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o 醯懋 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备 及手性拆分研究 摘要 众所周知，手性药物的对映体在人体内的药理活性及毒性存在着 显著的差异。因此，手性拆分作为获得光学纯物质的主要途径，在医 药工业，生命科学，有机化学等领域具有重要的意义，亦是当前国际 研究的热门课题。 与常规液相色谱相比，微柱液相色谱具有溶剂消耗量低、污染小、 样品用量少，分析速度快，易于与其他检测方法在线联用等优点，备 受人们关注。 本论文致力于自制微柱液相系统的建立，并利用自制的微柱液相 系统对六种手性化合物进行了成功的拆分。研究工作分为四部分： 第一部分，合成了纤维素- - ( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) ，红外 光谱和元素分析表明微晶纤维素酯化比较完全。并将合成的纤维素衍 生物涂敷于自制的氨丙基硅胶表面，得到手性固定相，并对涂敷量， 涂敷溶剂的选择和涂敷方法进行了探讨。 第二部分，在实验室自制了一套微柱装填装置，将常规 h p l c ( 1 5 c m 4 6 m mi d ) 的不锈钢柱作为匀浆液的储料池，用p e e k 管将其与常规h p l c 泵相连，末端连接1 0 c m l m mi d 的微柱，匀浆 法装柱。对所有自制的手性微柱进行了死时间和柱效测定。 第三部分，自制了一套纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 手 。缝缝 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 性微柱高效液相色谱分离系统，对柱系统，泵系统，进样系统，检测 系统几个方面进行了优化设计，以1 ，3 ，5 三叔丁基苯为分析物对自制 的微柱液相系统进行了表征，实验证明，该系统仪器设备简单，操作 简便，分离时间短，分离效果好，而且具有良好的稳定性。 第四部分，考察了手性固定相对手性化合物的分离性能，优化了 流速，涂敷量，醇的种类以及异丙醇的浓度对分离性能的影响。利用 自制微柱液相系统成功分离了六种手性化合物，其中正相模式下分离 了五种：b e n z o i n ，t r 6 9 e r sb a s e ，p r o p r a n o l o l ，m e t o p r o l o l ，p i n d o l o l 。 极性有机相模式下分离了三种：w a r f a r i n ，b e n z o i n ，t r 6 9 e r sb a s e 。 关键词：微柱液相色谱，手性固定相，纤维素- - ( 3 ，5 一二甲基苯基氨基 甲酸酯) ，手性拆分 。 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o na n de n a n t i o s e p a r a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so fc e l l u l o s ed e r i v 棚v e c h i r a lm i c r o h p l cs y s t e m a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a ti n d i v i d u a le n a n t i o m e r so fc h i r a l d r u g s s h o wv e r yd i f f e r e n t p h a r m a c o l o g i c a la n dt o x i c o l o g i c a la c t i v i t i e s e n a n t i o s e p a r a t i o ni so n oo ft h em a i na p p r o h e st o o b t a i nt h eo p t i c a l p u r es u b s t a n c e s ，w h i c hh a si m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ei no r g a n i cc h e m i s t r y , m e d i c i n a lc h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c ea n dh a sb c o o m eah o tr e s e a r c hi s s u ei nt h ew o r l d m i c r o - c o l u m nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( m i c r o - h p l c ) p l a y sac o m p l e m e n t a r yr o l ei nh p l c , b e c a u s eo fs e v e r a lk e ya d v a n t a g e s ：t h ea b i l i t yt ow o r ka tv e r yl o wf l o