品添加剂之一，作为一种强抗氧化剂，其保护食用油脂活性是v 。、 b h t 、阴a 3 9 倍，茶多酚抗氧化作用机理主要是：通过作用于与自由基有关酶并抑制其 活性；茶多酚直接作用于自由基，阻断自由基链式反应；茶多酚与诱导氧化的过渡金属 离子结合，从而降低金属离子对油脂氧化催化作用。 ( 2 ) 维生素e 维生素e 亦称生育酚，是人们最早发现维生素之一，系天然生育酚化合物，v 。属于 酚类化合物，多数情况下，维生素e 抗氧化作用是与脂氧自由基或脂过氧自由基反应， 向它提供h + ，使脂质过氧化链式反应中断，从而实现抗氧化效果。因此，天然维生素e 是一种强有效抗氧化剂，一般来说，v 。为淡黄色油状液体，在没有空气条件下对热和碱 都很不稳定1 0 0 以下与酸无作用，但易被氧化，在空气中经光照或用化学试剂均可将 它氧化成醌衍生物。 3 河北人宁：理学硕十学何论文 人们对天然抗氧化剂使用理所当然应当认为是绝对安全的，但实际上天然抗氧化剂 属于天然植物提取物，对于如茶多酚、生育酚等安全性已研究很深入，作为抗氧化剂使 用绝对安全。对一些新型天然抗氧化剂使用也必须严格进行相关毒理学研究，对其安全 性及最大用量进行科学评估，主要论证他们的致畸、致癌和其他引起疾病的可能性。此 外，天然抗氧化剂的使用还存在一些如下问题：( 1 ) 活性成分随原材料来源及萃取方 法不同而不同；( 2 ) 某些天然抗氧化剂会影响食品原来风味；( 3 ) 萃取成本高，且在 食品体系中可能会与其它营养成分发生反应。绝大多数天然抗氧剂由于其生产成本高而 无商业价值2 2 1 。 1 2 2 2 化学合成抗氧化剂的种类 由于合成抗氧化剂价格低廉，被广泛使用。二十世纪七十年代以来，国际上开发的 人工化学合成抗氧化剂种类有上百种，但被各国认可、符合安全、高抗氧化的只有十几 种，最经常使用的有叔丁基对羟基茴香醚( b h a ) 、2 ，6 一二叔丁基化羟基甲苯( b h t ) 、 没食子酸丙酯( p g ) 、特丁基对苯二酚( t b h q ) 、n d g a 、o g 、d g 等，这些化合物 与游离自由基反应能生成稳定低能量共振杂化合物，阻断油脂自动氧化链式反应机制， 所以具有很强抗氧化性能，几种抗氧化剂可单独使用也可混合使用。 ( 1 ) 没食子酸丙酯( p g ) p g 是一种常用抗氧化剂，是由没食子酸和正丙醇酯化而成白色或微褐色结晶性粉 末，其酚酸及其烷基酯赋予其很强抗氧化活性，本身微苦，微溶于油脂，在油脂中溶解 度随着烷基链长度增加而增大，使我国允许使用的一种油脂抗氧化剂。其能阻止脂肪氧 合酶酶促氧化，在动物性油脂中抗氧化能力较强，与增效剂柠檬酸配合使用时，抗氧化 能力更强；与b h a 、b h t 复配使用抗氧化效能尤佳；与铁离子易出现橙色反应，产生蓝 黑色，在食品焙烤或油炸过程中迅速挥发，耐热性稍差。 ( 2 ) 特丁基对苯二酚( t b h q ) 特丁基对苯二酚是新合成一种抗氧化剂，1 9 7 2 年美国开始使用，实验室及生产上应 用逐渐发现她对植物油有极好保护作用。在很多情况下，t b h q 对毛油和精炼油来说， 较其它不同抗氧化剂能提供更有效抗氧化稳定性。据国内外资料证明，对油脂抗氧化能 力比目前常使用b h a 、b h t 、p g 大2 5 倍。t b h q 具有防止胡萝卜素分解作用；t b h q 对植物油中生育酚有稳定作用。 4 第1 章前言 ( 3 ) 叔丁基对羟基茴香醚( b h a ) b h a 是2 b h a 和3 b h a 两种异构体混合物，广泛应用于食品和油脂工业，易溶于油 脂，对植物油抗氧化活性弱，对热比较稳定；但在富含天然抗氧化剂植物油中或与其它 抗氧化剂复配使用，具有抗氧化增效作用，抗氧化效果明显提高，还有较强抗菌力，可 抑制黄曲霉生长及黄益霉素产生。 ( 4 ) 2 ，6 二叔丁基化羟基甲苯( b h t ) b h t 易溶于动植物油，与金属离子作用不会着色，易受阳光热的影响，是目前最常 用抗氧化剂之一。与b h a 、v c 、柠檬酸、植酸等具有显著增效作用，可用于长期保存油 脂和含油脂较高食品及维生素添加剂。 ( 5 ) l 一抗坏血酸棕榈酸酯 是由l 一抗坏血酸与棕榈酸酯化而成一类新型营养性抗氧化剂，不仅保留l 一抗坏血酸 抗氧化特性，且在动植物油中具有相当溶解度，被广泛应用于粮油、食品、生物卫生等 领域。l 一抗坏血酸棕榈酸酯是最强脂溶性抗氧化剂之一，具有安全、无毒、高效、耐热 等特点，可有效防止各类过氧化物形成，延缓动植物油牛奶类胡萝卜素等氧化变质，同 时还具有乳化性质、抗菌活性，是一种高效、营养、多功能脂溶性食品抗氧化剂。 ( 6 ) 硫代二丙酸类抗氧化剂 硫醚类物质硫代二丙酸( t d p a ) 、硫代二丙酸二月桂酯( d l t p ) 作为抗氧化剂可 应用于食用油富脂食品中，且以证明这些硫醚类物质是一种新型高效低毒抗氧化剂，能 有效分解油脂自动氧化链反应中氢过氧化物，提高油脂保存期，我国最近也批准了d l r p 在食品中应用。周爱梅等【2 3 】通过实验证明，t d p a 对花生油有很好抗氧化作用，t d p a 与b h a 、b h t 、t b h q 等酚型抗氧化剂有协同作用；利用其复配，既可提高抗氧化效能， 又可提高油脂性。 ( 7 ) 2 2 4 6 抗氧化剂2 2 4 6 为良好的非污染型双酚工业抗氧剂，常用于合成橡胶、天然橡胶胶乳 和石油制品等。某些小型企业不注意酚类抗氧剂的具体用途和用量，可能向食品中添加 抗氧剂2 2 4 6 以达到延长食品储存的目的。 最经常使用的有叔丁基对羟基茴香醚( b h a ) 、2 ，6 - 二叔丁基化羟基甲苯( b h t ) 、 没食子酸丙酯( p g ) 、特丁基对苯二酚( t b h q ) 等酚类抗氧化剂，这些苯酚型结构化 5 河北人学理学硕十学位论文 合物与游离自由基反应能生成稳定低能量共振杂化合物，阻断油脂自动氧化链式反应机 制，所以具有很强抗氧化性能。一些常用抗氧化剂的结构式见下图l ： t b u p g 表1 ：常见抗氧化剂结构 o h 川匿舶：e 登3 c k 飘 b h a 0 h0 h c h 3c h 3 2 2 4 6 t b u 6 0 ( c h ， t b h q c | f a c c 鸭3 弼 4 己基问苯二酚 b h t c ( a b h c ( a 1 3 b 第1 章前言 h h 2 n 、n 1 1 0 h n h 2 n hh c i l 一抗坏血酸棕榈酸酯 1 3 抗氧化剂安全性评价体系 由于人们日益担心合成抗氧化剂的安全性，并且确有许多科学家的研究在一定程 度上证明了很可能损害人体的酶系统【2 4 啪】。因此，抗氧化剂的毒理学是其安全性的焦点 问题之一，对于抗氧化剂的安全评价，不仅要评估其自身是否存在危害，还要评价与氧 化物反应产物的危害性。对抗氧化剂安全性的评价分析可以归纳为：( 1 ) 致突变性； ( 2 ) 致癌性或在癌变三个阶段的修饰作用；( 3 ) 致畸变；( 4 ) 抗氧化物作用后的稳 定性与安全性；( 5 ) 抗原性；( 6 ) 毒理性； ( 7 ) 体内吸收部位和代谢周期等若干方 面综合评价【2 7 1 。 各国使用的抗氧化剂总数约3 0 种，而我国常用于油脂的脂溶性抗氧化剂有p g 、 t b h q 、b h a 、b h t 、n d g a 、o g 、d g ，几种抗氧化剂可单独使用也可混合使用2 引。抗 氧化剂的使用必须符合我国食品安全法的规定。过量添加会损害人体健康，有关食品中 抗氧化剂含量的标准，见表2 。 