细菌分类鉴定第三部分ppt课件.ppt

Topic:,DepartmentofMicrobiologyFaculity:XiancaiRao,ClassificationandidentificationofBacteria,1,Section6IdentificationofBacteria,RobertKochisoneofthetwofoundersofmodernbacteriology.Bornon11December1843,inGermany,Kochwasoneofthirteenchildren.Hisfatherwasaminingofficial.Hegrewuptobeanavidchessplayer,anadmirerofJohannGoetheandaboveallabrilliantscientificinvestigator.HeobtainedamedicaldegreefromtheUniversityofGottingen,in1866,afterstudyingfirstlynaturalscienceandthenmedicine.,2,Kochspostulates,3,4,In1905KochwontheNobelPrizeforPhysiologyorMedicineForhisinvestigationanddiscoveriesinrelationtotuberculosis.,5,微生物鉴定的方法,不同的微生物往往有自己不同的重点鉴定指标。1、细胞的形态和习性水平观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。2、细胞组分水平细胞组成成分例如细胞壁成分，细胞氨基酸库，脂类，醌类，光合色素等的分析。3、蛋白质水平氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术。4、核酸水平核酸分子杂交，G+Cmol值的测定，遗传信息的转化和转导，16S或18SrRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因组测序等。,6,常规鉴定工作步骤：,1、获得该微生物的纯种培养物；2、测定一系列必要的鉴定指标；3、查找权威性的鉴定手册。,7,一、微生物鉴定中的经典方法,指长期以来在微生物常规鉴定中普遍采用的一些形态、生理、生化、生态、生活史、血清学反应等指标。,8,经典分类鉴定法-条目分类法,一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表,9,A.能在60以上生长B.细胞大，宽度1.31.8mm1.热微菌属(Thermomicrobium)BB.细胞小，宽度0.40.8mmC.能以葡萄糖为碳源生长D.能在pH4.5生长2.热酸菌属(Acidothermus)DD.不能在pH4.5生长3.栖热菌属(Thermus)CC.不能以葡萄糖为唯一碳源4.栖热嗜油菌属(Thermoleophilum)AA.不能在60以上生长,双歧法检索表例样,10,二、微生物鉴定中的现代方法,（一）通过核酸分析鉴定微生物（二）细胞化学成分用作鉴定指标（三）数值分类法（统计分类法）,11,1.DNA的碱基组成(G+Cmol%),DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。,分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。,（一）通过核酸分析鉴定微生物,12,1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。,13,2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的微生物作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。测定方法:Tm法:G+Cmol%=(Tm-53.9)2.44,3）使用原则：,G+C含量只能说明其DNA的含量,不说明顺序,故主要用于微生物分类鉴定中的否定,每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。,例如:微球菌G+C70%,葡萄球菌35%-不同,又如:假单胞菌5870%,然而有89种为35%,分类手册第8版中增加一个属:Artiromana(另单胞菌),14,同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下；同属不同种的差别在515%；15%以上-不同属.G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。