（动物学专业论文）水生动物组织细胞与水体环境重金属离子间的生态学研究.pdf

。叠 譬 i 致谢 感谢恩师毛树坚教授多年来在学习、工作和生活上给予的悉心指 导和无微不致的关怀，特别是导师严谨的治学作风，正直的为人，深 深教育了我，使我终身受益。同时也要感谢师母陆庆一教授多年来给 予我及我家人生活和工作上的关心，在此表示衷心感谢! 同时还要感谢本教研室的邵健忠教授、李亚南副教授、张存新老 师以及中心实验室的杜英老师、陈汉民老师、金笛老师，遗传教研室 的潘建伟老师、王君晖副教授，湖滨校区电镜中心王丽老师，玉泉校 区生物医学工程学院叶剑峰老师给予的大力帮助；感谢本教研室徐柄 森、孟真、金红建等研究生以及球宜、沈慧绮、经络、傅宇峰、杨澍、 李琪、郭宇翔等本科生给予的协助。在此表示非常感谢! 最后还要感谢我的爱人邵健忠、女儿邵成岑以及父母亲等家人给 予的理解和支持，正是由于他们的无私奉献才保证了论文的及时完 成。 感谢所有关心、支持、帮助过的人! 项黎新 2 0 0 1 年6 月 浙江大学硕士学位论文 摘要 以草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 培养细胞z c 7 9 0 1 细胞及三角帆蚌活体 组织为模型，研究水生动物组织细胞与水体环境中一些重金属离子间的生态学。 研究分两部分。第一部分是选用六种重金属离子胁迫诱导鱼类细胞凋亡。结果显 示，用浓度为1 8 1 0 5 m o l l c d 2 + 、4 1 1 0 _ 4 m 0 1 lc r 2 0 7 2 。、6 1 1 0 m o l l h 2 p 、 3 0 x 1 0 叫m o l l c u 2 十、1 2 1 0 m o l l a s 0 4 3 和1 0 1 0 _ 4 m o l l p b 2 + 胁迫诱导z c 7 9 0 1 细 胞2 4 h r ，均出现明显的染色质凝集、趋边化、形成凋亡小体等凋亡形态特征。核 酸电泳显示d n a 发生特异降解并呈现约1 8 0 b p 2 0 0 b p 的电泳阶梯，用末端脱氧 核糖核酸转移酶介导的d u t p 切口末端标记( t u n e l ) 法，检测到d n a 的3 一o h 断端均被原位特异标记，表明六种重金属离子均能诱导鱼类细胞发生典型的凋 亡。进一步探讨了c j + 浓度、诱导时间与凋亡程度的关系，实验表明，c d 2 + 诱导 的细胞凋亡存在着诱导时间和诱导剂量的相关性。即用较高浓度的c d 2 + ( 1 1 1 0 1m o l l ) 诱导细胞，只需1 2 h r 就出现明显的d n a 梯带，而用较低浓度 的c d ”( 1 8 1 0 m o l l 和6 6 1 0 1m o l l ) 诱导时，则需2 4 h r 到3 6 h r 才出现 明显的d n a 梯带。所以说c d ”诱导细胞凋亡存在着诱导时间和诱导剂量的依赖 性。为了阐明重金属诱导细胞凋亡的机制，以c d h 诱导细胞凋亡为模型，探讨 了凋亡过程中胞内c a 2 + 和线粒体膜电位( v ) 的变化以及0 2 、h 2 0 2 、过氧化 物酶、超氧化物歧化酶( s o d ) 等氧化和抗氧化的动态变化，以期从氧化应激途 径来探讨重金属诱导细胞凋亡的方式。结果显示，当细胞在c d 2 + 胁迫下，( 1 ) 胞内c a 2 + 迅速上升，并在o 5 h r 内到达最高峰，之后开始下降，最后维持在一定 的水平，提示：c a 2 + 启动了细胞的凋亡；( 2 ) 线粒体膜电位( v ) 的变化存在 着持续快速下降的情况，提示：线粒体膜的通透发生了改变，可导致线粒体内一 些与细胞凋亡相关因子的释放。( 3 ) 胞内0 2 。、h 2 0 2 的快速上升，激活了抗氧化 剂：过氧化物酶和超氧化物歧化酶( s o d ) 的保护性应激反应，随着抗氧化酶活 性的增强又导致0 2 一、h 2 0 2 的下降，从而使细胞避免因0 ：一、h 2 0 ：的大量积累而走 浙江大学硕士学位论文 向坏死。所以氧化应激反应可能是c d 2 + 诱导细胞凋亡的途径之一。厂。寸一一一 第二部分是探讨了三角帆蚌( h y r i o p s i sc u m i n g i il e a ) 对水体c r 2 0 7 、p b 2 + 、 c d ”污染物的净化作用，以及三种污染物在蚌斧足、外套膜、肝脏、鳃、体表粘 液、肠道和生殖腺等组织中的吸收和富集规律。f 结果表明，三角帆蚌对水体 c r 2 0 7 2 。、p b 2 、c d 2 + 污染均有明显的净化能力，持续处理1 2 天，能使水体p b 2 + 含量下降8 倍，c r 2 0 7 。、c d ”含量各下降1 0 倍。蚌体6 种组织对三种污染物的 吸收和富集规律不尽相同，对c r 2 0 7 2 。、p b 2 + 、c d 2 + 的吸收和富集作用分别以体表 粘液、鳃和肝脏最为显著。三种污染物进入蚌体的速度很快，其组织吸收量一般 在第3 天即可达到较高水平。进入蚌体的污染物，可在组织间转移和重新分布。 研究结果为水体中c r 2 0 7 2 。、p b ”、c d 2 + 等污染开辟了一条生物治理的新途径。 ，一， 关键词：草鱼细艟y 7 重金属离宇细胞凋亡y 胞内c a 2 粒体膜电砬( ) 0 ：一，h 2 0 ：，过氧化物酶y 超氧化物歧化蘸( s o d ) ； 三角帆蚌丫吸富与净化 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t i np r e s e n ts t u d y ，a g r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o n i d e l l u s ) c e l lc u l t u r ez c 7 9 01 w a su s e da sa l li nv i t r om o d e ls y s t e mt os t u d yt h ee f f e c t so f h e a v y m e t a lo nf i s hc e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec u l t u r e c h e m i c a l l y s t r e s s e d b y s i x h e a v ym e t a l s o f 1 8 x 1 0 5 m o l l c d 斗，4 1 x 1 0 。m o l lc r 2 0 7 。，6 1 x 1 0 5 m o l lh g h ，3 0 x 1 0 4 m o l l c u ”1 2 x 1 0 3 m o l la s 0 1 + a n d1 0 x 1 0 - 4 m o l lp b 2 + e x h i b i t e dc e l ld e a t h a c c o m p a n i e db yv a r i o u sm o r p h o l o g i c a l a l t e r a t i o n ss u c ha sn u c l e a rc o n d e n s a t i o n ， c h r o m a t i na b u t t e d s h a r p l ya g a i n s t n u c l e a rm e m b r a n ea n d d e v e l o p i n t od i s t i n c t a p o p t o t i c l i k eb o d i e s ，w h i c h w e r ec h a r a c t e r i s t i cf e a t u r e ss e e ni n a p o p t o s i s b y a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d n a l a d d e r sw a s c l e a r l y v i s u a l i z e d a n dt u n e l a n a l y s i so f t h ec e l l sr e v e a l e dd n a f r a g m e n t a t i o nl o c a l i z e di nt h ed y i n gc e l l sa sw e l l a si nt h ea d d i t i o n a la p o p t o t i c l i k eb o d i e s t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts i xh e a v ym e t a l o f c d 2 + 、c r 2 0 7 2 一、h 9 2 + 、c u 2 + 、a s 0 4 3 a n d p b 2 + c a l la l li n d u c ea p o p t o s i si nf i s hc e l l s t h e nt h ec o n c e n t r a t i o na n dt i m eo fc d ”i n d u c i n gw a ss t u d i e d ，t h er e s u l t ss h o w e d t h e r ew e r ed o s e - a n dt i m e d e p e n d e n t i no r d e rt ok n o wt h er e a s o no fa p o p t o i s ei n h e a v e ym e t a l ，c h a n g e d o fi n t r a c e l l u l a r c a 2 + ，0 2 ，h 2 0 2 ，p e r o x i d a s e ，s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( s o d ) a n dm i t o c h o n d i am e m b r a n ep o t e n t i a l ( a t g m ) i nt h ea p o p t o s i so f c e l l si n d u c e db yc d 2 + w e r e i n v e s t i g a t e d t h ec e l lw e r e t o u c h e di n1 8 x 1 0 6 m o l lf o r o 2 5 ，o 5 ，1 ，2 ，4 ，6a n d8h o u r s t h ei n t r a c e l l u l a rc a 2 + c o n t e n ti n c r e a s e di no 5h r ，s o d i d0 2 。