（分析化学专业论文）毛细管电泳安培检测联用技术及应用.pdf

学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：蛰：塞亟 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：蛰：塞丝! 指导教师签名： 铂钨 签名日期：年月 日 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 毛细管电泳是2 0 世纪8 0 年代初迅速发展起来的一种高效分离分析技术。具有分离 效率高、分析速度快、检测灵敏度高、样品用量少、易于自动化操作等优点，已经广泛 的应用到食品卫生、农业、临床医学、药物分离、环境分析、生化分析等多种领域。样 品的预处理和检测灵敏度的提高一直是人们关注的问题，本论文针对这两个问题开展了 工作。一方面建立了一种简单预处理方法，即采用在毛细管进样端口原位相转化法制备 透析膜，以实现透析膜与毛细管电泳的在柱联用。另一方面，采用多壁碳纳米管修饰电 极和场放大富集技术来提高毛细管电泳的检测灵敏度，以满足分析痕量样品的分析。本 论文分为四个部分： 第一章：绪论 首先介绍了毛细管电泳的发展历史、基本原理、分离模式、检测技术和应用现状。 然后简单介绍了微透析进样技术、多壁碳纳米管修饰电极、毛细管电泳富集方法的原理 等相关知识。 第二章：基于聚砜膜的透析进样毛细管电泳系统与性能评价 将毛细管电泳技术与微透析进样技术相结合，采用在毛细管进样端口原位相转化法 制备透析膜，以实现透析膜与毛细管电泳的在柱联用。用多巴胺考察并优化了膜制作的 材料和工艺，对不同组成的成膜液制作的膜对大分子的拦截效果进行了研究。从膜对样 品的净化能力、膜对电泳的影响、膜的稳定性和制膜重现性等方面进行了考察，从而对 进样毛细管电泳系统性能进行评价。该法操作简单，成本低廉，接口死体积小，可直接 用此毛细管对复杂样品进行采样然后进行毛细管电泳分离，而无需复杂的样品预处理步 骤。 第三章：微型纳米组分电极的制备及其在毛细管电泳分析中的应用 采用化学吸附的方法制备多壁碳纳米管碳纤维修饰电极，并考察电极的性能，与碳 纤维电极相比较，具有更好的稳定性和重现性，提高分析测试灵敏度。将制备的电极用 于毛细管电泳，对磺胺嘧啶( s d ) 和甲氧苄胺嘧啶( 卟佃) 和磺胺甲嗯唑( s m z ) 进 行分离测定。本实验制备的碳纳米管修饰电极的方法未见文献报道，即直接在碳纤维微 电极表面吸附碳纳米管，操作非常简单，并且有效的提高了检测灵敏度，效果很好。 第四章：多壁碳纳米管修饰电极结合场放大技术的毛细管电泳法测定牛奶中磺胺类药物 残留 ， 样品的在 优势，又 ( 加) 测定。这 结果使人 多巴胺； 辽宁师范大学硕士学位论文 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o na n di t s a p p l i c a t i o n a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i san e w - s t y l es e p a r a t i o na n da n a l y s i st e c h n i q u ew h i c hi s e s t a b l i s h e da n dq u i c k l yd e v e l o p e di nt h ee a r l y1 9 8 0 s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a st h e a d v a n t a g e so fh i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , a n a l y s i ss p e e d ，h i g hs e n s i t i v i t y ，s m a l la m o u n to f s a m p l ea n de a s ya u t o m a t i o n n o w a d a y s ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e nw i d e l yu s e di nt h e f i e l d so f f o o ds a n i t a t i o n , a g r i c u l t u r e ，c l i n i c a lm e d i c i n e ，p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，e n v i r o n m e n t a n a l y s i s ，b i o c h e m i s t r ya n a l y s i sa n ds oo n p e o p l eh a v eb e e nc o n c e r n e da b o u ts a m p l e p r e p a r a t i o na n di m p r o v e ds e n s i t i v i t y i nt h i st h e s i s t h e s et w oi s s u e sa r er e s e a r c h e d o nt h e o n eh a n d as i m p l ep r e t r e a t m e n tm e t h o di se s t a b i l i s h 硼1 ed i a l y s i sm e m b r a n ei sm a d eb y p h a s e i n v e r s i o np r o c e s si nt h ei n l e te n do ft h es e p a r a t i o nc a p i l l a r y 。