（微生物学专业论文）纳豆激酶基因在酿酒酵母中表达的研究.pdf

摘要 摘要 纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n k ) 是一种具有很强纤维蛋白溶解作用的酶，可作为一种很有 耵景的新型药物予以开发。而酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是一种简单的单细胞真 核生物，它没有内毒素，无致病性，被美国食品和药物管理局( f d a ) 确认为一种安全生 物，是酿造、食品、饲料等领域应用最广泛的工业微生物之一。 本研究通过对纳豆激酶基因的p c r 扩增、连接、转化，筛选出p m d l 8 t - n k 阳性克 隆重组子，测序结果表明克隆的纳豆激酶基因的大小为1 1 9 2 b p ，共编码3 9 7 个氨基酸， 与n c b i 上公布的与纳豆激酶基因同源率较高的序列进行比对，表明纳豆芽胞杆菌中的 纳豆激酶基因与枯草芽胞杆菌( n c b i 登录号为a y 2 1 9 9 0 1 1 ) 的同源性高达9 5 ，而与豆 豉菌来源的( n c b i 登录号为d q l 7 8 6 5 8 1 ) 同源性仅为6 9 ；这说明进一步研究纳豆芽孢 杆菌纳豆激酶基因与豆豉菌纳豆激酶基因的差异导致功能上的差别还有一定的空间。 继而纳豆激酶基因与p y e s 2 连接，转化至h 1 5 8 感受态细胞，质粒小量提取后，单酶 切、双酶切对重组阳性质粒进行鉴定，6 半乳糖诱导成功转化的重组菌株h 1 5 8 n k ，使 其表达，用纤维蛋白平板检测出了重组菌h 1 5 8 n k 的发酵上清液具有纤溶活性。 具有纤溶活性的重组h 1 5 8 一n k 的成功构建，为筛选含目的基因的酿酒酵母表达体系 提供依据和思路，为后续建立高效的酵母遗传转化体系、以食品作为生物反应载体来获 取纳豆激酶蛋白提供一条新途径，为开发可直接食用型溶栓n k 产品、微生态制剂或新 型心脑血管疾病保健品奠定基础。 关键词纳豆激酶；酿酒酵母；p y e s 2 ：表达；纤溶活性 东北林业大学硕士学位论文 a b s t r a c t n a t t o k i n a s e ( n k ) i sak i n do ff i b r i n o l y t i ce n z y m et h a ti s e x t r a c t e df r o mn a t t o at r a d i t i o n a l f o o di nj a p a n c o m p a r e dw i t ho t h e rt h r o m b o l y t i cd r u g sw h i c ha r eu s e di nc o m m o n ，n ki s s a f e ra n de a s i e rt ob ea b s o r b e db yb o d y ，a n dh a sm o r ed i r e c ta n dm o r ep e r s i s t e n te f f e c to n t h r o m b o s i s ，b e s i d e si t sc o s ti s l o w e r t h e r e f o r ei tc a nb ed e v e l o p e da san e wa n dp o t e n t f i b r i n o l y t i cm e d i c i n e s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei sr e c o g n i z e da sak i n do fs i m p l es i n g l e c e l l e u k a r y o t e s ，w h i c hh a sn ot o x i na n dn op a t h o g e n i c i t y i th a sb e e nu s e di nb r e a da n da l c o h o l i n d u s t r yf o ry e a r sa n dw a sa f f i r m e db yf d a t ob eak i n do f b i o l o g i c a ls a f e t y t h eg e n o m i co fb a c i l l u ss u b t i c i sv a t n a t t o1 1 0 8 6w a se x t r a c t e da n dn a t t o k i n a s e ( n k ) g e n e w a sa m p l i f i e db yp c ra n dw a si i n k e da n dt r a n s f o r m e d n ep o s i t i v ep l a s m i dp m d l 8 t - n k w a ss c r e e n e d s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h en kg e n ew a s1 1 9 2b pi nl e n g t hi n c l u d i n g s i g n a lr