7 河北人学理学硕 j 学何论文 表2 抗氧化剂使用卫生标准( g b2 7 6 0 1 9 9 6 ) g b 2 7 6 0 1 9 9 6 ( 1 9 9 8 年扩大使用范围品种) 第1 章前言 1 4 食品中酚类抗氧化剂的检测方法 1 4 1 食品中酚类抗氧化剂国外研究现状 国外早期对抗氧化剂的测定采用分光光度法【2 9 1 ，但其灵敏度和鉴别能力差，i s o 欧美标准方法采用g c 方法【3 0 1 ，但是不同类多种抗氧化剂同时测定受到限制，且汽化室 和柱温对化学稳定性稍差的抗氧化剂有一定影响。近年来高效液相色谱法在油脂中多种 抗氧化剂的测定领域中得到广泛应用。已发表的用于检测食品中抗氧化剂的方法有很 多，其中可用于食品中的主要有高效液相色谱法【3 1 。3 酣，毛细管胶束电动色谱法【3 7 瑚】，分 光光度法【3 9 。4 0 1 ，气相色谱法【4 l - 5 0 1 ，伏安法【5 l 】，薄层色谱澍跚和比色澍5 3 1 。 1 4 1 1 高效液相色谱法 高效液相色谱法测定油脂、脂肪和黄油中p g 、t h b p 、t b h q 、n d g a 、b h a 、b h t 和l0 i l o s 1 0 0 等7 种抗氧化剂3 5 。3 6 1 。此方法已成为a o a c 方法，即a o a c 标准方法 9 8 3 1 5 ，油、猪油和奶油中的酚类抗氧化剂，液相色谱法，形p a c a o a c 方法。用 于分析油猪油和黄油中没食子酸酯含量的液相色谱法已做了协作实验。 ( 1 ) 原理用乙腈提取抗氧化剂，然后浓缩提取液，并用2 丙醇稀释浓缩液，用液 相色谱分离抗氧化剂，紫外2 8 0 n m 检测。 ( 2 ) 检测 提取：将约5 5 9 液体油或奶油，或约3 o g 猪油或起酥油( 置于6 0 水浴锅或烘箱 中溶解，搅拌或震荡以保证均一性) 装入5 0 m l 烧杯中，准确称取样品和烧杯质量，精 确至0 0 1 9 。先将分液漏斗中装入饱和正己烷，搅拌混合正己烷和样品，用乙腈重复萃取 3 次，收集分液漏斗提取液，倒入圆底烧瓶，除去正己烷一油层。 用快速蒸发器将样品蒸发至3 4 m l ，用移液管把乙腈一油混合液移入1 0 m l 具塞量 筒中，用少量异丙醇洗涤，合并洗涤液收集到1 0 m l 。 o 河j 匕人。：理9 产硕t 宁何论文 色谱法分析：采用c 1 8 黏合球状硅土柱，5 醋酸水溶液，乙腈甲醇( 1 ：1 ) 梯度洗 提流速：2 0m l m i n ，取1 0ul 样品提取液测定。 高效液相色谱法测定焙烤食品中抗氧化剂p g 、o g 、d g 、b h a 【3 7 1 ，采用e x t r a s i lo d s 2 柱( 2 5 伽o 4 6 锄，5 岬) 取1 0 9 切碎的样品，加入2 ，4 ，6 三甲基苯酚，并用乙腈异丙 醇( 1 ：1 ) 均质。分离液相再萃取两次。合并萃取液旋转蒸发后定容。a ：醋酸甲醇( 5 ：9 5 ) ， b ：醋酸水( 5 ：9 5 ) ，梯度洗提，流速：1 5 m i n 。此方法的准确性已确定并应用于1 5 种商业化样品中，校准标准曲线线性范围：2 1 0 0 p m l ，i s 的回收率为9 4 6 ( n _ 1 0 ) ， 分析的1 5 种样品都不含p g ，有9 种食品其1 9 脂肪的b h a 含量为1 7 5 5 5 6ug 。 1 4 1 2 气相色谱法 气相色谱法测定食用油脂中p g 、b h a 、b h t 【4 2 】，采用c p s i l8 c b 大孔毛细管柱( 3 0 m o 5 3 嗍，1 5 岬) ，1 0 四甲基氢氧化胺( t m a h ) 甲醇溶液加到6 0 8 0 m g 油样中，搅 拌混合2 0 m i n 使之甲基化。用乙醚提取，加入o 2 十四醇充分混合，进样时注入乙醚层 0 3 m l ，此方法的精密度已确认，应用于1 8 种食品中。与a o a c 方法【4 7 】比较，这种方法具 有更高提取率和精确度。 1 4 1 3比色法 比色法测定食品中p g 已成为a o a c 检测方法【5 3 】。