w h i c ha c h i e v ed i a l y s i s m e m b r a n ei nt h ec o l u m na s s o c i a t e dw i t ht h eu s eo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s o nt h eo t h e r h 趾也t h i sp a p e ri m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fc a p i u a r ye l e c t r o p h o r e s i sb ym u l t i - w a l l e d c a r b o nn a n o t u b em o d i f l e de l e c t r o d ea n dt h ef i e l da m p l i f i c a t i o ne n r i c h m e n tt e c h n o l o g yt o m e e tt h ea n a l y s i so ft r a c es a m p l e s 明1 ec o n t e n t so ft h i sd i s s e r t a t i o ni n c l u d ef o u rc h a p t e r s ： c h a p t e r1 p r e f a c e f i r s t , t h ep a p e rd e s c r i b e st h eh i s t o r i c a ld e v e l o p m e n to fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，t h e b a s i cp r i n c i p l eo fs e p a r a t i o nm o d e s ，t h ed e t e c t i o na n da p p l i c a t i o no ft e c h n o l o g y s e c o n d , t h e p a p e ri n t r o d u c et h em i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gt e c h n i q u e ，m u l t i - w a l lc a r b o nn a n o t u b e sm o d i f i e d e l e c t r o d e ，t h ep r i n c i p l eo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm e t h o df o re n r i c h m e n ta n do t h e rr e l a t e d k n o w l e d g e r c h a p t e r2 p o l y s u l f o n em e m b r a n ed i a l y s i ss a m p l i n gs y s t e ma n dp e r f o r m a n c ee v a l u a t i o no f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc o m b i n e dw i t hm i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gt e c h n i q u e ，t h ed i a l y s i s m e m b r a n ei sm a d eb yp h a s e i n v e r s i o np r o c e s si nt h ei n l e te n do ft h es e p a r a t i o nc a p i l l a r y , w h i c ha c h i e v ed i a l y s i sm e m b r a n ei nt h ec o l u m na s s o c i a t e dw i t ht h eu s eo fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s t h i sp a r ti n v e s t i g a t ea n do p t i m i z et h ep r o d u c t i o no fm e m b r a n em a t e r i a l sa n d p r o c e s s e sw i t hd o p