wr a t e s ，w h i c hl e a d st oa s i g n i f i c a n t l yl o w e rs o l v e n tc o n s u m p t i o n ；t h ep o s s i b i l i t yt oi n j e c tv e r yl o ws a m p l ea m o u n t ；t h e e n h a n c e dd e t e c t i o nu s i n gc o n c e n t r a t o n - s e n s i f i v ed e t e c t o r sd u et oam u c hl o w e rc h r o m a t o g r a p h i c d i l u t i o nd u r i n gt h es e p a r a t i o np r o c e s s ( m a s ss e n s i t i 访t y ) t h e s ea t t r i b u t e sm a k em i c r o - h p l c d e v e l o pr a p i d l y t h ep u r p o s eo ft h es t u d yi st op r e p a r ean e wm i c r o - c o l u m nl cs y s t e ma n ds e p a r a t es i xc h i r a l c o m p o u n d sb yt h es y s t e m 。t h ew o r k 啪b ed i v i d e di n t of o u rp a r t s ： f i r s t l y , c e l l u l o s et r i s ( 3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) ( c d m p c ) w a ss y n t h e s i z e d e l e m e n t a l a n a l y s i sa n di rs p e c t r ai n d i c a t e dt h a tm o s to ft h eh y d r o x y lg r o u p so ft h em i c r o c r y s t a l l i n e c e l l u l o s eh a db e e nc o n v e r t e di n t oe s t e rg r o u p s t h ec h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ( c s p ) w a sp r e p a r e db y c o a t i n gc d m p co nt h ea m i n o p r o p y ls i l i c a c o a t i n ga m o u n t ，c o a t i n g s o l v e n t sa n dc o a t i n gp r o c e s s w e r ei n v e s t i g a t e d s e c o n d l y ，m i c r o - l ce x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tu s i n gah o m e - m a d ep a c k e dm i e r o - c o h m u o n ee n do ft h ec o m m o ns i z ec o l u m n ( 1 5 c r u x 4 6 m mi d ) u s e da sar e s e r v o i ro ft h es l u r r yw a s c o n n o t e dt ot h ep u m pb yap e e kt u b e ，t h eo t h e re n dw a gc o n n c o t o dt ot h em i c r o - c o l u m n t h e p a c k i n gm a t e r i a l so b t a i n e dw e r es e l f - p a c k e di nt h em i c r o - c o l u m nb yas l u r r ym e t h o d d e a dt i m e i ! 童2 笔雾 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 a n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h i ce f f i c i e n c yw e r ed e t e r m i n e df o ra l lt h ec h i r a lm i c r o - c o l u m n s t h i r d l y , ak i n d o fh o m e - m a d em i c r o - c o l u m nl cs y s t e mw a se s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l y