第7讲 噬菌体载体与柯斯载体 吴乃虎 基因工程原理讲义.doc

第七讲 噬菌体载体与柯斯载体吴 乃 虎中国科学院遗传与发育生物学研究所2005年8月目 录一、噬菌体的一般问题1何谓噬菌体2噬菌体效价测定与双层平板法3噬菌体的生命周期4噬菌体的溶源生命周期5超感染免疫6溶源性的诱发7Campbell模型二、l噬菌体载体1l噬菌体的生物学概述2l噬菌体载体的构建(1) l噬菌体载体构建的基本原理(2) 插入型载体(3) 替换型载体3l噬菌体载体的改良(1) Spi-正选择的l噬菌体载体(2) 具有内删除特性的l噬菌体载体4l重组体DNA分子的体外包装(1) l重组体DNA的转染作用(2) l噬菌体的体外包装5l噬菌体DNA的包装限制问题(1) 包装限制的概念(2) 包装限制与l噬菌体的克隆能力(3) 包装限制的生物学意义6l重组体分子的选择方法(1) cI基因功能选择法(2) lacZ基因功能选择法(3) Spi-选择法三、柯斯质粒载体1柯斯质粒的定义及其构建(1) l噬菌体的克隆能力(2) 柯斯质粒载体定义(3) 柯斯质粒pHC79的构建(4) 柯斯质粒克隆能力及其组成2柯斯质粒载体的特点3柯斯质粒载体的改良4柯斯克隆(1) 定义(2) 理论依据(3) 柯斯质粒包装条件(4) 柯斯克隆程序(5) 柯斯克隆的优点5柯斯克隆的改良(1) 柯斯克隆的局限性及其克服办法(2) Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3) Bates-Swift克隆方案噬菌体载体与柯斯质粒载体一、噬菌体的一般问题1何谓噬菌体？(1)定义噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。“phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。例如：试管中含有T4和T7等多种phages。(2)噬菌体的核酸类型及结构*1.与质粒相比，噬菌体的结构显然要复杂得多，但与细菌或真核细胞相比，则显得十分简单。它的DNA分子中除了复制起点之外，还编码着外壳蛋白质的基因。噬菌体的核酸最常见的是双链线性DNA、双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA及单链RNA等多种形式。*2.不同的噬菌体颗粒结构相差甚大，可归结为如下三种基本类型：a. 无尾部结构的二十面体型；b. 具尾部结构的二十面体型；c. 线状体型。图7-1 T2噬菌体颗粒的结构示意图迄今已知的大多数噬菌体都是属于第二种结构类型(图7-1)，在其二十面体型的头部下端，连接着一条尾部结构，恰似一种小型的皮下注射器。2噬菌体效价测定与双层平板法(1)效价定义效价(titer)又叫滴度，系指单位体积的噬菌体制剂中所含有的具感染能力的噬菌体颗粒的数目。它以每毫升噬菌体制剂中的噬菌斑形成单位pfu/ml表示。(2)效介的测定(titering)10倍稀释法与双层平板法(3)噬菌斑形态混浊型与清晰型3噬菌体的生命周期(1)噬菌体的生命周期包括*1.溶菌生命周期产生子代噬菌体*2.溶源生命周期不产生子代噬菌体(2)烈性噬菌体和温和噬菌体：*1.烈性噬菌体只具有溶菌周期的噬菌体(phage)*2.温和噬菌体具有溶源周期的噬菌体(3)烈性噬菌 溶菌生长周期：吸附注入转变合成组装释放4噬菌体的溶源生命周期(1)若干基本概念*1.温和噬菌体(temperate phage)既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。*2.溶源性细菌(lysogen)在染色体基因组上具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。如果某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能够完成其溶菌周期，故含有这样噬菌体的细菌，叫做缺陷性的溶源性细菌。*3.溶源化(lysogenization)用温和的噬菌体感染细菌培养物，使寄主细菌转变为溶源性细菌的过程，叫做溶源化。溶源化的分子本质是噬菌体的DNA整合到寄主细菌染色体基因组DNA之中，成为它的组成部分。