（市政工程专业论文）Mn（Ⅱ）氧化细菌氧化活性的初步研究.pdf

摘要 摘要 一直以来，水资源的匮乏在一定程度上制约着我国经济的快速发展，因此地 下水的开发和利用显得尤为重要。地下水的铁、锰污染相当普遍，生物固锰除锰 理论为地下水除铁除锰技术开辟了新途径。生物滤池的滤料表面存在着复杂的微 生物群落，这些微生物的种类、数量和活性是影响滤池稳定运行主要因素。研究 滤池中细菌的m n o r ) 氧化活性，对于完善生物除锰理论，改进生物除锰工艺有着 重要的作用。 本课题主要是从生物滤池的滤料表面和水样中分离细菌，经过细菌鉴定以及 氧化活性测定，选出氧化能力较强的菌株，在此基础上研究细菌的氧化过程的特 点和影响因素。 通过分离和纯化，得到约3 0 0 株细菌，用m i d i 细菌鉴定系统鉴定并分类， 结果包含1 5 个属，4 0 个种。通过对这些细菌氧化活性的测定，发现有1 1 种细 菌具有m n ( n ) 氧化能力，其中6 种活性较强，分别为红球菌( r h o d o c o c c u s s p 1 ) 、 库克菌( k o c u r i a 印一1 ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p 1 ) 、两种节杆菌r t h r o b a c t e r s p 一1 、a r t h r o b a c t e rs p 一2 ) 和氢噬胞菌( h y d r o g e n o p h a g as p 1 ) 。 通过实验，研究了r h o d o c o c c u ss p 1 、k o c u r i as 1 9 1 和h y d r o g e n o p h a g as p 一1 这3 种活性相对较强的细菌的m n ( i i ) 氧化过程，发现：细菌对m n 2 + 的氧化是一 个比较迅速的过程：r h o d o c o c c u s 印1 细菌的活细胞能氧化m n 2 + ，培养基则不能； 处于稳定期的细菌的锰氧化活性要高于其它时期；温度和p h 值对氧化过程影响 很大，尤其是p s 值；培养基中各种成分浓度的不同影响了细菌的生长和氧化活 性的表达；氧化过程中一定量葡萄糖的加入，可以使细菌保持较长时间的活性。 通过研究6 种锰氧化优势菌种的协同作用，发现混合细菌总的氧化活性并非 各种纯菌氧化活性的简单叠加。其中几种细菌以一定方式和一定比例组合，可以 在一定程度上提高活性，它们之间存在着协同作用。 关键词生物除锰；m 畎) 氧化细菌；氧化活性；协同作用 北京工业大学工学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep r o b l e mo f w a t e rr e s o u r c es h o r t a g er e s t r i c t e dc h i n a se c o n o m i cd e v e l o p m e n t t os o m ee x t e n tf o ral o n gt i m e t h e r e f o r et h ee x p l o i t a t i o na n du t i l i z a t i o no f g r o u n d w a t e ra p p e a r st ob ep a r t i c u l a r l yi m p o r t a n t b u ti r o na n dm a n g a n e s ep o l l u t i o n i ng r o u n d w a t e ri sq u i t ep r e v a l ，e n t t h et h e o r yo fm a m g a n e s ef i x a t i o na n dr e m o v a l b r o k ean e w p a t hf o rt h ei r o na n dm a n g a n e s er e m o v a lt e c h n o l o g y t h e r ea r ec o m p l e x m i c r o b i a lc o m m u n i t i e sl i v i n g0 nt h es l l r a c eo fm e d i ai nb i o f i l t e r t h e i rs p e c i e s ， q u a n t i t ) ra n da e t i v i 够a r et h em a i nf a t o r st h a ti n f l u e n c es t a b l eo p e r a t i o n o ft h e f i l t e r t h es t u d yo nb a c t e r i a lm n ( i i ) 一o x i d i z i n ga c t i v i t yp l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i n i m p r o v i n gt h em n b i o o x i