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摘要 基于辅因子法对辣根过氧化物酶的化学修饰 专业：无机化学 硕士生：程学礼 指导教师：计亮年院士 摘要 辣根过氧化物酶( h i 冲) 是一种高效生物催化剂，可以在有过氧化氢或有机 过氧化物的存在下催化氧化芳香族化合物。具有来源广泛、催化效率高、专一性 强、无污染等优点，被广泛地应用于污水处理、有机合成、环境检测和食品工业 等领域。但由于存在着对酸、碱、热、氧化剂、有机溶剂和重金属离子稳定性差， 在有机相中的催化效率比在水相中低几个数量级等诸多缺陷，使其在工业生产中 的应用受到限制。为了改善辣根过氧化物酶的稳定性和催化活性，我们在查阅和 分析了大量有关文献的基础上，确立了用辅因子修饰法对辣根过氧化物酶进行分 子改造，以改善和提高辣根过氧化物酶的催化活性。并从动力学、热力学和蛋白 质溶液构象等几方面对这种改善和提高提出了初步的解释。论文的主要内容包 括： 1 用天然辣根过氧化物酶的活性中心血红素分别与l 组氨酸甲酯、l 谷氨 酸甲酯发生成肽反应得到了五种新的血红素衍生物( h e m e h i s o m e ， h c m e b i s ( h i s h ) ，h e m e - g l u , h o m e b i s ( g | u h ) ) ，并用电喷雾质谱、紫外可见吸收 光谱手段进行了表征，确认了它们的结构。 2 将合成的血红素衍生物分别与脱辅基的辣根过氧化物酶( a p o h r p ) 重 组得到五种新的重组酶( h r p h i s o m e ，h r p b i s ( h i s h ) ，h r p 。g l u ， h r p b i s ( g l u h ) ) 。通过酶活测定发现，五种重组酶中只有其中重组酶 h r p b i s ( h i s h ) 和h r p g l u 的活性较天然酶有提高。且h r p b i s ( h i s h ) 和h r p g l u 在水相中催化氧化苯酚的活性分别是天然辣根过氧化物酶的1 1 6 和1 2 9 倍。我 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文 们迸行了重组酶热稳定性，有机溶剂中的稳定性，酸碱稳定性以及在有机溶剂中 的催化活性的测定，结果表明重组酶的稳定性和催化活性比天然酶有不同程度的 提高。动力学测定表明，重组酶的k 。值较天然酶低雨k k 。值较天然酶高，说 明重组酶对底物的亲和力和催化效率比天然酶提高。 3 为了研究蛋白质溶液构象的变化，我们用紫外一可见光谱、圆二色谱、 荧光光谱等手段对重组辣根过氧化物酶和天然辣根过氧化物酶进行了光谱测定。 光谱数据表明重组辣根过氧化物酶的a 螺旋结构增强，同时芳香族氨基酸周围的 三级结构成分发生了改变。 关键词：辣根过氧化物酶辅因子修饰催化活性熟稳定性动力学常数 光谱 h a b s t t a c t c h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e w i t hc o f a c t o rr e c o n s t i t u t i o n m a j o r ：i n o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：c h e n gx u e l i s u p e r v i s o r ：p o f e s s o rj il i a n g n i a n a b s t r a c t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei sak i n do fe f f i c i e n tb i o c a t a l y s t ，w h i c hc a t a l y z e st h e o x i d a t i o no fa r o m a t i cc o m p o u n d sb yh y d r o g e np e r o x i d eo ra l k y lh y d r o p e r o x i d e i t w a sw i d e l ya p p l i e di nt h es y n t h e s i so fo r g a n i cc h e m i c a l s , e n v i r o n m e n t a ld e t e c t i o n , f o o di n d u s t r ya n dt h er e m o v a lo ft o x i cp h e n o l i c s 如mw a s t e w a t e rf o ri t sa d v a n t a g e s s u c ha sa b u n d a n ts o u r c e ，h i g he f f f i c i e n c y , l o wp o l l u t i o ne t c b u td u et ot h e i rl o w e r s t a b i l i t yi nt o l e r a n c eo fa c i d s ，b a s e s ，h i g ht e m