c o l u m n ，p u m p ，i n j e c t i o na n dd e t e c t i o ns y s t e m sw e r eo p t i m i z e ds i m u l t a n e o u s l y t h em a r k e ru s e d t od e t e r m i n et h ed e a dv o l u m ew a s1 , 3 ，5 - t r i - t e r t - b u t y l b e n z e n e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h es y s t e m h a ss e v e r a la d v a n t a g e ss u c ha s - h i g h e rs e n s i t i v i t y , l o w e rc o n s u m p t i o no fs o l v e n t s ，h i g h e r e f f i c i e n c y , b e t t e rr e s o l u t i o n l a s t l y ，t h ei n f l u e n c eo ff l o wr a t e ，c o a t i n ga m o u n t , 2 - p r o p a n o lc o n t e n ta n dd i f f e r e n ta l c o h o l s o nt h ee n a n t i o s e l e c t i v i t yw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l d i r e c to p t i c a lr e s o l u t i o no ff i v ec h i r a l c o m p o u n d ss u c ha sb e n z o i n , t r 6 9 e r sb a s e ，p r o p r a n o l o l ，m e t o p r o l o l ，p i n d o l o lw e r er e s o l v e db y n o r m a l - p h a s em o d eu s i n gh e x a n e - 2 - p r o p a n o l a se l u t i n gs o l v e n t t l ：l r c o m p o u n d ss u c ha s w a r f a r i n ，b e n z o i na n dt r 6 9 e r sb a s ew e r er e s o l v e db yp o l a ro r g a n i c - p h a s em o d eu s i n gm e t h a n o l a se l u t i n gs o l v e n t b a s e l i n es e p a r a t i o nw a sa l m o s to b t a i n e di na l lo ft h ec h i r a lc o m p o u n d s m e n t i o n e da b o v e w a n gq i a n q i a n ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) s u p e r v i s e db yp r o f z h uz h i j i a k e yw o r d s ：m i c r o - c o l u n l nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e , c e l l u l o s e t r i s ( 3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) ，e n a n t i o s e p a r a f i o n 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 王佶傍 日期： 州矿年月7 日 。 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 第一章绪论 1 1 引言 手性是自然界的本质属性之一。作为生命活动重要基础的生物大分子，如蛋 白质、多糖、核酸和酶等，几乎全是手性的，这些大分子在人体内具有重要的生 理功能。药物中有8 0 具有手性中心，手性药物的对映体在人体内的药理活性、 代谢过程及毒性存在着显著的差异【，例如普萘洛尔( p r o p r a n o l 0 1 ) 的l - 异构体比 d 异构体的生物活性强1 0 0 倍。某些对映体还具有严重的毒副作用，如许多孕妇 服用沙利度胺( t h a l i d o m i d e ) 后，发生胎儿畸变，曾在欧洲掀起一场风波，后经研 究发现使胎儿发生致畸的是其s 异构体【2 1 。 由于分离测定技术上的困难，大部分手性药物的两个对映异构体表现出的不 同的药理特性和动力学行为远未被深入研究。基于此，1 9 9 2 年美国食品和药物管 理局作出第一个政策性规定：凡研制具有不对称中心的药物，必须对其各个对映 体进行测定和评价【3 】，所以对映体的拆分和测定在生物医学和不对称合成等领域 具有非常重要的意义。 