d a t i o nt h e o r ya n dm nb i o l o g i c a lr e m o v a lt e c h n o l o g y i nt h i ss t u d y , b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o mf i l t e rs a n d sa n dw a t e ri nb i o f i l t e r , t h e n w e r ep u r i f i e da n di d e n t i f i e d w ep i c k e do u ts p e c i e sw i ms t r o n ga b i l i t yt oo x i d i z e m n ( n ) a n di n v e s t i g a t e dt h ee l i a r a e t e r i s t i c so ft h e i ro x i d i z i n gp r o c e s s e s t h ef a c t o r s a f f e c t i n gm n o x i d a t i o nw e r ea l s os t u d i e d ， a b o u t3 0 0s t r a i n sw e r ea b t a i n e da f t e rt h ep r o c e s so fs e p a r a t i o na n dw e r e i d e n t i f i e db ym i d im i c r o b i a li d e n t i f i c a t i o ns y s t e m 耽er e s u l t si n v o l v e d1 5g e n e r a a n d4 0s p e c i e s i nt h ee x p e r i m e n t so fm n ( h ) o x i d i z i n ga c t i v i t yd e t e c t i o n ，e l e v e n s p e c i e ss h o w e da c t i “锣a n ds i xo ft h e mw e r ef o u n dt oh a ds t r o n ga b i l i t yt oo x i d i z e m n ( 田t h e6s p e c i e si n c l u d er h o d o e o c e u ss p - 1 ，k o c u r i as p 1 ，p s e u d o m o n a ss p 一1 ， a r t h r o b a c t e rs p 一1 - a r t h r o b a c t e rs p 一2a n dh y d r o g e n o p h a g as p 一1 t h r e es p e c i e s ，r h o d o c o c c u ss p 1 ，k o c u r i as p - 1a n dh y d r o g e n o p h a g as p 一1 ， a p p e a r e dr e l a t i v eh i 豇o x i d i z i n ga c t i v i t y t h e i rm a ( n ) o x i d a t i o np r o c e s s e sw e r e i n v e s t i g a t e da n dr e s u l t ss h o w e dt h e s ee o u r s e sw e r ep r o c e s s e dr a p i d l y l i v i n gc e i l so f t h et h r e es p e c i e sc e u l do x i d i z em n 2 + ，w h i l et h e i rs p e n tc u l t u r em e d i u me o u l d n t b a c t e r i ai ns t a t i o n a r yg r o w t hp h a s eh a dh i g h e ra c t i v i t yt h a ni no t h e rp h a s e s t e m p e r a t u r ea n dp hv a l u ee s p e c i a l l yt h e l a t t e r s t r o n g l y a f f e c tt h e s ep r o c e s s e s g r o w t ha n de x p r e s s i o no fm n ( n 3 - o x i d i z i n ga c t i v i t yw e r ei n f l u e n c e db ys u b s t a n c e si n m e d i u mm o r eo rl e s s a d d i n gg l u c o s et ot h er e a c t i