p e r a t u r e ，h e a v ym e t a li o n sa n dl o w e r c a t a l y t i ca c t i v i t yi no r g a n i cs o l v e n t st h a ni nw a t e r , t h ec o m m e r c i a lu s eh a sb e e n l i m i t e d i no r d e rt oe n h a n c ee n z y m es t a b i l i t y ( t h e r m o s t a b i l i t y , p ha n dt o l e r a n c eo f o r g a n i cs o l v e n t s ) a n dc a t a l y t i ce f f i c i e n c y , c h e m i c a l m o d i f i c a t i o no fh r pw a s i n v e s t i g a t e d ，a n di nt h i sp a p e rw em a i n l ya p p l i e dt h ec o f a c t o rr e c o n s t i t u t i o n t o i n v e s t i g a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f t h es t a b i l i z a t i o n , t h ec h a n g e sb e t w e e n n a t i v e a n dm o d i f i e de n z y m e sw e r e s t u d i e d u s i n gk i n e t i c s ，t h e r m o d y n a m i c s a n d s p e c t r o s c o p i cm e t h o d o l o g y o u rm a i nr e s u l t sa l ea 8f o l l o w s ： 1 f i v en e wh e i n ed e r i v a t i v e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e db yc o n d e n s a t i o no f l h i s t i d i n em e t h y le s t e ro rl g l u t a m i ca c i dm e t h y le s t e ro nt h ep r o p i o n i ca c i d s i d e ，c h a i n so fh e i n e a n dt h e s ef i v ec o m p l e x e sw e r em a r k e da sh e m e - h i s o m e ， h e i n e b i s ( h i s h ) ，h e m e 一( g l u ) ，h e m e b i s ( g l u h ) a l lo ft h e mw e r ec h a r a c t e r i z e db y l m sa n du v - v i s 1 1 1 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文 2 t h e s eh e m ed e r i v a t i v e sw e f er e c o n s t i t u t e dw i t ht h ea p o h r pa n da c h i e v e d f i v en e wr e c o n s t i t u t e dh r p s a m o n gt h e s ef o u rn e we n z y m e s , o n l yt h eh r p s r e c o n s t i t u t e dw i t hh e m e - b i s ( h i s h ) a n dh e m e - ( g l u ) h a dh i g h e rc a t a l y t i ce f f i c i e n c y t h a nn a t i v eh r p , t h a tw e r e1 1 6 - f o l da n d1 2 9 - f o l di n c r e a s e r e s p e c t i v e l y t h e t h e n n o 或a b i l i t ya s s a ys h o w e dt h a tt h e i rt h e r m a ls t a b i l i t yb o t hi nw a t e ra n do r g a n i c s o l v e n t sw e r ee n h a n c e d a n dt h et o l e r a n c ei na c i d s ，b a s e sw e r ea l s oe n h a n c e d t h e k i n e t i c so ft h ec a t a l y t