1 2 手性拆分方法 获得单一手性物质的方法有三种：， ( 1 ) 手性源合成法：即以手性物质为原料合成其它手性化合物。这是化学家最常 采用的方法。但是由于天然手性物质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会 遇到很大的困难。 ( 2 ) 不对称合成法：是在催化剂或酶的作用下合成得到过量的单一对映体的方 法。近2 0 年来不对称合成法得到了长足进步，有些反应已开始用于工业化生产， 但是高旋光收率的反应( 如e e 9 0 以上) 仍然有限。 ( 3 ) 外消旋体拆分法：是在手性助剂的作用下将外消旋体拆分为纯对映体。据统 计，大约有6 5 的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆分得到的。外消 旋体拆分方法主要有： 化学拆分法：对映异构体先与纯手性物质形成非对映异构体，然后利用非对 映体的性质差异进行分离( 如分级结晶) ，再将衍生物还原为纯对映体。这种古老 的方法至今仍在广泛使用，但费时，消耗大，适用的化合物多限于酸碱类物质。 。缝盥 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 酶或酶生物法：利用酶或微生物对对映体具有专一识别能力的性质，消耗掉 一种对映体而得到另一种对映体。 色谱拆分法：色谱法与经典方法相比具有许多明显的优点，可以满足各种条 件下对映体分离和测定的要求，不仅能进行简便快速的定性定量分析，而且能进 行制备规模的分离和微量测定。目前，色谱法已成为光学拆分最有效的方法。 最初人们将对映体混合物，首先用手性试剂转化为共价键的衍生物，再将产 生的非对映体溶液注射到非手性柱中，然后采用适宜的流动相淋洗，非对映体( 如 肽胺类、酯类、脲、硫脲和氨基甲酸酯等) 便可分离。欲使分离出的纯非对映体 的共价衍生物经水解得到原来的对映体而不致产生消旋，一个重要因素就是要选 择那些易于除去的衍生试剂。这种间接法后来被直接法所取代。所谓直接法就是 手性固定相直接与消旋物相互作用，而其中一个生成具有不稳定的短暂的对映体 复合物，造成在柱淋洗时保留时间不同，从而达到分离的目的1 4 j 。 目前应用于对映体拆分的色谱技术包括气相色谱法( g c ) ，高效液相色谱法 ( h p l c ) ，超临界流体色谱法( s f c ) ，毛细管电泳法( c e ) ，以及毛细管电色谱法( c e c ) 和微柱液相色谱法( 肛l c ) 。下面重点介绍最近发展起来的c e c 和i 咀- l c 。 毛细管电色谱是以电渗流为驱动力的微柱液相色谱技术，该技术结合了 h p l c 的高选择性和c e 的高效性，很适合于对映体化合物的分离【5 】。按照制备方 式的不同，毛细管电色谱柱可分为开管柱，填充柱和整体柱三类。对于开管柱， 手性选择剂可涂敷或键合在毛细管内壁上，这样制备的色谱柱柱效低，选择性差。 填充柱是将颗粒型的手性填料填入毛细管，为防止填料流失，一般需要烧制塞子， 这样制备的色谱柱柱效高，选择性好，但塞子的存在通常会引起峰展宽，分离过 程中易产生气泡。毛细管整体柱一般由单体在管内原位聚合而成，手性选择剂可 通过原位聚合或柱后衍生引入。该技术不需要制备塞子，且具有较高的柱效和选 择性。大部分液相色谱用手性选择剂都可以应用于毛细管电色谱中。 在不断深入研究的实践中，人们逐渐发现高效液相色谱法也存在着一些不 足，如流动相消耗量大，所用溶剂甲醇、乙腈等大多有毒且价格昂贵。特别是对 于一些较复杂样品的分析，用单相分离分析方法往往难于完成，虽然也可以采取 高效液相色谱与质谱等检测器联用的技术来解决，但由于流速匹配等问题使其推 广、应用受到一定限制。对微柱液相( p , - l c ) 的研究始于1 9 6 7 年，h o r v a t h 等 6 1 用微 柱分离核苷酸取得了较好的结果，伴随精密加工以及微加工制造技术的进步和新 材料的出现，微柱液相逐渐发展起来。微柱液相通常采用内径为0 1 0 m m - 1 0 0 m m 色谱柱，与常规液相色谱相比，具有溶剂消耗低、环境污染小、样品用量少，柱 效高，分析速度快，易于与其他检测方法在线联用等优点 7 1 ，单位长度的柱效与 总柱效均比常规柱高，固定相和流动相比常规h p l c 节省9 7 以上，样品消耗减 少9 0 ，从而大大减少了二次污染和运行费用；柱压低，渗透性好，因此可以使 2 o 醴缝 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 用较小颗粒的固定相。p l c 的最佳流量仅为0 2 i x l m i n 3 0 i x l m i n ，易与其它检 测器( 如质谱) 和二级色谱系统在线联用，柱惰性好且有适于生物样品的分离分析 等常规液相色谱不可比拟的优点，在生化分析、手性分离、神经科学、蛋白质及 多肽的研究以及医药、工业聚合物与添加剂的分析等领域具有广阔的应用前景， 因此成为微型色谱研究的重要方向。i x - l c 产业化的关键在于高压微流量定量输 液系统和高灵敏检测器检测池的微型化。1 9 7 6 年，日本j a s c o 公司推出了第一台 商品化p l c 仪器，随后，各大色谱仪器公司也相继推出了自己的产品。