v es o l u t i o nc o u l dp r o m o t em n ( n ) o x i d a t i o na n dm a k eb a c t e r i ak e e pa c t i v ei nal o n gt i m e s y n e r g i s t i ce f f e c ta m o n gt h e6s p e c i e sh a db e e ns t u d i e dt o o t h et o t a la c t i v i t y w a sn o tt h es u mo fi n d i v i d u a la c t i v i t yo fe a c hs p e c i e s m i x i n gb a c t e r i a 而t hc e r t a i n m o d ea n d 稍t l lc e r t a i np r o p o r t i o nc o u l de 1 2 1 1 a n c et h e i rm n ( r 0o x i d a t i o na b i l i t yt oa n 摘要 c e r t a i ne x t e n t t h e r em i g h tb es y n e r g i s t i ce f f e c ta m o n gt h e m k e y w o r d sb i o l o g i c a lm a n g a n e s er e m o v a l ；m n ( i i ) 一o x i d i z i n gb a c t e r i a ；o x i d i z i n g a c t i v i t y ；s y n e r g i s t i ce f f e c t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：! 已垡 日期：兰! ：i ：! 丝 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名： ! 己强 导师签名：裆善 第1 章绪论 1 1 我国地下水资源的利用与锰的危害 1 1 1 我国地下水资源的利用与污染情况 我国属于缺水国家，人均水量只有世界人均占有量的1 4 。我国陆地水资源 总量为2 8 0 0 0 x 1 0 8 m 3 a ，其中可更新的地下淡水资源量为8 7 0 0 x 1 0 8 m 3 a ，微咸水 2 0 0 x 1 0 8 m 3 a ；地下淡水可开采资源量为2 9 0 0 x 1 0 8 m 3 a ，微咸水可开采资源量为 1 3 0 x 1 0 8 m 3 a ”。地下淡水资源占全国水资源总量的1 3 ，在我国占有举足轻重的 地位，正被越来越广泛地开发和利用。 2 0 世纪6 0 年代中期以前，地下水开采相对较少，6 0 年代中期n 7 0 年代末，是 我国地下水大规模开发利用阶段，近2 0 年，地下水开采量平均以每年2 5 亿m 3 的 速度增加。全 4 0 0 多个城市开采利用地下水，在城市用水总量中地下水占3 0 ； 北方城市以开采地下水为主，其中华北、西北城市利用地下水的比例高达7 2 和 6 6 2 1 。以2 0 0 2 年为例，全国总供水量5 5 3 4 亿m 3 ，其中地表水供水量4 4 4 3 , f l m 3 ， 占总供水量的8 0 3 地下水供水量1 0 9 1 亿r n 3 ，占总供水量的1 9 7 ；河北省地 下水供水量1 6 8 亿，占总供水量的8 0 以上，北京、山西、河南、山东等省占 5 0 - - 7 0 ，辽宁、陕西、黑龙江、吉林、内蒙古、天津等地占3 0 , - , 5 0 n 。 我国城市地下水污染日益加剧，约有“的城市地下水遭受了严重污染， 3 3 的城市地下水受到轻度污染，基本清洁的城市地下水只有3 4 1 。反映地下水 污染的指标包括矿化度、总硬度、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮、铅、砷、汞、 铬、氰化物、挥发性酚、石油类、铁和锰等。其中铁、锰的污染非常普遍，受其 污染的水量约占我国地下水总储量的2 0 以上。从整体分布来看，受铁、锰污染 的地区主要集中在南方，而北方地区由于地下水开采量大，使得铁锰污染问题更 加突出。 1 1 2 地下水中锰的来源及危害 铁和锰都是地壳的主要构成成分。锰在地壳中的平均丰度为9 5 0 p p m ，是微 量元素中丰度最大的，以锰为主要元素的矿物近百种，而以锰为次要元素的矿物 则更多。火成岩中平均含锰为l o o o p p m ，煤中平均5 0 p p m ，褐煤中含锰2 0 9 0 p p m 。锰的天然风化量每年3 8 0 万吨，从河流流向海洋输送量为3 0 万吨。水 体所含锰的来源，主要是由原生地质污染、含锰土壤的面源污染和采矿的矿山尾 水污染所引起的。 m n 是典型的氧化还原元素，因此在自然界中存在的价态较多，有：+ 2 、+ 3 、 北京工业大学工学硕士学位论文 + 4 、+ 7 价，其中+ 2 、+ 4 价较为稳定。