（微生物学专业论文）橙色红曲菌ctng基因和ctnh基因缺失菌株的构建及其功能分析.pdf

缩略语 一一 缩略语 缩略语 a m p o b 6 b p d n a d n t p e d t a h p h h p l c k b l b m e s o d p c r p e g p k s p t c r n a s d s s t c 英文名 a b br e v i a t i o n s 中文名 a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 d e g r e eb a u m e 波美度 b a s ep a i r碱基对 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ea c i d 乙二胺四乙酸 h y g r o m y c i nb - r e s i s t a n tg e n e 潮霉素抗性基因 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 飚l o b a s ep a i r s千碱基对 l u r i ab e r t a n im e d i u m l b 培养基 m a l te x t r a l c ts u c r o s em e d i u m 麦芽汁培养基 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p o l y k e t i d es y n t h a s e 聚酮合酶 p o l y e t h y l e n eg l y c o l t r i s c a l c i u mc h l o r i d e 聚乙二醇一t r i s 一氯化钙溶液 r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 s o f i t o i r if t s c a l c i 啪c h l o r i d e 山梨醇一 ir i s 一氯化钙溶液 6 删7m 脚1脚y 缩略语 t b 3 t a q 晡s y e s t e r r i t i cb r o t hm e d i u m t h e 衄o sa q u a t i c u s t r i s o a y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e y e a s te x t r a c ts u c r o s em e d i u m i i 丰富肉汤培养基 嗜热菌 三羟甲基氨基甲烷 酵母浸膏蔗糖培养基 摘要 摘要 红曲菌是我国传统的食品发酵用菌，可以产生多种生物活性物质，被应用于 食品、保健品和医药工业等领域。但由于红曲菌会产生桔霉素，使红曲产品的安 全性受到质疑。 本文采用基因敲除技术，构建了c t n g 基因红曲菌缺失菌株，为阐明桔霉素 代谢途径提供理论依据。主要研究内容如下： 1 、通过生物信息学分析，推测c t n g 基因编码d 型碳酸酐酶，c t n h 基因 编码短链脱氢酶，并预测c t n g 和c t n h 基因可能参与桔霉素的p k s 后修饰过 程。 2 、成功构建了两端含目的基因同源臂序列、中间为潮霉素抗性基因的置换 型打靶载体p c t n g h p h 和p c t n h - h p h 。 3 、采用原生质体p e g 介导转化将置换型打靶载体p c t n g h p h 和 p c t n h h p h 分别转入红曲菌a s 3 4 3 8 4 原生质体中，采用潮霉素抗性筛选、打 点杂交初筛和s o u t h e r n 杂交验证，最终获得3 株c t n g 红曲菌缺失菌株，c t n h 红曲菌缺失株正在验证中。 4 、采用h p l c 法检测c t n g 缺失菌株中桔霉素的产量，采用紫外分光光度 法检测红曲色素的含量。发现3 个缺失株桔霉素产量分别降低了5 0 3 、4 9 2 和5 0 8 ，从而验证c t n g 基因与桔霉素合成相关，预测c t n g 基因参与桔 霉素的p k s 后修饰过程。 