（分析化学专业论文）用于细胞内具有重要生物学意义的活性小分子物种的高选择性识别的新型荧光探针的合成研究及其在生物体系中的应用.pdf

山东师范大学硕士论文 用于细胞内具有重要生物学意义的活性小分子物种的高选择性 识别的新型荧光探针的合成研究及其在生物体系中的应用 摘要 生物体内存在着各种各样的活性物种( 如阳离子、阴离子等) ，它们有着特殊的 生理功能，并对生命过程起着至关重要的影响。如果要详细阐述这些活性小分子物 种在生命过程中所发挥的作用、所引起的各种生物学效应和生物学功能，那么就必 须对它们进行准确实时地检测。但是由于生物本身环境的多样性和复杂性，对这些 活性物种的研究就必须采用选择性好、灵敏度高的分析方法。随着荧光生物分析技 术的发展，荧光显微成像的方法比其他侵入性方法提供了更好的灵敏性和操作的简 便性，因此，检测生物体内活性物种的可视荧光探针技术也迅速发展起来。 细胞内h + 在细胞的许多生理过程中起着关键性的作用，例如受体介导的信号转 导、酶催化活动、细胞生长和凋亡、离子运输和动态平衡、钙调节、细胞内吞作用、 趋化和细胞粘附等。在正常生理状态下，细胞外氢离子浓度维持在一个非常狭窄的 范围内，正常值约为4 0n m 0 1 l - 1 ( p h 值7 4 0 ) ，大约有5n m o l l 1 的浮动范围( p h 值7 3 5 7 4 5 ) 。p h 升高或降低达到o 1o 0 2 0 个p h 单位即可引起肺心病变和神经系 统的问题( 如阿尔茨海默氏病) ，体内较大的p h 波动则是致命性的。因此，h + 是一 个衡量生物体生理变化的最重要的指标之一。 氯是人体必需的一种元素，氯在体内主要以离子的形式存在。氯离子在维持生 物体内p h 平衡、维持细胞外液渗透压和酶催化等生命过程中起着举足轻重的作用。 因此对阴离子识别和检测的研究就显得尤为重要。就目前阴离子识别发展状况看来， 阴离子与受体相互作用过程中会受到很多因素的干扰，因而设计合成具有特异专一 性识别阴离子受体就显得比较困难。阴离子与受体分子之间的相互络合识别的非共 价键作用类型主要有：静电引力作用、氢键作用、静电引力与氢键共同作用、金属 或路易斯酸配位作用。 铁是生物体所必需的过渡金属元素，但细胞内过多的螯合铁却被认为是对细胞 致病损伤的一个决定性因子，尤其是细胞胞浆内过负载的亚铁离子能够催化f e n t o n 反应，从而产生氧化性极强的羟基自由基。如果想要对f e 2 + 的生物学功能作深入性 的了解，就必需发展出高选择性、高灵敏度的新型检测方法。对阳离子探针设计合 近红外荧光活性物种检测 成的机理常见的有：光诱导电子转移、电荷转移激发态、单体一激基缔合、荧光共 振能量转移、电子能量转移。 为了实现高选择性、高灵敏度快速识别和检测生物体内的矿、c 1 和f e 2 + ，并使 之达到可视化的目的，本论文开展了以下两方面的工作： ( 一) 设计合成了一种近红外中性p h 值荧光探针。探针结构采用“荧光团一桥 体一受体设计模式，通过光诱导电子转移机理来操控荧光强度的增减。在结构设 计策略基础上，我们选择了具备有高吸光系数的七甲川花菁( c y ) 染料作为荧光团， 4 一( 苄胺基) - 2 ，2 ：67 ，2 - _ 三联吡啶( t p y ) 为质子受体。通过p h 滴定实验，我们发现此探 针可用于监测生理p h 值微小的波动。经测定，探针的p 约为7 1 0 。在p h 值6 7 0 7 9 0 范围内，荧光强度对h + 浓度变化有强的依赖性和迅速响应灵敏性，并且在此范围内 荧光强度和p h 值之间有着良好的线性关系。此探针可以在生化体系中有效地避开生 物自发荧光和生物内源性物种的干扰。同时探针也展现出高灵敏性、良好的光稳定 性和优异的胞膜穿透性等优点。本文成功地实现了对h e p g 2 细胞和h l 7 7 0 2 细胞内 h + 原位监测成像。 ( 二) 设计合成了一种连有三联毗啶基团的磺酸花菁结构的荧光分子探针用于 选择性检测生物体内的f e 2 + 和c 1 。探针的工作原理是基于探针金属离子阴离子络 合配位和重原子的三重态荧光淬灭效应。探针本身有强的荧光，在氯离子存在下与 f e 2 + 络合后，导致磺酸花菁的荧光猝灭，而且荧光强度的猝灭程度分别与f e 2 + 的浓度 和c l 。的浓度成一定的比例关系。探针在与f e 2 + 和c l 反应前后的颜色由蓝色变为紫 色，实验结果显示探针对f e 2 + 和c l 。有高度的选择性。据此，我们分别固定了f e 2 + 和 c l 浓度，成功地实现了对f e 2 + 和c 1 。的分别检测，探针的荧光强度变化分别与亚铁离 子和氯离子的浓度呈现较好的线性关系。探针对介质的酸碱度不敏感，荧光性质稳 定。该探针成功用于血浆和血清中f e 2 + 和c l 的选择性检测。选择性实验表明该探针 是检测生物体内f e 2 + 和c l 的理想近红外荧光探针。 关键词：氢离子氯离子亚铁离子近红外荧光探针共聚焦显微成像 比色法 i i 山东师范大学硕士论文 d e s i g na n ds y n t h e s i sn e wt y p e so ff l u o r e s c e n c ep r o b e sf o rs e l e c t i v e d e t e c t i o ni n t r a c e l l u l a rf u n c t i o n a c t i v i t ys p e c i e s ( m e t a li o n s ，a n i o n s ) a n dt h e i ri m a g i n ga n a l y s i so nv i s u a l i z a t i o ni nv i v o a b s t r a c t i n t r a c e l l u l a r p hp l a y s a