*4.整合(integration)噬菌体DNA组入寄主细胞染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入(insertion)。整合的准确定义是：小分子量的DNA分子插入到大分子量的DNA分子中的重组过程。参入(incorporation )*5.原噬菌体(prophage)在溶源性细菌中存在的处于抑制状态的整合的或非整合的噬菌体DNA叫做原噬菌体5超感染免疫(再感染免疫)(1)超感染免疫定义溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性细菌具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性叫做超感染免疫。(2)超感染免疫理论解释*1.阻遏基因cI：编码阻遏蛋白质分别同启动基因PL和PR相邻的操纵单元(operator)oL及oR结合同启动基因pL相邻 同启动基因pR相邻*2.在溶源性细菌中，cI的产物阻遏蛋白是超量的，致使oL和oR处于被结合的状态，于是RNA聚合酶无法启动pL和pR进行转录，因此处于溶源状态。*3.溶源性细菌(对l phage而言的)发生l phage超感染时，当l phage DNA进入细菌之后，超量的cI阻遏物立即同其空闭的oL和oR结合，从而阻止其进入溶菌状态。这种被阻遏物分子结合着的操纵单元，阻止l phage发育成溶菌状态，我们称这种抑制作用为对同源免疫超感染的抗性。*4.超感染的l phage DNA将会发生什么变化？超盘旋l phage DNA复制困难，而细菌细胞却能正常复制，结果l DNA被“稀释”。6溶源性噬菌体的诱发(1)定义溶源性细菌经过许多世代之后，便能够开始进入溶菌周期，这个过程叫做溶源性细菌的诱发。(2)原理溶源性细菌的诱发，同样也是依赖于阻遏基因和操纵单元的相互作用。溶源性细菌中的阻遏物失活l phage操纵单元oL和oR处于自由状态转录作用正常发生结果phage在删除酶的作用下被诱发游离的l phage DNA再环化。7Cacmpbell模型(1)概念*1.l的附着位点attlDNA是整合在大肠杆菌染色体上位于gal操纵子和bio操纵子之间的一个特定位点，这个位点叫做att。*2.int基因l phage编码的一种整合酶，能够认别phage DNA和细菌DNA的附着位点。并催化这两种DNA之间发生链的交换。(2)Campbell模型这是一种解释l噬菌体DNA对E.coli染色体DNA整合作用的模型：lDNA环化成环形分子在细菌DNA附着位点BOB及噬菌体DNA附着位点POP，发生物理性破裂在这两个附着位点之间进行准确的噬菌体DNA和寄主DNA的再接合完成整合作用图7-2 Campbell模型二、l噬菌体载体1l噬菌体的生物学概述(1)基因组结构*1.粘性末端l噬菌体的基因组是由双链DNA组成，其线性分子的两端各有一条由12个核苷酸组成的彼此互补的5单链突出序列，即通常所说的粘性末端。*2.cos位点注入感染寄主细胞内的lDNA线性分子，会迅速环化形成双链DNA分子。这种由粘性结合形成的特定的双链区段称为cos位点cos=cohesive-end site，即粘性末端位点*3.分子长度l噬菌体DNA分子长度为48502bp。*4.结构为叙述的方便，l噬菌体基因组被人为地区分为三个区域：a. 左侧区自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白和尾部蛋白合成所需的全部基因；b. 中间区介于基因J与基因N之间，又称为非必要区。该区的编码基因与噬菌斑形成无关，但包括重组相关基因(redA和redB)；整合基因(int)，及删除基因(xis)；c. 右侧区位于N基因的右侧，包括全部的调控基因，如复制基因(O)和溶菌基因(S及R)。(2) l噬菌体DNA的复制*1.在感染的早期：环形的lDNA分子按q形式从双向进行复制，其复制起点位于c基因和O基因之间，并且需要O和P蛋白质的参与；*2.到了感染的晚期：控制滚环复制机理的开关被启动，合成出由一系列线性排列的lDNA组成的多连体分子。