a m i n e t h ea b i l i t yo fm e m b r a n ec u r i n go f fm a c r o m o l e c u l e sa n dp a r t i c l e s i sa l s oa s s a y e dq u a l i t a t i v e l y t h em e m b r a n ep u r i f i c a t i o na b i l i t yo ft h es a m p l e s ，t h ei m p a c to f m e m b r a n eo ne l e c t r o p h o r e s i s ，t h em e m b r a n es t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t ya r ee v a l u a t e d t h e i i i 毛细管电泳安培检测联用技术及应用 m e t h o di ss i m p l e ，l o wc o s t ，s m a l ld i ei n t e r f a c ea n dt h ec a p i l l a r yc a nb ed i r e c t l yu s e di nt h i s s a m p l eo fc o m p l e xs a m p l e sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t h o u tc o m p l i c a t i n gs a m p l e p r e t r e a t m e n ts t e p s c h a p t e r3 p r e p a r a t i o no fn a n o c o m p o n e n t so fm i c r o e l e c t r o d ea n dt h ea p p l i c a t i o n s i n c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h ep r e p a r a t i o no fm u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s c a r b o nf i b r em o d i f i e de l e c t r o d ei sc a r r i e d o u tb yc h e m i c a la d s o r p t i o n t h ee 伍c i e n c yo ft h ee l e c t r o d ei se v a l u a t e d , w h i c hi sb e t t e rt h a n c a r b o nf i b e re l e c t r o d ei ns t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t y 叨1 es e n s i t i v i t yi so b v i o u s l yi m p r o v e d 1 1 1 ee l e c t r o d ei su s e di nt h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i st os e p a r a t ea n dd e t e r m i n es u l p h a d i a z i n e ， t r i m e t h o p r i ma n ds u l f a m e t h o x a z o l e i nt h i ss t u d y ，t h ep r e p a r e dm e t h o do fc a r b o nn a n o t u b e s m o d i f i e de l e c t r o d eh a s n o tb e e nr e p o r t e d t h es u r f a c eo fc a r b o nf i b e rm i c r o e l e c t r o d ea d s o r b e s c a r b o n n a n o t u b e sd i r e c t l y 1 1 1 eo p e r a t i o ni s v e r ys i m p l e t h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y i s e f f e c t i v e l yi m p r o v e da n dw e l l c h a p t e r4 m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b em o d i f i e de l e c t r o d ea n df i e l da m p l i f i e rt e c h n o l o g y c o m b i n e dw i t hc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sf o rd e t e r m i