v i s s e r s 8 】 就肛l c 的仪器、检测、应用以及联用技术作过综述，对于柱技术、检测技术等 也有相关的综述文章发表p d l l 。 1 3 手性识别机理 为了解释色谱手性拆分的机理，1 9 5 2 年d a l g l i e s h t l 2 】提出三点作用原理：a 对 映体与固定相之间存在氢键或兀7 【作用；b 偶极偶极相互作用；c 手性空腔的立 体作用。对映体与手性作用物之间存在的三点作用，其中必须有一个是立体选择 性的。“三点相互作用”是一种静态的热力学理论，近5 0 年来该理论一直处于一种 垄断地位，用该理论成功解释了许多固定相的拆分机理。 最近，w a i n e t l l 3 】对该理论提出了质疑，并提出一种动态作用模型。根据该模 型，样品与固定相间的作用分为三步：( 1 ) 借助于一种主要作用力样品分子接近 固定相并与其吸引；( 2 ) 样品分子在固定相表面调整构象；( 3 ) 通过氢键作用或 静电作用使得样品分子与固定相的配合物稳定化。 由于固定相的种类很多，某些固定相特别是聚合物固定相的结构又非常复 杂，所以手性拆分的机理远没有弄清，仍是手性拆分的重要课题。 1 4 液相色谱手性固定相 手性化合物色谱分离技术的关键是手性固定相( c s p s ) 的制备，具有不对称手 性中心或手性识别能力的手性固定相的开发与研究，是手性色谱的前沿，也是手 性色谱发展的关键和核心。本节重点介绍液相色谱手性固定相的研究进展。 目前所报道的液相色谱手性固定相主要有以下几大类：( 1 ) p i r k l e 型；( 2 ) 配 体交换色谱型；( 3 ) 含多肽或蛋白质类；( 4 ) 大环类，包括环糊精，手性冠醚类， 抗生素类；( 5 ) 聚合物类，它包括天然多糖衍生物如纤维素、淀粉等及合成的手 性聚合物如纤维素、淀粉等的衍生物；( 6 ) 分子印迹类；( 7 ) 分子设计类。 3 。 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 1 4 1p ir k ie 型 在手性液相色谱领域，p i r k l e 型c s p s 是当前使用量最大，适用量最广的c s p s 。 它们具有确定的化学结构，其共同特征是在手性中心附近至少含有下列基团之 一：( 1 ) 舻酸或7 【。碱芳基，具有给体受体相互作用能力；( 2 ) 极性氢键给体、受体； ( 3 ) 形成偶极相互作用的极性基团；( 4 ) 大体积非极性基团，提供立体位阻，范 德华作用或构型控制作用【1 4 】。这类手性固定相常被用来拆分胺、氨基醇、氨基酸、 醇、羧酸和硫醇等。 p k h e 研究组【1 5 】首先以9 葸基三氟甲基甲醇为手性选择剂制备了第一代 p i r k l e 型c s p s ；然后根据他们提出的交互作用原理又相继设计了以3 ，5 二硝基苯 甲酰衍生化氨基酸为手性选择剂的第二代【1 6 】和以5 芳基己内酰脲【l 。刀，n 酰化1 芳基1 氨基烷【1 引，n 芳基氨基酸酯【19 】等为手性选择剂的第三代p i r k l e 型c s p s 。 根据手性识别机理，可预测对映体洗脱顺序，确定绝对构型，测定光学纯度。 这种类型的手性固定相的不足之处在于被分离的溶质大部分需衍生化以引入芳 基等手性识别所需要的基团，而且由于多使用非极性溶剂作流动相，溶解度可能 限制了对某些溶质的使用。 1 4 2 多肽和蛋白质类 多肽和蛋白质是一类复杂的高分子聚合物，所含亚单位l 氨基酸具有手性特 异性，能特异性地键合小分子，因此对手性分子具有很强的识别能力。 目前可用作高效液相色谱手性固定相的蛋白质为数不多，按蛋白质的来源 分类可分为：白蛋白类，如牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 和人血清 白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h a s ) ；糖蛋白类，如c 【1 酸糖蛋i 兰t ( a l - a g p ) 、类 粘蛋白( o ) 、抗生素蛋白( a v i d i n ) 、核黄素结合蛋白( i u b p ) ；酶类( e n z y m e ) ， 如纤维素酶( e e l l u l a s e ) 、胰蛋白酶( t r y p s i n ) 、a - 胰凝乳蛋白酶( o t c h y m o t r y p s i n ) 、胃 蛋白酶( p e p s i n ) 、溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 、淀粉葡萄糖苷酶( a m y l o g l u c o s i d a s e ) ；其他类 蛋白等。目前已商品化的品种有：b s a ，h s a ，a g p ，o m c h i ，a v i ，c b h 及 p e p s i n 。其中b s a c s p s 最为常用。 蛋白质类c s p s 锖, 备法有两种：( 1 ) 吸附法：蛋白质物理地吸附在载体上；( 2 ) 化学键合法：蛋白质以共价键方式通过氨基或羧基结合到载体表面。 1 4 3 配体交换色谱( l e o ) 型 手性配体交换色谱法是拆分手性化合物，特别是氨基酸和羟基酸对映体的一 种有效方法，其选择性高，不需进行柱前衍生化，流动相水对环境无污染，实验 成本低，是一种高效、绿色、实用的分离技术。 