采用石油醚溶解样品后用醋酸铵水溶 液萃取，过滤醋酸铵萃取液，滤液移入锥形瓶中，用醋酸铵溶液稀释至2 0 m l ，在锥形 瓶中精确加入水和酒石酸亚铁试剂，混合均匀，以试剂空白样为对照在5 4 0 眦处测定a 值，根据标准曲线计算的p g 量。 酚类抗氧化剂的检测还有其它方法，( 1 ) 毛细管胶束电动色谱法( m e c c ) 测定 可乐饮料中抗氧化刹5 4 1 ，此方法与高效液相色谱法相比较，可使4 种抗氧化剂被完全分 离，在6 m i i l 内具有非常高的分辨率和效率，利用紫外吸收光谱法可以检测微微摩尔含量 的抗氧化剂。用i 冲h p l c 分离没有这么高的效率且需要更大量的样品和更长的分离时 间；( 2 ) u v ，t l c u v ，比色法，t l c 比色法测定植物油中p g 、b h t 、b h a 【2 2 1 ，这几 种检测方法经比较，紫外检测方法不适用于含有2 种或更多种抗氧化剂或干扰物质的样 品，t l c u v 和t l c 比色法更适合；根据干扰物质和比色特性，也可使用比色法。比 色法比t l c 更经济快速。 经统计有些检测方法的精确度已确定，并应用于食品检测中，见表2 1 0 第1 章前言 表2 ：国外食品中抗氧化剂检测的统计学参数 这些方法中有的已成为a o a c 方法。用于分析油、猪油和黄油中抗氧化剂含量的液 相色谱法已做了协作试验。用于分析脂肪类食品中抗氧化剂的方法现有很多，选择哪一 种方法取决于待分析的食品。这些检测方法主要应用于液态食品，比如油，随着方法的 进一步发展，将要求这些分析检测方法可适用于所有食品。 1 4 2 食品中酚类抗氧化剂国内研究现状 国外在食品中酚类化合物的测定方法的研究起步比我国早，目前，国内食品中酚 类抗氧化剂的测定方法主要有高锰酸钾滴定法【5 4 1 、高效液相色谱澍5 5 。7 8 1 、薄层色谱法 【7 9 8 0 】、气相色谱法【8 1 - 8 4 1 、气相色谱法一质谱法【8 5 8 7 】等。 1 4 2 1 高锰酸钾测定法 t 1 河北人号：理学硕卜学何论文 此法是传统的测定方法，具有一定代表性。它是利用酚类化合物中酚羟基的还原 性，以o 1 靛红溶液为指示剂，使用高锰酸钾滴定法测定食品中酚类物质含量。高锰酸 钾是强氧化剂，被测溶液中的还原性物质一般均能被氧化，所以用这种方法测定的选择 性不高。 1 4 2 2 可见分光光度测定法 该方法主要利用食品中酚类化合物与其它试剂发生显色反应来测定食品中的酚类 化合物含量，此法操作简便，应用广，仪器成本和材料消耗较低，是目前国内对食品或 其他植物中酚类化合物进行总含量测定最常用的方法。 1 4 2 3 原子吸收光谱法 将原子吸收光谱法应用于茶多酚的含量测定，国内外均有报道，他属于一种间接测 定方法。利用c u ( a c ) 2 与多酚类化合物反应生成难溶性的，经分离后，用原子吸收光 谱法测定溶液中过量的c u ，由此间接测定食品中多酚类化合物的含量。由于生成的c u 多酚化合物在水中溶解度较大，且食品中的氨基酸有干扰作用，因此误差较大。原子吸 收光谱法选择性比高锰酸钾氧化法要高，但增加了沉淀离心分离步骤，操作比较繁琐【7 4 】。 1 4 2 4 气相色谱法 气相色谱法是英国生物化学家m a r t i n 等人在液液分配色谱的基础上，于1 9 5 2 年创立 的一种极为有效的分离方法，可分离、分析复杂的多组分混合物【8 8 】。高效能的色谱柱、 高灵敏度的检测器以及计算机处理技术，使其在食品中酚类抗氧化的检测中也达到了广 泛应用。g b 1 5 0 0 9 3 0 2 0 0 3 即采用气相色谱法测定食品中叔丁基羟基茴香醚( b h a ) 与2 ，6 一二叔丁基对甲酚( b h t ) 。 