（生物化学与分子生物学专业论文）建立糖链长度可调节的大肠杆菌n连接糖基化系统.pdf

l 吣y 1 m 7 帆9 帆眦1 吣2 眦0 l 8 l l 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任 由本人承担。 论文作者签名：谲一日期：型! ：圭兰! 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电 子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盟导师签名：进日 期： f刀 z o ，o 孓，少了 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i i 符号说明v 第一章绪论1 1 0 引言1 1 1 真核连接糖基化途径2 1 1 1 内质网中的- 连接糖基化过程2 1 1 2 高尔基体中糖链的进一步加工与修饰4 1 1 3 真核- 连接糖基化的特征5 1 2cl e j u n i 中的- 连接糖基化系统：5 1 2 1 原核生物中的蛋白糖基化修饰5 1 2 2ci e j u n i 同时具有- 连接与d 连接糖基化系统5 1 2 3c j e j u n i 中- 连接糖基化一t , g t 途径的发现6 1 2 4c j e j u n i 中的p g l 途径7 1 2 5 细菌o s t p g l b 9 1 3ec o l io - p s 1 2 1 3 1 细菌表面多糖一1 2 1 3 2ec o l il p s 1 2 1 3 3ec o l i0 p s 的结构1 4 1 3 4ec o l i0 p s 的合成1 5 1 3 5ec o i l0 8 6 ：b 7 与h 2 中的o p s 1 7 1 4 糖蛋白缀合物疫苗1 9 1 4 11 1 与t d 抗原1 9 1 4 2 多糖疫苗2 0 1 4 - 3 糖蛋白缀合物疫苗2 l 1 4 4 糖蛋白缀合物疫苗的化学合成2 5 第二章ec o l i n - 连接糖基化系统的建立2 5 2 0 引言2 5 2 1 实验材料2 6 2 1 1 基因组、菌株、质粒及小鼠2 6 2 1 2 酶、试剂及耗材2 6 2 1 3 培养基与缓冲液2 8 2 1 4 引物2 9 2 1 5 主要仪器3 0 2 2 实验流程3l 2 3 实验方法3 2 2 3 1 抗a c r a 多抗的制备3 2 2 3 2 巨c o l in - 连接糖基化系统的建立3 5 2 4 结果与讨论3 8 2 4 1 抗a c r a 多抗的制备3 8 2 4 2ec o l in - 连接糖基化系统的建立4 0 2 5 小结4 6 2 6 本章创新性4 8 第三章重塑ec o i ln - 连接糖基化系统中o p s 的长度4 9 3 o 引言4 9 3 1 实验材料5 0 3 1 1 菌株与质粒一5 0 3 1 2 酶、试剂及耗材一5 l 3 1 3 培养基与缓冲液一5 l 3 1 4 引物一5 l 3 1 5 主要仪器5 l 3 2 实验流程5 3 3 3 实验方法5 4 3 3 1 敲除w , z ：z b 7 基因获得重组子b 7 2 5 4 3 3 2w z z h 2 与w z z b 7 的克隆5 4 3 3 3p g l b 、a c r a 、w z z m 及w z z a 7 在b 7 2 中的表达5 5 3 3 4w e s t e r nb l o t 分析a c r a 糖基化5 6 3 4 结果与讨论5 7 3 4 1 敲除w 2 z b 7 基因获得重组子b 7 2 5 7 3 4 2w z z h 2 与w z z b 7 的克隆5 7 3 4 3p g l b 、a c r a 、w z z m 及w z z b 7 在b 7 2 中的表达5 8 3 4 4w e s t e r nb l o t 分析a c r a 糖基化5 9 3 5 小结6 l 3 6 本章创新性6 3 第四章一步生物法生产糖蛋白缀合物疫苗的初步探索一6 5 4 0 引言6 5 4 1 实验材料6 6 4 1 1 菌株与质粒6 6 4 1 2 酶、试剂及耗材一6 6 4 1 3 培养基与缓冲液6 6 4 1 4 引物6 9 4 1 5 主要仪器6 9 4 2 实验流程7 l 4 3 实验方法7 2 4 3 1 仉与c r m l 9 7 的表达与纯化7 2 4 3 2 一步法生产糖蛋白缀合物疫苗7 3 4 4 结果与讨论7 4 4 4 1t t c 与c r m l 9 7 的表达与纯化7 4 4 4 2 一步法生产糖蛋白缀合物疫苗7 5 4 5 小结7 9 4 6 本章创新性8 l 第五章p g m 性质的初步研究8 3 5 0 引言8 3 5 1 实验材料8 4 5 1 1 菌株与质粒8 4 5 1 2 酶、试剂及耗材8 5 5 1 3 培养基与缓冲液8 5 5 1 4 引物8 5 5 1 5 主要仪器8 5 5 2 实验流程8 6 5 3 实验方法8 7 5 3 1t p g l b s 的克隆8 7 5 3 2t p g l b s 与a c r a 的共表达8 7 5 3 3w e s t e r nb l o t 分析t p 哲b s 活性8 7 5 4 结果与讨论8 8 5 4 1t p g l b s 的克隆8 8 5 4 2w e s t e r nb l o t 分析t p g l b s 活性8 8 