i co x i d a t i o no fp h e n o l i cs u b s t r a t e sb yh y d r o g e np e r o x i d ei n p r e s e n c eo ft h e s en e wh r p sw e r es t u d i e di n1 0 m mp h o s p h a t eb u f f e r ( p h7 o ) a t r o o mt e m p e r a t u r e t h em o d i f i c a t i o ni n c r e a s e dt h es u b s t r a t ea f f i n i t y ( k i n ) a n dt h e c a t a l y t i ce f f i c i e n c y ( k c 毗k m ) b o t hi nw a t e ra n ds o m eo r g a n i cs o l v e n t s 3 u v - v i s ，c da n df l u o r e s c es p e c t r aw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ee n v i r o n m e n to f t h eh e m e t h em o d i f i c a t i o nc h a n g e dt h ee n v i r o n m e n to fb o t hh e m ea n dt r y p t o p h a n , i n c r e a s e dc t - h e l i xc o n t e n to fh r pa n dc h a n g e dt h et e r t i a r ys t r u c t u r ea r o u n dt h e a r o m a t i ca c i dr e s i d u e si nh p p k e y w o r d s ：h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ；e o f a e t o rr e e o n s t i t u t i o n ；c a t a l y t i ca c t i r i t y ； t h e r m o s t a b i l i t y ；k i n e t i c s ；s p e c t r a 第1 章前言 第1 章前言 1 1 辣根过氧化物酶的结构和性质 1 1 1 辣根过氧化物酶的结构 辣根( h o r s e r a d i s h ) 是一种常年生香草，在世界大部分温和地区都有种植。 它的根主要用来做调味品，同时也是辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ， h r p ) 的主要来源。辣根过氧化物酶属于过氧化物酶超家族，在过氧化物酶 ( p e r o x i d a s e ，p x ) 中以辣根过氧化物酶的结构和作用机理研究地较为成熟和透 彻。它含有一个i 1 3 0 8 个氨基酸残基构成的单一肽链( 分子量为4 4k d ) ，其氨基 酸序列已f l j w e l i n d e r l 1 等测得。其n 一末端连着一个固定的吡咯烷酮羧基，而c 末端 连着的丝氨酸却经常丢失。在这条链中有四个由两分子半胱氨酸组成的二硫键， 它们分别是1 卜9 1 ，4 4 4 9 ，9 7 3 0 1 以及1 7 7 2 0 9 之间；同时还存在一个r - h a s p 9 9 和a r 9 1 2 3 组成的盐桥。整条主链上有九个潜在的糖基化点，而其中的八个已经被 占据。在整个多糖分子中，一个含有七个单糖的残基占了总体的7 5 8 0 ，但整 个多糖的构型却由于其他单糖的变化而变化。在这些小的单糖中，两端的g i c n a e 和中问的一些甘露糖残基是固定不变的。单塘在糖基化点上构型的变化也使整个 多糖的构型变的更为复杂。 辣根过氧化物酶的三级结构如图卜1 【2 l ，可以看出酶的结构大部分是n 一螺 旋，只有很少一部分是b 一折叠。在血红素平面上下两侧存在着两个空白区域， 该区域可能是由钙结合位点与其他结构元素共同作用而组成的，也可能是基因复 制后留下的产物。辣根过氧化物酶的中心上由三个a 一螺旋，其中两个( f 螺旋 和f ”螺旋) 的氨基酸序列和种类都表现出了很强的可变性，但由于c v s l 7 7 与 c y s 2 0 9 之间存在一个二硫键，使f 螺旋和f ”螺所组成的区域在整体结构上保持 了相对稳定。由于f 螺旋可能存在着底物的结合位点和通道，使许多研究h r p 的学者对该区域表现出了浓厚的兴趣；还有部分学者推测该区域对催化反应中生 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学札 成的基本产物的稳定性起着重要作用。 