e g i o n p r e - l e a d i n gr e g i o na n dm a t u r er e g i o nf r a g m e n t s n ep u r p o s eg e n eh a d 9 5 a n d 6 9 h o m o l o g yw i t ht h a to fa c c e s s i o nn o a y 2 1 9 9 0 1 1f r o mb a c i l l u ss u b t i l i sa n da c c e s s i o n n o d q l 7 8 6 5 8 1f r o md o u c h fb a c t e r i ar c p o n e di nn c b i ，r e s p e c t i v e l y t h eh o m o l o g yw a s m u c hd i f f e r e n t i ti n d i c a t e dt h a tw ec a nt a k ef u r t h e rs t u d yo ft h ed i f f e r e n c e sa b o u tn a t t o k i n a s e g e n eb e t w e e nb a c i l l u ss u b t i l i sa n dd o u c h fb a c t e r i aw h i c hi c a dt od i f f e r e n tf u n c t i o n s t h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n v e c t o rp y e s 2 - n kw a st r a n s f o r m e di n t os a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eh 1 5 8c o m p e t e n tc e l l t h er e c o m b i n a n th 1 5 8 - n kw a si n d u c e dw i t h1 3 g a l a c t o s e t h ef i b r i n o l y t i ca c t i v i t yo ff e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n tw a sd e t e r m i n e dw i t hf i b r i np l a t e t h er e c o m b i n a n th 1 5 8 n kw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l yb r i n g sn e wi d e a st od e v e l o pan e w r o u t et oc o n s t r u c tt h ee f f i c i e n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fs a c c a r o m y c e sc e r e v i s i a es y s t e mt o o b t a i nn a t t o k i n a s ew i t hf o o da sb i o r e a c t o r m e a n w h i l e ，i th a ss e tt h ef o u n d a t i o nf o rd e v e l o p i n g c h e a pe d i b l en kp r o d u c t s k e y w o r d sn a t t o k i n a s e ；s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；p y e s 2 ；e x p r e s s i o n ；f i b r i n o l y t i ca c t i v i t y n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究， 作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅韭盐 业太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 朝1 佣产 签字目期：年 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤j 匕盐些太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权壅j 壁挞些太堂可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：年月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：亨；i f 冯 。 