关键词：橙色红曲菌a s 3 4 3 8 4 ；基因敲除；p 型碳酸酐酶；短链脱氢酶 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t t h ef i l a m e n t o u sf u n g u sm o n a s c u si sat r a d i t i o n a lf u n g u su s ef o rf o o d f e r m e n t a t i o n , w h i c hc a np r o d u c eav a r i e t yo fb i o a c t i v em e t a b o l i t e s ，a n da p p l i e dt o f o o d ，h e a l t hp r o d u c t sa n dp h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r i e sf i e l d s h o w e v e r ，s o m e m o n a s c u ss t r a i n sc a np r o d u c ec i t r i n i n ak i l a do ff u n g a lt o x i n s ，s ot h es a f e t yo f m o n a s c u sp r o d u c t sa l ec a l l e df o re v a l u a t i o n i nt i f f s p a p e r , t h ec t n gg e n ed i s r u p t i o nm u t a n t s i nm o n a s c u sa u r a n t i a c u s a s 3 4 38 4w e r ec o n s t r u c t e d i tp r o v i d e sat h e o r e t i c a lb a s i sf o re l u c i d a t i n gt h ec i t r i n i n b i o s y n t h e t i cp a t h w a y t h em a j o rf i n d i n g sw e r ee x p o u n d e d a sf o l l o w s ： 1 t h r o u g ht h eb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，s u p p o s e dc t n gg e n ee n c o d e s1 3 - c a r b o n i c a n h y d r a s e ，c t n hg e n ee n c o d e st h es h o r t c h a i nd e h y d r o g e n a s e ，a n dp r e d i c t e dc t n g a n dc t n hg e n e sm a yb ei n v o l v e di nt h ep k s m o d i f y i n go fc i t r i n i nb i o s y n t h e t i c p a t h w a y s 2 t w or e p l a c e m e n tv e c t o r s ，p c t n g h p ha n dp c t n h h p hw e r ec o n s t r u c t e d w h i c hh a v eh y g r o m y c i nbr e s i s t a n c eg e n ei nt h em i d d l eo ft w oh o m o l o g o u sa l t l l s e q u e n c ef r a g m e n t s 3 t h er e p l a c e m e n tv e c t o rp c t n g h p ha n dp c t n h h p hw e r er e s p e c t i v e l y t r a n s f o r m e di n t op r o t o p l a s to f m a u r a n t i a c u sa s 3 4 3 8 4t od i s r u p tt a r g e tg e n e t h e n ， m e t h o d so fh y g r o m y c i nr e s i s t a n c e ，d o tb l o ta n a l y s i sa n ds o u t h e mb l o ta n a l y s i sw e r e p e r f o r m e do ns e l e c t e dc l o n e s t h r e ec t n gg e n ed i s r u p t i o nm u t a n t sw e r eg a i n e d t h e c t n hg e n ed i s r u p t i o nm u t a n t sa r es c r e e n e d 4 t h ec i t f i n i no ft h ec