图1 1 辣根过氧化物酶的三维晶体结构 f i g 1 一1 t h r e e - d i m e n s i o n a lr e p r e s e n t a t i o no f t h ex r a yc r y s t a ls t r u c t u r eo f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s c i s o e n z y m ec ( b r o o k h a v e na c c e s s i o nc o d ei h s a ) t h eh e i n eg r o u p ( c o l o o r e di nr e d ) i sl o c a t e d b e t w e e nt h ed i s t a la n dp r o x i m a ld o m a i n sw h i c he a c hc o n t a i no n ec a l c i u ma t o m ( s h o w na sb l u e s p h e r e s ) a - h e l i c a la n db - s h e e tr e 百o a so f t h ee n z y m ea r es h o w ni np u r p l ea n dy e l l o w , r e s p e c t i v e l y t h ef a n df a - h e l i c e sa p p e a ri nt h eb o t t o mr i g h t - h a n dq u a d r a n to f t h em o l e c u l e 在觑红素平面的上下两侧存在着两个钙原子的结合位点，它们通过一个氢键 群与血红素结合区域相连。每个钙原子都是7 供氧配合体，它们能同时与主肽链 上含羰基的氨基酸，侧链上的a s p 、s e r 和t h r ，以及一个末端结构水分子结合。 钙离子的丢失将会导致h r p 活性和热稳定性的下降【3 l ，还能使血红素的构型发生 改变。h r p 含有两个不同的金属中心：正铁原卟啉( 即血红素) 和两个钙原子。 这两个金属中心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。血红素中铁原子的一个 轴向结合点与肽链上h i s l 7 0 侧链的n 原子结合，使血红素垂直连接在h i s l 7 0 上( 图 卜2 ) ；而卟啉铁的另一个轴向结合点在静态酶中则是空着的，有h 2 0 2 存在时， 该结合点就能与c o 、氰化物、氟化物或叠氮化物等小分子结合。这些小分子中 有些是以质子化了的形式存在的，这样它们还能通过氢键与a 职3 8 和h i s 4 2 结合， 使这些小分子更加稳定。 2 第1 章前言 图卜2 辣根过氧化物酶活性中心的结构特征 f i g 1 2s t r u c t u r a lc h a r a c t e ro f t h ea c t i v es i t eo f h r p 含有铁卟啉的蛋白质或酶在4 0 0a m 附近总存在一个非常强的吸收带( = 1 0 5 lm m o l 叫c m - 1 ) ，称为s o r e r 带或九带1 4 1 。其中h i 冲是非常典型的，天然的h r p 在4 0 2a m ( = 1 0 21m m o l 叫c m - 1 ) 处有特征的吸收光群卯。 酶活性中心的结构，不同来源的同类型p x 的氨基酸组成相似，这类p x 活性 中心除f e ( i i i ) 一原卟啉i x 基本结构外，还有一些重要的氨基酸残基。辣根过氧 化物酶的重要残基如下： 图i - 3 辣根过氧化物酶的重要残基 f i g1 - 3k e ya m i n oa c i dr e s i d u e si nt h eh e m e - b i n d i n gr e g i o no f h r p t h eh e m eg r o u pa n dh e i n e i r o na t o ma r es h o w ni nr e d ，t h er e m a i n i n gr e s i d u e si na t o mc o l o u r s h i s l 7 0 ，t h ep r o x i m a lh i s t i d i n e r e s i d u e , i sc o o r d i n a t e dt ot h eh e i n ei r o na t o mw h e r e a st h ec o r r e s p o n d i n gd i s t a lc o o r d i n a t i o ns i t e a b o v et h ep l a n eo f t h eh e i n ei sv a c a n t 3 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学礼 其中p h e 4 1 、h i s 4 2 、a r 9 3 8 = 个配体为远端配体，a s n 7 0 、h i s l 7 0 、a s p 2 4 7 三个配体为近端配体。轴向配体一个是h i s l 7 0 的咪唑氮，另一个位置是空的。由 此可使得f e 呈s = 5 2 的高自旋态。该空位与它相对的h i s 4 2 的咪唑基共同起着调 控铁的反应活性的作用。实验证明h i sn 1 h 或失去质子、或通过氢键与底物结合。 这种解质子作用可能在使p x 稳定在高氧化态中起作用。