辩醐：1 年冲日 ， 电话： 邮编： l 绪论 1 1 纳豆激酶研究进展 1 绪论 1 1 1 纳豆激酶的由来及功用 1 9 8 7 年日本的须见洋行博士从2 0 0 余种食品中筛选出了有很强溶解纤维蛋白作用的 纳豆食品，并从其中提取纯化出的一种酶，由于此酶从纳豆中获得，因此称为纳豆激酶 ( n a t t o k i n a s c ，n k ) i 。 纳豆具有抗血栓、降血压、抗菌、抗氧化、抗病毒、预防癌症等多种生理调节功能 l 捌，而其各种有效成分中最受瞩目的是就具有溶血栓作用的纳豆激酶p l ；研究发现，纳 豆激酶具有纤溶活性，可治疗和预防血栓病，它还可激活体内的纤溶酶原，从而增加内 源性纤溶酶的量与作用，更好地达到溶栓效果。 纳豆激酶作为一种很有潜力的新犁溶栓药物，在同本已得到广泛深入的研究，而在 我国才刚刚起步，它必将成为医疗和发酵工业上新的热点。 1 1 2 纳豆激酶的性质及结构 1 1 2 1 纳豆激酶的理化性质 纳豆激酶的活性不受5 m m c y s 的影响，i m m d f p ( - 一异丙基氟磷酸) 和5 r a mn c g u v o n 则能完全抑制该酶的活性，由此可推测纳豆激酶的活性中心是丝氨酸结构i ”，与同属于 枯草杆菌蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶一样，n k 保守的催化活性部位在a s p 3 2 、h i s 6 4 、 s c r 2 2 1 ，与底物结合部位在s e r l 2 5 、l e u l 2 6 和o l y l 2 7 1 2 1 。以小分子肽为底物研究该酶的 酰胺水解酶活性，发现纳豆激酶最敏感的底物是血浆纤溶酶底物h - d v a l l e u l y s p n a ( s 一2 2 5 1 ) ，对于尿激酶p y r o - g l u g l y - a r g - p n a ( s - 2 4 4 4 ) 和弹性蛋白酶底物p y - r o g l u p r o v a l p n a ( s 2 4 8 4 ) 不起作用，这说明纳豆激酶有其特异的蛋白水解_ 【 别位点1 5 i 。 1 1 2 2 纳豆激酶的基因结构 1 9 9 2 年n a d a m u r a i4 l 等人利用鸟枪法在大肠杆菌中首次从分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆 菌中克隆到包括调控序列在内的n k 全长基因，对1 4 7 3 b p n k 全长基因序列进行了分析。 其结构基因的3 术端是3 个连续的终止密码子t a a 、t a g 、t a a ，其后一段序列可形成 茎环结构，起始密码子上游1 7 b 口处是核糖体结合位点a a a g g a g ，s d 序列上游是a t 含 量高达7 2 的转录调控区域1 6 l 。1 9 9 1 年须见洋行等发表了纳豆激酶基因d n a 序列和氨基 酸序列的一级结构1 8 i ，同时对这个序列与几种枯草杆菌蛋白酶基因的氨基酸序列进行了 比较。研究发现纳豆激酶由2 7 5 个氨基酸组成，与枯草杆菌的其他蛋白酶氨基酸序列比 较发现，与菌株1 1 6 8 的纳豆激酶相比较同源性高达9 9 3 。m i t s u g u 等研究了纳豆中的纳 豆激酶基因结构1 9 】发现该酶的基因序列与大肠杆菌素e 和j 的氨基酸序列相比除了各2 个和4 个氨基酸替换外都是一致的。在与其他大肠杆菌素相比，纳豆激酶表现出与 c a r i s b e r 9 6 9 的同源性，与大肠杆菌素b p n 相比有8 5 的同源性，与大肠杆菌素d y 相比 有7 0 的同源性l7 1 。 彗莲* 嚣罢蓥点苗母鹾前诤匿 皿赫珏蚌业匿 l i l l 纳豆激酶全基因结构简图一4 。啊 f i g 1n k g o n ec o n s t r u c t i o n 1 i o “x i x h 。i 1 1 1 2 3 纳豆激酶的蛋白质结构 从纳豆激酶的d n a 序列推导的氨基酸组成显示：该基因以g t g 为起始密码子，随后 是由1 1 4 3 b p 组成的阅读框架，编码含2 9 个氨基酸的信号肽，7 7 个氨基酸的前导肽和2 7 5 个氨基酸组成的单链成熟肽，无二硫键结构，共3 8 1 个氨基酸。根据纳豆激酶基因的 d n a 序列推出n k 理论分子量为2 77 2 8 d a ，纯化的n l 通过s d s p a g e 电泳，在2 80 0 0 k 处 有明显的条带。纳豆激酶的氨基酸序列中含有8 个赖氨酸残基，内肽酶可将其水解成9 个 小肽l 蕊。 n k 信号肽包含一个带3 个正电荷的亲水氨基端以及一段不带电荷的疏水残基序列， 其切割位点位于a l a g i n a l a 保守序列之后i 引。此外，n k 基因编码序列中尚有一不同于 多数原核基因的特点，即在信号肽与成熟肽之间有一段2 3 1 个核苷酸编码的前肽序列。 通常真核细胞在分泌蛋白酶之静，先在胞内合成无活性的酶原，分泌到胞外后，切断前 导肽部分成为有活性的蛋白酶，目前已发现一些与n k 基因同源的枯草杆菌素蛋白及链 激酶有与此相似的前导肽区域【7 1 。有报道称前导肽具有帮助n k 正确折叠成有活性构象的 功能1 1 埘。 1 1 3 纳豆激酶国内外分子生物学研究进展 1 1 3 1 纳豆激酶基因的克隆与表达 自从n a k a m u r a 于1 9 9 2 年首次克隆了纳豆激酶基因并测定了全基因序列i l t ，使得利 用基因工程技术研究纳豆激酶成为可能l 钔。