,若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。,15,在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。,其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。,G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定,16,2.核酸的分子杂交,不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。,直接分析比较DNA的碱基排列顺序,-由于技术上的困难目前尚难以普遍地进行；,核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA,碱基排列顺序的相似性,17,核酸分子杂交-固相、液相,a）DNA-DNA杂交；,（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）,b）DNA-rRNA杂交；,（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）,c）核酸探针；,（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）,Southernblot,Northernblot,Westernblot,18,原理,测定序列的相似性：85%同一个株,19,菌落原位杂交,20,特异性的探针主要用于病原微生物的快速鉴定,21,16SrRNA普遍存在于原核生物和真核生物细胞中，故可用以比较它们在进化上的相互联系。rRNA被称作细胞中的“活化石”。过分析原核或真核细胞中的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。,3rRNA寡核苷酸序列分析,16sRNA基因序列同源性在97%以上的菌株为同一个种。,22,随着微生物基因信息，特别是全基因组完全测序的不断增加，我们可以通过各种计算机软件对不同物种的遗传信息进行直接比较，从而分析不同微生物间的亲缘关系。,4、微生物全基因组序列的测定,2010-3-8,23,微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法(chemotaxonomy)。在近二十多年中，采用化学和物理技术来研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料。,化学分类法,（二）细胞化学成分用作鉴定指标,24,细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用,25,1细胞壁的化学组分,利用细胞壁组分进行细菌化学分类工作。,为用放线菌的形态特征和化学组分相结合的方法划分属提供了科学的依据。,26,2全细胞水解液的糖型,现以放线菌为例，其糖型可分四类：,27,3磷酸类脂成分的分析,位于细菌、放线菌的细胞膜上的磷酸类脂成分，在不同属中有所不同，故可用于鉴别放线菌属的重要指标之一。,28,4枝菌酸的分析,枝菌酸存在于诺卡氏菌属、分枝杆菌属和棒杆菌属3属称作“诺卡氏菌形放线菌”中，它们在形态、结构和细胞壁上难以区分，但它们所含的枝菌酸却差别明显，分别含有80、50、30个碳原子，可对它们分属。,29,5醌类的分析,在细菌和放线菌中所含有甲基萘醌（VK）和泛醌（辅酶Q）。在放线菌分类鉴定上有重要价值。,30,6气相色谱技术用于微生物鉴定,气相色谱技术可分析微生物细胞组分和代谢产物中的脂肪酸和醇类等成分，对厌氧菌的鉴定十分有用。,31,（三）数值分类法（统计分类法）,是一种依据数值分析的原理、借助现代计算机技术对拟分类的微生物对象按大量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法。现代的数值分类学必须借助于电子计算机，因此又称电子计算机分类学。在工作开始时，必须先准备好一批待研究菌株和有关典型菌种的菌株，它们被称作OTU（操作分类单位，operationaltaxonomicunits）。要用50个以上甚至几百个特征进行比较，且所用特征越多，其结果也就越精确。在比较不同菌株时，都要采用相同的可比特征，包括形态的、生理的、生化的、遗传的、生态的和免疫的特征等。