目前已知p x 中血红素平面 上方的远端空穴是h 2 0 2 的作用位点，该位点包含两个保守氨基酸残基一远端h i s 和远端a r g ，它们共同构成一个亲水性口袋结构，p x 中血红素的疏水性五配位态 是由远端空穴的特殊性质和近端h i s 残基的强配位性共同决定的，尤其是后者使 f e 偏离血红素平面，而防止了水分子从另一侧轴向位置与血红素结合配位。另外， 远端空穴的亲水性口袋结构可借助氢氢键网和f e - n 8 2 键的共同作用，稳定周围环 境的水分子，使其不能与f e 原子结合配位。由于活性中心的疏水性，我们认为提 高其疏水性可能会提高它在有机溶剂里面的催化活性。 1 1 2 辣根过氧化物酶的性质 由辣根过氧化物酶( h r p ) 催化1 6 1 的多数反应可由以下等式表示： 2 a h + h 2 0 2 a 2 + 2 h 2 0 其中a h 是还原性底物，包括芳香族化合物，酚类化合物，吲哚，胺类和磺酸 盐。该反应是通过一个二质子二电子还原过程进行的，反应过程可以描述为： h e m e f e ( i i i ) 】( p + h 2 0 2 h e m e o = f e ( i v ) - 购唧i ) + h 2 0 ( 1 - 1 ) h e m e o = f e ( i v ) 一r + l ( c o m pi ) + a h + h e m e 【o = f c ( i v ) ( r o m pi i ) + a ( 1 2 ) h e m e o = f e ( i v ) ( e o m pi i ) + a h h e m e f e ( 1 1 1 ) ( p x ) + a ( 1 - 3 ) 2 a a 2 ( 或在底物为a h 2 时歧化生成a 2 + a 2 h 4 ) ( 1 4 ) c o m pi 的形成机制阴如图卜4 所示： 4 第1 章前言 图1 - 4 络合物( i ) 的形成机制 f i g 1 4 m e c h a n i s mo f c o m p o u n dif o r m a t i o ni np e r o x i d a s e sp r o m o t e db yg e n e r a la c i d - - b a s e c a t a l y s i so f p o l a rr e s i d u e si nt h ea c t i v es i t e 催化循环的第一步是h 2 0 2 和静态酶中的f e ( 1 1 1 ) 反应生成化合物i ( c o m pi ) ( c o m p i 形成过程如图) ，e o m p i 是一个高氧化态的催化中间体，包含一个含氧f e ( i v ) 中心和一个带正电荷的卟啉。c o m pi 再结合一分子还原性底物，生成另一个 含有含氧f c ( i v ) 中心的催化中间体c o m p l i ，同时一r 被还原为初始态。c o m pi 和 c o m pi i 都是强氧化剂，氧化还原电势接近+ i v 。c o m pi i 结合一分子的底物a h 释放出一分子的静态原酶，同时生成了一分子的底物自由基a ，最后两个a - 或结 合为a 2 或歧化为a 2 + a 2 h 4 。 底物的氧化位点是在血红素边缘的“裸露”部分【舯，如图1 - 2 所示，该区域包括 血红素的c 1 8 2 甲基和c 2 0 2 碳原子。o r t i z d e m o n t e l l a n o t g l 在用苯肼、叠氮化钠及其它 试剂使h r p 失活的实验中验证了该位点。当h r p 与h 2 0 2 相遇时，该位点就能与其 它基团结合，生成c 1 8 2 羟甲基及c 2 0 2 苯基等血红素衍生物，从而进一步生成氧化性 底物。 1 2 辣根过氧化物酶的应用 现代酶工程具有技术先进、厂房设备投资小、工艺简单、能耗低，产品收率 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学礼 高、效率高、效益大和污染小等优点，正日益成为食品、化工医药工业应用方面 的主力军。以往采用化学合成、微生物发酵及生物材料提取等传统技术生产的产 品，皆可通过现代酶工程生产，甚至可获得传统技术不可能得到的昂贵产品，如 昂贵药品人胰岛素、m c a b 、i f n 、6 - a p a 、7 a c a 及7 - a d c a 等。固定化基因 工程菌、工程细胞以及固定化技术与连续生物反应器的巧妙结合，将导致整个发 酵工业和化学合成工业的根本性变革。 1 2 1 在医学上的应用 人巨细胞病毒( h c m v ) 是人群中感染较为普遍，多数呈隐性感染，但对特殊 人群如器官移植者、新生儿、恶性肿瘤患者等免疫功能低下者可引起严重的感染 和较高的死亡率。常规的病毒分离因操作繁琐、检测周期长而不能适应临床诊断 的要求。核酸探针杂交技术是特异、敏感、快速的生物学检测手段。用活化辣根 过氧化物酶复合物直接标记人巨细胞病毒( h c m v ) d n a 特异片段制备酶标基 因探针【l o l 。与靶d n a 杂交后酶催化检测系统中相应的发光剂，再经增强剂作用 将光信号放大，杂交信号通过x 光自显影。经狭缝杂交证明该法标记的基因探针 可检测n o 2 p g 的同源d n a ，且仅h c n m vd n a 杂交，与h s v 、e b v 及正常人 d n a 不杂交。