t n gg e n ed i s r u p t i o nm u t a n t sw e r ea n a l y s i s e db yh p l ca n dt h e p i g m e n t sw e r ea n l y s i s e db yu vs p e c t r o p h o t o m e t e r t h ec i t r i n i np r o d u c t i o no f t h r e e c t n gg e n ed i s r u p t i o nm u t a n t sw e r er e s p e c t i v e l yd e c r e a s e db y5 0 3 ，4 9 8 a n d 5 0 8 s oc o n f i r m e dt h a tc t n gw a sac i t r i n i ns y n t h e s i s r e l a t e dg e n ea n dt op r e d i c t e d c t n g g e n ei n v o l v e di nt h ep k s m o d i f y i n go fc i t r i n i nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y s k e yw o r d s ：m o n a s c u sa u r a n t i a c u s a s 3 4 38 4 ；g e n e - k n o c k o u t ；1 3 - c a r b o n i c a n h y d r a s e s ；s h o r t c h a i nd e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e i v 目录 目录 第1 章文献综述_ 。l 1 1 前言：1 1 2 桔霉素。l 1 2 1 桔霉素的简介1 1 2 2 桔霉素生物合成途径2 1 2 3 桔霉素基因簇及其基因的分析4 1 3 基因敲除技术5 1 3 1 基因敲除的概念一5 1 3 2 丝状真菌基因敲除的策略与方法6 1 3 3 靶基因缺失细胞的筛选和鉴定7 1 4 基因敲除在丝状真菌研究中的应用一8 1 4 1 应用于基因功能的研究8 1 4 2 应用于基因的改造8 1 5 研究的内容、目的和意义一9 第2 章c t n g 缺失菌株的构建。1 0 2 1 实验材料l0 2 1 1 菌种和质粒1 0 2 1 2 主要仪器与设备1 0 2 1 3 酶和生物试剂1 0 2 1 4 分析试剂、缓冲溶液和培养基1 1 2 2 实验方法1 2 2 2 1c t n g 基因生物信息学分析1 2 2 2 2 打靶载体构建示意图1 3 2 2 3 引物序列1 4 2 2 4 菌种的培养1 4 2 2 5 玻璃珠法提取红曲菌基因组d n a 1 5 2 2 6 改进的氯化苄法分离纯化红曲菌基因组d n a 1 5 2 2 7 重组载体p c t n g 的构建l5 v 目录 2 2 8 打靶载体p c t n g h p h 的构建1 7 2 2 9 打靶载体p c t n g h p h 的线性化1 8 2 2 1 0 打靶载体p c t n g h p h 转化红曲原生质体1 8 2 2 。1l 目的缺失菌株的验证1 9 2 2 1 2c t n g 缺失菌株次级代谢产物的测定2 4 2 3 实验结果2 4 2 3 1c t n g 基因的生物信息学分析结果。2 4 2 3 2 重组载体p c t n o 的构建2 6 2 3 3 打靶载体p c t n g h p h 的构建2 8 2 3 4 打靶载体p c t n g h p h 的转化3l 2 3 5 目的缺失菌株的验证3 1 2 3 6c t n g 缺失菌株次级代谢产物的测定3 3 2 4 小结3 7 第3 章c t n h 缺失菌株的构建3 8 3 1 实验材料3 8 3 2 实验方法3 8 3 2 1c t n h 基因生物信息学分析3 8 3 2 2 打靶载体构建示意图3 9 3 2 3 引物序列4 0 3 2 4 菌种的培养4 0 3 2 5 玻璃珠法提取红曲菌基因组d n a 4 0 3 2 6 改进的氯化苄法分离纯化红曲菌基因组d n a 。