s u i l a mw a n g 等通过质粒整合和噬菌体p b s l 转导构建了枯草杆菌蛋白酶e 的基因图谱。研究表明克隆化的枯草杆菌蛋白酶基因只能 在静止生长期表达1 1 2 j 。t a k a g i 等将枯草杆菌蛋白酶e 基因克隆到嗜热表达载体上，实现 了枯草杆菌蛋白酶e 在嗜热杆菌中的表达1 ”。 1 9 9 9 年复旦大学医学院分子遗传学研究室的刘北域等用p c r 方法扩增了纳豆激酶基 因，并将该基因重组至l j p l y 4l - ，构建表达质粒，转化到e c o l ij f l l 2 5 受体菌中表达【l “， 其核苷酸序列与文献报道完全一致，将该基因重组到温控型表达载体p l y 4 上，构建成 i 缘论 表达质粒p e s x 1 转化n e c o l ij f l l 2 5 眨体菌中，实现了纳豆激酶芷大肠杆菌中的表 达。表达产物为3 8 k d 的纳豆激酶厉i 嗣1 2 8 k d 的纳豆激酶，表达总产物约占菌体蛋白的 1 8 ，纤维蛋白法测定显示，n k 具有? f 溶活性1 4 l 。同年，张淑梅等克隆了纳豆激酶成熟 肽基因，重组后表达1 1 4 j 。 2 0 0 0 年华南理工大学的黄志立等人从纳l i 杆菌中克隆了纳豆激酶原基因，其基因序 列与文献报道的核营酸同源性达9 9 0 8 ，重组到温控型表达载体p b v 2 2 0 上，转化e c o i l h b l 0 1 中，实现了在大肠杆菌中表达，表达产物的表达率达1 2 ，用c l t 法测定具有溶 栓活性，l m l 菌液的溶栓活性相当于1 2 0 u 尿激酶【1 5 j 。并研究了外源基因在大肠杆菌中的 遗传稳定性，结果表明传代2 1 代。外源基因的丢失率达5 2 1 1 6 l 。2 0 0 1 年又报道克隆了纳 豆激酶结构基因，其基因序列与文献报道的核苷酸序列完全相同，并将该基因重组到 p t c z a a 表达载体上，转化到毕赤酵母g s l l 5 中，研究了外源基因在真核表达系统酵母 中的遗传稳定性，结果表明传代1 2 0 代，外源基因的丢失率仍为o ，可见，外源基因在 酵母中具有很好的遗传稳定性。但没有报道外源基因在酵母中的表达情况l l ”。 2 0 0 2 年暨南大学生物工程研究所的谢秋玲等人克隆了纳豆激酶原基因，重组到温控 型表达载体p b v 2 2 0 _ l ，转化到e c o l id h 5a 受体菌中，温度诱导表达后，s d s p a g e 电 泳表明在3 8 k d 处有一条明显的表达带，表达蛋白占菌体蛋白的2 0 左右，表达蛋白以包 涵体形式存在，包涵体经变性、复性后，用c l t 法测定具有溶栓活性i “i 。 同年，四川大学的彭勇等人从解淀粉芽饱杆菌d c - 4 基因组中克隆了豆豉溶栓酶成熟 肽基因( d f e ) ，序列分析表明d f e 基因长8 2 5 b p ，编码2 7 5 个氨基酸，与文献报道的纳豆 激酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为8 0 0 和8 6 5 ，构建成融合表达载体p e t - n d e ，转化e c o l ib l 2 1 中，在l p l l g 诱导下，表达的融合蛋白以包涵体形式存在，占菌体 可溶性蛋白的4 0 ，表明豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶1 1 9 l 。同年，又从纳豆杆菌 基因组d n a 中克隆了纳豆激酶成熟肽基因，与文献报道的核苷酸序列和氨基酸序列分别 有9 3 4 和9 4 5 的同源性，重组到融合型表达载体上，经i p t g 诱导后，表达的融合蛋 白占菌体可溶性蛋白的2 6 1 2 0 j 。 综上所述，我国学者对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的活性方面进行了深 入系统的研究，已经初步能够利用基因工程菌生产纳豆激酶样品。但是对于基因工程菌 的下游工作工程菌的发酵工艺、表达产物的分离纯化工艺、表达产物的产量及收率方 面仅进行了一些探索性研究，要想实现利用基因工程菌工业化生产纳豆激酶，还需更加 深入地研究1 4 i 。 1 。1 3 2 纳豆激酶的生产调控和分子改造 同其它生物活性物质一样，纳豆激酶的分泌表达受多种因素的影响。w o n g 等人的 研究表明，纳豆激酶基因的分泌表达受6 3 7 启动子的控制1 2 “。利用s 1 核酸内切酶保护实 验分析法确定了该基因在体内转录的起始位点，基因的体外转录有两个启动位点，两位 点之间被1 5 个核酸隔丌：体内转录也在这两个位点或其附近进行。m a r i a 等人研究表 明，纳豆激酶基因的1 0 5 3 3 6 处编码了一段7 7 个氨基酸的蛋白肽，参与调节纳百激酶的 活性1 7 1 。根据以上研究结果预知：可以通过提高启动子活性和改变蛋白肽结构来提高纳 豆激酶产量。 由于人们对纳豆激酶分子的结构研究很清楚，并且能熟练的操纵纳豆激酶基因，针 对纳豆激酶的特点，可以有目的的对纳豆激酶分子进行改造，如延长半衰期、提高酶活 力和热稳定性等。h i r o s h i 等人采用定点突变技术，使g l y 6 1 和s e t 9 8 变为c y s 6 1 和c y s 9 8 ， 再利用计算机分析，找到合适的硫键位点，双硫键的引入，提高了酶的耐热性，而不改 变酶的催化性能，c y s 6 1 和c y s 9 8 突变株的半衰期是野生型的2 3 倍，引入双硫键后，热 稳定性提高了4 5 。