但这种多连体分子须经过核酸酶从cos位点处切割之后，形成单体的lDNA之后，才能被包装起来；*3. lDNA复制所必须的条件a. cos末端(cos ends)12bp的粘性末端在体内可以彼此配对而使线性的lDNA重新环化起来。这种12bp的延伸末端是由于cos位点切割形成的，它是在包装期间发生的。b. O和P蛋白质O蛋白质同DNA结合，而P蛋白则是同寄主编码的dnaB蛋白质相互作用。c. GAM蛋白质抑制大肠杆菌核酸外切酶(recBC核酸酶)，从而保护滚环复制产生的多连体DNA分子免受核酸外切酶的破坏。N抗终止因子(N antitermination factor)引起DNA聚合酶通读早期的终止区(terminator)，表达Q蛋白质以及复制蛋白质。Q抗终止因子(Q antitermination factor)引发RNA聚合酶通读tR65，表达头部以尾部组装蛋白质以及寄主细胞溶菌蛋白质。复制蛋白质(replication proteins)噬菌体O和P蛋白质同寄主蛋白质一道工作，使DNA进行复制。包装及溶菌蛋白质(Packaging and lysis proteins)为噬菌体生长所必不可少的其它蛋白质。2l噬菌体载体的构建1l噬菌体载体构建的基本原理多余位点的删除野生型的l phage，对大多数限制酶都具有过多的识别位点，例如EcoRI有5个位点，Hind有7个位点。按照上述原理构成的l phage载体有两种类型：*1.插入型载体(insertion vectors)只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。这样的派生载体叫插入型载体。*2.替换型载体(replaument vectors)在两个限制位点之间的l DNA片段可以被插入的外源DNA片段所取代，这样的l派生载体叫替换型载体。(2)插入型载体*1.插入失活效应因外源DNA片段的插入而导致噬菌体某种功能的失效，此即所谓的插入失活效应。*2.免疫功能失活的插入型载体(inactivation of immunity function)在其基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切点，外源DNA片段在此克隆会导致载体失去合成活性阻遏物的功能，而不能进入溶源周期。免疫功能失活的插入型载体的辨别标记：带有外源DNA插入片段的载体感染之后，只能形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入片段的载体感染之后则形成混浊的噬菌斑。根据噬菌斑形态学特征，选择体外重组噬菌体和亲本噬菌体。*3.b-半乳糖苷酶失活的插入型载体(inactivation of E.coli b-galactosidase)在其基因组中含有一段E.coli的lac5区段，其中编码着b-半乳糖苷酶基因lacZ (lacZ基因)感染lac-大肠杆菌菌株(指示菌)IPTG和Xgal的作用形成蓝色的噬菌斑选择标记：具外源DNA片段的l phage形成白色噬菌斑不具外源DNA片段的形成蓝色噬菌斑(3)替换型载体l噬菌体载体克隆外源DNA的能力有一定的限制，因此改良l phage载体的一个重要目标是提高载体容纳外源DNA片段的能力，以期发展出可以接受任何一种的限制片段的载体系列。从目前情况看替换型载体有可能满足这样的要求。*1.根噬菌斑形态选择的替换型载体例如M. Thomas等人(1974)发展的替换型载体lgtlc，即是属于根据噬菌斑形态选择的替换型载体的一例。该载体的可替换片段C含有att、int、xis 3个基因选择表型：没有外源DNA取代时，可处于溶源状态，形成混浊噬菌斑非重组体有外源DNA取代时，att、int、xis 3个基因被取代，而不能处于溶源状态。因此形成清晰的噬菌斑重组体*2.根据噬菌斑显色反应选择的替换型载体N. E. Murrag等人(1977)发展的替换型载体lNM781，即属于根据噬菌斑显色选择的替换型载体的一例。该载体的可替换片段EcoRI片段含有supE基因由于这种噬菌体lNM781的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了。因此可以在乳糖麦康基氏(MacConkey)琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。