4 0 3 2 7 重组载体p c t n h 的克隆4 1 3 2 8 打靶载体p c t n h h p h 的构建一4 2 3 2 9 打靶载体p c t n g h p h 的线性化_ 4 2 3 2 1 0 打靶载体p c t n g h p h 转化红曲原生质体4 3 3 2 11 目的缺失菌株的验证4 3 3 2 1 2c t n h 缺失菌株次级代谢产物的测定4 4 3 3 实验结果4 4 3 3 1c t n h 基因的生物信息学分析结果4 4 3 3 2 重组载体p c t n h 的克隆4 6 3 3 3 打靶载体p c t n h h p h 的构建4 7 v i 目录 3 3 4 打靶载体p c t n h h p h 的转化4 9 3 3 5 目的缺失菌株的验证4 9 3 4 小结5 0 第4 章讨论51 4 1 打靶载体的构建5 1 4 2 原生质体的制备5 1 4 3 转化子基因组d n a 的提取5 3 4 4c t n g 、c t n h 的基因功能分析5 3 第5 章结论与展望5 5 参考文献5 6 致谢6 0 个人简介6 l v i i 第1 章文献综述 1 1 前言 第1 章文献综述 红曲菌( m o n a s c u s ) 是我国传统的食品发酵用菌，是用来制备红曲的微生 物菌种，已有上千年的应用历史，能够产生多种有益的代谢产物f l 】：红曲色素 是一种安全、稳定性好的天然可食用色素；m o n a c o l i n 类化合物可以降低胆固 醇的合成；t 一氨基丁酸和乙酰胆碱具有控制血压的功效；麦角固醇可防治幼儿 的佝偻病，促进孕妇和老年人的钙磷吸收；他汀类化合物具有抗骨质疏松的功 效，是唯一能够增加骨骼密度的一类物质，可以逆转骨质疏松这一进程【2 】。红 曲广泛用于乳制品、酒类、果汁、冰淇淋、海产品、腐乳、调味品、医药和化 妆品等行业。红曲应用前景广阔，特别是具有保健功能的红曲制品更受到消费 者的青睐。 然而1 9 9 5 年b l a n c 报道了有些红曲菌菌株可产生桔霉素( c i t r i n i n ) 一种对人畜有害的真菌毒素【3 】。桔霉素主要作用的靶器官是肾脏，它不仅可以 诱发突变，而且可以致畸、导致肿瘤【4 j 。桔霉素的污染对广大消费者的健康构 成了危害。日本厚生省在1 9 9 9 年版的“日本食品添加剂标准”中规定红曲色素 中桔霉素的限制量是0 2p g ，这一剂量是当时能够检出的桔霉素的最低剂量 1 5 j ：美国f d a 明确提出红曲产品作为食品添加剂取得认可必须对桔霉素进行 评价；在欧洲，有的用户提出用最新的技术检测不出桔霉素的红曲产品方可使 用。而我国的红曲中桔霉素含量很难达到检测标准，h e b e r 用酶联免疫法检测 了九种作为营养补充剂的中国红曲制品，发现七种含有桔霉素【6 】。在“2 0 0 0 东 方红曲国际研讨会上”来自日本的报告，测定了3 个来自中国的红曲色素样 品，结果桔霉素全部超标1 7 j 。桔霉素污染成为限制我国红曲出1 3 的瓶颈问题。 保证菌种的安全性，减少菌种有毒代谢产物对食品的污染，对保护消费者的健 康意义重大。 1 2 桔霉素 1 2 1 桔霉素的简介 1 9 9 7 年，w o n g 等人提出红曲菌具有抗菌作用，其代谢产物m o n a s c i d i n a 第1 章文献综述 对于抑制b a c i l l u s ，s t r e p t o c o c c u s 和p s e u d o m o n a s 等菌有效【s 】。而19 9 5 年， b l a n c 博士认为原先被w o n g 等认为是m o n a s c i d i n a ，实际上是桔霉素【3 ，9 1 。 桔霉素的分子式为c 1 3 h 1 4 0 5 ，结构式见图1 1 ，其熔点为1 7 2 ，在无水 乙醇或苯环己烷中结晶呈柠檬黄针状结晶。桔霉素难溶于水，但在稀的n a o h 、 n a 2 c 0 3 或醋酸钠溶液中溶解；桔霉素在二乙醚和乙醇中微溶，但溶于热酒精， 乙酸乙酯，苯，丙酮，氯仿。桔霉素能形成鳌合物，在酸性溶液、碱性溶液或 加热情况下容易被降解。 o hh o h a cc h 3 h 3 图1 1 桔霉素的分子结构式 f i g u r e1 1m o l e c u l a rf o r m u l ao ft h ec i t r i n i n 桔霉素具有明显的致癌、致畸、致突变作用。桔霉素主要是通过在细胞的 线粒体中累积，干扰电子传递系统，减缓d n a 合成，并进一步受阻r n a 和 蛋白质的合成【1 0 1 1 ，1 2 1 。其主要的靶器官是肾脏。 大部分实验证实红曲菌在产红曲色素的同时往往伴随着桔霉素的产生，红 曲菌产桔霉素是普遍性的问题，是红曲菌基因组差异表达的结果1 4 ，1 5 ，1 6 1 ，同 时培养条件也会影响桔霉素的产生【l 丌。 1 2 2 桔霉素生物合成途径 1 9 9 9 年，h 确旬5 j 课题组通过同位素标记方法观测1 3 c 在各级代谢产物中 的累积情况，从而对红曲菌产桔霉素和红曲色素的生化代谢途径进行了深入探 讨，其认为桔霉素的产生与红曲色素的生成均属于聚酮类生物合成途径。