h 2 0 2 ，p e r o x i d a s e ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i nl h r ，t h e nd e c t e a s e d b u t m i t o c h o n d i am e m b r a n ep o t e n t i a l ( v m ) k e p td e c r e a s e d i n gq u i c k l y t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h ei n t r a c e l l u l a rc a 2 + ，0 2 一，h 2 0 2 ，p e r o x i d a s e ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a n dm i t o c h o n d i am e m b r a n e p o t e n t i a l ( v m ) a l lp l a y e dr o l e si nt h ea p o p t o s i so f c d h i n d u c i n g ，m a y b e t h eo x i d a t i v es t r e s si st h ew a yo fa p o p t o s i s t h ed e c o n t a m i n a t i o ne f f e c to nw a t e rp o l l u t a n t so fc r 2 0 7 2 。，p b 2 + a n dc d 2 + b 3 ， 浙江大学硕士学位论文 m u s s e lh y r o p s i sc u m i n g i il e a w a si n v e s t i g a t e d ，a n dt h ea b s o r p t i o na n da c c u m u l a t i o n c h a r a c t e r i s t i c so ft h r e ep o l l u t a n t si nm u s s e lt i s s u e so f p o d i u m ，m a n t e l l u m ，l i v e r , g i l l ， m u c u s ，i n t e s t i n ea n dg o n a dw e r ea l s os t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a th y r o p s 掂 c u m i n g i il e ah a dh i g ha b i l i t yt o d e c o n t a m i n a t et h ep o l l u t a n t so fc r 2 0 7 p b 2 + a n d c d ”i nw a t e r t r e a t i n gt h ep o l l u t e dw a t e rw i t hi tf o r1 2d a y s t h ec o n c e n t r a t i o n so f p b ”，c r 2 0 7 2 。a n dc d ”d e c l i n e df o r8a n d10t i m e sr e s p e c t i v e l y t h ea b s o r p t i o na n d a c c u m u l a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h r e ep o l l u t a n t si ns i xt i s s u e sm e n t i o n e da b o v ew e r e d i f f e r e n t m u c u s ，g i l l a n dl i v e rw e r et h e m o s te f f i c i e n t a b s o r p t i o n a n d a c c u m u l a t i o nt i s s u e sf o rc r 2 0 7 2 。，p b 2 + a n dc d 2 + r e s p e c t i v e l ya b s o r p t i o nr a t eo f c r 2 0 7 2 。