选择没有外源DNA取代时，在乳糖麦康基氏琼脂培养基上产生红色噬菌斑，或是在Xgal培养基上产生蓝色噬菌斑非重组体当EcoRI片段(含supE基因)被外源DNA片段取代时，形成无色噬菌斑重组体3l噬菌体载体的改良l噬菌体载体改良的目的有四：a. 增加克隆外源DNA的能力；b. 提高对重组体正选择的特性；c. 可通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针；d. 可使插入的真核cDNA与b-半乳糖苷酸形成融合蛋白质；(1)Spi-正选择的l噬菌体载体*1.Spi-正选择的原理：野生型的l噬菌体不能够在P2噬菌体溶源性的细菌中生长，其表型为Spi+，即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感性(sensitive to P2 inhibition)。实验证明，这种生长抑制作用是受l噬菌体red和gam这两个基因编码产物控制的。如果噬菌体丧失了这两个基因，(例如被外源插入DNA所取代)，这样的噬菌体突变体便获得了Spi-表型，能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。因此，具有red和gam基因的替换型载体(即red和gam基因可被外源插入DNA片段所替代)作克隆实验，可以按照Spi特性来选择重组体。因此，Spi-表型为我们提供了一种正选择标记。*2.选择标记Spi+表型：不能在P2噬菌体溶源性的E.coli中生长，为非重组体Spi-表型：能够在P2噬菌体溶源性的E.coli中生长，red和gam基因被外源DNA取代，为重组体失去red和gam这两个基因的l噬菌体载体，其表型由Spi+Spi-(2)具有体内删除特性的l噬菌体载体(i) lZAP载体的结构*1.内删除载体定义lZAP载体是一种典型的具有内删除特性的l噬菌体载体，应用这种载体可在体内将插入的DNA片段直接从l载体转移到质粒载体上，而无须经过亚克隆的步骤。具有这种特性的载体叫做内删除载体。图7-3 lZAP载体的结构及其体内删除作用*2.lZAP载体的结构：a. 含有一个可以在体内发生删除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段；b. 在pBluescript DNA两侧含有f1起始子(I)和f1终止子(T)；c. 在pBluescript噬菌粒内部有一段其两端分别为T3和T7噬菌体启动子的多克隆位点MCS区；*3.pBluescript噬菌粒内删除原理：体外重组：lZAP载体+外源DNA片段(形成重组载体)感染：重组载体感染F E.coli菌株，之后再用M13和f1辅助噬菌体超感染反式蛋白质切割作用：在寄主细胞内由辅助噬菌体M13或f1基因II编码的反式作用蛋白质，识别位于lZAP载体臂上的f1起始子和终止子，最终导致含有克隆DNA插入序列的pBluescript噬菌粒从lZAP载体上删除下来包装作用与释放： 删除下来的lZAP被MB蛋白质包装成单链DNA噬菌体颗粒，并被挤压出寄主细胞。(ii) lZAP载体的主要特点a. 具有多种不同的核酸内切限制酶的单识别位点，可以克隆10Kb大小的外源DNA片段；b. 在插入的外源DNA序列取向及读码结构均保持正确时，就能从lacZ启动子表达杂种或融合的蛋白质，并可用抗体筛选；c. 在lacZ基因的NH2部位有6个单克隆位点，能发生b-半乳糖苷酶的插入失活效应，故可在Xgal显色平板上筛选重组体分子；d. 利用T3或T7噬菌体的RNA聚合酶，lZAP能够转录出任何一条链的mRNA分子，因此可方便地用来制备外源DNA插入序列的RNA转录本。(iii)RNA探针的制备由于MCS区的两端有一对T3和T7噬菌体的RNA聚合酶启动子，因此可以利用lZAP载体在体外制备插入的外源DNA序列之RNA拷贝。实验操作步骤：选用适当限制酶进行切割使pBluescript DNA线性化T7 RNA聚合酶及4种(NTPs)核苷三磷酸mRNA分子*如果用的NTPs是带有a-32P的核苷三磷酸，则可合成高比活性的标记的mRNA分子。