首先 两者由一个乙酰辅酶a 和三个丙二酰辅酶a 在聚酮合酶催化作用下经反复缩 合和延伸形成4 个酮基的初始聚酮链骨架，然后两条途径分离，一条途径继续 与乙酰辅酶a 缩合，通过甲基化，缩合，还原，甲氧基化，还原，氧化和脱 水等多个步骤最终形成桔霉素；另一条路径是4 个酮基的聚酮链与丙二酰辅酶 2 a 缩合，形成红曲色素中间产物，然后经过一系列步骤最终形成红曲色素。桔 霉素和红曲色素的合成具体路线见图1 - 2 和图1 - 3 t 1 8 ，9 1 。 卜耐一 a c e l y 卜c o a 3m a l o n y 卜c o a lr 咖蛔曲，唰黼 v 嘲时 溉删 o c t m e l ea c m 能州a 1 e x a k e t i d e ，洲+ 脚、c 嘲 毒 毒 l 如o o h |文rl 8 - k e t o a c d p o | y k e t t c l t ec h r e m e p h o r e o 囊i 口- - h 艟n i b r t i - 圣 c o a s h ( 1 虱1 - 3 ) 图1 - 2 红曲菌次级代谢产物一红曲色素和桔霉素生物合成推测途径【1 9 1 f i g u r e1 - 2s c h e m eo ft h eh y p o t h e t i cb i o s y n t h e t i cp a t h w a y so fs e c o n d a r y m e t a b o l i t e s r e d p i g m e n ta n dc i t r i n i n 第1 章文献综述 毒叫一l 嚣叫一 图1 - 3 红曲菌中桔霉素( 1 3 c 标记) 生物合成途径【1 8 l f i g u r e1 - 3s c h e m eo f t h eb i o s y t h e s i so f c i t r i n i na sr e v e a l e db y1 3 cn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e 1 2 3 桔霉素基因簇及其基因的分析 桔霉素是真菌聚酮类化合物，对真菌聚酮类化合物合成基因簇研究表明，真 菌中聚酮体合成酶( p o l y k e t i d ss y n t h a s e ，p k s ) 基因通常与p k s 后修饰过程的编 码基因、调节基因及抗性基因成簇存在，其为合成桔霉素的关键酶1 2 们。 2 0 0 5 年s h i m i z u 等利用酮酯酰基合酶单元k s ( k e t o a c y ls y n t h a s e ) 和酰 基转移酶单元a t ( a c y l t r a n s f e r a s e ) 的保守区而设计的简并引物，从紫色红曲 菌中克隆得到了p k s c t 基因，并利用基因敲除技术验证了该基因与桔霉素合成 相关，与红曲色素合成无判2 l j 。 随后s h i m i z u 等对p k s c t 5 端上游的c t n a 进行阻断，发现桔霉素的产量 4 筚静静卜嘴 第1 章文献综述 只达到刚刚能被检出的水平，认为c t n a 是激活桔霉素合成的蛋白质因子瞄】。 2 0 0 8 年s h i m i z u 等用曲霉大肠杆菌穿梭粘性载体将未经过基因改造的红曲霉 的桔霉素相关基因簇导入到米曲霉中，使其覆盖米曲霉中相似的基因区，最终 使得米曲霉有桔霉素的产生瞄j 。 2 0 0 7 年付桂明在橙色红曲霉中，以含有潮霉素抗性基因的置换型打靶载体 取代p k s c r 基因中部分序列，使得桔霉素的产量减少了9 8 ，同时产红曲色 素和黄色色素能力提高了4 9 4 和2 8 8 m j 。 2 0 0 9 年徐民俊【2 5 】等用红曲色素相关基因p k s l 替换掉桔霉素合成相关基因 c t n a 。从而使得桔霉素的产量减少了4 2 ，同时红曲色素产量提高了3 3 9 。 真菌中聚酮类化合物的基因成簇存在是真菌次级代谢途径的一个重要特征。 根据这一特性，对橙色红曲菌基因组文库筛选，获4 个克隆子，经测序，预测 红曲菌中桔霉素合成基因簇长约4 4k b ，包括六个已报道的基因瞄】，1 0 个新发 现的基因一其中9 个编码基因和1 个调控基因。经b l a s t x 比对，该基因簇 中两个编码基因c t n h 基因和c t n g 基因分析结果如下：c t n g 基因编码的蛋白 质与黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 中的碳酸酐酶高度同源，该酶为锌酶，它能够催 化最重要的反应是碳酸酐可逆的水合；c t n h 基因编码的蛋白质与费希新萨托 菌( n e o s a r t o r y a f i s c h e r i ) 中的短链脱氢酶高度同源。 