配体交换色谱法中，手性配体与金属离子形成络合物，并与对映体发生交换 4 o 缝篮 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制各及手性拆分研究 作用，对映体d 和l 型与手性配体固定相所形成的络合物稳定性不同，决定了它 们在洗脱液作用下的保留时间或保留体积也不同，越稳定者，其保留时间越长， 后洗脱，因而可以进行d l 对映异构体的拆分。 手性固定相配体交换色谱法根据载体的不同，主要分为以聚合物为载体和 以硅胶为载体两类。d a v a n k o v 等人【2 0 】曾评述了此方法。文献【2 1 】的作者认为， 以光活性氨基酸或哌可酸作为手性选择子的涂渍相和键合相的制备是手性配体 交换色谱法发展的主流。 1 4 4 大环类 ( 1 ) 环糊精( c d ) 类 19 8 3 年，k a w a g u c h i 等t 捌首次通过氨或者酰胺键将环糊精键合到硅胶表面， 不含氮键，水解稳定的键合c d c s p s 是由加m s 们n g 等【2 3 】发展起来的，其合成途 径是将环糊精( c y c l o d e x t r i n , c d ) 与环氧氯丙烷、聚乙烯咪唑( p o l y v i n y l i m i d a z o l e , p v i ) 等反应制得。 依据其结构可分为两类：一类是将环糊精通过一条间臂连接在一条聚合物主 链上，另一类是使环糊精和小分子试剂交错连接。 环糊精是通过与对映体之间的包含复合作用来达到手性拆分的目的【2 4 o 环糊 精手性键合固定相对形成包合物有最佳大小的内腔，适用于大多数药物对映体的 位阻和电子特征。a 环糊精键合固定相适合于分子量小于2 0 0 的药物对映体的分 析；而丫环糊精键合固定相适用于较大分子量药物对映体的分析。 ( 2 ) 冠醚( c w p ) 类 冠醚可与金属离子、铵离子等形成主客体包容配合物是冠醚的重要特征。 手性识别主要是基于c w p 的“空穴”主客体络合和氢键作用。 冠醚类用于含有能够质子化的伯胺官能团的药物对映体的分离，尤其是氨基 酸及其衍生物的分离。 ( 3 ) 大环抗生素类 1 9 9 4 年m m 8 们n g 等【2 5 1 首次使用大环抗生素来制备c s p s ，在反相、正相以及 极性有机相模式下拆分了一系列光学异构体，开辟了手性分离科学领域一个新 的研究热点。目前，大环抗生素类物质在手性分离领域已得到广泛的应用。 目前报道的用于对映体分离的大环类抗生素有8 种，根据其结构特点可分为 三大类：糖肽抗生素类( g l y c o p e p t i d ea n t i b i o t i c s ，g a s ) 、柄状霉菌素类( 包括利福 霉素b ，利福霉素s v 等) 、多肽与氨基糖苷类( a m i n o g l u c o s i d e ) ( 包括链霉素，弗氏 霉素，卡那霉素等) 。 其中糖肽类抗生素的对映体选择性较高，而且在固定相的键合和装柱过程 中较稳定，所以大环抗生素手性固定相的研究主要集中在糖肽抗生素。 5 。缝怂 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制各及手性拆分研究 糖肽类抗生素包括阿伏帕星( a v o p a r c i n ，a v ) 、瑞斯托菌素a ( r i s t o c e t i na ， r i ) 、游壁菌素( t e i c o p l a n i n ，t e ) 及其相似物a 4 0 9 2 6 、万古霉素( v a n c o m y c i n ，v a ) 及其两个类似衍生物。除万古霉素外，其他三种物质在自然界中都不是以一种 化合物的形式存在，而是由几种在结构上相似的物质混合而成。这类物质在结 构上的共同特点是：含有由数个大环稠合而成的糖苷配基，呈“提篮”状并与糖 类化合物相连。 万古霉素最早被用来键合于聚丙烯酰胺树脂，用来测定络合反应的稳定常 数。万古霉素分子量为1 4 4 9 ，结构中存在1 8 个手性中心，五个芳香基团，三个 疏水性点作为手性空穴，含多个官能团，能与被拆分物质发生多种不同的相互 作用。万古霉素具有“篮状”结构，它的附近还有一个可弯曲的糖平面，可将 分析物分子包埋在“篮子 中。羧基和仲氨基分布在“篮子的边缘，参与和 分析物分子产生离子作用。万古霉素的等电点为7 2 ，可溶于水，微溶于甲醇。 万古霉素手性柱可以分离胺类、中性酰胺类、脂类，但对于酸性化合物选择性 较低。万古霉素手性色谱柱载样量可以很大，非常适用于制备色谱。 目前，它被广泛应用于高效液相色谱( h p l c ) ，毛细管电泳( c e ) ，毛细管电 色谱( c e c ) ，超临界流体色谱( s f c ) 的对映体分离。 h a s s a n 等【2 6 】比较全面地综述了流动相的组成，流动相的p h 值，流速，温度 以及其他参数对手性分离的影响。 1 4 5 纤维素及其衍生物 纤维素及其衍生物是一类重要的手性填料，它具有价格低、容量大、拆分范 围广等优点，所以广泛应用于生化、医药、农药等手性化合物的拆分。 纤维素是一类重要的天然手性源化合物，它是p 。d 葡萄糖单元由1 、4 糖 苷键形成的高度有序、呈螺旋型空穴结构的光学活性天然高分子。由于葡萄糖 单元具有手性，所以可以用作c s p s 4 。 纤维素衍生物是由纤维素和相应的异氰酸酯或酰氯相互作用制取得到，它 可以制成凝胶颗粒直接装柱，并对分离某些对映体取得成功。