4l重组体DNA分子的体外包装(1)l重组体DNA的转染作用*1.转染(transfection)效率定义每微克lDNA转染寄主细胞所产生的噬菌斑数目，叫做转染效率；*2.l DNA的转染是个低效过程未经任何遗传操作、新鲜制备的l DNA，其标准的转染效率也只有105-106之间；而经过基因操作的l DNA，如带有插入片段等，其转染效率则更低，一般只有103-104左右，无法满足实验要求。*3.l重组体DNA低效转染原因分析：载体分子同外源DNA片段之间的结合完全是一种随机的方式，形成的重组分子中有相当比例是没有活性的，无法转染寄主细胞。因此，l重组体DNA对寄主细胞的转染是一种低效率的过程。(2)l噬菌体的体外包装*1. l噬菌体DNA的包装过程在正常的生长期间，寄主细胞内l噬菌体要进行特殊的包装反应，它涉及如下一系列的过程：滚环模型合成多连体形式(concatemeric form) DNA，在具备噬菌体头部前体和A基因产物的条件下，会发生如下反应从COS位点处切割成l DNA单体分子这种线性的l单体DNA分子适于包装，会很快被装填到头部外壳里边由于具有12bp长的粘性末端，所以这种线性单体的l DNA分子又会重新再环化起来随后基因D的产物便掺入到完整的头部，接着通过基因W和FII产物的作用，把头部和分别组装的尾部结构连成一体，最终形成成熟的噬菌体颗粒*2.体外包装定义在体外试管中完成发生于寄主细胞内的l DNA的全部包装过程，叫做lDNA的体外包装。*3.体外包装原理l噬菌体的头部和尾部是分开进行装配的头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部；尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部。将从这两种不同突变型噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。*4.互补突变体D基因突变的l phage 是一对互补的突变型phageE基因突变的l phageE基因发生琥珀突变(Eam)的l噬菌体不能形成头部结构，所以在其感染的寄主细胞中积累大量的尾部蛋白。D基因发生琥珀突变(Dam)的l噬菌体，lDNA不能进入头部，成熟作用在头部前体阶段受阻。所以在其感染的寄主细胞中，累积大量的头部蛋白。这两种溶菌物彼此互补，所以lDNA单体能被包装成为成熟的噬菌体颗粒。(3)内源DNA包装的克服：实验制备的包装蛋白质提取物，既能包装外源的DNA(重组体DNA分子)，也能包装内源的DNA。因此在l噬菌体DNA体外包装中一个重要问题是，要克服内源DNA被包装的问题。因为正如上述所说，用于制备包装蛋白的溶源性细菌，它们的原噬菌体被诱发产生的内源DNA同样也会被包装起来。克服的办法是： 通过b2区缺失，高效地删去att位点，抑制在诱发过程中发生原噬菌体的删除，从而避免了内源DNA被包装的问题。因此b2突变的原噬菌体之溶源性细菌提取物中，就不会出现内源DNA的包装问题。 避免内源DNA包装的噬菌体形成噬菌斑，这样也可达到纯化内源本低的目的。例如Imm434溶源性细菌，由于imm434免疫性，就能阻止噬菌斑的形成。 选用重组缺陷(red-，rec-)的溶源性细菌，并用紫外线照射诱导法制备溶菌液。这样便消除了内源DNA的生物学活性，从而克服了令人困扰的内外源DNA间的重组问题。(4)包装及溶菌的条件*1.cos位点lDNA多连体分子在此处(cos位点)被切割，两个cos位点之间的lDNA被包装进噬菌体头部*2.Nul及A蛋白质这两种蛋白是“终止酶”(末端酶)(terminase)的成分，该酶的生物学功能是从cos位点切割lDNA多连体分子。*3.B，C，D，E及Na3蛋白质这些蛋白质参予噬菌体头部的构成及组装*4.G，H，I，J，K，L，M，T，U，V和Z蛋白质这些蛋白质参予尾部及尾纤维的构成及组装*5.R. S.和R2蛋白质S蛋白破坏内膜，R和R2蛋白质协力降解细胞壁以使细胞裂解(lysis)5. l噬菌体DNA的包装限制问题(1)包装限制的概念l噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的，上限不超过正常野生型DNA总长的5%，而下限又不得少于正常野生型lDNA总量的75%，也就是说l噬菌体的包装能力控制在野生型lDNA长度的75-105%之间。