本研究以c t n h 基因和c t n g 基因为目标基因，采用基因敲除技术构建基 因工程菌，分析这两个基因生物学功能。 1 3 基因敲除技术 1 3 1 基因敲除的概念 基因敲除又称为基因打靶，是在2 0 世纪8 0 年代后半期发展起来的一种新 型分子生物学技术。其主要是利用基因转移方法，将外源d n a 序列导入靶细 胞后，通过外源d n a 序列与靶细胞同源d n a 序列间的重组，将外源d n a 定 点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进行定 点突变，从而改变细胞遗传特性【2 6 1 。基因敲除技术具有定位性强、打靶后新的 基因随基因组d n a 稳定遗传的特点，逐渐成为后基因组时代基因功能研究的 有力工具之一【2 7 1 。 第1 章文献综述 1 3 2 丝状真菌基因敲除的策略与方法 基因敲除其操作过程大致可分为：( 1 ) 打靶载体的构建；( 2 ) 打靶载体质 粒转化受体细胞；( 3 ) 靶基因缺失细胞的筛选；( 4 ) 靶基因缺失细胞的鉴定。 1 3 2 1 打靶载体的构建 基因打靶载体的设计及构建是非常重要的，因为其可以根据不同的目的， 利用插入、删除、置换、修饰等手段对d n a 序列进行重新构建。 1 3 2 2 转化受体细胞 基因敲除依赖稳定、高效、单拷贝插入率高的转化体系。近年来，各种有 效的转化方法在丝状真菌中得到建立。常用的有： ( 1 ) c a c l 2 p e g 介导的原生质体的转化 许多丝状真菌采用c a c l 2 p e g 介导的原生质体转化。因此，制备高效的原 生质体【2 8 】是进行转化的前提和基础。首先是用溶壁酶处理菌丝体或萌发的孢子 获得原生质体，然后将原生质体、外源载体d n a 混合于一定浓度的c a c l 2 、 p e g 缓冲液中进行融合转化，若去掉p e g 则无转化发生，然后，将原生质体 涂布子再生培养基中选择转化子。2 0 0 7 年李燕萍等建立了p e g 8 0 0 0 介导的橙 色红曲菌a s 3 3 4 8 4 原生质体转化方法，转化效率为1 0 巧【2 9 l 。 原生质体作为受体细胞具有群体数量大，容易获得纯合性的转化子等优点， 但原生质体具有培养难度大、再生频率低和周期长等缺点。 ( 2 ) 基因枪转化法( b i o l i s t i cb o m b a r d m e n t ) 基因枪法其原理是加入c a + 的亚精胺等使外源d n a 吸附在微小的金粒 或钨粒表面制成d n a 微弹，在基因枪激发的瞬间力量作用下，将外源基因直 接导入受体细胞中。 很多研究者认为，与原生质体转化相比，基因枪法具有相同或者更高的转 化效率、整和度及遗传稳定性。可用于基因枪法转化的真菌组织相对较多，而 能够用于制备原生质体的真菌组织是有限的，二者相比，基因枪法具有优势。 在尚未建立原生质体转化或对于细胞壁成分缺乏了解的真菌，基因枪法是一种 有效的转化方法。2 0 0 3 年k a m o l n a nl a k r o d 利用基因枪介导将带有潮霉素b 抗性基因的考斯质粒p m o c o s x 成功导入红曲菌菌体内 3 0 j 。 ( 3 ) 农杆菌介导转化法( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ) 。根癌农杆菌( a t u m e f a c i e n s ) 是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细 菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位。 1 9 9 5 年b u n d o c k t 3 l j 等首次成功进行了根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化。 进一步研究发现a t u m e f a c i e n s 可用于转化细菌、真菌、动物并将其t i 质粒上 的一段d n a 整合进基因组，并稳定地遗传给后代。2 0 0 5 年f l o r 利用农杆菌 6 第l 章文献综述 介导成功地进行了红曲菌种属间的转化研列3 2 】，2 0 0 6 年丁月娣报道利用农杆菌 介导法实现了红曲菌t d n a 的插入转化【3 引。2 0 1 0 年嘉晓勤通过农杆菌介导转 化的方法，成功的将mp u r p u r e u ss m 0 0 1 中的# s c t 基因敲除，从而使菌株 不产桔霉素【3 4 1 。他们的研究为丝状真菌的转化提供了新途径。 