5 5 小结9 0 5 6 本章创新性9 l 全文总结9 3 附录和附表9 7 l r e d 重组技术基因敲除原理9 8 h克隆t i c 、c r m l 9 7 及其突变体所需引物、模板、载体及重组质粒命名9 8 i i i 利用n e t n g l y c1 0s e r v e r 对耵c 、c r m l 9 7 进行- 糖基化位点预测9 9 i v 向t t c 与c r m l 9 7 引入的氨基酸及对应碱基序列1 0 0 vc r o s s o v e rp c r 技术原理1 0 0 v i t t c 、c r m l 9 7 突变体向载体p b a d 2 4 中的构建1 0 1 1 1 1 v i i t t c 、c r m l 9 7 突交体的蛋白序列1 0 1 v i i it p g l b s 向p b a d 2 4 中的构建示意图1 0 3 i x p g l bt m h m m 模型中穿膜a 螺旋对应的氨基酸位置1 0 4 参考文献1 0 5 致谢1 1 5 攻读学位期间发表的学术论文目录1 1 7 外文论文1 1 9 c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i a b s t r a c t i i i s y m b o l a b b r e v i a t i o n s v c h a p t e rii n t r o d u c t i o n 1 1 0b a c k g r o u n d 1 1 1e u k a r y o t i cn - g l y c o s y l a t i o np a t h w a y 2 1 1 1n - g l y c o s y l a t i o np a t h w a yi ne r 2 1 1 2f u r t h e rp r o c e s s i n ga n dm o d i f i c a t i o no f t h en - g l y c a n si ng o l g i 4 1 1 3c h a r a c t e r i s t i c so f e u k a r y o t i cn - g l y c o s y l a t i o n 一5 1 2n - g l y e o s y l a t i o np a t h w a yi nc j e j u n i 5 1 2 1p r o t e i ng l y c o s y l a t i o nm o d i f i c a t i o n si np r o k a r y o t e s 5 1 2 2 n - a n do - g l y c o s y l a t i o ns y s t e m si nc j e j u n i 5 i ，2 3d i s c o v e r yo f t h en - g l y c o s y l a t i o n p g tp a t h w a y mc j e j u n i 6 1 2 4 p g tp a t h w a yi nc j e j u n i 7 1 2 5b a c t e r i mo s t 。p g l b 9 1 3ec o i lo - p s s 1 2 1 3 1b a c t e r i a ls u r f a c ep o l y s a c c h a r i d e s 1 2 1 3 2ec o i ll p s 1 2 1 3 3s t r u c t u r eo f o - p s si nec o i l 一1 4 1 3 4b i o s y n t h e s i so f o - p s si nec o i l 1 5 i 3 5o p s si nec o l i0 8 6 ：b 7a n dh 2 1 7 1 4s u g a r - c o n j u g a t e dv a c c i n e s 1 9 1 4 1t ia n dt da n t i g e n s 1 9 1 4 2p o l y s a c c h a r i d ev a c c i n e s 2 0 1 4 3s u g a r - c o n j u g a t e dv a c c i n e s 2 1 1 4 4c h e m o s y n t h e s i so f s u g a r - c o n j u g a t e dv a c c i n e s 2 5 c h a p t e r2e s t a b l i s h m e n to f n - g l y c o s y l a t i o ns y s t e mi nec o l i 2 5 2 0b a c k g r o u n d ：! ! ； 2 1m a t e r i a l s ：1 6 2 1 1g e n o m e s ，s t r a i n s p l a s m i d sa n dm i c e 2 6 2 1 2e n z y m e sa n dr e a g e n t s 2 6 2 1 3m e d i u m sa n db u 虢r s 2 8 2 1 4p r i m e r s 2 9 v 2 1 5p r i m e r s 。