在这个范围之内的lDNA可以被包装成有活性的噬菌体颗粒，而超出这个范围的就不能形成正常大小的噬菌斑。(2)包装限制与l噬菌体的克隆能力包装限制说明l噬菌体的克隆能力不是无限的，而是有一定的限制。按野生型lphage MW=48kb计算包装上限=48105%=51kb而lDNA必要区=28kb 51-28=23kb*所以l噬菌体克隆外源DNA的理论极限值是23kb(3)包装限制的生物学意义 包装限制表明最好采用能增加基因组空间位置的缺失方法构建l噬菌体克隆载体。 包装限制保证正常的重组体方可形成正常的噬菌斑，因此实际上是一种正选择。6l重组体分子的选择方法由l噬菌体载体不具抗菌素抗性选择记号，因此对l重组体分子的选择除了Spi-正选择法外，主要依据噬菌斑形态学特征，Xgal-IPTG显色法进行的。(1)cI基因功能选择法这是一种根据噬菌斑形态学特征选择l重组体分子的方法。其原理如下：a. cI基因编码的阻遏蛋白质，是促使l噬菌体感染的E.coli寄主细胞进入溶源化状态的必要条件。b. cI基因失活或缺失的l噬菌体是无法使其寄主细胞发生溶源化效应，故形成的是清亮的噬菌斑，而不是混浊的噬菌斑。c. 如果在插入型的l噬菌体载体的克隆位点上、或是在替换型的l噬菌体载体的可取代区段中，存在一个cI基因。那么外源DNA的插入或取代，将会使cI基因失活或丧失。d. 因此，l重组体分子的表型将是cI-，形成清亮型的噬菌斑；非重组体的lDNA分子的表型将是cI+，形成混浊型的噬菌斑。(2)lacZ基因功能选择法在插入型的l噬菌体载体的lacZ基因序列中，引入了若干常用的核酸内切限制酶位点。当外源克隆的DNA片段插入到这些位点中，形成无功能的b-半乳糖苷酶，于是被感染的E.coli细胞在Xgal-IPTG平板上形成无色的噬菌斑重组体克隆。没有插入外源DNA的非重组体的分子，形成有功能的b-半乳糖苷酶，结果被感染的E.coli细胞在Xgal-IPTG平板上形成蓝色的噬菌斑非重组体克隆。(3)Spi-选择法此法在有关章节已作介绍，不再重述。三、柯斯质粒载体1柯斯质粒的定义及其构建(1) l噬菌体克隆能力 23Kb理论值15Kb实际的有效克隆范围*1.这样的克隆能力一般说来是可以容纳一个基因包括其非编码的侧翼序列。但许多基因的分子量比较大，特别是真核生物的基因，有的竟达35-40Kb。*2. l噬菌体作载体往往不能够同时克隆两个连锁基因由此可见，在实际工作中，尤其是关于真核基因结构与功能的研究需要发展出具更大克隆能力的载体。(2)柯斯质粒载体定义1978年，J. Collins和B. Hohn，发展出了柯斯质粒载体(cosmid vectors)，在一定程度上满足了真核生物基因克隆的要求。cosmid=cos site-carrying plasmid粘粒、柯斯体、粘合体中文译法不好*定义：一类由人工构建的带有lDNA的cos序列和大肠杆菌质粒复制子的特殊类型的质粒载体。(3)柯斯质粒pHC79的构建从pHC79这个名称起头字母P，也就说明了cosmid的中文名称叫柯斯质粒为好。lphage中的cos序列及其控制包装作用的序列pHC79pBR322中的完整的复制子：oriTerr基因Ampr基因由此可见，pHC79柯斯质粒兼具了l phage vector和pBR322 vector两方面的优点。(4)柯斯质粒的克隆能力及其组成。柯斯质粒的克隆能力可达45kb柯斯质粒本身分子量较小，典型的是5kb-7kb的环形DNA分子，它由如下4部分组成： 一个质粒的复制起点； 一个或数个选择记号； 大量的限制酶单一识别位点(a number of unique restriction sites); 一个cos位点(此系包装的必要条件)；2柯斯质粒载体的特点(1)具有lphage的特性：a.体外包装后可以高效地转导敏感的E.coli cell；b.导入Cell后的lDNA线性分子可重新环化起来；c.但无法进入溶菌周期，无法形成子代噬菌体。(2)具有质粒载体的特点：a. 具有质粒复制子，可在寄主细胞内像质粒DNA一样进行复制；b. 可在氯霉素作用下扩增，有效提高克隆基因的产量；c. 