a t u m e f a c i e n s 介导的真菌遗传转化法，具有转化低拷贝、高频率转移、成 本低、稳定性好、操作方便和重复性好、能转化大片段d n a ，能明显提高了 转化率获得稳定的转换子，在应用领域中具有很大的潜能。 ( 4 ) 醋酸锂( l i t h i u ma c e t a t e ) 转化法 它的转化对象是完整的细胞。其基本原理：用l i a c 或其他一价金属离子 ( n a 、k 、c a 、r b 等) 处理对数生长期的细胞使之成为感受态，经热休克( h e a t s h o c k ) 处理，在p e g 帮助下质粒d n a 进入真菌细胞，形成转化子。 这个方法最早应用于酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，随后，在粗糙 脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 的转化也获得了成功。但这种方法的使用仅仅局 限于少数种类的丝状真菌【35 1 。 ( 5 ) 电击转化法( e l e c t r o p o r a t i o n ) 电转化是一种使用瞬间高压电，使细胞膜破裂，短时间内保持小分子d n a 进入细胞内。l a k s h m i 等电击转化系统对疏棉状嗜热丝孢菌进行转化，转化效 率达到1 2 7 x 1 0 3 个转化子1 t gd n a t 3 6 】。k i m 对紫色红曲菌( mp u r p u r e u s ) d s m l 3 7 9 进行的电击转化，效率最高达到了4 0 0 个转化子l i n gd n a i 了刀。 除了以上几种方法外还有限制性内切酶介导转化法、脂质体法等。 2 0 0 6 年周礼红研究表明在红曲菌的原生质体转化中，农杆菌介导转化同源 重组频率最高，其次是p e g 介导转化和电击转化1 3 8 】。 1 3 3 靶基因缺失细胞的筛选和鉴定 在丝状真菌遗传转化过程中，发生同源重组的机率比较低，因此要从大量 随机整合的菌株中筛选出发生定点整合转化子来，就成了基因敲除要解决的关 键技术问题。 。 1 3 3 1p c r 法 用p c r 方法来筛选，所用引物一条来自打靶载体上的标志基因，另一条 与靶序列附近的序列配对，因此只有发生了同源重组的菌株d n a 为模板，才 能扩增到预期大小的d n a 产物。 p c r 也存在缺点，当打靶载体中靶基因同源序列较长时，p c r 扩增长片 段的效率不够高；另外基因组中大量重复序列的存在也容易引起假阳性结果， y r u 等【3 9 】根据同源区之外的序列设计引物，根据扩增条带的大小来筛选转化子 7 第1 章文献综述 降低了p c r 产生假阳性的可能。 1 3 3 2s o u t h e r n 杂交法 该方法的原理是发生了同源重组的细胞与发生非同源重组的细胞其d n a 经过合适的限制性内切酶切割后，在s o u t h e r n 杂交中会得到不同的带型。 s o u t h e r n 杂交操作起来比p c r 要繁杂些，周期较长，对d n a 的要求也比较 高，但结果清晰且可靠性较好。 1 4 基因敲除在丝状真菌研究中的应用 1 4 1 应用于基因功能的研究 利用基因敲除技术使靶基因失活，对目的基因进行有效的功能分析，是后 基因组时代基因功能研究的重要技术手段之一【4 0 j 。 黄曲霉毒素，是由黄曲霉( a f l a v u s ) 产生而污染食物和饲料的一种潜在致 肝癌的真菌毒素。c h a n g 等通过基因敲除方法研究黄曲霉毒素基因簇上鄙丁 基因时，发现卵丁基因在黄曲霉毒素的分泌中不起重要作用【4 l 】。 黑曲霉( a n i g e ，) 是非常好的外源蛋白分泌表达系统。然而，外源蛋白相 对于内源蛋白的分泌表达，水平却很低。王永超等对黑曲霉m n n 9 基因缺失功 能分析，发现黑曲霉m n n 9 基因缺失使外源蛋白漆酶的分泌表达提高了1 4 ， 内源蛋白葡萄糖淀粉酶的分泌表达则降低了4 4 2 1 。 1 4 2 应用于基因的改造 基因敲除技术在基因改造中也起到了重要的作用，如在工业微生物的菌种 改良中，用于改变微生物的代谢途径和代谢流，以提高发酵产品的产量。 季宏飞利用原生质体p e g 介导转化的方法将置换型打靶载体p h d l l 6 转入红色红曲菌似r u b e r ) m r l l 中，敲除了m r l l 中的p k s c t 基因，从而使 其桔霉素表达量比原始菌株降低了9 9 ，同时红曲色素产量提高了1 6 6 嘣4 3 j 。 f a n g 等也通过基因敲除技术得到了几丁质酶编码基因过量表达的突变菌 株，改善了昆虫病原真菌球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 的生防活性m 】。 