3 0 2 2e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s 3 l 2 3m e t h o d s 3 2 2 3 1p r e p a r a t i o no f a n t i - a e r ap c a b 3 2 2 3 2e s t a b l i s h m e n to f n - g l y c o s y l a t i o ns y s t e mi nec o i l 3 5 2 4r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 3 8 2 4 1p r e p a r a t i o no f a n t i - a c r ap c a b 3 8 2 4 2e s t a b l i s h m e n to f n - g l y c o s y l a t i o ns y s t e mi nec o l i 4 0 2 ! ；c o n c l u s i o n 4 6 2 6i n n o v a t i v e n e s s ，4 8 c h a p t e r3r e m o d e l i n gt h ec h a i nl e n g t ho ft h e0 - p si nt h ee s t a b l i s h e d n - g l y c o s y l a t i o ns y s t e m 4 9 3 0b a c k g r o u n d 4 9 3 1m a t e r i a l s ! ；0 3 1 1s t r a i n sa n dp l a s m i d s 5 0 3 1 2e n z y m e sa n dr e a g e n t s 5 1 3 1 3m e d i u m sa n db u f f e r s 5 l ：；1 4p r i m e r s 5 l ：；1 5p r i m e r s ! ；1 3 2e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s 5 3 3 3m e t h o d s 5 4 3 3 1k n o c k o u to f w z z 8 7 f o rr e c o m b i n a n tb 7 2 5 4 3 3 2c l o n i n go f w z z m a n dw z z b 7 5 4 3 3 3e x p r e s s i o no f p g l b ，a c r a ，w z z ma n dw z z b 7i nb 7 2 5 5 3 3 4a n a l y s i so f g l y c o s y l a t e da c r a sb yw e s t e t t tb l o t 5 6 3 4r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n ! ；7 3 4 1k n o c k o u to f w z z b 7f o rr e c o m b i n a n tb 7 2 5 7 3 4 2c l o n i n go f w z z ma n dw z z b 7 5 7 3 4 3e x p r e s s i o no f p g l b ，a c r a ，w z z ma n dw z z b 7i nb 7 2 5 8 3 4 4a n a l y s i so f g l y c o s y l a t e da c r a sb yw e s t e r nb l o t 5 9 3 5c o n c l u s i o n 6 l 3 6i n n o v a t i v e n e s s 6 ：； c h a p t e r4t e n t a t i v es t u d yo fo n es h o ta p p r o a c ht op r o d u c es u g a r - c o n j u g a t e d v a c c i n e s 6 1 ； 4 0b a c k g r o u n d ，6 5 4 1m a t e r i a l s 6 6 4 1 1s t r a i n sa n d p l a s m i d s 6 6 v l 4 1 2e n z y m e sa n dr e a g e n t s 6 6 4 1 3m e d i u m sa n db u f f e r s 6 6 4 1 4p r i m e r s 6 9 4 i 5p r i m e r s 6 9 4 2e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s 7 l 4 3m e t h o d s 7 2 4 3 1e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f l r r r ca n dc i wl9 7 7 2 4 3 2o n e - s h o ta p p r o a c ht op r o d u c es u g a r - c o n j u g a t e dv a c c i n e s 7 3 4 4r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 7 4 4 4 