+ 3 价是只有在酶催化氧化过程中会产生的 中间产物，+ 7 价具有强氧化性，如遇到还原性物质，将被还原成低价形式。在 天然水体中呈溶解状态稳定存在的主要是+ 2 价，它也是主要的去除对象。 锰是人体所必需的微量元素之一，人每公斤体重平均含锰为0 2 毫克。正常 人每日从食物和水中摄取锰3 1 0 毫克。但在生产和生活用水当中锰过量会导致 一系列的问题：影响水的色、嗅、味等性状；在卫生洁具和工业产品上形成斑点； 由于锰的存在，输送过程中细菌会繁殖，形成细菌粘泥沉积在管道上，减小过水 断面甚至堵塞管道；更重要的是人长期饮用高含锰水会产生一系列疾病，如神经 病变、内分泌紊乱、遗传素质变化等。 1 1 3 锰的浓度标准 各个国家对生活及工业用水中锰的浓度做出了严格的规定。生活饮用水中锰 的容许浓度并非生理学要求，将饮用水中的铁、锰控制在不出现不愉快的颜色和 味道的水平，对人体就不会产生毒害作用【5 】。饮用水中锰的最高允许浓度一般为 0 0 5 m g l ，我国规定生活饮用水中锰的含量不得超过0 1 m g l 。某些工业用水对 锰的要求比饮用水中的浓度限制标准还要严格，例如美国规定纺织品染色、纤维 造纸、照相业用水中锰的最大容许浓度为0 o l m g l ；透明胶和粘胶制品生产用 水为0 0 2 m g l 。 1 2 国内外生物除锰技术的研究进展与应用 1 2 1 除锰技术的发展与生物除锰的提出 在世界范围内，针对水中锰的去除技术的研究由来已久。从1 9 世纪末期开始， 相继产生的除锰方法有：混凝、沉淀、过滤法；强氧化剂氧化法；空气氧化接触 过滤法；离子交换法和活性碳吸附法等。其中比较有代表性是空气氧化接触过滤 法，对于其机理的认识，先认为锰质活性滤膜的除锰过程是一个自催化反应过程， 其催化物是m n 0 2 ，后来有人提出起催化作用的是m n 3 0 4 。 上世纪8 0 年代中期，我国研究人员在试验中发现，细菌存在与否与滤池的除 锰能力有很大关系，因此针对我国除锰工程实际存在的问题，开始了锰的生物氧 化的研究工作，并于1 9 9 6 年提出了“生物固锰除锰”理论【6 7 1 ：在p h 中性时，m n ( m 首先吸附于细菌表面，然后在酶的作用下氧化为m n ( r v ) ，从而从水中除去。以 该理论为指导提出了简洁的地下水生物除铁除锰工艺流程，使广泛存在的生产性 除锰问题得到了较好的解决。与此同时，在国际上如欧洲也出现了生物除铁除锰 工艺【2 】，在美国和加拿大也日益受到重视 1 3 , 1 4 1 ，但国外工艺技术同我国相比流 程较复杂。 2 第1 章绪论 1 2 2 生物除锰工艺 ( 1 ) 单级过滤工艺 反冲洗 管网 图i - 1 单级过滤工艺流程图 f i g u r e1 - 1t e c h n o l o g yo f s i g l e - s t e pf i l t r a t i o n 大多数地下水中f e 和m n 通常相伴存在，在单级工艺中，f e 、m n 在同一生 物滤池中被氧化去除( 图1 - 1 ) 。单级工艺较多极工艺流程短、占地面积小、投资 省、处理效果好，因此我国多数生物除锰的地下水厂 1 5 1 刀和国外一些水厂【1 8 1 采 用这种工艺。此外，单级工艺用于地表水的预处理，也能达到很好的除锰效果【1 9 1 。 ( 2 ) 多级过滤工艺 管网 图1 - 2 多级过滤工艺流程图 f i g u r e1 - 2t e c h n o l o g yo f m u l t i s t a g ef i l t r a t i o n 许多能氧化f e 2 + 的细菌同样能氧化m n 2 + ，但各自氧化的最佳条件不同，m n 2 + 的氧化需要更高的o r p 和p h 【1 4 1 。当f e 和h 恤同时存在，f e 超过一定浓度时，可以 先通过一个曝气过滤步骤去除f e ，再通过中间曝气补充溶解氧、散除c 0 2 以提高 p h ，然后通过二级曝气过滤系统去除m n ( 图1 2 ) 。国外大都采用多级系统 1 2 - 1 4 , 2 0 ， 2 1 1 。 然而研究表明，f e 在生物滤池生态稳定性上起着重要作用，铁的存在是细菌 固锰除锰的必要条件，一级除铁后若水中没有一定数量的铁，二级滤池除锰效果 北京工业大学工学硕士学位论文 将难以保证阱，2 3 】，因此，采用上述哪种工艺，一级除铁到怎样的程度，应该根据 具体情况来确定。 ( 3 ) 复合m f 册膜工艺 s u z u k i 2 4 1 等人研究了一种循环粉末活性炭( p a c ) 与m f 膜结合的复合工艺( 图 1 ，3 ) ：中空纤维m f 膜浸没于水中，原水与p a c 以及m f 膜滤池里的回流污泥在混 合池中混合，然后进入m f 膜滤池。p a c 可以吸附原水中的有机物，并作为微生 物的载体，将m n 和n h 3 - n 进行生物氧化，p a c 和污泥通过m f 膜，实现与水的分 离。与传统m f 膜工艺相比，增加活性炭吸附有机物，可以改善膜的渗透条件， 减缓膜污染f 2 4 , 2 5 1 。 出水 图1 3 复合m f u f 膜工艺流程图 f i g u r e1 - 3h y b r i d m f u f h o l l o w f i b e r m e m b r a n es y s t e m 膜技术适用范围很广，但膜污染和高昂的费用是影响其进一步推广应用的主 要因素。