1 4 2 5 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h i g l lp e 墒m 舭c el i q u i dc h r o m a t o 四a p h y 简称h p l c ) ，于1 9 6 0 年后 期开始应用。它是目前实验室应用最广泛、最有效的分离分析技术之一，具有分辨率高、 分析速度快、重复性好、定量分析精确度高等优点，并可用作实验室小量色谱纯样品的 制备，所以发展特别迅速【7 6 1 。h p l c 是色谱法中的一个重要分支，据估计，自然界7 0 以 上的化合物均可用这种方法分析。在短短的几年时间内，它被广泛应用于食品中多酚类 化合物等非挥发性成分的分离鉴定。目前，较为常用的高效液相色谱柱是o d s ( 4 6 2 5 0 m m ，5um ) ，由于固定相相对较为昂贵，为了优化分析条件，通常采用改变流动相的 1 2 第1 章前青 组成与配比，以提高分离程度和分析速度，因此流动项的选择很重要，常用的流动相有 甲醇乙醇乙腈四氢呋喃或其它多种比例组合。洗脱系统有等度洗脱和梯度洗脱2 种，采 用紫外( u v ) 检测器检测，流速在1 啦2 0m l m i n 之间。多种分析方法都能实现对儿茶 素组分的定量测定。 张曼等用高效液相色谱法同时测定饲料中8 种抗氧化剂。该方法提取方式为乙腈提 取并离心，溶剂中痕量杂质可能造成抗氧化剂的丢失，在提取时应用高纯度溶剂，有报 道强调t b h q 在提取溶剂蒸发中应注意避免氧化。因此实验提出旋转蒸发过程中做到高 度真空，并限时l o m i n 完成。实验用试样的纯乙腈溶液过c 1 8 柱并同时收集，再以4m l 乙腈沈脱，8 种抗氧化剂洗脱率均达8 0 以上。实验采用梯度洗脱二极管阵列检测器方 法进行检测。此研究方法可同时对8 种抗氧化剂进行检测，其分析周期和实验成本优于 国内外现行方法，体现了先进、高效、可靠技术等特点。 易湘茜等人利用高效液相色谱法分析了多酚类物质在菠萝果皮果肉果心中的含量 及分布情况色谱条件：色谱柱为d i 锄o ns i l c l a 柱( 2 5 0 4 6 m m ，5um ) ，流动相为乙 腈和o 3 醋酸溶液，柱温为2 5 ，流速为1 0 m l m i n ，线性梯度洗脱，检测波长为2 8 0 衄。 在该色谱条件下，各组分均得到良好分离。 胡小钟等：用高效液相色谱法同时测定油脂中的9 种抗氧化剂。样品用正己烷溶解， 用乙腈提取，浓缩，用异丙醇定容，过0 4 5um 滤膜最低检测限为1 o m g l 。添加回收 率8 2 4 9 8 7 ，r s d 为1 o l 4 ，7 4 。此实验研究了九种酚类抗氧化剂的色谱保留 行为，并运用微量技术和反相高效液相色谱技术，以梯度洗脱，外标法定量，建立了一 种同时测定九种脂溶性酚类抗氧化剂的快速、简便的方法，经用于实际样品测定，可满 足进出口商品检测工作中油脂检测的需要。根据此实验，胡小钟等人还编写了s n t 1 0 5 0 2 0 0 2 标准，此标准规定了进出口油脂中9 种抗氧化剂的高效液相色谱测定方法。本 标准适用于色拉油和人造黄油等油脂中没食子酸丙酯( p g ) 、2 ，4 ，5 三羟基苯丁酮 ( t h b p ) 、叔丁基对苯二酚( t b h q ) 、去甲二氢愈创木酸( n d g a ) 、叔丁基对羟基茴 香醚( b h a ) 、2 ，6 二叔丁基4 羟甲基苯酚( i o n o x 1 0 0 ) 、没食子酸辛酯( o g ) 、2 ，6 二叔丁基对羟基茴香醚( b h t ) 、没食子酸十二酯( d g ) 等9 种抗氧化剂的检测。 g b 厂r 5 0 0 9 3 0 2 0 0 3 即采用气相色谱法测定食品中叔丁基羟基茴香醚( b h a ) 与2 ， 6 一二叔丁基对甲酚( b h t ) 、薄层色谱法和比色法。该标准适用于糕点和植物油等食品 河，i 匕人号： 甲号：7 页 j 字! 伊论文 中b h a 、b h t 的测定。