1e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f r r ca n dc i 洲1 9 7 7 4 4 4 2o n e - s h o ta p p r o a c ht op r o d u c es u g a r - c o n j u g a t e dv a c c i n e s 7 5 4 5c o n c l u s i o n 7 9 4 6i n n o v a t i v e n e s s 8 1 c h a p t e r5t e n t a t i v es t u d yo ft h ec h a r a c t e r i s t i c so f p g l b 8 3 5 0b a c k g r o u n d 8 3 5 1m a t e r i a i s 8 4 5 1 1s t r a i n s a n d p l a s m i d s 8 4 5 1 2e n z y m e sa n d r e a g e n t s 8 5 1 ；1 3m e d i u m sa n db u f f e r s 8 5 5 1 4p r i m e r s 8 5 5 1 5p r i m e r s 8 5 5 2e x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s 8 6 5 3m e t h o d s 8 7 1 ；3 1c l o n i n go f t p g l b s ：8 7 5 3 2c o e x p r e s s i o no f t p g l b sa n da c r a 8 7 5 3 3a n a l y s i so f t h ea c t i v i t i e so f t p g l b sb yw e s t e r nb l o t 8 7 5 4r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 8 8 5 4 1c l o n i n go f t p g i b s 8 8 5 4 2a n a l y s i so f t h ea c t i v i t i e so f t p g l b sb yw e s t e r nb l o t 8 8 5 5c o n c l u s i o n 9 0 5 6i n n o v a t i v e n e s s 9 1 s u m m a r y 9 3 a p p e n d i c e s 9 7 i m e c h a n i s mo f r e dr e c o m b i n a n ts y s t e m 9 8 1 1 p r i m e r s ，t e m p l a t e s ，v e c t o r sa n dr e n a m eu s e di nc l o n i n g t t ca n dc r m l 9 7m u t a n t s 9 8 i i ip r e d i c t i o no f n - g l y c o s y l a t i o ns i t e so f t t ca n dc r m19 7b yn e t n g l y c1 0s e r v e r 9 9 v l l i va m i n oa c i da n dn u c l e o t i d es e q u e n c e si n t r o d u c e di n t or r ca n dc l 洲1 9 7 1 0 0 vm e c h a n i s mo f c r o s s o v e rp c r 1 0 0 v ic l o n i n go f t t ca n dc r m l 9 7m u t a n t st op b 艘4 1 0 1 ia m i n oa c i ds e q u e n c e so f r r ca n dc r m l 9 7m u t a n t s 1 0 1 i ic l o n i n go f t p g l b st op b a d 2 4 1 0 3 i xt h el o c a t i o no f t ma h e l i x si nt m h m mm o d e io f p g l b 1 0 4 r e f e r e n c e s 1 0 5 a c k n o w l e d g m e n t s 1 1 5 l i s to fp u b l i c a t i o n s 1 1 7 e n g l i s hd l s s er r a t i o n 1 1 9 v i l l 中文摘要 空肠弯曲菌c a m p y l o b a c t e r j e j u n i 为侵染人类消化道粘膜的致病菌，是引起细菌性 腹泻的主要诱因之一。1 9 9 9 年，s z y m a n s k i 等人首次在c j e j u n i 中发现了编码- 糖基 化途径的p g l 基因簇。原核- 连接糖基化系统的发现，尤其是原核寡糖基转移酶( o s t ) p g l b 的发现，为利用原核表达系统合成- 连接糖蛋白提供了一条新的方法。 c e j u n i 中的连接糖基化途径同ec o l i 中w z y - d e p e n d e n t 途径进行的o - p s 合 成过程极为相似，首先在胞质内由各种糖基转移酶向包埋于质膜的u n d e c a p r e n o l 上依 次添加不同的单糖形成寡糖前体。