经临床实验表明，用h r p 直接标记基因探针经化学发光自显影检测 h c m v 是安全、快速、敏感和特异的方法，适用于临床诊断和研究。 在人体的氧化过程中会产生不同的自由基，其中超氧离子自由基( 0 2 ) 是有 害人体健康的。例如( 0 2 ) 能改变血浆膜的性质，引起蛋白的变性及核苷功能的损 伤。已经有报道说它能引起冠状心脏病、动脉硬化、肿瘤。因此，及时检测( 0 0 的浓度非常重要。1 3 0t a n g 等利用辣根过氧化物酶( h r p ) 的氧化显色反应形成了 一种简单、快速的检测( 0 2 ) 的浓度方法，其可能的机制如下： ( 1 ) v b 2 光照产生超阳离子自由基( 0 2 ) i n ： v b 2 地堕0 0 2 ( 2 ) 超阳离子自由基( 0 2 ) 在介质中发生歧化反应【1 2 l ： 2 0 2 。+ 2 h + h 2 0 2 + 0 2 6 第1 章前言 6 + c t n a n 2 仙q 骂 1 2 2 在有机合成中的应用 苯酚与4 一氨基安替比林( 4 一 o 最近二十几年来，酶工程领域中的最新研究结果表明，酶不仅能在水溶液体 系中使用，还可以在非水介质中催化某些化学反应的进行，这为非生物功能材料 的合成提供了一条新途径。 h r p 能将给电子的芳香化合物( 如苯酚或苯胺) 氧化得到可控结构的新型聚 合物，这类反应通常是通过自由基反应历程完成的。h r p 催化合成n 的聚酚类物 质是一种无甲醛的酚树脂，而且这类聚酚、胺类物质是一类重要的三阶非线性光 学材料，它不仅具有反应条件容易控制的优点，还能够制备传统的有机合成反应 难以合成的产物。h r p 及其多种过氧化物酶已被广泛的应用于合成功能聚合物和 其它具有特殊结构的化合物。 聚苯胺( p a n i ) 可用h r p h 2 0 2 在磷酸盐缓冲溶液和有机溶剂中酶促合成。 由于合成路径多样、反应环境良好、反应在常温常压下进行，所以引起了人们 的极大兴趣。其p a n 的结构主要由如下a 和b 两部分组成【1 3 1 ： d l ! i h n 。i 。i 。n o ：c ：_ b 7 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学礼 a 是邻对位取代的c c 、c n 结构，b 是常规合成方法所得对位连接的苯醌结 构。其中a 的链交联和支化严重限制了共轭度，从而减少了电导率，影响了电性 能和光学性能，另外堆积密度也降低。尽管这种聚合物的分子量和加工性有很多 的提高，但从总体来讲，通过h r p 催化合成p a ni 的电、光性能离实用化和商业 化还比较远。最近l i u 掣1 4 】利用h r p 在磷酸盐的缓冲溶液中以高分子电解质磺化 聚苯乙烯( s p s ) 为模板，催化合成了对位结构的水溶性导电p a ni s p s 复合物。反 应机理如下： 6 詈恰；o ：c o ：c 北京化工大学的许海燕等【1 5 1 通过h r p 在非水介质中的催化作用，在h 2 0 2 存 在下，在二氧六环等有机溶剂与水的混合溶液中催化对苯二胺的聚合反应，在较 温和的条件下合成有一定热稳定性、具有大共轭体系的聚对苯二胺，得到了深颜 色的聚合物粉末，通过调节有机溶剂的浓度，可以改变聚合产物的分子量。姜远 良等1 1 6 1 用h r p 催化h 2 0 2 氧化邻苯二胺合成了2 ，3 - - - 氨基吩嗪，并对反应条件 进行了研究，而且用紫外一可见光谱、红外光谱以及元素分析法对该产物进行了 表征。将产物纯品用全自动元素分析仪器对c 、h 、n 元素分析，其结果是c 为 6 6 2 7 ，h 为4 6 8 ，n 为2 8 4 ，通过计算求得c ：h ：o 原子个数比为6 ：5 ：2 而 2 ，3 一二氨基吩嗪分子式为c 1 2 h l o n 4 ，其c 、h 、n 原子个数之比为6 ：5 ：2 ，因 此利用元素分析法确定产物为2 ，3 一二氮基吩嗪。其反应的化学方程式如下： n h z n h 2 h r p h 2 0 2 q 舡： 由以上可知，以有机溶剂作为反应介质，极大地拓宽了酶的应用领域。辣 根过氧化物酶，由于被广泛地用作有机高分子合成的生物催化剂，故可作为氧化 酶在有机相反应的代表，具有重要的应用价值。 3 第1 章前言 过氧化物酶催化反应的类型主要有如下四种i 1 ( 如图1 5 所示) ： ( 1 ) 氧化脱氢：2 s h + h 2 0 2 ，2 s 。+ 2 h 2 0 ( 2 ) 氧化卤化：s h + h 2 0 2 + h + + x + s x + 一2 h 2 0 ( 3 ) h 2 0 2 歧化：2 h 2 0 2 2 h 2 0 + 0 2 ( 4 ) 氧传递反应：s h + h 2 0 2 + s o h + h 2 0 2 h 04 - 0 2 图1 _ 5 辣根过氧化物酶催化反应的例子； ( a ) 氧化脱氡；( b ) 氧化卤化；( c ) 过氧化氢歧化；( d ) 氧传递反应 f i g i 一5e x a m p l e so f r e a c t i o r sc a t a l y z e db yp e r o x i d a s e s ：( a ) o x i d a t i v ed e h y d r o g e n a t i o n ；( b ) o x i d a t i v eh a l o g e n a t i o n ；( c ) h 2 0 2d i s m u t a t i o n ；( 由o x y g e n t r a n s f e rn m c t i o n s 1 2 3 辣根过氧化物酶在环保方面的应用 9 婶 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学礼 1 2 3 1 环境中污染物含量的检测 过氧乙酸是一个具有重要用途的有机合成氧化剂和化工原料，它是过氧有机 酸中结构较为简单、制造比较容易的化合物。