，p b 2 + a n dc d 斗i n t ot i s s u e sw a sr a p i d ，t h ec o n t e n t so ft h e ma b s o r b e di n t i s s u e sc o u l da r r i v ea tar e l a t i v e l yh i g hl e v e la t3d a y s ，a n dt h ep o l l u t a n t sc o u l db e t r a n s f e r r e da n dr e d i s t r i b u t e da m o n gt h et i s s u e s t h er e s u l t so ft h i sp a p e rp r o v i d e da n e wm e t h o df o rt h ed e c o n t a m i n a t i o no f h e a v ym e t a lp o l l u t i o no f w a t e r k e y w o r d s ：h e a v ym e t a l si o n s ，f i s hc e l l ，a p o p t o s i s ，nv i t r o i n d u c t i o n i n t r a c e l l u l a rc a “，m i t o c h o n d i am e m b r a n e p o t e n t i a l ( a v m ) ，o x i d a t i v e s t r e s s h y r o p s i sc u m i n g i il e a d e c o n t a m i n a t i o na n d a b s o r p t i o n 4 浙江大学硕士学位论文 月l j吾 由于重金属离子是严重的水体污染物，它们易被生物体吸收和富集，不被分 解，进而转化为毒性更大的金属有机化合物，再经食物链传递，危害人类健康， 因此，重金属污染长期以来直备受人们关注。鱼类作为水体污染的直接受害者， 它们与重金属污染的关系更是受到重视。近年来，有关重金属污染物对鱼类生长、 健康的影响等已有较多研究，重金属污染物对鱼类的毒理机制也有一定的报道， 但从研究内容来看，主要集中在重金属对鱼类组织细胞结构的损伤、生理生化代 谢的变化等方面，从凋亡角度探讨重金属与鱼类细胞的关系则尚未见报道。细 胞凋亡( a p o p t o s i s ) 又称编程性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) ，是细胞受 内、外因子刺激后发生的由自身基因调控的生理性死亡行为，是一种区别于细胞 坏死( n e c r o s i s ) 的主动死亡过程，目前在部分动、植物中已有较深入探讨 2 - 4 1 。 近年来，我们在开展重金属污染物对鱼类细胞的毒理机制研究中，发现c r 、 c r 。0 i2 、t t g ”、c u ”、a s 0 4 3 - 和p b ”等均能诱导鱼类细胞产生典型的凋亡现象，这为 揭示重金属的细胞毒理机制提供了新的思路。本文试阐述该研究结果，并对c d 2 + 诱导细胞凋亡的机制进行初步探讨，分析0 ：一、h ：o ：、c a ”、线粒体膜电位( ) 以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶( s o d ) 与凋亡的关系。 重金属污染治理是当前环境治理的重要内容。目前对重金属污染物主要通过 物理化学方法，如粘土矿物吸附等进行治理5 “ ，这些方法存在工程复杂，成本 高，效率较低，有潜在二次污染危险等问题。而对操作相对简单易行，成本低， 效率高的生物自然净化的研究还不多，仅见利用藻类富集的报道。卜引，所涉及的 重金属则多见c u 、z n 、l i 、h g 等”1 ，对危害严重的i 类重金属污染物c r ”、 p b ”和c d ”的治理较少。近年来，国内外学者发现了多种海洋贝类如贻贝、牡蛎 等对重金属具有很高的富集能力，从而把这些贝类作为海洋重金属污染的生物指 示种，应用于海洋环境检测1 1 3 一”。受这些工作的启发，我们利用我国培育淡水 珍珠的优良品种三角帆蚌，开展了贝类自然净化水体c r 2 0 ，2 。、p b 2 + 和c d 2 + 的生物 防治研究，并探讨了c r 2 0 。2 。、p b 斗、c d 2 + 在贝类体内的吸收和富集规律。试通过 三角帆蚌作为水污染治理的生物净化器，探讨其净化水体重金属污染的可行性。 水体污染是目前环境资源中的一个很值得关注的问题。在水体污染时，水生 渐江大学硕士学位论文 生物都要受到影响。一方面是水生生物吸收了污染物而使生物体受到损伤，甚至 死亡。水生生物的这种影响又以通过食物链的传递影响到人类，危害人类的健康。 另一方面水生生物又可富集污染物而降低水体中的污染物的含量，使水体净化。 