n a t i o no fs u l f o n a m i d e sr e s i d u e si nm i l k f i r s t , m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e | c a r b o nf i b e rm o d i f i e de l e c t r o d ei sp r e p a r e db yt h e m e t h o d so fc h e m i c a la d s o r p t i o n s e c o n d , t h eo n l i n ee n r i c h m e n to ft h es a m p l e si sa c h i e y e db y f i e l da m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g y 硼1 es e n s i t i v i t yh a sb e e ni m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y e n r i c h m e n t t e c h n o l o g yn o to n l yh a st h ea d v a n t a g e so fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，b u ta l s ot h en e e dt oa d a p t t ot h et r a c ea n a l y s i s u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h i sp a p e rs e p a r a t ea n dd e t e r m i nt h e s t a n d a r d so fs u l f a d i a z i n e ( s d ) ，t r i m e t h o p r i m ( t m p ) a n ds u l f a m e t h o x a z o l e ( s m z ) t h e r e s i d u e so ft h e s ec o m p o n e n t si nm i l ki sd e t e r m i n e d 1 1 1 em e t h o d so fu s i n gm o d i f l e d e l e c t r o d e sw i t hf i e l da m p l i f i e rt e c h n o l o g yt oi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yh a sn o tb e e n r e p o r t e d 1 f 1 1 er e s u l ti ss a t i s f a c t o r y k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；m i c r o d i a l y s i ss a m p l i n gt e c h n i q u e ：m u l t i w a l l e d c a r b o nn a n o t u b em o d i f i e de l e c t r o d e ；f i e l da m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ； d o p a m i n e ；s u l f o n a m i d e s i v 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要。i a b s t r a c t i i i l 文献综述1 1 1 毛细管电泳概述1 1 1 1 毛细管电泳的发展与兴起l 1 1 2 毛细管电泳的基本原理1 1 1 3 毛细管电泳的分离模式2 1 1 4 毛细管电泳的检测方法4 1 1 5 毛细管电泳特点6 1 1 6 毛细管电泳的研究进展和应用现状6 1 2 透析进样毛细管电泳技术。7 1 2 1 微透析的基本原理7 1 2 2 微透析的联用技术7 1 2 3 微透析技术的优点8 1 2 4 微透析技术的缺点9 1 2 5 透析膜的种类9 1 2 6 微透析技术的展望1 1 1 3 化学修饰电极一多壁碳纳米管碳纤维修饰电极1l 1 3 1 化学修饰电极11 1 3 2 化学修饰电极的修饰方法11 1 3 3 化学修饰电极的修饰材料。1 2 1 3 4 制备修饰电极的新材料碳纳米管。1 3 1 3 5 碳纳米管修饰电极的制备1 4 1 4 毛细管电泳在线富集技术1 4 1 4 1 样品堆积( s a m p l es t a c k i n g ) 1 5 1 4 2 扫集法( s w e e p i n g ) 1 6 1 4 3 离子选择性耗尽进样( s e l e c t i v ee x h a u s t i v ei n j e c t i o n , s e 0 1 7 1 4 4 等速电泳( i s o t a c h p h o r e s i s 。