具有抗菌素抗性基因，便于重组体分子的选择。(3)具有高容量的克隆能力*1.上面已经提到柯斯质粒只有一个ori、一两个选择记号、大量的限制酶的单一识别位点和一个cos位点。因此它的分子比较小，只有5kb-7kb左右，所以它可以克隆大至45kb的外源DNA片段，其低限值为30kb。*2.Cosmid的克隆能力取决于：能包装到lphage头部的DNA分子量的大小载体本身分子量的大小lphage可包容高达52kb的DNA，Cosmid自身大小为5-7kb，故其克隆能为45kb-47kb。由于可包装的lDNA最小为38kb左右，而Cosmid DNA大小一般为5-7kb，故其克隆的下限为30-33kb上下。(4)能够与带有同源序列的质粒DNA发生重组作用*1.共合体的形成一旦柯斯质粒与带有同源序列的质粒在同一个细胞中共存时，它们之间便可形成共合体(Cointegrant)。因此，若质粒和Cosmid各带有一个不同的抗药性记号及相容的复制起点，在转化至另一个菌株细胞之后，能够很容易地选择出含有两个不同选择记号的共同体。*2.共合体的概念由一种具有一个转位子的复制子，同另一种不具转位子复制子融合而成的结构。在其两个复制子结合部位，具有一对同向重复排列的转位子拷贝。3柯斯质粒载体的改良(1) 将两个cos位点组入到同一个柯斯质粒载体上，以简化在cosmid上的定向克隆。(2)构建与通用质粒载体无同源性的柯斯质粒载体在具重组能力的细胞中同时具有这种载体时，它们之间就不会发生重组，但如果它们各带上同源的外源DNA时，两者之间就会发生重组形成共合体。(3)使Cosmid带上由噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子，这些启动子可在体外合成克隆的插入片段之任意一端的特异性RNA探针。(4)在Cosmid中加入选择性记号，以简化鉴定经重组Cosmid转染的真核细胞的步骤。(5)在Cosmid中加入真核基因复制起点，以使转染的Cosmid能够在哺乳动物细胞中自主复制。(6)在Cosmid中加入原核标记，以促进转染到哺乳动物细胞内的Cosmid序列在细菌中获救。(7)用噬菌体复制起点代替质粒复制起点，有证据表明如此可缓解由携带ColE1起点的重组Cosmid所造成的生长速度不同的问题。(From J. Sam brook et al. 1989) P.170(中译本)4柯斯克隆(Cosmid cloning)(1)定义应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做柯斯克隆。这个定义的三个要点是：a.柯斯质粒作载体；b.大肠杆菌为寄主;c.克隆大片段的真核基因组DNA。(2)理论依据a. 在lphage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点)b. lphage的多连体分子是由cos连接而成的。cos cos cos cos cos cosc.末端酶(treminase)或叫Ter体系即lphage具有一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system).*此系统能识别两个相距适宜的(38-54Kb)cos位点，并切割之。*根据上述分析可知lphage DNA包装的两个必要条件是： cos位点 Ter体系(3)柯斯质粒包装条件由于只有在被作用的lDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间距离保持在38-54Kb的条件下，Ter体系才能对它发生作用。据此推断：柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个cos位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重组成具有两个cos位点而且相距达38-54Kb之间时，才能被包装。(4)柯斯克隆程序真核DNA+限制酶 局部消化与消化的柯斯质粒连接 重组a. 其中有一部分是两端具cos位点且相距适宜的重组体b. 没有cos位点的真核DNA片段自身重组体c. 柯斯片段多聚体其