纤维素衍生物手 性固定相在液相色谱法拆分对映异构体中具有广泛的应用。 目前应用于对映体分离的纤维素衍生物主要包括纤维素酯类衍生物，纤维 素苯基氨基甲酸酯，纤维素烷基氨基甲酸酯和纤维素芳烷基氨基甲酸酯。 ( 1 ) 纤维素酯( c t a ) 类衍生物 1 9 7 3 年h e s s e 和h a g e l 【2 7 】首次报道纤维素三醋酸酯微晶( 图1 1 ) 具有极好的分 离芳香族化合物对映异构体的能力。进一步的研究表明：在多相反应条件下制备 的c t a 具有较好的手性识别能力，这种手性识别能力来源于纤维素的晶体结构本 身。此后许多纤维素衍生物一葡萄糖残基中羟基被不同官能团修饰。o k a m o t o 2 8 j 6 o 醯缝 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 和i c h i d a 掣2 9 1 分别将纤维素三醋酸酯溶解后涂敷于硅胶表面，制成的涂敷型c s p s 有着良好的手性识别能力。 。 h 3 c o c 0 图1 - 1 纤维素三醋酸酯的结构 f i g 1 - 1s t r u c m 她o fc e l l u l o s et r i a c e t a t e 纤维素三苯甲酸酯( c t b ) 及其衍生物( 图1 2 ) 是一大类用作c s p s 的纤维素酯 类，由于苯环的引入，提高了c s p s 的手性识别能力。o k a m o t o 等【3 0 】用纤维素和相 应的苯甲酰氯及其衍生物反应制备了一系列此类衍生物，并系统研究了苯环上取 代基的电子诱导效应和空间位阻效应对手性识别能力的影响。其中纤维素三( 4 甲基苯甲酸酯) ( c t m b ) 对许多手性化合物显示出很高的手性识别能力，包括药物 和一些非芳香族化合物，因此被广泛使用。 x = h ，4 一c h 3 ，3 - c h 3 ，2 - c h 3 ，4 一( c h 3 ) 3 c ，3 , 4 ( c h 3 ) 2 ，3 , 5 一( c h 3 ) 2 ，3 , 5 一c 1 2 ， 4 一f 4 - c f 3 ，4 一c h 3 0 ，3 , 5 一( c h 3 0 ) 2 ，4 - n 0 2 ，1 ，3 ，5 一( n 0 2 ) 3 ，4 一b r 图l - 2 纤维素三苯甲酸酯衍生物的结构 f i g 1 - 2s t i u c t i l r e so fc e l l u l o s et r i b e n z o a t e s ( 2 ) 纤维素苯基氨基甲酸酯类衍生物 由微晶纤维素和异氰酸苯酯及其衍生物反应生成的纤维素三苯基氨基甲酸 酯( c t p c ) 及其衍生物是被研究和使用最多的一类用作c s p s 的纤维素衍生物。 o k a m o t o 等 3 1 j 也合成了一系列此类衍生物( 图1 3 ) ，并系统地研究了它们的手性识 别能力和手性识别机理。特别是纤维素- - - ( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) ( c d m p c ) 对很多手性化合物都有极好的手性拆分能力。o k a m o t o 等【3 2 】曾用c d m p c 对5 1 0 个 消旋体进行手性拆分，其中2 2 9 个完全拆分，8 6 个部分拆分，这就是说，当时大 7 0 醢怂纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性妻分研究 约有6 2 的旋光物质能在3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯上进行拆分。近几年又有许 多消旋体在c d m p c a 得到手性拆分3 3 。引。 纤维素- - ( 3 ，5 二氯苯基氨基甲酸酯) 也有优异的手性识别性能，但其易溶性 限制了它的使用，直到键合型c s p s 的出现才解决了这个问题。 h x = h ，4 - c h 3 ，3 - c h 3 ，2 - c h 3 ，4 - c h 3 c h 2 ，4 - ( c h 3 ) 2 c h ，4 - ( c h 3 ) 3 c ，4 - c h 3 0 ，4 - c 2 h 5 0 ， 3 一c i ，4 - ( c h 3 ) 2 c h o ，4 一( c h 3 ) 2 c h o ，4 - ( c h 3 ) 2 c h c h 2 0 ，4 - ( c h 3 ) 3 s i ，4 _ f 4 - c 1 ，2 - c 1 ， 4 一b r , 4 - i ，4 - c f 3 ，4 n 0 2 ，3 , 5 - ( c h 3 ) 2 ，2 , 5 ( c h 3 ) 2 3 , 4 一( c h 3 ) 2 ，2 , 6 - ( c h 3 ) 2 ，3 , 4 ，5 - ( c h 3 ) 3 ， 4 - p h - n = n ，3 ，5 - ( c h 3 h - 4 - c h 3 0 ，3 , 5 - f 2 ，3 , 5 - c 1 2 ，3 , 4 - c 1 2 ，2 ，6 - c 1 2 ，3 , 5 - ( c f 3 ) 2 ， 4 一f - 3 一c h 3 ，3 - f 一4 一c h 3 ，3 - f - 5 - c h 3 ，5 - f - 2 - c h 3 ，4 - c 1 - 3 - c h 3 ，4 - c 1 - 2 - c h 3 ， 3 一c 1 4 - c h 3 ，3 一c 1 - 2 一c h 3 ，3 - c 1 5 c h 3 ，2 一c 1 4 一c h 3 ， 2 - c 1 - 5 - c h 3 ，2 一c 1 - 6 - c h 3 ， 5 一c l 一2 - c h 3 ，3 - b r 一5 一c h 3 图1 3 纤维素苯基氨基甲酸酯类衍生物的结构 f i g 1 - 3s t u c t u r e so fc e l l u l o s et r i s p h e n y i c a r b a m a t e s ( 3 ) 纤维素烷基氨基甲酸酯类衍生物 由于缺乏有序的超分子结构，取代基位阻小的已经制备的几个纤维素环烷基 氨基甲酸酯和环烷基酯类衍生物( 图1 4 ) 都有较好的手性识别能力【3 9 - 4 1 1 。纤维素烷 基氨基甲酸酯类衍生物如甲基氨基甲酸酯和异丙基氨基甲酸酯的手性识别能力 很低，但是某些取代基位阻大的纤维素环烷基氨基甲酸酯类衍生物、环烷基酯类 衍生物和芳烷基氨基甲酸酯却有很高的手性识别能力，由于纤维素环烷基氨基甲 酸酯衍生物在紫外区没有吸收，特别适合于t l c ，能快速地为h p l c 建立手性拆 分条件。 若干个纤维素芳烷基氨基甲酸酯衍生物( 图1 5 ) 也被研究用作c s p s 。它们中 大部分几乎没有手性识别能力，但是纤维素1 苯乙基氨基甲酸酯和1 苯丙基氨基 甲酸酯却显示出独特的手性识别能力，这可能与这两个衍生物高度有序的结构有 关。纤维素- - ( 1 苯乙基氨基甲酸酯) 的手性拆分能力在很大程度上取决于芳烷基 的手性，其( e ) 和( r s ) 构型的手性识别能力要高于( s ) 构型，可见c s p s 的手性拆分 能力对空间适应性的严格要求。 8 0 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 龇翘勺，qr 髟习 图l 一4 纤维素环烷基氨基甲酸酯和酯类衍生物的结构 f i g 1 - 4s t r u c t u r e so fc y c l o a l k y l c a r b a m a t e sa n dc y c l o a l k y l c a r b o x y l a t e so fc e l l u l o s e ( 4 ) 纤维素芳烷基氨基甲酸酯衍生物 o k a m o t o 掣4 2 1 制备了纤维素苯基碳酸酯、苯甲酰甲酸酯、对甲苯磺酰基氨基 甲酸酯和5 个苯甲酰氨基甲酸酯类衍生物等若干个不同于以上种类的纤维素衍生 物，并考察了它们的手性识别能力。 肛一h 2 c - - o 。c 肛，卜，c s 卜一h ? o ( r s ? q ，一h c 旬，卜一罕。卜叫? 弋，一h c 飞乡，c 髂卜一罕q c 2 h 5 c h c h 3 k 一一罕 卜c i ( 州r s ) - , ( s ) - 一h 罕q 一 一罕勺，c 骼卜一罕口呲 亡h 3 c h 3 图l - 5 纤维素芳烷基氨基甲酸酯类衍生物的结构 f i g 1 - 5s t r u c t u r e so fa r y l a l l 呵l c a r b a m a t e so fc e l l u l o s e 纤维素衍生物手性固定相的制备方法如下： 1 ) 纯聚合物型固定相 第一个用作c s p s 的纤维素衍生物是纯聚合物形式的c t a i 。f r a n c o t t e 等 4 3 1 制 备了c t b 及其衍生物颗粒，都直接用作h p l c 的c s p s 。这些纯聚合物型c s p s 都有 较高的手性识别能力，由于样品载荷量大，特别适合于制备分离，但这种没有无 9 。缝懋 纤维素衍生物手性微柱液相色谱系统制备及手性拆分研究 机载体的c s p s 强度有限，难以适用于高压场合。i k a i 等m 】制备了部分取代的纤维 素( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 微珠，并用4 ，4 二苯基甲烷二异氰酸酯交联，所 制得的交联型纤维素( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 微珠不仅样品载荷量大，而且 可以使用非极性较强的溶剂如氯仿作为流动相。 2 ) 涂敷型固定相 涂敷型c s p s 是将纤维素衍生物涂敷于大孔硅胶等载体而制成的固定相，是 目前的纤维素衍生物c s p s 应用最多的一类，已商品化的纤维素类c s p s 绝大部分 是此类。这种涂敷的方法最早由o k 锄o t 0 等【4 5 】开发用于( + ) 聚甲基丙烯酸三苯甲 烷( ( + ) p t r m a ) ，后来o k 锄o t 0 【2 8 】和i c h i d a 等2 9 】分别将这种方法用于c t a ，制成的 c s p s 有着特别的手性识别能力。这一发现促使大量的纤维素衍生物被制备，并 涂敷于硅胶等基质用作c s p s 。硅胶等载体的使用大幅度提高了c s p s 的力学性能 和柱效，并能提高手性拆分能力。这种c s p s 的性能受很多因素影响，如硅胶粒 径、孔径和比表面积、涂敷溶剂、涂敷方法和涂敷量。涂敷型c s p s 有一个缺点 就是纤维素衍生物能溶于极性有机溶剂，如四氢呋喃和氯仿，所以使用涂敷