t a k e a g i 等人采用定点突变的方法，改变活性中，t t , , a s r , 3 2 附近的 h e 3 1 ，然后将突变基因转入e c o l i 中表达，获得了较高的酶活力，其催化效率是野生型 的2 6 倍，作为对照，在l l e 3 1 位点引入8 种不同的氨基酸残基( c y s 、s e r 、t h r 、g l y 、 a l a ，v a l 、l e u 、p h e ) ，结果发现只有v a l 3 1 和1 - 上u 3 1 突变株表现出酶活力增加，其中 l e u 3 1 的酶活力显著增加，其它六种突变株的酶活力均显著下降，这表明在3 1 位点的侧 链氨基酸对表现纳豆激酶的活力是非常重要的，并且酶活力表现的水平依赖于侧链基因 的结构1 2 “。 1 1 4 纳豆激酶溶栓机制及活性测定方法 h i s u m i 等早在1 9 8 7 年就发现纳豆及纳豆的生理靛水浸提物能够直接溶解纤维蛋白， 此外实验还证实纳豆激酶不仅具有显著的直接溶解血栓能力，其溶解血凝块能力为血纤 溶酶的4 倍，而且还可以诱导肝脏或血管内皮产生组织型纤溶酶原激活剂t p a 使生物体 自身纤溶系统活化，自j 接激活纤维蛋白溶酶原活性，从而温和、持续提高血液的纤溶活 性；除了在体外具有明显的溶解效果外，纳豆激酶可使血栓模型实验狗组栓塞的血管在 5 h 内再通，血液循环完全畅通，对兔血栓模型也有明裎溶柃效果1 2 2 2 3 1 ：因此n k 在体内 外都具有明显的溶栓活性。健康人口服纳豆激酶后，优球蛋白溶解时间e l t 明显缩短， 纤维蛋白原降解物e d p ，组织型纤溶酶原激活自：l j t p a 增加，说明口服纳豆激酶可提高血 浆的纤溶活性【z 4 j 。 近年来，人们对纳豆激酶的溶栓作用机理有了进一步的认识，现已证明纳豆激酶的 溶栓机制可以归为以下四种途径( 如图1 。2 ) ： a 纳豆激酶的直接溶栓作用，纳豆激酶最敏感的底物是血浆纤溶酶的底物，即h d v a l l e u l y s p n a 。它具有同血浆纤维蛋白溶酶相似的特异性，可以有效地分解血栓 的主要成份纤维蛋白及由h d v a l l e u l y s p n a 等合成的基质1 7 , 2 5 1 ： b 激活尿激酶原变成尿激酶，纯化后的纳豆激酶还能激活尿激酶原( p r o u 硒使之 转化为尿激酶l ”i ； c 激活血管内皮细胞产生t p a ，纳豆激酶可激活生物体自身纤溶酶系统，促进血 管内皮细胞释放t p a ，同时引起继发性t p a 增加，因此在进一步增强人体纤维蛋白酶的 活性的同时，不易引起出血且无抗原性：而对血浆纤溶酶原激活抑制剂( p a l 1 ) 无影响 f 4 2 5 l ： d 纳豆激酶的百j 接溶柃f l ：j i i ，通过降解和失活p a i 1 。增加纤溶作用i 7 圳1 n k l 叮 使血浆内t x b 2 的含量显著降低从而通过抑制环氧化酶或j 缸栓素a 2 ( ，d ( a 2 ) 合成膨的 活性束发挥溶栓作用l “。 幽1 2 纳豆激酶溶栓机制示意图州“| l f i gl - 2 t h r o m b o l y t i cm e c h a n i s mo f n a t t o k i n a s e 【“”“u j i 研究证明，n k 的纤维蛋白原水解活性远远低于纤溶酶和弹性蛋c a 酶、甚至尿激 酶，而与t - p a 基本相同。这揭示n k 在发挥纤溶作用的同时，不水解血浆纤维蛋白 质，不易引起出血倾向1 3 1 1 ，并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白的溶酶原激活剂( t - p a ) ，从而也间接地表现其溶解纤维活性。 常见的纳豆激酶的活性测定方法1 2 l 包括：纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间 法、微量稀释法、酶联免疫吸附法、四肽底物法。 ( 1 ) 纤维蛋白平板法 纤维蛋白平板法是参照u k 旦c t t p a 的测活方法建立的，也是最早用于n k 活性测定的 方法之一。参照a s t n l p ( 1 9 5 2 ) 的方法【3 2 l 改进，以凝血酶和纤维蛋白原作用制成人工血栓 平板，注入n k ，用溶解面积表示n k 的溶解纤维活性。在平板上分别点样n k 、u k ， 3 7 c 孵育1 8 h 后。测量n k 相对于u k 的活力单位，溶解圈越大，酶活性越大。用纤维蛋 自平板测定n k 活性，结果显示每克湿重纳豆约相当于1 6 0 0 1 u ( 尿激酶单位) 或者4 0 c u 单 位纤溶酶。 本法最常用，但易受孵育时i b j 影响，因此对恒温时间的控制十分重要。另外在测量 的过程中也有一定的误差，且平板制作和点样的技术十分关键。目前发表的、常用的纳 豆激酶活性测定方法就是这种纤维蛋白平板法a s t m p ( 1 9 5 2 ) 的改进方法i l j 。 ( 2 ) 纤维蛋白块溶解时问法( c l t 法) 纤溶酶、t - p a 、u k 等溶血栓物质都以此方法来测定活性。