目前，对于较大规模的水厂，如果只是针对原水中的m n 2 + 、n h 3 - n 和 少量有机污染物，生物滤池工艺比复合膜工艺具有更大的优势。 ( 4 ) 人工湿地处理矿山废水 矿山废水中m n 的浓度通常比未受污染的地表水和地下水高，美国环保总署 ( u s e p a ) 规定，酸性矿山废水中m n 的最高浓度为4 m g l ，3 0 天平均排放浓度不 超过2 r a g l 2 6 。矿山废水通常通过投加氧化药剂、石灰药剂和混凝剂来处理( 主 动方法) ，这就增加了处理费用，因此人工湿地处理系统( 被动方法) 得到了发展。 人工湿地系统可以单独运行，在严重污染的地方，还可作为大型处理系统的一部 分与主动处理系统一起运行。 湿地系统中存在有效的促进m n 2 + 氧化沉淀的生物过程：细菌对1 2 + 的生物 氧化；藻类通过光合作用提高水的p h 值和溶解氧，为m n 2 + 的生物氧化创造更有 利的环境。此外，对于酸性矿山废水，采用碱性的底层提高原水p h 值，也有利 于m n 2 + 的氧化【2 3 】。 目前设计除锰湿地，主要是通过最大限度地增加光照和溶解氧来提高处理效 率，如在湿地深处曝气、采用适于接触反应的底层【2 9 】。英 s h i l b o r l e 煤矿【3 0 】采 4 第l 章绪论 用氧化塘和多个湿地串联的系统，大部分f e 能在系统的前段被有效地去除，m n 2 + 浓度的降低则出现在后面部分，这与生物除锰滤柱的情况相似。s 蜘f 【韧在他 的研究中发现，同等负荷下，除锰需要比单纯除f e 多三倍的湿地面积。 湿地作为一种新型生态污水处理技术，具有设计简单、易于维护、出水水质 较好、改善和美化生态环境等诸多优点。目前，我国大部分矿山废水未经处理直 接排放【3 ”，对矿区周围环境造成了严重污染，利用天然湿地或建造人工湿地是 一个可行的方法。 1 2 3 生物除锰技术研究进展 ( 1 ) 同时去除n h 4 + 、f e 2 + 并i im n 2 + 的研究 用生物法同时去除n h 4 + 、f d 2 + 、m n 2 + l 较困难，这主要是由于它们的氧化需 要不同的氧化还原电位【8 1 。很多研究者都认为，如果水中含有n h 4 + ，只有在硝化 反应完全后才会发生m n 2 + 的去除【1 0 , 3 2 , 3 3 。 v a i l d e i l a b e e l e 【3 2 1 认为n 0 2 的存在对m n 2 + 去除有抑制作用，在微酸性环境下， n o ；参与了m n 0 2 的还原，而n 0 3 则是m n 0 2 的稳定因素。硝化菌是快滤池除m n 的一个关键因素，通过将n 0 2 氧化，就能降低n 0 2 对m a 2 + 氧化的负面影响。 m a d o n i “】认为，n h 4 + 的去除和m y l 2 + 的去除正相关，说明这两个过程可能受 同样参数的影响。g o u z i n i s 8 l 等人研究发现，如果n h 4 + 含量低，n h 4 + 和m n 2 + 能在 同一生物滤池中去除，否则就需要另设一个滤池来去除m n 2 + 。张杰【3 4 】等人研究 了f c 2 + 、m n 2 + 对n h 4 + 去除的影响效应，发现微量的f e 2 + 、m n 2 + 对亚硝化反应的促 进作用强于对硝化反应的作用。 ( 2 ) 其它工艺中m n 2 + 的生物氧化 在某些并非为除锰专门建造的水厂和工艺中，也存在锰的生物氧化现象。意 大利l o m b a r d i a 州的一个地下水厂用活性污泥法对受到有机物污染的原水进行 处理，b e r b e n n i 等人 3 5 1 发现出水中m n 2 + 浓度随季节的变化显著( 夏季低冬季高) ， 和污泥龄也有一定关系。他们建议：夏季采用较低的污泥龄，促进m n 的生物氧 化；冬季对原水进行加热或采用较高污泥龄，留住m n 0 2 促进m n 的化学氧化。 因此，在很多工艺中都可以利用这种机理，通过调整各项参数创造适应m n 2 + 氧 化的环境，优化水质。 ( 3 ) 生物滤池运行模式的研究 g o u z i n i s 嘲等人研究了生物滤池采用不同运行模式( 和连续式) 的除m n 效果。 在启动期间，滤料上没有形成足够的生物膜，m n 主要通过化学氧化去除，这时 只有s b r ( 序批式) 显示出了较好的效果。运行稳定后，用连续模式可以采用相当 低的停留时间来达到很高的m n 去除率。我们在生产性生物滤池启动过程中，采 用的是低负荷、小滤速、弱反冲洗的模式。该模式既保障了出水质量，与上述方 法相比又减少了运行管理的劳动强度，效果很好。 