g b t 5 0 0 9 3 2 油脂中p g 的测定方法采用比色法；g b t1 7 4 0 一1 9 9 8 食品中植酸检验方法采用分光光度法。由于抗氧化剂允许使用的品种增多，使用范围不 断扩大，上述检测方法已不能满足工作需要。目前抗氧化剂检验方法的发展趋势是各类 食品中抗氧化剂的多组分同时测定。 1 5 食用油脂抗氧化剂检测方法及其发展趋势 我国食品卫生法规中明确规定了各种抗氧化剂的最大使用量。目前，世界各国对各 种抗氧化剂的允许使用限量基本一致。我国的食品国家标准已有b h a 、b h t 和p g 的检 测方法，关于其它几种检测目前还没有国家标准。为了达到更好的抗氧化效果，许多厂 家常常添加几种不同的抗氧化剂以提高抗氧化效果，进出口油脂行业标准中检测方法虽 然可以同时检测多种抗氧化剂，但监测低限只能达到2 o m g 蚝，而今年日本已将食品中 t b h q 的限量降低到1 o m g 蚝。 由于抗氧化剂允许食用的品种增多，使范围不断扩大，上述检测方法已不能满足工 作需要。目前抗氧化剂检测方法的发展趋势是各类食品中抗氧化剂的多组分同时测定。 如食品中抗坏血酸钠、维生素e 的测定方法有卫生标准尚无标准检测方法，我国已批准 在口香糖中使用b h t ，但尚无检测方法。所以，为适应油脂检验的需要，急需建立一种 简便快速准确的检测方法。 1 4 第2 章油炸薯条巾酚类抗氧化剂的高效液棚色谱法洲定 第2 章油炸薯条中酚类抗氧化剂的高效液相色谱法测定 摘要：采用反相高效液相色谱法测定油炸薯条中p g 、t b h q 、b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 。 其中p g 、t b h q 用5 0 甲醇( 体积分数1 的冰醋酸) 作流动相，b h a 、4 h r 、b h t 、 2 2 4 6 用8 0 的甲醇作流动相，检测波长为2 8 0 姗，纯甲醇提取样品中p g 、t b h q ；甲 醇：二氯甲烷= 9 ：1 ( v ) 提取b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 。相关系数在o 9 9 8 3 0 9 9 9 6 之间，检出限为1 ou g 2 op g ，标准偏差在o 2 1 5 3 0 之间，平均回收率均 在8 5 以上。 关键词：高效液相色谱法，油炸薯条，酚类抗氧化剂； 2 1引言 没食子酸丙酯( p g ) 、特丁基对苯二酚( t b h q ) 、丁基羟基茴香醚( ) ( b h a ) 、二 丁基羟基对甲酚( b h t ) 、4 一己基间苯二酚( 4 h r ) 是国家允许但限量使用的食品包括油 脂类抗氧化剂，2 2 4 6 全称2 ，2 二甲基双( 4 甲基一6 叔丁基苯酚) 是工业抗氧化剂，价 格便宜。这几种都属于酚类抗氧剂，酚类抗氧剂是环境雌激素的一类，具有弱雌激素样 效应，可通过食物链富集，在体内长期蓄积，超标或滥用对人体危害很大，某些不法生 产者有可能把2 2 4 6 加入食品中。因此，准确监测食品中酚类抗氧化剂的情况十分必要。 此类化合物的测定方法有薄层色谱法，气相色谱法，气相色谱法质谱法，高效液 相色谱法等。胡晓钟等用高效液相色谱法测定油脂中九种酚类抗氧化剂，但采用的是梯 度洗脱，对仪器要求高，且未涉及2 2 4 6 的分离。本文以反相h p l c 考察了油炸薯片中这6 种酚类抗氧化剂的测定，结果令人满意。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 岛津l c 6 a 高效液相色谱仪、s p d 6 a v 紫外检测器、n 2 0 0 0 双通道色谱工作站( 浙 江大学智能信息工程研究所) 、s z 一9 7 自动三重纯水蒸馏器( 上海亚荣生化仪器厂) 。 