与双氧水相比，过氧乙酸的水溶液 具有更强的氧化性和优良的杀菌性能，因此它又是一个高效、广普的化学消毒剂。 近年来，随着应用范围的不断扩大，人们对它日益重视，生产和科研发展较快 f i8 1 9 】。 随着消毒剂的大量生产和广泛使用，一方面需要分析产品中有效成分， 用于检查消毒剂原药是否合格；另一方面需要测定进入环境中的消毒剂含量。同 时过氧化物类消毒剂大规模使用可能造成的环境污染1 2 0 2 2 。用气体吸收管现场 采集以喷雾法和熏蒸法进行空气消毒的过氧乙酸，在磷酸盐缓冲液存在和h r p 作用下，能够简便、准确和灵敏检测环境中过氧乙酸的含量。 过氧乙酸与过氧化氢相似，在h r p 或模拟酶的作用下，可以和苯酚、4 - a a p 反应，生成醌类色素，这种色素在5 0 0 5 1 0 n m 处有吸收峰。c h 3 c o o o h 发生如下 反应： 6 + d 必2 一一h 骂哪n 3 cp 。 c h 3 + 2 h 2 0 + 2 c h 3 c o o h 在天然水和废水中存在着大量的硫化物，它是水污染的重要来源。在溶液中 存在下列平衡： h 2 s ；苎h s + 时；兰s 2 + 2 h + 由于高温体系中硫化物的非自氧化一还原或地球化学过程，废水中的硫化物 进入空气，进而污染环境，所以总的硫浓度的测定是十分重要的。己经应用的方 法有分光光度计法 2 3 - 2 4 】、电流计法 2 3 - 2 6 l ，极谱法【2 7 】、化学发光法【2 s l 、紫外一可 见分光光度计法1 2 9 1 、离子层析法【3 0 1 、电位法【3 1 。2 1 、伏安法【3 3 1 ，一些方法的灵敏 1 0 第1 章前言 度低，一些方法时间自耗。近年来将辣根过氧化物酶固定于电极表面的电流计法 有较高的灵敏度鲫，展现出好的应用前景。 1 2 3 2 去除工业废水中的酚或苯胺等芳香类物质 酚和苯胺类化合物是常见的有毒有机污染物，特别是含酚废水在我国水污染 控制中被列为重点解决的有害废水之一。它的大量排放对水体、土壤会造成严重 的污染，进而危害人类的健康。因此，从工业废水中除去酚类物质越来越受到人 们的关注。我国规定，地面水中酚类化合物最高允许浓度为o 0 1 m gl 一。目前所 用的除酚的方法主要有微生物降解 3 5 - 3 6 】、活性炭吸附p 7 瑚l 、化学氧化 3 9 - 4 0 l 等。由 于传统方法处理酚类化合物的浓度有限，而且处理成本高、净化不完全以及会产 生毒副产物，使其应用受到很大的限制。九十年代，麻省理t k l i b a n o v 教授在 s c i e n c e 上发表了有关过氧化物酶应用于含酚类废水处理的论文1 4 1 1 ，此后过氧化 物酶应用于含酚、氯酚和苯胺等废水的处理中取得了较大的进展1 4 2 4 9 1 。由于酶处 理技术具有高效、专一、反应条件温和等特点，日益受到人们的关注和重视，其 前景十分诱人。 在含酚的溶液中加入辣根过氧化物酶和过氧化氢后，溶液变成棕黑色，沉淀 逐渐产生。此类酶催化反应分为两步，首先形成游离基，然后自由基发生聚合生 成高分子化合物而沉淀。整个反应过程和以往的酶处理反应过程不同，先是酶反 应，接着是化学反应，克服了酶反应中基质特异性的限制，用一种酶可以处理废 水中多种含羟基的芳香组化合物，这种酶促反应的机理称为氧化一耦合。其它污 染物如五氯酚( p c p ) 可以和酚发生共沉淀 4 2 1 。其他研究者也发现辣根过氧化物 酶可以从水溶液中除去酚类和芳胺，并可以使含酚废水脱色【5 。采用过氧化物 酶添加过氧化氢可以将一系列的酚和芳香胺形成相应的自由基，并聚合成较难溶 于水的物质。 另外，酶在工业脱色中的应用也越来越受到人们的重视。合成染料广泛应用 于纺织、印染印刷工业，彩色摄影及石油产品添加剂等方面。染料废水的排放量 大、组成复杂、有毒且难生物降解等特点，是较难处理的工业废水之一。染料的 种类极其繁多，分子式结构式也很复杂，且大多是难以生物降解的芳香族化合物， 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学礼 就其结构而言可以分为偶氮、蒽醌、三苯甲烷、杂环等，而这其中偶氮染料的数 量比例在5 0 以上，因而这类染料的降解研究备受关注。这些染料废水用常规处 理方法难以奏效。当前以离效作用微生物为活性物质的处理工艺，由于其耗能少， 费用低、效率高、不易产生二次污染的优点，使其在染料废水处理中的应用得到 广泛关注【5 ”扪。 随着现代化的进程，酶在工业、农业、医药、环境及能源等方面得到越来越 多的应用，但总的来说，因酶对热、酸、碱、氧化剂、有机溶剂和重金属离子的 稳定性差，同时酶在有机相中反应的效率比在水相中低几个数量级，这是其在应 用上最大的局限。