因此研究水生生物与水体环境间的生态关系，或许可在与人类有正反两方面的关 系中，找出一些对人类有利的结果。如果我们从水生生物组织细胞的水平去研究 生物体与水体环境间的生态关系，或许还可探索建立一门细胞与环境的细胞生态 学( c e l le c o l o g y ) 新科学。 浙江大学硕士学位论文 第一部分 重金属离子诱导细胞凋亡的研究 以及细胞凋亡机制的初探 i 、六种重金属离子胁迫诱导鱼类细胞凋亡的研究 一、材料与方法 1 1 试验细胞 草鱼吻端组织z c 7 9 0 1 细胞株，系上皮样和纤维样混合型二倍体细胞，染色 体2 n = 4 8 。用含1 0 胎牛血清，1 0 0 u m l 青霉素、1 0 0 蚓m l 链霉素的t c 1 9 9 培 养液，2 7 。c 常规方法培养【1 6 】。 1 2 重金属离子的细胞毒性试验 将c d c l 2 、k 2 c r 2 0 7 、h g c l 2 、c u s 0 4 、n a 3 a s 0 4 、p b s 0 4 六种重金属盐( 均为 分析纯) 配成不同浓度，加入培养液，处理细胞2 4 h r ，用m t t 法测定活性 1 ， 确定各种重金属离子对细胞的毒性剂量。 1 3 细胞凋亡的诱导 在z c 7 9 0 1 细胞中分别加入终浓度为1 8 x l o _ 5 m o l lc d 2 十、4 1 x 1 0 _ 4 m o l l c r 2 0 ，2 、6 1 x 1 0 。m o l lh f + 、3 , 0 x 1 0 _ 4 m o l lc u 2 + 、1 2 x l o - 3 m o l f ln s 0 4 3 。和 1o 10 - 4 m o l lp b 2 + ，2 7 。c 诱导2 4 h r ，同时设不加重金属离子处理的对照。 1 4 细胞凋亡的检测 1 4 1 吖啶橙荧光染色：经重金属离子处理的细胞，用o 0 1 吖啶橙( p b s ，p h 7 0 配制) 染色5 m i n ，常规封片后，置n i k o n 荧光显微镜下观察 1 8 。 l4 2 d n a 提取与电泳分析：细胞经重金属离子处理后用p b s 洗2 次，加t e ( 5 0 m m o l l t r i s ，1m m o l l e d t a ，10 m m o l l n a c l ，p h 7 2 ) 缓冲液悬浮，再加 1 0 s d s 至终浓度为1 ，适当保温后，加o 2 9 l 蛋白酶k ，3 7 c 。作用2 h r ，等 体积饱和酚一氯仿抽提，除尽蛋白后，加1 1 0 体积3 m o l l n a a c 混匀，无水乙醇 沉淀。d n a 用t e 溶解，5 0 9 9 m lr n a s e a3 7 。c 处理o 5 h r ，1 5 琼脂糖5 0 v 电 泳，e b 染色观察。 塑兰查堂堡圭兰堡堡苎 14 3 末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d u t p 切口末端标记检测( t u n e l ) ：应 用s i g m a 公司的试剂盒进行。细胞用1 0 中性福尔马林固定2 5 m i n ，p b s 洗3 次， o 2 t r i t o n x - 】0 0 处理5 r a i n ，p b s 清洗。 脱氧核糖核酸转移酶和b i o t i n 标记的 然后用标记缓冲液处理1 5 m i n ，加末端 d u t p 3 7 。c 温育l h r ，再用2 x s s c 和 o 3 h 2 0 2 一甲醇分别作用1 5 m i n ，p b s 清洗，加封闭液处理3 0 m i n ，再加a v i d i n h r p 液，3 7 。c 反应l h r 后加d a b 显色观察。 145 电镜观察：经诱导的细胞用p b s 清洗，离心收集，2 5 戊二醛固定2 h r ， 】o s 0 4 固定l h r ，丙酮系列脱水，e p o n 8 1 2 包埋。超薄切片厚度为3 0 - 4 0 r i m ， 醋酸双氧铀染色1 5 m i n ，柠檬酸铅染色5 m i n ，h i t a c h i 一6 0 0 等电镜观察。 二、结果 2l 六种重金属离子的细胞毒性试验 结果显示，六种重金属离子对z c 7 9 0 1 细胞均呈现较强的毒性，其中c d 2 + 浓 度达到6 6 1 0 1 m o l l 时，细胞活性开始下降，而达到1 1 x 1 0 - 4 m o l l 时，细胞全 部死亡，表明c d 2 + 的毒性剂量范围为6 6 x 1 0 - 6 1 1 i o q m o l l ；其他五种离子 c r 2 0 72 、h g ”、c u 斗、n s 0 4 3 - 和p b 2 + 的毒性剂量依次为1 0 x 1 0 - 4 5 x 1 0 - 4 m o l l ， 3 7 1 0 一1 8 x 1 0 - 4 m o l l ，6 6 x 1 0 - 6 7 0 x 1 0 - 4 m o l l ，3 2 x 1 0 - - , 4 2 x 1 0 一m o l 几和 3 0 x 1 0 - 8 3 x 1 0 1 m o l l ( 图1 a ，b ，c ，d ，e ，f ) 。