p g 、t b h q 、b h a 、4 h r 、b h t ( a c r o s 公司，瑞典) 、2 2 4 6 ( 南京米兰化工有限 公司) ，甲醇，二氯甲烷均为色谱纯( 科密欧公司，天津) ，冰醋酸为分析纯。油炸薯条 购自超市。 1 5 疖i 北大学理学硕十7 吖市论文 标准溶液：以甲醇为溶剂，配制浓度为1 0 m m l 的标准品储备液，4 冰箱存放。 移取标准储备液逐级稀释，配制成一系列浓度的工作溶液。 2 2 2 样品处理 准确称取研碎的样品1 o g 于5 0 i i l l 具塞锥形瓶中，p g 和t b h q 用1 0 0 m l 甲醇萃取， 连续震摇5 分钟，过滤至2 5 0m l 容量瓶中，用8 0 m l 、5 o m l 洗涤两次，洗涤液倒入漏斗 中，至液体全部流下，再用滴管润沈滤纸边沿，挤压，定容至2 5 0m l 。移液管移取5 0 m l 至5 0 m l 具塞刻度管中，5 0 氮吹浓缩至0 2 m l ，进样分析。b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 的萃取溶剂为甲醇：二氯甲烷= 9 ：1 ( ) ，萃取方法同上。 2 2 3色谱条件 色谱柱：o d s 2 h y p e r s i l ( 2 5 0 4 6 m m ，5um ) ，p g 和t b h q 的流动相为： 甲醇：1 的醋酸水溶液= 1 ：l ( v ) ；b h a 、4 h r 、b h t 和2 2 4 6 的流动相为：甲醇： 水= 8 ：2 ( v ) ，流速1 o m l m i n 。检测波长2 8 0 n m ，进样量2 0pl 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 分离和检测条件 采用反相c 1 8 柱对这6 种物质进行分离，在等度洗脱条件下，实验了不同配比的甲醇 水和乙腈水，以及不同配比的甲醇乙腈水三元混合流动相，6 种化合物中，最难分离的 物质对是p g 和t b h q ，当两者分开时，2 2 4 6 洗脱时间太长，且峰形不好；2 2 4 6 及其它 组分能适当洗脱时，p g 和t b h q 不能分离。因此，在等度洗脱时想同时分离这几种化 合物比较困难，所以我们采用不同组成的流动相进行分离和测定。5 0 甲醇流动相可使 p g 和t b h q 有效分离，但p g 峰拖尾严重，加入体积分数为l 醋酸，p g 峰拖尾得到改善。 8 0 甲醇为流动相时，b h a 、4 h r 、b h t 、2 2 4 6 可很好分离测定，标准谱图见图1 和图2 。 1 6 第2 章油炸薯条巾酚类抗氧化剂的高效液相色谱法洲定 l ，p g2 ，t b h q 图l 标准组分谱图 f i g 1c h m m a t o g r a mo fs t a n d a r dc o m p o n t l ，b h az 4h k 3 ，b h i 4 ， z 2 4 6 图2 标准组分谱图 f j g 2c h m m a o g r a mo f s t a n d a r dc 0 怖p o n c l l t 经紫外波段扫描选择检测波长2 8 0 n m 时，对这六种化合物的吸收最好，干扰也最小。 2 3 2 萃取溶剂 这6 种化合物易溶于甲醇，当用纯甲醇做萃取剂时，p g 和t b h q 的萃取效果很好， 回收率可达到9 5 以上；但其它几种化合物的萃取率很低。实验了不同配比的甲醇和二 氯甲烷做萃取剂，当甲醇：二氯甲烷= 9 ：l ( v ) 的混合溶剂作萃取剂时，b h a 、4 h r 、 b h t 和2 2 4 6 的回收率都能达到8 5 以上。另外，选用醇类和醇类为主的提取剂，油脂类 化合物不易萃取过来，减少了此类化合物的干扰，简化了样品处理步骤。 2 - 3 3 线性方程和相关系数 配制一系列浓度的工作溶液，在所选用的色谱条件下，