北京工业大学工学硕士学位论文 1 3m n q i ) 氧化细菌的研究进展 1 3 1m n ( i i ) 氧化细菌的种类 m n ( i i ) 氧化细菌广泛存在于海水、淡水和土壤环境中，其中既能氧化锰又能 氧化铁的细菌有c r e n o t h r i x ( 泉发菌属) 、l e p t o t h r i x ( 纤发菌属) 、g a l l i o n e l l a ( 嘉利翁 氏菌属) 、s i d e r o e a p s ap s a c e a e ( 鞘铁菌) 、h y p k o m i c r o b i u m ( 生丝微菌属) 、 m e t a l l o g e n i u ms y m b i o t i c u m ( 共生生金菌) 、t h i o b a e i l l u st h i o o x i d a n s ( 氧化硫硫杆菌) 和t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s ( 氧化亚铁硫杆菌) ；只能氧化铁的细菌有s p h a e r o t i l u s n a t a n s ( 浮游球衣菌) ；只能氧化锰的细菌有两种假单胞菌( 胁黜如m 彻a s ) j 3 6 - - 3 8 。 1 3 2m n ( i i ) 生物氧化的机理研究 ( 1 ) m n 对锰氧化细菌的生理作用 m n 是所有生物体的基本微量元素，是某些金属酶如过氧化物岐化酶、精氨 酸酶和磷酸盐转移酶的成分【3 9 】。对于细菌为什么以及如何氧化m n ( i i ) 这个问题， 一直都没有得到满意的答案。研究者们对此提出了一些假设： 对于一些自养细菌，m n 0 0 的氧化过程能产生虮p 作为能量来源【4 0 】； 锰通常不被认为是有毒元素，对于某些细菌来说，m n 2 + 有时是有毒的或能 引起突变【4 “。有研究者认为m n 2 + 的氧化是为了避免m n 2 + 毒性的积累嗍。 m n 的氧化物包裹在细菌表面，可以防止病毒的侵害或原生动物的吞噬 【3 9 】。 m n 的氧化物能分解复杂有机分子，促进细菌对碳源的利用【4 3 】。 在厌氧条件下，细菌利用m n 的氧化物作为电子受体【蛔。 或者细菌并不能从锰的氧化中获益，这个过程仅仅是偶然现象，是其他过 程的副产物【3 9 1 。 ( 2 ) m n ( i i ) 的生物氧化机理 以往的研究提出，生物对i v l n 2 + 的氧化有两种方式。一种是间接方式，即生物 细胞体分泌有反应活性的小分子代谢物与锰反应，或通过新陈代谢作用改变环境 微环境的p h 、e h 等来促进氧化( m n 2 + ：在p h 8 4 条件下可以实现化学氧化) ；另一 种是直接方式，即细菌直接产生酶或其他专一性因子来催化相关反应。 细菌可以通过胞外富集、细胞表面吸附络合、胞内富集等方式将锰从水中分 离。对几种锰氧化细菌的研究表明【4 7 】：p s e u d o m o n a zp u t i d a ( , 恶, 臭假单胞菌) 和 p e d o m i c r o b i u m ( 土微菌属) 的锰氧化发生在膜外，l e p t o t h r i xd i s c o p h o r a ( 生盘纤发 菌) 的氧化锰发生在外壳上。 在实际生产生物滤池中我们观测到，滤池中具有锰氧化能力细菌的数量同滤 池所具有的锰去除能力是正相关的；用抑制剂来抑制细菌的酶合成系统，会导致 除锰效果大幅度下降甚至完全丧失【4 8 4 9 】，这证明了在实际具有除锰能力的滤池 6 第1 罩绪论 中，m n 2 + 的生物氧化是由酶催化来实现的。国外一些研究者也成功地从微生物体 内提取到t m n o d 氧化酶。 ( 3 ) m n ( i i ) 生物氧化产物的研究 p 嬲t 6 i l 5 0 】对l e p t o t h r i xd i s c o p h o r as p 6 氧化m n 的产物进行了分析，发现m n 介于i i 价和价之间，当有f e 存在时，更靠近i i 价，无f e 耐靠近价。 k a t s o y i a n n i s 嘲对m n 2 + 生物氧化产物的x 射线衍射结果显示，沉淀物是完全无定 形的，生成的锰氧化物中m n 介于i i i 、价之间( m n 0 2 和m n o o h ) 。b a r g a r 等 人发现芽孢杆菌b a c i l l u s 印氧化 恤( i i ) 的主要产物是m n ( i v ) ，而m n 0 i d 是瞬时 的中间产物。 1 3 3m n 氧化酶的研究 已经证实，很多细菌中能够分泌催化锰氧化还原的酶，对于不同的细菌，锰 的氧化还原具有不同的生理意义，因此氧化机制各异，其中涉及的酶也不尽相同。 目前对于细菌产生的锰氧化酶的认识比较少，有研究发现，多元铜氧化酶在三种 细菌( p s e u d o m o n a s p u t i d ag b 1 、b a c i l l u ss g 1 和l e p t o t h r i x d i s c o p h o r a ) 的锰氧化过 程中扮演着重要的角色1 5 1 - s 3 1 ，c u m a 基因片段、假单胞菌中的x c p 基因也与m n ( i i ) 的氧化有关1 5 4 , 5 5 ，但是这些基因并没有被明确识别。 大量研究集中在真菌上，白腐真菌、枯叶降解真菌、担子真菌有一定的锰氧 化能力，它们产生的锰氧化酶同时也能降解木质素 5 6 5 7 1 。这些酶包括锰过氧化物 酶、木质素过氧化物酶、虫漆酶等，其中研究最多的是锰过氧化物酶( m r y ) 。 