从纤维蛋白形成丌始计 时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面。到气泡冒出停止时，作为纤维蛋白溶解时f b j ( c l t ) 。以u k 作为标准品，以c l t 对n k 浓度的对数作图。该方法t 匕平扳法迅捷，但精 东北林业大学硕士学位论文 度不够，且不适合多个样品的同时测定1 3 引。 ( 3 ) 血清板法 该法是纤维蛋白平板法的改进，纤维形成初始，在6 5 5 n m 处的吸光值最大，随着 n k 的加入，纤维溶解，吸光值下降，吸光值的减少同浓度成线性关系。该方法可同时 测多个样品，且冶i 4 4 , 时内可对酶活性进行测定，操作简便、快捷，样品消耗小，成本 低，可信度高。但是反应开始时小孔内血栓的吸光值需在0 2 以上，这样才可以减少人工 血栓对a 6 5 5 n m 值的影响i “。 ( 4 ) 酶联免疫吸附法( e u s a ) 酶联免疫吸附法是免疫检测技术的一种，用于测定微量蛋白质。对n k 有特异性的 单克降抗体与n k 发生特异结合，再同连有标志酶的多克隆抗体结合，形成一种类似三 明治的结构，通过标志酶辣根过氧化物酶的反应而测定n k 的活性。该法特异性好，灵 敏度高，利用偶联h r p 的负抗n k 抗血清作包被抗体，鼠抗n k 单克隆抗体作检测抗体， 测定n k 活性，灵敏度达0 1 n g m l ，但操作复杂，成本高p j 。 ( 5 1 四肽底物法 在四肽底物s u e a i a - p r o p h e p n a 溶液中加入纤溶酶酶液，3 7 c 水浴孵育l m i n ，测定 单位时间1 勾4 1 0 n m 光吸收的变化。l m i n 水解该四肽生成物1 i 硝基苯胺的纤溶量为g 。 该法简便易行，可迅速测定酶的活性。缺点是得到的蛋白酶并不能完全表示其纤溶活 性，二者之间是否有相关有待进一步试验1 “。 1 1 5 纳豆激酶发展前景展望 纳豆在同本已有二千多年的历史，开本是长寿之国，这与科学的饮食关系极为密 切。现今，人们在盼望长寿的同时，不希望出现痴呆症、半身不遂，更不愿成为植物 人。当前世界上有许多由血栓引起的疾病，据w h o 公布的统计数字，全世界新增血栓 患者1 5 0 0 万，每年约有3 0 0 万患者死亡m j 。 当前的溶栓剂，如尿激酶、链激酶、重组织型纤溶酶原激活剂等，存在半衰期短、 副作用大、价格昂贵等缺点，难以成为适用的大众药品。纳豆是以大豆为原料，经纳豆 菌发酵而成的食品。因其含有增强大脑活力不可缺少的卵磷脂和溶解血栓、防止老化的 纳豆激酶以及防止痴呆症的维生素还含有能使肠胃保持活力的低聚糖，被日本视为具有 魔法般力量的物质p 5 为l 。而发挥这些功效的物质中，最受人瞩目的物质就是具有溶栓效 果的纳豆激酶。 纳豆激酶安全性好、成本低、药效持久，具有抗胰酶水解的能力，因此纳豆激酶不 仅可以静脉注射而且口服效果也好。由于纳豆激酶是由纳豆菌发酵得到的，所以可以 规模生产；纳豆激酶具有的稳定性、易于提取纯化，价廉、安全无副作用等性能将使纳 豆激酶成为一种理想的预防和治疗血栓的生化药物。 针对目前血栓病例的不断增加，由于纳豆激酶具有无毒、高效溶栓、廉价的特点 纳豆激酶必将逐渐成为新一代较适用的溶栓药物。近年来，国内外掀起了对纳豆激酶的 l 绪论 研。丸和j l 发热潮，纳豆激酶的约刚价值f l 益突出。利川辏i 川l 袱菌，l 产纳豆激晦，使纳 豆激酶毡i q 的克隆、表达、纯化及活性方面取得了较夫进塍。随着分子生物学研究的不 断深入，震用基肉工程技术人们将逐渐更加熟练地操作纳，激酶堆因。将使细胞水平 表达纳j 激酶基i 訇获得成功；近年来发展起柬的转基动物技术是生物技术上的一大突 破，通j _ lz j j 物个体表达系统k 产纳豆激酶，为纳豆激嘶的乍广提供了一条崭新的途径。 1 2 酿酒酵母基因工程研究进展 酵母含有丰富的蛋白质，具有人体所必需的八种氨基酸耵i 多种b 族维生素、维尘素 d 2 原、脂肪、粗纤维索、碳水化合物、矿物元素及微量元素，同时还含有丰富的酶系 统和尘理活性物质，如辅酶i 、辅酶a 、辅酶q 、细胞色素c 、卵磷脂、凝血质、谷胱 甘肽和核糖核酸等1 3 7 l 。 而酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s c ) 是单细胞真核! e 物，被人类应用征酿酒、 烘焙等上业上己经有几千年的历史，因而被认为是g r a s 生物( g e n e r a l l yr e c o g n i z e da s s a f e ) 。在长时州的应用过程中，人类积累了这个传统物种的大齄、：# 富的遗传、生理、 分f7 e 物学的知识，在过去的2 0 年问，越来越多的结构辏w 被得到后，克隆、分析的 酿洒酵母肇冈超过一千个，并且在1 9 9 6 年，科学家究成了酿酒醉母的整个旌【q 钎l 图 谱，以酿洒酵母为代表的酵母表达系统因其特有的生物学性质己成为有效表达外源坫闪 的重要工具哪i ，酿酒酵母在鉴因工程上的应用成为人们用来生产蛋白的新途径，并在蜃 础研究、应用研究中发挥重要作用。 因为酿酒酵母基因工程菌不仅具有原核系统的优点，而且具有典型真核系统的特 性，被认为是表达外源蛋e l 的合适寄上。 其优越性表现在： 1 ) 具有类似原核生物生长快，容易培养，易于遗传操作的特点。 