i t p ) 18 1 4 5 动态p h 连接法( d y n a m i cp hj u n c t i o n ) 18 1 4 6d 、结1 9 2 基于聚砜膜的透析进样毛细管电泳系统与性能评价2 0 一v 一 毛细管电泳安培检测联用技术及应用 2 1 前言2 0 2 2 实验部分2 0 2 2 1 主要实验仪器2 0 2 2 2 实验药品2 0 2 2 3 试验方法2 l 2 2 4 膜的制备2 1 2 2 5 电极的制备及活化2 1 2 3 结果与讨论：2 1 2 3 1 制膜材料：2 1 2 3 2 制膜的工艺条件【7 3 1 2 2 2 3 3 膜的结构与位置2 2 2 3 4 基于聚砜膜的毛细管电泳系统与性能评价2 3 2 3 5 定量分析3 l 2 4 ，j 、： 5 ：；2 3 微型纳米组分电极的制备及其在毛细管电泳分析中的应用3 4 3 1 前言3 4 3 2 实验部分3 4 3 2 1 主要仪器设备3 4 3 2 2 试剂与药品3 4 3 2 3 电极的制备及修饰：3 5 3 2 4 实验方法3 6 3 3 结果与讨论3 7 3 3 1 吸附时间的影响3 7 3 3 2 缓冲液种类、酸度及浓度的影响3 7 3 3 3 有机溶剂的影响4 0 3 3 4 分离电压的影响4 0 3 3 5 检测电位的影响4 l 3 3 6 进样电位和进样时间的影响4 2 3 3 7 多壁碳纳米管修饰电极的性能评价4 4 3 3 8 重现性、线性范围及检出限4 5 3 3 9 实际样品的测定及回收率4 6 3 4 结论4 7 辽宁师范大学硕士学位论文 4 多壁碳纳米管修饰电极结合场放大技术的毛细管电泳法测定牛奶中磺胺类药物残留 z 1 9 4 1 前言4 9 4 2 实验部分4 9 4 2 1 主要仪器设备4 9 4 2 2 实验药品4 9 4 2 3 电极的制备及修饰5 0 4 2 4 实验方法5 0 4 2 5 场放大富集技术的原理5 0 4 2 6 样品的处理5 0 4 3 实验条件的优化51 4 3 1 有机溶剂乙腈含量的优化5l 4 3 2 分离电压的优化51 4 3 3 检测电位的优化：5 2 4 3 4 缓冲溶液酸度的优化5 3 4 3 6 场放大技术m w c n t 修饰电极对样品的富集效果对比5 4 4 3 6 重现性、线性范围及检出限5 5 4 3 7 实际样品的测定及回收率5 6 4 4 结论5 6 结论5 8 参考文献5 9 致谢：6 4 辽宁师范大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 毛细管电泳概述 1 1 1 毛细管电泳的发展与兴起 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) ，是2 0 世纪8 0 年代初迅速发展起来 的一种高效分离分析技术。毛细管电泳包容电泳、色谱及其交叉内容，是一类以毛细管 为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。 毛细管电泳源远流长，1 9 3 7 年，a r u n et e s i l i u s e 建立了“移动界面电泳方法 ，分 人血清中的白蛋白以及a l 、( 1 2 、p 和丫球蛋白五种蛋白【1 1 ，1 9 4 8 年获得诺贝尔化学奖。 1 9 7 4 年v i r t a n e n 报导了2 0 0 5 0 0 岬i d 玻璃管中电分离溶质的电位检测，开创了区带 电泳在小直径管中进行的先河。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a s 使用7 5i n n 毛细管、荧光检 测器在线检测【2 】，标志着毛细管区带电泳( c z e ) 在生物技术领域应用的开始。1 9 8 4 年 t e r a b e 发明的胶束电动力学色谱法( c c ) 可分离中性化合物，电泳和色谱的完美结 合从此开始。1 9 8 7 年h j e r t e n 把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行，提出c i e f 。 c o h e na n dk a r g c r 发表了毛细管凝胶电泳的研究工作。1 9 8 8 年r o s ea n dj a r g e n s o n 首先 提出使用毛细管电泳作微量制备的可能性，实现了5 x 1 0 _ 1 2m o l l 的蛋白和肽的毛细管 电泳提取。1 9 9 3 年【3 z a r e 等将激光引入毛细管电泳作检测器，c e 开始突飞猛进的发展。 目前，毛细管电泳技术已经成为一种广泛使用的微量分离分析方法。 1 1 2 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳是以高压电场作为驱动力，毛细管为分离通道，样品的多种特性( 电荷、 大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等) 为依据，根据各组分之间在毛细管中 的迁移速度和分配行为上的差异，而进行高效分离的一种液相微分离分析技术【4 】。毛细 管电泳系统主要由高压电源、样品缓冲液贮池、石英毛细管、检测器等四部分组成。毛 细管电泳仪主要包括高压电源、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。