2 0 0 6 年c r a i g 报道链霉菌( s t r e p t o m y c e sc l a v u l i g e r u s ) 产小棘酸的生物合 成途径中的起点是精氨酸和3 磷酸甘油醛，利用基因敲除技术对c l a v u l i g e r u s 中编码3 磷酸甘油醛脱氢酶( g l y c e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ) 的2 个基因g a p l 和g a p 2 进行敲除，缺失株小棘酸的产量提高了2 0 【4 5 1 。 3 第1 章文献综述 1 5 研究的内容、目的和意义 我国是红曲制品的主要出口国，而桔霉素是红曲菌代谢过程中产生的聚酮类 次级代谢产物之一，对人畜有较大的毒性，所以严重影响红曲产品的出口。 通过发酵工艺的改良，可以减少桔霉素的生成，但很难完全抑制桔霉素的 生成，而用传统的方法筛选完全不产桔霉素的菌株费时耗力，从分子生物学水 平出发，筛选出与红曲霉产桔霉素相关的基因，从基因水平上对桔霉素的产生 进行调控，也许是一种行之有效的方法。 因此，从分子水平上利用基因敲除技术，对桔霉素基因簇上的c t n h 和 c t n g 两个基因进行功能分析，可以为进一步阐明桔霉素代谢途径奠定基础，为 有目的地控制代谢产物的类型和产量，研究构建不产或低产桔霉素的红曲霉， 同时可为建立一套红曲工业用菌的安全评价体系提供理论基础。 9 第2 章c t n g 缺失菌株的构建 第2 章c t n g 缺失菌株的构建 本章研究中，构建置换型打靶载体p c t n g h p h ，并采用c a c l 2 p e g 介导 的原生质体的转化方法，将打靶载体导入到红曲菌原生质体中使其与红曲茵基因 组d n a 发生置换型同源重组，以构建c t n g 基因缺失株，最后通过分析c t n g 基因缺失株的代谢产物，进一步来分析c t n g 的生物学功能。 2 1 实验材料 2 1 1 菌种和质粒 橙色红曲菌( ma u r a n t i a c u s ) a s 3 4 3 8 4 ：购自中科院微生物研究所，接种 于m e s 斜面，4 保存，每三个月传代一次； 大肠杆菌j m l 0 9 ：接种于l b 平板4 保存； 质粒p u c l 8 ：购自t a k a r a 公司，将其转化到大肠杆菌j m l 0 9 感受态细 胞中长期保存； 质粒p u c l 8 h p h ：转化到大肠杆菌j m l 0 9 感受态细胞中长期保存。 2 1 2 主要仪器与设备 u l t r a s p e c4 3 0 0 紫外分光光度计( 美国p h a r m a c i a 公司) g e n ea m pp c r s y s t e m2 4 0 0 型p c r 扩增仪( p e 公司) c o n v i r o n 霉菌培养箱( 德国c o n v i r o n 公司) m l s 3 7 5 0 型全自动灭菌锅( 日本s a n y o 公司) h q l l 5 0 b 恒温摇床( 中科院武汉仪器厂) 微量移液器( f i n l a n dl a b s y s t e m ) 2 1 0 1 5 低温离心机( s i g m a 公司) u n i v e r s a lh o o d i i 凝胶成像系统( 美国b i o r a d 公司) a g i l e n t11 0 0 高效液相色谱( 美国安捷伦公司) 2 1 3 酶和生物试剂 t a qd n a 聚合酶，d n t p s ，r n a s e ，蛋白酶k ，限制性内切酶( b a mh i ， e c o ri ，x p ni ，h i n d i i i ，n fi ，b g l i i ) ，t 4d n a l i g a s e ，d l 2 0 0 0d n a m a r k e r ， l o 第2 章c t n g 缺失菌株的构建 a - h i n d l i id n a m a r k e r ，a g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 0 ( 均购自t a k a r a 公司) ；y e a s te x t r a c t ，t r y p t o n e ( 购自o x o i d 公司) ；d i gh i g hp r i m ed n al a b e l i n g a n dd e t e c t i o ns t a r t e rk i ti ( 购自r o c h e 公司) 。 2 1 4 分析试剂、缓冲溶液和培养基 2 1 4 1 色谱分析试剂： 甲醇、乙腈为国产色谱纯，桔霉素标准品为s i g m a 公司产品。 2