根据该结果，实验选择约产生6 0 细胞毒性的离子浓度作为细胞凋亡的诱导剂量。 细 胞 存 活 奎 一 一 x ： 图1 ac d 2 + 对细胞毒性效应的测定 加 蛐 们 如 0 j 浙江大学硕士学位论文 l j l 23 459 4 5 r 1 0 - 5 m o l l ) 图1 bc r 2 0 7 2 一对细胞毒性效应的测定 、 、 k f 37621 254 59 01 8 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 图1c h 9 2 + 对细胞毒性效应的测定 、 “1 0 “m o l l ) 3 1 56 31 2 53 5 07 0 0 ( 1 0 6 m o l l ) 图1 dc u 2 对细胞毒性效应的测定 加 0 细胞存活率一一 加 印 如 0 细胞存活率一一 细胞存活率一一 浙江大学硕士学位论文 1 2 0 细 胞 1 0 0 存 8 0 活 窒 5 0 4 0 一 2 0 o 细1 2 0 胞1 0 0 存 活 8 0 率 6 0 ，、 4 0 、 2 0 o 。 图1 ea s 0 4 3 对细胞毒性效应的测定 k 图1 fp b 2 + 对细胞毒性效应的测定 2 2 细胞凋亡的检测 2 21 细胞凋亡形态的荧光显微镜观察 在荧光显微镜下，经吖啶橙染色的正常对照细胞形态规则，细胞核和细胞质 染色均匀，分别呈黄绿色和桔红色荧光( 图2a ) ；而经六种重金属离子诱导的 细胞，均出现了一系列典型的凋亡细胞形态特征，如在诱导早期，核内染色质发 生不规则凝集、固缩和周边化，有些呈月牙形，分布在核膜一侧( 图2b ) ，有 些呈致密的颗粒或团块状( 图2c ) 。诱导后期，核内凝集的染色质突出到核外， 形成凋亡小体，最终在细胞质内出现大量凋亡小体( 图2 d ) 。 浙江大学硕士学位论文 2 2 2 t u n e l 标记的d n a 末端短裂 结果显示，经六种重金属离子诱导的细胞，其核d n a 经t u n e l 反应后， 均出现大量棕黑色阳性标记斑点，表明其d n a 发生了特异降解，出现大量37 o h 断端而被原位标记( 图2 e f ) 。正常对照细胞未见标记。 图2 重金属离子诱导草鱼z c 7 9 0 1 细胞凋亡的荧光和t u n e l 检测结果 a 未经诱导的对照细胞( 2 0 0 x ) ； b c 经诱导的细胞，核内染色质分别呈月牙状( 个所示，2 0 0 x ) 、颗粒或团块状( 个 所示，4 0 0 ) ； d 细胞质内出现凋亡小体( 个所示，4 0 0 x ) ： e - f 经诱导的细胞，t u n e l 阳性标记结果( 个所示，4 0 0 x ) 。 223d n a 发生特异降解而形成梯状电泳( d n aia d d e r ) d n a 发生特异降解而形成梯状电泳是细胞凋亡的主要生化指标。实验结果显 示，经六种重金属离子诱导的细胞，其d n a 均发生了特异降解而出现典型的梯状 电泳，梯状条带的间隔约2 0 0 b p ，而对照细胞的d n a 完好，未见降解现象( 图3 ) 。 对c d ”诱导规律的研究表明，d n al a d d e r 的形成与离子浓度和诱导时间有关，离 子浓度较低时，出现d n al a d d e r 所需的时间较长，而随着离子浓度的增高，出现 d n al a d d e r 所需的时间缩短，且出现的梯状条带越明显。如用1 1 x 1 0 。4m o l lc d ” 诱导，只需1 2 h r 就出现明显的d n a 梯带、而用1 8 1 0 4m o l l 和1 3 x 1 0 。5m o l l 浙江大学硕士学位论文 c d 2 + 诱导，则需2 4 h r 以上才出现明显的d n a 梯带、用6 6 x 1 0 “m o l hc d 2 + 诱导 需3 6 h r 出现梯带( 图4 ) 。 图3 重金属离子诱导草鱼z c 7 9 0 1 细胞凋亡的d n a 梯带电泳结果 m 分子量标准( 九d n ae c o r i + h i n d l i i 酶切) ； 1 未经诱导的对照细胞d n a ；2 7 依次为c d ”、c r 针、h 9 2 + 、c u 2 + 、a s 5 + 和p b 2 + 诱 导细胞的d n a 梯状条带 图4 不同浓度c d 2 + 诱导不同时间后草鱼z c 7 9 0 1 细胞的d n a 梯带状电泳结果 a 分予量标准执d n ah i n d l i i 酶切) ； b ，c ，k ，n 未经诱导的对照细胞d n a ； d 。g 依次为1 1 x 1 0m o l l 、1 8 x 1 0 一m o l l 、1 3 x 1 0 一m o l l 、6 6 x 1 0 “m o l lc d 2 + 诱导1 2 h r 后的d n a 电泳； h j 依次为1 8 x 1 0m o l l 、1 3 1 0m o l l 、6 6 x 1 0 。