图1 1 为毛细管电泳系统基本结构。 毛细管电泳安培检测联用技术及应用 图1 1 毛细管电泳系统基本结构 f i g 1 1t h e b a s i cs n l l c t i l eo f c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i ss y s t e m h p c e 通常采用的是石英毛细管柱，一般情况下( p h 3 ) ，硅醇基( - s i o h ) 电离 为硅氧基负离子( - s i o ) ，使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子( 一 般为阳离子) 被吸附到表面附近，形成双电层，并且存在电位差。当在两端施加电压时， 液体会相对于固体表面移动，这种现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电 渗流( e o f ) 。带电粒子在电解质溶液中的迁移速度是电泳和电渗流两个速度的矢量和， 阳离子的移动方向和电渗流方向一致，因此阳离子最先从负极流出，中性粒子的电泳速 度为零，迁移速度等于电渗流速度，随后流出，阴离子的移动方向和电渗流方向相反， 因为电渗流速度一般大于待测离子电泳速度，故阴离子在中性粒子之后流出，这样由于 不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。如果待分离组分均为中 性粒子，则需向缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水 内核、外部带负电的胶束，中性粒子在胶束相和水相之间分配，疏水性强的组分与胶束 结合的较牢，在电场力的作用下，由于本身疏水性不同从而实现分离。毛细管电泳的分 离实质就是各组分的差速运动。混合物在迁移过程中，由于样品的多种特性( 电荷、大 小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等) 的不同，各组分迁移速度不同，将逐渐 分成不同的区带。区带越窄、区带间距离越大，分离效果就越好。在分离的终点，检测 器把被分析组分通过终点时的情况记录下来，各组分由于迁移速度的不同，得到按时间 分布的电泳谱图。根据迁移时间定性分析，峰的高度或峰面积定量分析。 1 1 3 毛细管电泳的分离模式 细 泳 泳 毛细管电泳安培检测联用技术及应用 表1 1 毛细管电泳的类型【5 】 t a b 1 1t y p e so fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 注：通常成为前导电解质和终结电解质缓冲液，记作l e a d i n ge l e c t r o l y t e ，l e 和t e r m i n a t i n ge l e c t r o l y t e ， t e ，l e 中的离子淌度需大于样品离子，而t e 中的离子淌度则需小于样品。 1 1 4 毛细管电泳的检测方法 毛细管电泳以其高效、快速的优势，受到人们越来越多的关注。但是，由于 一4 一 辽宁师范大学硕士学位论文 c e 中的毛细管内径细、样品进样体积小，对检测器灵敏度要求很高，所以增加检测的 灵敏度，又避免样品区带出现明显展宽是c e 发展中的关键问题。目前，已经实现多种 检测技术与毛细管电泳的联用【6 】。主要有紫外可见吸收检n ( u v - v i ) 、荧光检测( f d ) 、 质谱检n ( m s ) 、化学发光检测( c l ) 、电化学检测( e c d ) 等。 ( 1 ) 紫外一可见光吸收检测法 紫外一可见检测法的原理遵守朗伯比尔定律，该方法通用性较好，结构简单。但是 毛细管内径很细，光路狭窄，该技术的检测灵敏度受到限制，因此该检测方法的灵敏度 一般较低。后来，通过采用矩形扁毛细管、改良检测窗口、使用带球镜聚焦的紫外可 见检测器或光二极管阵列检测器等方法，显著提高了检测的灵敏度、选择性和分辨率。 该法的检测灵敏度大多在1x 1 0 5 1x1 0 石m o l l 之间，是最普遍的一种毛细管电泳检测 方法。 ( 2 ) 荧光检测法 荧光检测法是目前c e 中最灵敏的一种检测方法，该方法对组分区带不会引起额外 的展宽。荧光检测器分为普通荧光检测器和激光诱导荧光( l ) 检测器，但该类检测器 价格昂贵，而且需要对不具有荧光特性或者发出的荧光非常弱的样品进行衍生或标记后 才能检测，限制了荧光检测法的使用范围。然而，尽管如此，荧光检测法的高灵敏度和 高选择性，使它仍然成为c e 不可或缺的检测方法。 ( 3 ) 质谱检测法 质谱法定性功能较强，它是根据分子的质荷比的不同而达到分离目的，它可以区分 不同分子质量的物质，还可以区分质量相同，不同分裂模式的物质，灵敏度高，结构分 析能力强，快速得到样品的定性定量结果。毛细管电泳与质谱联用，可以快速完成众多 复杂成分的分离和结构鉴定。该技术主要应用于基因分析和重要复杂体系的研究。但 c e m s 联用灵敏度较低、仪器昂贵，目前难以普及。 ( 4 ) 化学发光检测法 化学发光是物质进行化学反应时伴随的光辐射现象，可以通过检测发光强度和发光 光谱，来进行物质的定量和定性分析。该类检测器与毛细管电泳相结合，可直接用于复 杂样品中微量组分的分离与测定。