2 ) 具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程。 3 ) 不产生有毒物质。 4 ) d n a 既能以自土复制的形式，又能以整合到基因组的方式被引入酵母细胞，使 得基因克隆和基因工程技术可以很容易地在酵母这种真核生物的模式菌中丌展1 3 9 。 随着重组d n a 技术的发展，越来越多的蛋白在酿酒酵母中实现了表达。 自从1 9 8 1 年h i t z e m a n i 加l 首次在酵母中表达了人a 干扰索，之后己有众多的外源基 因陆续得到表达如人干扰素a2 a i “j 、人干扰素a2 b ，乙型肝炎病毒融合抗原s a 2 8 1 牡1 及核心抗原、超氧化物歧化酶s o d 、白细胞介索、多肽类激素、乙型肝炎病毒表面抗 原，艾滋病病毒抗原、凝乳酶、淀粉酶、甜味蛋白、血浆蛋白等。 作为生产真核异源蛋白的宿主菌，酵母融合了分子遗传操作、原核微生物的生长性 质股真核蛋白的翻译后；n l - 修饰等特点，因而近年柬己被成功地应用予多种异源蛋白的 商、世化生产。其中s a c c h a r o m y c e sc p 陀c 豇妇p ( 酿酒酵母) 是第一个作为异源蛋白基因表达 系统并加以应用的酵母。这些蛋白表达的基础是拥有完善、稳定的表达体系。 1 - 2 1 酿酒酵母基因工程的载体系统 酿酒酵母表达系统中的表达载体，通常是既能在酵母菌中复制又能在大肠杆菌中复 制的穿梭质粒，这类载体往往同时带有细菌和酵母的复制起始原点和选择标畦，它们既 能在细菌中进行质粒复制和选择，又能在酵母中进行质粒复制和选择。 按载体的复制形式，酵母的常规克隆载体又分为五大类，r i p ( 整合型载体) 、 y r p ( 自主复制型载体) 、v c p ( 着丝粒型载体) 、y e p ( 附加体型载体) ，y a c ( 酵母人工染色 体型载体) 载体的基本性质可参考下表( 表1 1 ) 。而酿酒酵母主要分为两大类载体：常规 克隆载休和特殊克隆载体。科学家已成功地构建了一系列可供研究应用的酿酒酵母克隆 载体1 4 4 1 。 表1 - 1 酿酒酵母克隆载体舶基本性质 t a b l e l - lt h eb a s i cc h a r a d e r so f v e c t o r sf r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e c i s i a e 载体类型复制模式转化频率m g d n a 复制起点举例 y l p 整合。单拷贝 1 - 1 0 0 无y l p 5 y g p多拷贝，自动复制 1 旷1 0 ) a r s y r p 7 y e p多拷贝自动复制 l o ，一1 矿z u - o r j y e p 2 4 y c p 多拷贝，自动复制 1 0 0 4 a r s - z u - o r j y c p 5 0 y l p多拷贝，自动复制 1 0 j 1 0 s r s z 1 1 o r j l y p l y d p多拷贝，自动复制 1 0 ，一l 旷z u - o i l p s a c 3 0 0 本实验采用酿酒酵母大肠杆菌穿梭质粒p y e s 2 ( a m p + u r a + ) 。 1 。2 2y e p 酵母附加体型质粒的产生和特性 各种载体因其具有的不同结构特性而在酵母基因表达技术中具有不同的适用范围1 4 4 7 l 。其中附加体型载体y e p 具有天然的酵母犁质粒的部分序列( 复制起始点) 或全部序 列，使得这类载体有很高的转化效率，稳定性高于y r p 型载体、每个细胞中的载体拷 贝数也高于y i p 型载体和y c p 型载体，因而成为构建外源基因高表达工程菌株的主要 载体类型。 把酵母内源2 - u m 质粒上的e c o ri 片段，插入到酵母整合质粒而形成了酵母游离质 粒。2 - t m 质粒是一种小分子双链环状d n a ，存在于酵母属的大多数菌株中，它由2 个 5 9 9 b p 的反相重复分隔成2 个区域，含有4 个阅读框和一个复制起点，其中r e p l 和 r e p 2 编码的产物与细胞分裂时的质粒平均分配有关，y e p 载体含有r e p 3 位点，它是 保证质粒稳定性必要的因子。这类质粒通过自身复制，重组到酵母菌中。 来源于y i p s 的酵母游离质粒y e p 2 4 ，是一种既能在大肠杆菌又能在酿酒酵母中自动 复制的质粒，它在大肠杆菌中以四环素为选择标记，在酿酒酵母中则利用u r a 3 的互补作 用。y e p 2 4 的优点在于它可以自行复制。每个细胞内有1 0 3 0 个拷贝；尽管它的拷贝数较 高，y e d 2 4 在缺少选择压力的条件下，分离不够稳定，而且结构也不够稳定。它不稳定 b i 绪论 的主要原i q 是t 矗升i 有内源2 - u r n 质村。作为一种广泛应用的穿梭质托，y e p 2 4 参与了把外 源基因引入酿洒酵母的过程。 再如y e p 酵母附加体型质粒中的表达质粒p y e x 2 b x ：p y e x 2 b x 含z f i c u 2 十可诱导的 启动子c u p ! 、劫质粒复制起始点序列，选择性标记u r a 3 和l e u 2 2 d 。