w a r i i s h j 提出，h 2 0 2 使m n p 上的亚铁血红素处于氧化态；m 0 + 进入酶的m n 结合 部位并将电子传递给亚铁血红素，将其还原，而自身变为了m n ( i i d ；m n ( i i i ) 通 过与有机酸螯合而脱离m n p ，成为自由的氧化还原性物质，进而可以氧化各种有 机物如木质素，同时被还原为m n ( t d ，开始另一个循环。 1 4 课题提出及研究意义 1 4 1 课题提出 缺水问题一直制约着我国经济的快速发展，我国很多地方以地下水作为城镇 和工矿企业的水源，但铁锰含量高的问题给生活和生产带来不便。生物除锰技术 与化学除锰相比，运行费用低、抗冲击能力强、效果稳定，我国很多水厂的实际 运行表明，这是一种安全有效的方法。国外对生物锰氧化的研究已经有很长的时 间，但其在水处理领域的应用还不是十分广泛，很多国家仍以化学氧化作为主要 的除锰工艺。主要原因是机理研究不够深入，使得这项技术在实际应用上还存在 不少问题。目前国内研究主要集中在工艺方面，很少涉及核心问题；国外有部分 针对m n ( u ) 氧化微生物的研究，这也只进行到细胞水平而很少涉及进一步的酶学 北京工业大学工学硕士学位论文 研究。 正是基于这种现状提出了本项课题，本课题为国家自然科学基金( 5 0 5 7 8 0 0 1 ) 资助项目。希望通过筛选锰氧化优势菌种并对其氧化活性进行一些研究，能够为 进一步酶学研究打下基础，为探究锰的生物氧化机理提供依据。 1 4 2 研究意义 研究锰氧化细菌的氧化活性，对于完善生物除锰理论、改进生物除锰工艺有 着重要的作用；可以为进一步的m n ( 1 1 ) 氧化细菌酶学研究、制备产品酶或构建基 因工程菌打下基础；对改善我国饮水卫生、提高人民健康水平、缓解城市供水紧 张局面具有一定的意义。相信随着对m n ( i d 生物氧化机理的不断探索，和对实际 工艺存在问题的不断改进，生物除锰将有更加广阔的应用空间。 1 5 课题的研究目的和研究内容 1 5 1 研究目的 本项研究主要是从实际运行生物滤池的滤料表面分离得到纯菌，经过细菌鉴 定和氧化活性测定，选出锰氧化优势菌种，在此基础上研究细菌氧化过程的特点 和影响因素等，以期对m n z + 的微生物氧化过程有一个更为清楚地认识，并对进 步的酶学研究提供一定的依据。 1 5 2 研究内容 ( 1 ) 细菌的分离和鉴定 采集菌种并分纯 对细菌进行鉴定 ( 2 ) m n ( n ) 氧化优势菌种的筛选 定性检测细菌的锰氧化能力，选出具有锰氧化能力的细菌 定量检测细菌的锰氧化活性，筛选出氧化能力较强的菌种 0 ) m n ( ) 氧化细菌氧化活性的研究 研究细菌氧化m n ( n ) 过程的特点 研究温度和p h 值对m n ( m 氧化的影响 研究碳源氮源及无机盐对m n ( i i ) 氧化的影响 ( 4 ) m n ( n ) 氧化细菌协同作用初步研究 细菌等量组合的m n ( m 氧化实验研究 细菌不等量组合的m n ( i i ) 氧化实验研究 第2 章研究方案和分析方法 第2 章研究方案和分析方法 2 1 培养基和培养条件 2 1 1 培养基 p y c m 培养基 4 8 1 ：蛋白胨0 8 9 ，酵母膏0 2 9 ，m n s 0 4 h 2 00 2 9 ，k 2 h p 0 40 1 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，n a n 0 30 2 9 ，c a c l 20 1 9 ，( n h 4 ) 2 c 0 3o 1 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ， 调p h 6 8 - 7 2 ( 固体培养基另加琼脂1 5 9 ) ，高压灭菌( 1 2 1 ，l s m i n ) 后备用。 含铁p y c m 培养基：在p y c m 培养基中加入4 9 柠檬酸铁铵。 低锰p y c m 培养基：p y c m 培养基中m 1 1 s 0 4 - h 2 0 采用0 0 2 9 。 无锰p y c m 培养基：不舍m n s 0 4 h 2 0 的p y c m 培养基。 t s b a 培养基：t s b ( 胰蛋白胨大豆肉汤) 3 0 9 ，琼脂1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l 。 2 1 2 培养条件 ( 1 ) 平板培养：2 5 c ( 鉴定前以t s b a 培养基培养，2 8 4 c ，2 4 h ) 。 ( 2 ) 斜面培养：2 5 。c ，1 0 天，然后移至4 c 冰箱保存。 ( 3 ) 摇瓶培养：2 5 ，1 0 0 1 2 0 转份，2 3 天。 2 2 细菌分离 由沈阳开发区水厂的生物滤池中取得成熟锰砂，取适量放入灭菌( 1 2 i 。c ， 1 5 m i n ) 后的烧杯中，加入无菌水并充分搅拌。取l 毫升菌悬液进行梯度稀释，分 别涂布在p y c m 和含铁p y c m 平板上。2 5 c 下培养7 天，取典型菌落，在上述 两种培养基上重复划线培养，直到菌落形态单一，进行革兰氏染色并用光学显微 镜观察。