但是，光学仪器的选择性差，限制了该方法的应用范 围。 ( 5 ) 电化学检测法 毛细管电泳与电化学检测联用，与其他类型的检测方法相比具有独特的优点，具有 灵敏度高、选择性好、分离效率高、线性范围宽、设备简单等特点，适合复杂体系中痕 量电活性物质的检测，c e e d 联用技术是应用最广泛的技术。电化学检测法有三种基本 毛细管电泳安培检测联用技术及应用 模式：电位法、电导法和安培法。电位检测操作简单，但容易导致峰变形，且重现性相 对较差；电导检测通用性好，但是灵敏度较低，适用于较小离子的检测；安培检测的原 理是测量化合物在电极表面发生氧化或还原反应时，产生与分析物浓度成正比的电流。 其中，安培法是三种模式中最容易实现，应用最为普遍的一种电化学检测方法，但一般 只能检测本身带有电化学活性的物质。本论文采用安培检测法。 1 1 5 毛细管电泳特点 传统电泳受到焦耳热、密度梯度、对流、温度梯度、( 溶剂蒸发) 等因素的限制， 毛细管电泳同时具有高压电泳的优点又有和高效液相色谱的优点t 高效小孔径毛细管柱提供了较大的内表面积体积比，允许使用高电场( 1 0 0 5 0 0 v c m ) ，开创了快速高效的分离( n 1 x1 0 5 1 1 0 6 ) 。 快速几十秒至十几分钟完成分离。 样品对象广从无机离子到整个细胞，具有“万能分析功能或潜力。 多模式电渗使得所有溶质均可出峰，c e 比大规模电泳更易自动化，且分离模式多样 化，丰富的检测方式，类似于h p l c 。 自动自动化程度最高的分离方法。 微量进样体积一般为n l 。 经济缓冲液用量相当于h p l c 的l ，实验消耗及维护费用低廉。 洁净通常使用水溶液，对人体环境无害。 1 1 6 毛细管电泳的研究进展和应用现状 毛细管电泳技术从诞生到现在，不断的完善和发展，已经广泛的应用到多种领域， 其中食品分析、环境检测、医学研究、复杂药物分析、d n a 与r n a 分析、生化研究、 单细胞分析、蛋白质组分离、糖组分析、手性分离等几乎涵盖了化学和生命科学的各个 领域。从无机离子到生物大分子，从荷电离子到中性分子，从简单分子到基体复杂的生 物大分子，毛细管电泳均能对其进行分离分析，展示出c e 的优越分离能力和广阔的应 用前景。阵列毛细管电泳( c a e ) 以其巨大的高通量的发展潜力，已经成为当今d n a 测序的主力方法 7 3 。二维和多维c e 技术，是蛋白质化学研究发展的基石，可能成为c e 继续发展的突破点【删。毛细管电泳的联用技术是迄今为止，解决毛细管电泳定性问题的 关键手段。但是，找出能与毛细管电泳技术完美结合的高灵敏度定性手段，还需要大量 的研究工作。c e 研究正在向前沿领域推广，但是随着科技的发展，开发新的研究方法 和提高检测灵敏度引起科研工作者的普遍关注。 一6 一 辽宁师范大学硕士学位论文 1 2 透析进样毛细管电泳技术 毛细管电泳具有分析时间短、分辨率高、样品用量少等特点，在各个领域中已经得 到广泛应用。但是c e 在生物样品分析中存在着一些困难，在分析复杂体系中的小分子 时，样品中含有的高浓度的蛋白质等颗粒物或生物大分子会干扰实验【1 0 1 ，如产生干扰峰、 吸附在毛细管壁上的硅羟基上，引起一系列的影响，使毛细管电泳分析效率下降，所以 进样前必须对样品进行预处理。样品预处理技术与毛细管电泳联用方法可分为离线( o f f l i n e ) 、( a tl i n e ) 、在线( o nl i n e ) 和在柱( i nt i n e ) 等模式t 1 1 填中在线样品预处理模式蚴( 色谱 方法、电泳方法和膜技术) 简化了预处理的过程，克服了微量样品处理上的困难。所以， 如果在毛细管进样端端口制备一种透析膜( 这样接口死体积小) ，利用微透析技术把大 分子截留在毛细管进样端外面，这样就可以对复杂体系样品直接进样而不需要繁琐的样 品预处理。 透析技术是一种新型生物采样技术，1 9 7 2 年美国耶鲁大学d e l g a d o 等用来研究猴脑 内多巴胺浓度而首创【1 3 1 ，开启了微透析技术在神经科学和脑部研究领域的大门。8 0 年 代中期电化学技术有了突飞猛进的发展，使得微透析技术广泛的应用到各个领域。随着 微透析采样和检测灵敏度的不断提高，微透析技术迅速发展起来。近年来兴起的新型药 代采样技术【1 4 1 ，具有“实时、在线、活体、动态 的优势，在药动学、药物体内分布、 代谢产物、蛋白结合率等研究领域中发挥重要作用。所以，高流速、小体积、采样间隔 短、高通量成为微透析技术的发展趋势【1 5 , 1 6 。毛细管电泳以其独特的优点：分析速度快、 低消耗、高分辨率、样品用量少等，为与微透析技术的联用提供了理想的条件。 1 2 1 微透析的基本原理 1 7 ，1 8 】 微透析技术是以透析作为取样的基础，采用具有一定截留分子量的纤维半透膜，根 据渗透扩散原理，利用透析管内存在着的浓度梯度，当某些物质的浓度在透析膜的一侧 较高时，待测物质按浓度梯度扩散，进入透析管，达到一种动态平衡，并可被透析管内 的流动的缓冲液不断带出。一般情况下，透析膜外的样品浓度高于膜内的浓度。微透析 样品用量少、浓度低，对与之联用的分析仪器的灵敏度要求较高。 1 2 2 微透析的联用技术 微透析技术具有在体、实时、在线取样的优点，但是由于样品用量很少，对分析仪 器检测灵敏度的要求较高，所以将微透析技术与灵敏度高的检测技术联合使用，可达到 多种检测目的。对于含有不饱和基团的药物，可采用紫外检测