6m o l lc d 2 + 诱导2 4 h r 后 的d n a 电泳； l m 依次为1 3 1 0 m o l l 、6 6 ) ( 1 0 。6m o l lc d ”诱导3 6 h r 后的d n a 电泳 浙江大学硕士学位论文 22 4 电镜超薄切片观察 结果显示，未经诱导的对照细胞，形态规则，核染色质分布均匀，细胞质内各 种细胞器清晰可辨，超微结构未见异常变化。而经重金属离子诱导的细胞，其形 态结构出现了一系列凋亡细胞的特征，如核内染色质凝聚，呈颗粒或团块状，染 色质周边化，核向细胞质突出、断裂，细胞质出现大量空泡，细胞向外突出，形 成凋亡小体( 图5 ) 。 图5 重金属离子诱导草鱼z c 7 9 0 1 细胞凋亡的电镜观察结果 a 未经诱导的正常对照细胞； b f 经诱导的凋亡细胞： b 示细胞质出现大量空泡( v c ) ； c 示核内染色质凝聚，细胞向外突出，形成凋亡小体( a p ) ： d 示细胞核向外突出、断裂，核内染色质浓缩成颗粒状，细胞质出现空泡( v c ) 细胞向外突出，形成凋亡小体( a p ) ； e 示染色质凝聚成团块状； f 示染色质周边化凝聚 三讨论 六种重金属离子诱导草鱼细胞所发生的变化，均符合凋亡细胞的特征【1 9 ，表 浙江大学硕士学位论文 明它们都能诱导鱼类细胞发生凋亡。且所用的重金属离子浓度除h g ”外均小于国 标( g b l 9 9 9 年地表水五类水质标准) ，提示：水体重金属污染物对鱼类的毒害之 一可能是通过细胞凋亡来实现的。进一步探讨c d ”浓度、诱导时间与细胞凋亡之 间的关系，发现细胞凋亡的程度与离子浓度、诱导时间存在着相关性，即当c d ” 浓度较高时，胁迫细胞凋亡所需要的时间就短；相反当c d ”浓度较低时，胁迫细 胞凋亡所需要的时间就长，这与c d ”诱导人和小鼠细胞凋亡的报道一致【2 。 近年来，国际上已有c d ”等少数重金属离子诱导人和小鼠细胞凋亡的报道 2 1 2 2 1 ，但尚未见其诱导鱼类细胞凋亡的研究。鱼类作为重要的水生动物，重金属 离子则是主要的水体污染物之一，因此探讨重金属与鱼类细胞凋亡的关系，不仅 可以丰富环境毒理学等研究内容，而且对揭示细胞与环境的关系具有理论意义。 浙江大学硕士学位论文 i i 、o d 2 + 胁迫诱导- 垒m b g 凋亡的机制研究 一、试剂与仪器 11 主要试剂：r h o d a m i n e1 2 b 、f u r a2 - a m 、b c e c f a m 、r n a s e 均为s i g m a 产品 氮兰四唑( n b t ) s e r v a 进口分装，其它试剂均为国产分析纯。 1 2 b e c t o nd i c k i n s o nf a c s o r t 流式细胞仪( 美国) ；d g 3 0 2 2 酶标仪( 国产) 7 2 2 光栅分光光度计( 国产) 二、方法 2 1 细胞处理 用浓度为1 8 x l o - 5 m o l l c d 2 + ，分别处理草鱼z c 7 9 0 1 细胞( 浓度i x l 0 6 ) 0 5 、 1 、2 、4 、6 和8 h r ，p b s 洗2 次，经2 0 0 0 r p m 离心l o m i n 后备用。同时设不经c d 2 + 处理的对照组。 2 2 细胞凋亡率的流式细胞仪测定 细胞经c d 2 + 处理后，加7 0 冷乙醇悬浮，4 。c 过夜，离心去乙醇，p b s 洗2 次，离心后加0 5 m l p b s ，再加r n a s e ( 终浓度为8 0 9 9 m 1 ) ，3 7 0 c 保温3 0 m i n ， 加p i ( 终浓度5 0 肛g m ) ，4 0 c 避光放置3 0j 】j n ，用流式细胞仪( k e x = 4 8 8 n m ) 测 定细胞凋亡率【2 m 4 1 。 2 3 线粒体膜电位( ) 测定 细胞经c d 2 + 处理后，用无血清培养基悬浮，加罗丹明r h l 2 3 ( 终浓度为 0 5 9 9 m 1 ) ，3 7 。c 保温2 0 m i n ，用预冷的p b s 洗3 次，用流式细胞仪( k e x = 4 8 8 n m ， k e m = 5 3 0 n m ) 测定线粒体膜电位。线粒体膜电位以荧光强度表示瞳”。 2 4 胞内c a ”测定 细胞经c d 2 + 处理后，用无血清培养基悬浮，加f l u 0 2 一a m ( 终浓度为5 斗g m 1 ) 3 7 0 c 保温4 0 m j n ，用预冷的p b s 洗3 次，用流式细胞仪( k e x = 4 8 8 n m ，九e m = 5 3 0 n m ) 测定 2 6 1 。 2 5 0 2 的测定 细胞经c d 2 + 处理后，移至9 6 孔培养板( 1 0 5 个孔) ，各加n b t ( 1 m g m 1 ) l o o g l 浙江大学硕士学位论文 孔，2 7 。c 培养l h r ，3 0 0 0 r p m 离心5 m i n 去上清，加甲醇2 0 0 u l 固定，用p b s 洗 细胞3 次，离心去_ k _ f l 后加2 m o l l 的k o h l 2 0 9 l 和d m s 0 1 4 0 肛l ，立即混匀，6 3 0 n m 波长测o d 值”，同时设p b s 空白组。 