,32,数值分类的基本步骤为：,1、计算两菌株间的相关系数2、列出相似度矩阵3、将矩阵图转换成树状谱,33,微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定技术,1、API细菌数值鉴定系统2、“Enterotube”系统3、“Biolog”全自动和手动细菌鉴定系统,34,1、API细菌数值鉴定系统,该系统通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称,能同时测定20项以上生化指标,35,36,2、“Enterotube”系统,3、“Biolog”全自动和手动细菌鉴定系统使用96孔板。,37,Section7微生物资源的利用,一、什么是微生物资源？1992年联合国环境发展大会通过了生物多样性公约（ConventiononBiologicalDiversity），公约指出：“生物资源是指对人类具有实际或潜在用途或价值的遗传资源、生物体或其部分、生物群体或生态系统中任何其他生物组成部分。”“最好在遗传资源原产国建立和维持产地保护及研究植物、动物和微生物的设施”。所以，我们研究微生物多样性与研究动、植物多样性同样重要，无论是维持生态系统的平衡，还是提供对人类具有实际或潜在用途或价值的资源，动物、植物、微生物都有其不可替换的作用，即独特之处，作为资源，它们都有自身的特点。,38,二、微生物资源的特点,1具有潜在用途或价值的遗传资源特别丰富，代谢种类繁多。,2微生物多样性未知处太多,3微生物繁殖快、易变异、个体小，是工业化大规模自动化生产和提高效率的理想资源。,39,三、资源的开发利用急待拓宽和深入,开发利用微生物资源大概可以归纳为四个方面的利用：首先是对微生物菌体的利用。例如：活性酵母、单细胞蛋白、微生物杀虫剂、细菌肥料、食用菌等。第二，微生物代谢产物的利用。例如：抗生素、氨基酸、有机酸、维生素、醇类、核酸、多糖、酶制剂等。第三，微生物特性的利用。例如：甾体转化、湿法冶金、石油勘探、环境治理等。第四，微生物基因的利用。例如：将苏云金杆菌毒蛋白基因转入作物，培育出抗虫作物；将产碱杆菌聚b-羟基丁酯（Poly-b-ydroxybutyrate，PHB）基因转入拟南芥，可以在转基因拟南芥中大量产PHB，其产量达到了叶子鲜重的1%，有望利用微生物基因在植物中生产出可降解的生物塑料原料，治理“白色污染”。,40,(一)微生物在药物生产中的应用,1、抗生素,2、微生物多糖微生物多糖可由许多细菌和真菌产生。根据多糖在微生物细胞中的位置，可分为胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。其中胞外多糖由于产生量大，且易与菌体分离，而得到广泛关注。微生物多糖有着独特的药物疗效和独特的理化特性，使其成为新药物的重要来源。,41,真菌胞外多糖按其功效分类为解表类、利尿渗湿类、消导类、止血活血类、祛痛类、止咳化痰类、健胃类、清热类、通便类、安神类、补益类、驱虫类、祛风湿类、平肝息风类、降血压类、调节机体代谢类，抗肿瘤类，外用消炎等17类。如香菇含有的香菇素能降低血液胆固醇。白木耳有提神生津、滋补强身的功用，是珍贵的滋补品。黑木耳具有润肺和消化纤维素的功用。猴头菌制片对胃及十二指肠溃疡具有良好疗效，并可缓解消化系统癌症。灵芝菌具有治疗神经衰弱和延缓衰老的作用。,42,3、免疫调节剂能增强、促进和调节免疫功能的非特异性生物制品，称为免疫调节剂。它在治疗免疫功能低下和某些继发性免疫缺陷症和某些恶性肿瘤等疾病中，具有一定的作用。免疫增强剂有BCG菌体、溶链菌OK-432(picibanil)菌体、N-CWS(Nocardiarubra)细胞骨架、香菇多糖(lentinan)、云芝多糖K(krestin)等。免疫抑制剂有环孢菌素A（cyclosporinA），藤霉素(tacrolimus，FK-506)，雷帕霉素(rapamycin,RPM)，都那霉素(dunamycin)，脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualin)，灵菌红素25C(prodigiosin25C)等。,43,微生物毒素是人类的重要医药宝库，尤其是寻找新药的资源库。（1）可直接用作药物，如肉毒毒素可用于治疗重症肌无力和功能性失明的眼睑及内斜视。利用白喉毒素的A链与多种癌症细胞抗体连接研制出导向抗癌药物。（2）以微生物毒素为模板，改造和设计抗病抗癌和治疗新药。（3）抗毒素（4）作为超抗原使用，可用于治疗自身免疫性疾病。（5）真菌毒素已显示出抗癌和延缓癌变进程的良好前景，从真菌毒素中寻找抗癌新药。,4、微生物毒素,44,（1）临床上较常用的微生物酶,促消化酶类：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等消炎酶类：溶菌酶抗肿瘤酶类：天冬酰胺酶侵袭性酶类：链激酶、链道酶、透明质酸酶其他药用酶类：青霉素酶、葡萄糖酶等,5、微生物生产的酶及酶抑制剂,45,（2）酶抑制剂,调节代谢，增强免疫力抗药性细菌感染的治疗,46,47,微生物转化：利用微生物使甾体类化合物的结构发生改变，从而获得新的化合物。