劫序列使得质粒可侄 染色体外f i 主复制，每个细胞的拷9 1 数高达4 0 0 5 0 0 ，从而外源l i 的基因可以在酵母荫 中高水平表达i “ 1 2 3 酿酒酵母的转化方法 一个重组d n a 的基本过程就是外源d n a 进入宿主，外源基因进入酿酒酵母一般采 用转化的方法。建立高效的酵母转化系统对研究酵母基因工程菌具有重要意义。 在1 9 7 8 年首先报道了酵母菌原生质体转化方法之后，随着酿酒酵母基因工程技术 的只趋成熟，整体细胞转化法，电击转化等方法逐渐被人们使用。 表1 2 三种常川酿酒酵母转化方法的比较 t a b l e l 一2t h et r a n s f o r m a t i o nc o m p a r i s o n so f t h r e ec o m m o n l yu s e ds a c c h a r o m y c e sc e r e c i s i a e 外源基因表达载体在宿主细胞中的拷贝数和质粒稳定性是外源基因高表达、发酵生 产的基本条件，因此找出表达载体在酵母细胞中拷贝数和稳定性下降的原因，掌握酵母 载体在细胞中的复制和分配的规律，可望进一步提高工程菌外源基因的表达水平。 1 2 4 影响酵母表达的因素 以酿酒酵母基因工程菌作为表达外源基因的宿主，表达外源基因，外源基因的表达 水平受到很多因素的影响，比如表达载体的启动子，信号的分泌，表达载体的稳定性以 及宿主菌株木身的特性、外界因素都可以影响到外源基因的表达，如何优化这些影响因 素，提高表达水平，只益受到人们的重视，并且提出了很多改良的措施。 影响酿酒酵母表达水平的外界因素还有温度、生物反应器的操作等等，这些因素无 非都是通过影响酵母细胞的生长代谢、质粒的稳定性来影响其表达水平的，在确定相关 因素后可以通过优化发酵实验，达到一个最佳的实验结果1 4 9 i 。 1 2 5 酿酒酵母发展展望 酵母( y e a s t ) 是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性，又具 有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酵母作为人类利用最早的微生物，和人类的 生活极其密切，是酿造、食品、饲料等领域应用最广泛的：亡业微生物。 其中，酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的工业应用比较广泛，历史悠久，遗传背 景清楚，不产生有毒物质，生物安全性好，易于推广应用，现已成为分子生物学研究最 重要的工具和模型。对于酿酒酵母的遗传改良主要经历了四个阶段：自然筛选阶段，诱 变育种阶段，杂交与原生质体融合，d n a 重组技术，且改良手段日趋成熟【蛐l 。因此可 利用酿酒酵母的现代生物工程技术，开发、生产表达有益活性物质的酿酒酵母，做成高 级营养品添加到食品中或用作饲养动物的高级饲料。 但是由于当前科学界对生物工程食品的安全性尚无明确的结论。因此对sc e r e v i s i a 工程制品在食品的安全性、风味和化学成分发生变化时，对其的影响更加需要科技工作 者进行长期、科学、谨慎的考察i ”l 。 1 3 本课题的目的与意义 我国老年人口逐年增多，我国即将迈入老龄化国家社会。老龄化问题的出现，这将 使血栓栓塞性疾病的发病率明显增高，提供给我们的不仅仅只是一个巨大的溶栓药物市 场，更主要的是寻求降低血栓栓塞型基本的残废率和病残率提供安全高效、使用方便的 溶栓药物。纳豆激酶具有高效溶栓、无毒、价廉等特点，因此对其研究有着重要的意 义。 而酵母菌与人们的生活息息相关，是目前世界上唯一利用量超过百万吨的微生物， 也是当代遗传工程利用最多的模式生物菌之一。酵母菌含有人体所必需的氨基酸、b 族 维尘素、微量元素、碳水化合物等营养成分，富含多种生物活性物质。其中，酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) - f 业应用比较广泛，历史悠久。遗传背景清楚，不产生有毒 物质，生物安全性好。易于推广应用，现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型。 随着现代科学技术的发展，人们能够选育不同用途的酵母菌，进行工业化生产。因此， 酵母基因工程菌在功能食品、动物饲料、医疗保健及微生态制剂、人工口服疫苗等领域 的应用均具有广泛的发展前景。 本实验旨在建立溶栓的酵母遗传转化体系，为后续工业化生产纳豆激酶的酵母工程 菌株奠定基础，为用食品作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供一条新途径，无论作 为抗血栓药物还是预防血栓病的保健食品，都具有十分重要的价值。今后将生产出新一 代保健酵母，对血栓栓塞性疾病起到防病为主、治病为辅的作用。 2 纳正澈酶肇l 1 的克隆和序列分折 2 纳豆激酶基因的克隆和序列分析 对目的基因片断钠，激酶进行克降和序列分析，大体步骤足将目的i - 冈”断与t s i m p l ev e c t o r 连接，电降全大肠杆菌，抗性平扳、蓝白斑筛选阳性克隆t f _ i 质粒，对应 阳性转化菌送由上海乍l 公司测序分析。 详细技术路线见i 剖2 - 1 。 日的菌 p c r 扩增 产物缱化 转化d i l 5a 簿受态细臆 a m p 平扳筛选阳性克隆 质稳摄搬双晦切翻序罄窄 | ! l2 - l 纳豆激酶基冈克隆载体的构建流撑l !