菌落的选取非常重要，为了避免遗漏，需要尽可能多地去选取。 为了避免菌种丢失，将细菌接种于p y c m 和含铁p y c m 斜面上培养，1 0 天 后，在试管内加入无菌液体石蜡( 高于斜面l e m ) ，密封后移至4 * c 冰箱保存。 p y c m 培养基适合很多锰氧化细菌生长，但它是有机培养基，用来作为分离 培养基会导致部分自养型细菌的丢失。由于工作量的关系，本实验不再以无机培 养基分离细菌，希望以后研究能够补充这一部分。 2 3 细菌鉴定 由于需要鉴定的细菌很多，传统方法操作复杂，特异性不强，而自动化微生 9 北京工业大学工学硕士学位论文 物鉴定系统可以使鉴定流程简单化，因此本实验决定采用m i d is h e r l o c k 回脂肪酸 细菌鉴定系统来进行鉴定。将细菌以4 区划线法接种于t s b a 平板上，2 8 c 下培 养，2 4 h 后取第3 区的细菌提取短链脂肪酸，通过毛细管气象色谱仪分析，与系 统库中的短链脂肪酸指纹图谱进行对比，鉴定出细菌的种属。具体方法在第3 章中介绍。 按照鉴定结果将所有的菌株分类。后续实验在这个基础上进行，可以避免重 复，减少工作量。 2 4m n 田) 氧化优势菌种的筛选方案 2 4 1 细菌m n ( i i ) 氧化活性的定性检测方法 高价锰的测定采用l b b ( 1 e u c o b e r b e l i nb l u e ) 1 3 9 j 9 ，6 0 1 法。l b b 试剂含0 0 4 的 l b b 和4 5 m m o l l 的乙酸，配制好后放入棕色玻璃瓶内，4 c 保存。由于p y c m 培养基中含有m n 2 + ，经过数天培养，具有氧化能力的细菌能将其氧化为高价锰。 用接种环在固体培养基表面刮取少量菌体，放入试管中，滴加数滴l b b 试剂， 显现蓝色就表明有高价m n 生成，即细菌具有m n 2 + 氧化能力。通过这种定性检 测，从所有菌株中初步筛选出具有m n ( i o 氧化能力的细菌。 2 4 2 细菌m n ( i i ) 氧化活性的定量检测方法 将已初步选出的具有m n 2 + 氧化能力的细菌接种于低锰p y c m 液体培养基中 培养，用l b b 法对高价锰进行定量检测，以确定每种细菌氧化能力的强弱，筛 选出其中具有较强氧化能力的细菌。具体方法： 将菌悬液冷冻离一已, ( 1 5 m i n ，1 0 0 0 0 x g ，4 ) ，沉淀用l o m m 的h e p e s 缓冲 液( p h 7 ) 洗涤一次，再次离，t = l , ( 1 5 m i n ，1 0 0 0 0 x g ，4 ) ，沉淀用h e p e s 缓冲液悬 浮至o d 6 0 0 = _ 2 。 将1 9 m l 悬浮液移至无菌试管中，加入2 m m o l l 的m n s 0 4 溶液l m l ( o 2 9 m 滤膜过滤除去细菌) ，使反应液中m r l 2 + 浓度为o 1 m m o l l ，塞上棉塞，2 5 下反 应，用水浴控制反应温度，总反应时间定为3 h 。 每隔一定时间，吸取反应液0 5 m l ，加入l b b 试剂2 m l ，离，g ( 1 5 m i n ， 1 0 0 0 0 x g ) 后用分光光度计测其在6 2 0 n m 处的吸光值， 将所得吸光值与k m n 0 4 标准曲线【3 9 】对比( 2 5 n m o lm n 0 2 相当于的l n m o l 的k m n 0 4 ) ，得出生成的m n 0 2 的量。 由于经过一段时间的培养，培养基中的部分m n 2 + 经被氧化为m n 0 2 ，沉积 在细胞上，无法通过洗涤完全去除，使所得的值偏大。因此还需要同时进行空白 实验，即：往1 9 m l 细菌悬浮液中加入l m l 去离子水，按上述步骤检测，测得背 景值，将前面得到的m n 0 2 生成量减去这个背景值，就得到了细菌在这3 h 内实 1 0 第2 章研究方案和分析方法 际氧化的m n 2 + 的量。如果培养基中m n z + 浓度太高，会导致背景值增大、误差增 大，而浓度过低可能会影响细菌生长和活性表达。经过多次实验确定，当培养基 中m n s 0 4 h 2 0 采用0 0 2 9 时，对实验结果影响较小，因此在定量检测时采用低 锰p y c m 培养基。 2 5m n ( i i ) 氧化细菌氧化活性和种间协同作用的研究 2 5 1m n ( i i ) 氧化细菌氧化活性的研究 m n ( i i ) 氧化细菌氧化活性的研究是本课题的核心部分，检测指标主要为 m n o , 生成量，方法采用前述l b b 定量检测方法。 ( 0 m n ( 1 0 氧化细菌生长过程特点。将筛选出的具有氧化活性的细菌在发酵罐 中进行液体培养，定期取出一定量的菌液，用分光光度计测其吸光值，得到生长 曲线。由生长曲线可以看出各种细菌的生长过程特点，尤其是到达稳定期的时间 和细菌量，这可以为接下来的实验提供参考。 ( 2 ) 细菌氧化m n ( n ) 过程的特点。与前面提到的氧化活性定量检测方法类似， 只是每隔1 5 或3 0 m i n ，取l m l 反应液，用l b b 法测生成的m n o z 的浓度，得到 浓