寡糖前体经翻转酶翻转到周质空间后，或由细菌寡 糖基转移酶( o s t ) p 酉b 将寡糖前体转移到蛋白底物中，或经多聚化为o p s 后被。 抗原连接酶w a a l 连接到类脂a 核心寡糖上形成l p s 。这种相似性为将两个途径相结 合，以o - p s 代替c j e j u n i 中的七糖前体提供了理论基础，而p g l b 相对宽松的底物特 异性将这一设想变成了现实。本文就利用细菌o s tp g l b 建立ec o l # n - 连接糖基化系 统、一步生物法生产糖蛋白缀合物疫苗、以及p g l b 的性质等三方面展开研究。 敲除ec o l i0 8 6 ：k 6 1 ：b 7 中w a a l 基因得到重组菌b 7 1 2 ，使连接在脂载体上的o p s 在周质空间内积累。将来源于c j e j u n i n c t c1 1 1 6 8 的p g l b 和a c r a 克隆到b 7 1 2 后， p g l b 能够催化积累在周质空间内的o p s 向a c r a 的转糖基反应，获得带有0 8 6 ：b 7 o p s 的a c r a ( a c r a 0 p s ) 。本文利用细菌o s t 成功地建立了ec o l in - 连接糖基化 系统，为以下工作的展开创造了平台。 在o p s 合成过程中，o 抗原长度决定蛋白w z z 在o p s 聚合时负责控制链长， 不同的ec o l i 菌株由于w z z 不同而具有链长不等的0 p s 。本文用于建立ec o l i n - 连 接糖基化系统的0 8 6 ：b 7 具有较短链长的o p s ，同为0 8 6 血清型的另一菌株0 8 6 ：h 2 则具有中等链长的o p s 。将w z z b 7 替换为w z z m 后，显著地增加了a c r a - o p s 中o - p s 的糖链长度。因此，糖链长度可调节的ec o l i n - 连接糖基化系统得以成功构建。 利用ec o l i n - 连接糖基化系统，可以将细菌o p s 以糖链的形式连接到蛋白上， 这种糖蛋白缀合物可以用作预防细菌感染的疫苗。为此，将ec o l in - 连接糖基化系 统中的蛋白底物由模式蛋白a c r a 替换为广泛使用的疫苗载体蛋白破伤风毒素c 片段 亿和白喉毒素无毒突变体c r m l 9 7 ，并向两者中引入p 寸b 的糖基化位点，对一步生 物法合成糖蛋白缀合物进行了初步探索。 利用t m h m m 软件预测p g l b 的n 端具有1 1 个穿膜舡螺旋。本文还构建了缺失 第1 个、第l - 5 个、第1 8 个和第1 1 1 个穿膜仅螺旋的截短p g l b 突变体( t p g l b s ) p 1 、 p 5 、p 8 和p ll ，并利用e f fn - 连接糖基化系统对上述截短p g l b 突变体进行转糖基 活性检测，发现这些截短p g l b 突变体均失去了转糖基活性，说明n 端结构域对p g i b 的转糖基活性至关重要。 总之，糖链长度可以调节的ec d 疗n - 连接糖基化系统的建立为生产糖蛋白缀合 物疫苗开辟了新的途径。研究表明将这些细菌o p s 共价连接到载体蛋白以后得到的 糖蛋白缀合物能够有效地激发机体产生t d 免疫应答，保护人体免受细菌感染。目前 普遍应用于生产的两步化学法合成糖蛋白缀合物疫苗具有多次发酵纯化、成本高昂等 缺点。而本文建立的一步生物法合成糖蛋白缀合物疫苗仅需一次发酵、纯化就能够得 到结构一致的缀合物；且可作为生产糖蛋白缀合物疫苗的平台，通过进一步的基因工 程改造，可以获得连接有不同细菌来源的多糖蛋白缀合物疫苗，具有较高的应用价值。 关键词：寡糖基转移酶p g | b ，n - 连接糖基化，o 多糖，糖链长度，糖蛋白缀合 物疫苗 a b s t r a c t a sak i n do fh u m a ng a s t r o e n t e r i cp a t h o g e n , c a m p y l o b a c t e r j e j u n ii so n eo ft h em a i n c a u s e so fd i a r r h e a i n19 9 9 ，s z y m a n s k ie ta 1 f o u n dap g lc l u s t e rw h i c he n c o d e st h e n - g l y c o s y l a t i o np a t h w a yi nt h eg e n o m eo fc j e j u n i t h en - g l y c o s y l a t i o np a t h w a yo fc j e j u n i h a s s i g n i f i c a n t s i m i l a r i t i e sw i t ht h e w z y - d e p e n d e n ts y n t h e s i sp a t h w a y o f o - p o l y s a c c a r i d e ( o p s ) i ne s c h e r i c h i a c o l i i nt h e c y t o p l a s m ，d i f f e r e n tk i n d s o f g l y