,6、微生物转化生产功能性化合物,微生物转化的特点：,反应专一性区域专一性立体专一性,48,49,7、核酸类药物,50,根据微生态理论研制的含有益微生物(益生菌)及其代谢产物和有益菌生长促进物质的生物制剂,8、微生态制剂,（1）作用机制：竞争性抑制病原细菌，维持、调整肠道微生态平衡。可产生多种酶类，并提高消化酶活性。能产生多种营养物质，参与机体的新陈代谢诱导细胞因子产生、活化全身的免疫防御系统,（2）生产菌：乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、大肠埃希菌、蜡样芽胞杆菌、酵母菌等。,51,（3）按成分：a.益生剂：含有活菌和/或死菌，包括菌体成分及代谢产物的制剂b.益生元：能选择性地促进肠内有益菌的生长繁殖的，不被宿主消化的食物成分。主要成分是寡聚糖（oligosaccharide），又称双歧因子c.合生素：益生剂和益生元联合使用,52,(二)清洁能源的微生物生产,能源问题环境污染问题甲烷、乙醇和氢气等不仅是可再生的燃料，而且在燃烧过程中不产生严重危害环境的污染问题，尤其是氢气，燃烧后仅形成水，具有清洁、高效、可再生等突出特点。另一方面，这些燃料可由微生物利用有机废弃物生产，从而在获得清洁燃料的同时，处理了有机废物，保护和改善了环境。利用生物技术将可利用的廉价有机物甚至有机废物转化为清洁燃料替代“石油”等矿物燃料，将是世界性的实施环境可持续发展的长期战略。,53,1、甲烷的微生物学产生,54,2、微生物制氢,在生命活动中能形成分子氢的微生物有两个主要类群：一是固氮微生物尤其是具有固氮作用的光合微生物，包括藻类和光合细菌在内。目前研究较多的主要有颤藻属、深红红螺菌、球形红假单胞菌、深红红假单胞菌、球形红微菌、液泡外硫红螺菌等。,二是严格厌氧和兼性厌氧的发酵性产氢细菌。如丁酸梭状芽孢杆菌、拜氏梭状芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌、产气肠杆菌、褐球固氮菌等。,55,化学肥料的施用已经和仍然正在不断地显现出对土壤生产力和对环境生态的破坏，已经成为人类可持续发展的一个阻拦。微生物肥料是指一类含有活的微生物并在使用后能获得特定肥料效应，能增加植物产量或提高产品质量的微生物制剂。微生物肥料无疑可以，至少部分可以替代化学肥料的应用，减少化学肥料的污染和提高作物产品质量。,(三)微生物肥料,56,微生物肥料的分类根瘤菌肥是指利用能够与某种豆科作物共生形成根瘤并固氮的根瘤菌，进行培养扩大后生产的生物肥料，用于对豆科植物播种时拌种或其他方式使用使豆科植物能够提早结瘤、增加结瘤量，从而提高固氮量，促进豆科植物生长和提高产量。“5406”放线菌肥是指利用“5406”放线菌即细黄链霉菌生产制成的微生物肥料，具有抗植物细菌性病原菌、某些生长刺激因子。固氮菌肥是指利用能固定大气氮素为氨态氮并产生某些生长因子的细菌生产的微生物肥料。磷细菌肥是指利用某些能转化矿石中的无效态无机磷或有机物中的有机磷为有效磷的微生物生产的微生物肥料。钾细菌肥是指利用能有效地讲矿石中的无效钾转化为有效钾的微生物生产的微生物肥料。,57,(四)微生物农药微生物是人类和动植物病害的主要病原菌。但是病原微生物也受其他微生物的拮抗抑制或毒害，应用微生物间的拮抗关系，防治农作物的病害，达到以菌治菌的目的。微生物也可引起昆虫的病害，利用昆虫的病原微生物防治害虫。达到以菌防虫治虫、以菌防病治病。利用微生物防治植物病虫害，可以避免或减轻化学农药对人畜和害虫天敌的毒害，而且也不易产生抗药性，并可以解决或缓和由于大量施用化学农药而造成的环境污染。,58,1、农用抗生素,2、杀虫微生物利用微生物防治害虫至少已有百年的历史，近年来“以菌治虫”的研究更受世人重视。已知的杀虫微生物近1600种，包括细菌、真菌、病毒、立克次氏体和原生动物，其中主要的是细菌、真菌和病毒。,59,一类是能杀死害虫的生物毒素，如苏云金杆菌等，它们被敏感害虫吞食，或由其他途径侵入虫体后，敏感害虫中毒死亡。另一类是敏感害虫的传染性病原体，敏感害虫被感染后发病，并成为传染源扩散，使敏感害虫流行病害。例如白僵菌、金龟子乳状病杆菌和各种昆虫病毒等等。,杀虫微生物可分为两类：,60,环境污染是由于进入环境的某种物质的数量超过了环境所能接受的容量，或进入的速度在某一时间内超过了环境中物理、化学和生物因素对进入物所能进行的沉淀、吸附、结合、分解、利用的速度而使其积累的现象。在污染环境的治理与修复中，微生物具有十分突出的作用。微生物的一大特点是其代谢类型多种多样。自然界中的各种物质，特别是有机化合物，几乎都可被微生物降解或