2 6 h 2 0 2 的测定 细胞经c d ”处理后，移至9 6 孔培养板( 1 0 5 孔) ，依次加入p r s 溶液( 由 1 4 0 m m o l l n a c l ，p h 7 0 的l o m m o l l 磷酸钾缓冲液，5 5 m m o l l 葡萄糖，0 5 6 m m 0 1 l 酚红及1 0 0 9 9 m l 的辣根过氧化物酶组成) 1 0 0 “1 孔，2 7 。c 培养l h r ，再加入 1 0 肛l i m o l l 的n a o h 终止反应，6 3 0 n m 波长测定其光吸收值【2 8 】，同时设p b s 空白 对照。 2 7 过氧化物酶活性的测定 2 7 1 标准曲线绘制 分别在试管加入纯硝酸银标准溶液0 5 、10 、2 0 、3 0 、4 o m l ，补加水至8 m l ， 再加入o 3 愈创木酚l m l ，混匀，2 0 。c 水浴保 温5 m i n 后，迅速向各管加入3 过 硫酸铵lm l ，立即摇匀并继续在2 0 。c 水浴保温，1 5 m i n 后立即加入0 2 7 m o l l 硫酸 2 0 m l 摇匀。在波长4 7 5 n m 处测定吸光度，并以水作空白对照，绘制标准曲线。 2 7 2 过氧化物酶活性的测定 收集经c d ”处理后的细胞，计数后加l o o u l 样品提取液，冻融，分别加h ，0 2 m l ， 0 3 愈创木酚2 5 0 u l ，摇匀，2 0 。c 水浴保温5 m i n ，再加o 0 5 nh 2 0 2 2 5 0 u l ， 继续保温1 5 分钟，再加入0 5 m l 丙酮，7 2 2 光栅分光光度计测定吸光度。 2 7 超氧化物歧化酶( s o d ) 邻苯三酚自氧化测定川 2 7 1 邻苯三酚自氧化速率标准曲线绘制 取5 0 m m o l lt r i s h c l 缓冲液( p h 8 2 ) 4 5 m l ，2 5 0 c 保温2 0 m i n ，然后加预 热4 5 r n m o l l 邻苯三酚o 0 1 m l ( 用加t o m m o l lh c i 为空白管) ，迅速摇匀倒入1 c m 的比色杯，在3 2 5 n m 、4 2 0 n m 下，分别隔3 0 秒测定o d 值，要求自氧化速率控 制在o 0 7 0 a m i n ，并制标准曲线。 2 7 2s o d 活性测定 取5 0 m m o l lt r i s h c i 缓冲液( p h 8 2 ) 4 5 m l ，2 5 。c 保温2 0 m i n ，加经处理并 冻融3 次后的细胞0 0 1 m l ( 1 0 6 个m 1 ) ，再加4 5 m m o l l 邻苯三酚o 0 1 m l ，同上方 法测定吸收值，并根据公式计算活力： t 浙江大学硕士学位论文 单位体积活力( u m 1 ) = ( o 0 7 0 一样液速率) o 0 7 1 0 0 反应液总体积样液稀释倍数样液体积 总活力( u ) = 单位体积活力原液总体积 三、结果与讨论 3 1 细胞凋亡率的流式细胞仪测定 结果表明，细胞经c d 2 + 胁迫3 0 m i n 后便开始出现凋亡，6 h r 凋亡率达到7 2 9 8 ( 表l ，图1 ) ，而采用“梯带”检测则需要2 4 h r ，因此使用流式细胞术测定细 胞凋亡比采用“梯带”检测灵敏，是测定早期细胞凋亡的理想手段。 表1细胞凋亡的流式细胞术测定结果 、测定结果 g o g f f 、s 期( )g 2 m ( )凋亡率( ) 作用时叭 1 5 m i n6 4 0 l2 1 4 71 4 5o 3 0 m i n6 3 2 63 1 9 57 3 81 2 8 1 h r6 6 22 8 55 34 9 2 h r7 2 6 81 9 9 54 7 91 5 3 5 4 h r7 7 6 61 7 7 l 4 6 36 4 6 2 6 h r9 2 4 55 0 82 4 87 2 9 8 细 胞 凋 亡 室 一 一 图l 流式细胞仪测定动态测定细胞凋亡 3 2 线粒体膜电位( z x w ) 测定 ( h r ) 浙江大学硕士学位论文 结果表明，细胞在c d 2 + 胁迫后，线粒体v 。快速持续下降( 表2 ，图2 ) 。这 种快速持续下降，可能与线粒体膜的通透转运孔( p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n p o r e ，p t p ) 持续开放有关。 表2r h l 2 3 测定线粒体膜电位( v 。) 的结果 广次数 l 123x s d t 检验 旧问 f0 ( 未处理组)1 2 0 2 3 11 1 9 8 6 51 1 3 4 3 2 1 17 8 4 3 + 3 1 2 2 l 3 0 m i l l1 0 9 1 9 31 0 4 4 59 9 4 0 41 0 4 3 4 9 + 3 9 9 7p 0 0 5 1 l h r6 4 1 8 86