大规模应用酶及酶工艺尚不够多，尤其在国内，酶及其应用就 更加少，导致这种现象的原因是多方面的。但酶本身在应用上暴露出来的一些性 质上的缺点常常是更为基本的原因，这主要表现在下列几个方面： ( 1 ) 稳定性：酶是生物大分子，一旦离开生物细胞，离开其本身的作用环境 常常显得不够稳定，不能适应大量生产的需要。 ( 2 ) 作用的最适条件：一般酶反应是在基本接近中性，与室温相差不大的水 溶液中进行的。但在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，作用时的p h 常 常不在中性范围内。温度升高，酶促反应速度加快，但酶往往会不稳定，如果降 低反应温度，不但影响反应速度，还会导致微生物的污染。遇到底物不溶于水时， 酶就更难发挥作用。 ( 3 ) 酶的主要动力学性质的不适应：米氏常数( k 。) 值过大，通常使反应不能 在低底物浓度下高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度较低，这种酶用于临床 检测或治疗时，影响就更大。此外，有些底物，特别是有些产物对酶活有抑制作 用，天然酶的反应条件不能适应工业生产的要求。 这些缺陷使得工业生产中使用酶时导致生产成本很高，从而限制了酶的工业 化应用。 1 2 第1 章前言 1 3 酶的化学修饰研究进展 随着现代化的进程，酶在工业、农业、医药、环境及能源等方面得到越来越 多的应用，但总的来说，因酶对热、酸、碱、氧化剂、有机溶剂和重金属离子的 稳定性差。酶自身存在的弊端极大的限制了酶的工业化应用，如何提高酶的稳定 性和催化活性，改善其在有机介质中的催化活性己成为近年来酶催化的一个研究 热点。目前己开发出一些成功的方法，概括起来主要有三大类：一是基因工程方 法，如定点突变和分子进化等；二是酶冻干时添加非缓冲液盐类( 如k c ! ) 冠醚和 环糊精等保护剂【5 4 】；三是利用化学方法的酶分子改造。第一种方法只能用天然氨 基酸进行取代，仍然有一定局限性。第二种方法只是在酶的使用过程中所采取的 一种方法，不能改变酶的本质。化学法酶分子改造往往能在天然酶分子上接上一 些化学功能基团，可得到多种多样的修饰酶。因此，酶的化学修饰仍然是一个有 效的蛋白质工程的手段【5 5 - s 6 ，化学修饰改善酶催化特性作为分子酶工程手段之 一，其里程碑成果是1 9 8 8 年k a i s e r 成功地将黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，从 而将蛋白酶转变成氧化还原酶【5 ”。其后，蛋白质水平的酶分子改造一酶化学修饰 改进酶的性能，再次成为研究热点。事实说明，只要选择合适的修饰剂，利用化 学修饰法可快速、廉价地提高酶的稳定性甚至合成出新的酶。酶的化学修饰的 发展前景是非常诱人的，在理论及实用上均具有重要意义。下面我们就改进酶催 化特性的各种化学修饰方法的研究现状及其最新动态进行简单的概述。 1 3 1 蛋白质交联技术 利用双或多功能交联剂对酶进行分子间和分子内交联，已取得较好的研究 进展。最先使用的是戊二醛交联剂。1 9 9 2 年s t c l a i r 等首次证实，利用交联酶 晶体( c r o s sl i n k e de n z y m ec r y s t a l , c le c ) 技术，能够在保持较高的酶活性基础 上提高嗜热芽孢菌蛋白酶的稳定性1 5 3 1 ，随后发现，在有机溶剂和水溶液中枯草 杆菌蛋白酶的交联酶晶体都具有显著增强的稳定性【5 9 1 。交联酶晶体制备主要包 括两个步骤：酶的分批结晶及保持酶活性和酶晶体的晶格不被破坏的化学交联。 多功能交联剂除了传统的戊二醛外，还包括一些新近开发成功的化合物。如经 2 0 0 7 届中山大学硕士学位论文程学礼 葡聚糖二乙醛交联的青霉素g 酰化酶在5 5 ( 2 的半衰期提高了9 倍而v 。保持不 变。酶的稳定性提高的主要原因是交联增强了葡聚糖的羟基与酶分子亲水基团间 的相互作用1 6 0 i 。利用戊二醛或蔗糖二乙醛单体或多聚体交联的丝氨酸胰蛋白酶， 最适作用温度从4 5 c 升至7 6 ( 2 ，而且其解链温度t m 也升高2 2 - ( 2 6 n 。目前，已 成功地将许多酶( 如蛋白酶、脂肪酶、酯酶和脱氢酶) 制备成交联酶晶体。其应 用主要有以下三个方面【6 2 】：用于有机溶剂中酶的x 一射线的研究；在生物转化中 的应用；作为微孔材料应用于高压液相层析中，这是由于交联酶晶体的晶格与 氟石的孔相似，而且酶蛋白又具有手性，对不同化合物具有特定的结合位点。 在生物转化中，交联酶晶体主要用于酰胺键和酯键的选择性水解和合成，交联酶 晶体能够克服有机相中酶催化合成多肽的两个主要障碍( 酶的自消化和在有机溶 剂中的不稳定性) ，因此利用交联酶晶体进行多肽合成时，产率高、副产物少，甚 至以消旋混合物为原料时也能获得光学活性的产物 6 3 - 6 4 。 交联酶晶体技术与酶活性中心修饰的结合应用，出现了一种新型的半合成 酶一化学突变酶( c h e m i c a l l yt a i l o r e de n z y m e ) 。这种酶不仅具有交联酶的特性( 稳 定性提高) ，而且也能改变催化活性。交联枯草杆菌蛋白酶晶