p i v o t a l r o l ei n m a n y c e l l u l a r e v e n t s ，i n c l u d i n g r e c e p t o r - m e d i a t e ds i g n a lt r a n s d u c t i o n ，e n z y m a t i ca c t i v i t y , c e l lg r o w t ha n da p o p t o s i s ，i o n t r a n s p o r ta n dh o m e o s t a s i s ，c a l c i u mr e g u l a t i o n ，e n d o c y t o s i s ，c h e m o t a x i s ，a n dc e l la d h e s i o n u n d e rn o r m a lp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n se x t r a c e l l u l a rh y d r o g e ni o nc o n c e n t r a t i o ni s m a i n t a i n e dw i t h i nv e r yn a r r o wl i m i t s t h en o r m a lv a l u ei sa b o u t4 0n m o l l 1 ( p h7 4 0 ) a n dv a r i e sb ya b o u t5n m o l l 1 ( p h7 3 5 7 4 5 ) d e v i a t i o nb y0 10 0 2 0p hu n i t si ne i t h e r d i r e c t i o nc a nc a u s ec a r d i o p u l m o n a r ya n dn e u r o l o g i cp r o b l e m s ( e g ，a l z h e i m e r sd i s e a s e ) ， a n dm o r ee x t r e m ev a r i a t i o n sc a nb ef a t a l h e n c e ，h 十i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tt a r g e t s a m o n gt h es p e c i e so fi n t e r e s t si nv i v o m o r e o v e r , t h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yp r o v i d e s g r e a t e rs e n s i t i v i t ya n dc o n v e n i e n c et h a no t h e ri n v a s i v em e t h o d s t h e s ea d v a n t a g e sh a v e m a d ef l u o r e s c e n ti n t r a c e l l u l a rp hp r o b e si m a g i n gt e c h n o l o g yd e v e l o p i n gr a p i d l y c r d o r i n ei sa l le s s e n t i a le l e m e n tf o rc r e a t u r e s ，i te x i s t sm a i n l yi nt h ef o r mo fa n i o ni n v i v o c h l o r i d ep l a y sap i v o t a lr o l ei nm a n yl i f ep r o c e s s e s ，s u c ha se q u i l i b r i u mp hv a l u e s ， m a i n t e n a n c ee x t r a c e l l u l a rf l u i do s m o t i cp r e s s u r ea n de n z y m ec a t a l y s i s s oi ti si m p o r t a n t f o ra n i o nr e c o g n i t i o na n dd e t e c t i o n a sf a ra st h ed e v e l o p m e n ts t a t u so fa n i o nr e c o g n i t i o n i sc o n c e m e d ，m a n ye x t e r n a li n f l u e n c ef a c t o r sw i l ld i s t u r bt h er e c o g n i t i o np r o c e s sb e t w e e n a n i o na n dr e c e p t o r t h e r e f o r e ，t h e r ea r es o m ed i f f i c u l t i e sf o rd e s i g na n ds y n t h e s i sa r e c e p t o rt h a ti se x c l u s i v et oa na n i o n i ng e n e r a l ，t h en o n - c o v a l e n tb o n da s s o c i a t i o nc a nb e d i v i d e di n t of o u rt y p e s ：e l e c t r o s t a t i cf o r c e ，h y d r o g e nb o n d i n g ，e l e c t r o s t a t i cf o r c ea n d h y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o n ，a n dm e t a li o n so rl e w i sa c i d sc o o r d i n a t i o n i r o n ，at r a n s i t i o nm e t a le l e m e n t ，i sa l s oe s s e n t i a lf o rl i v e s h o w e v e r , m a n ys t u d i e sh a v e s h o w nt h a ti n t r a c e l l u l a rc h e l a t i n gi r o ni sac r u c i a lp a t h o g e n i cf a c t o rf o rc e l ld a m a g e s t h e o v e r l o a di r o nc a i lc a t a l y z ef e n t o nr e a c t i o n ，a n dt h e nh y d r o x y lr a d i c a li sp r o d u c e d ，w h i c h i so n eo ft h es t r o n g e s to x i d a n t sk n o w n i tc a nl e a dt oi r r e p a r a b l ec e l l u l a rd a m a g e i no r d e r u i 近红外荧光活性物种检测 t of u r t h e ri n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ff e r r o u si o n ( f e 肿) ，i ti s u r g e n t f o r d e v e l o p i n gn e wm e t h o dw i t hh i 曲s e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t yt od e t e c tf e z + t h e r ea r es o m e f a m i l i a rm e c h a n i s m sf o rd e s i g na n ds y n t h e s i si o n - p r o b e s u c ha sp h o t o i n d u c e de l e c t r o n t r a n s f e r , c h a r g e - t r a n s f e re x c i t e ds t a t e s ，m o n o m e r - e x c i m e r , f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r , a n de l e c t r o n i ce n e r g yt r a n s f e r b a s e do nt h eo v e r a l ls t r a t e g yt h a ti sf l e e t l yd e t e c t i n ga n di m a g i n gh + ，c 1 。，a n df e 2 + i n v i v ow i t hh i 曲s e l e c t i v i t ya n d h i g hs e n s i t i v i t y w ec a r r i e do u tt w oa s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，an e a r - n e u t r a lp hn e a r - i n f r a r e d ( n i r ) f l u o r e s c e n tp r o b eu t i l i z i n g a f l u o r o p h o r e - s p a c e r - r e c e p t o rm o l e c u l a rf r a m e w o r kt h a tc a nm o d u l a t et h ef l u o r e s c e n c e e m i s s i o ni n t e n s i t yt h r o u g haf a s tp h o t oi n d u c e de l e c t r o n - t r a n s f e rp r o c e s sw a sd e v e l o p e d o u rs t r a t e g yw a st oc h o o s et r i c a r b o c y a n i n e ( c y ) ，an i rf l u o r e s c e n td y ew i t hh i 曲 e x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t s ，a sa f l u o r o p h o r e ，a n d4 - ( a m i n o m e t h y l p h e n y l ) - 2 ，2 ：6 ，2 - t e r p y r i d i n e ( t p y ) a u sar e c e p t o r t h ep ht i t r a t i o ni n d i c a t e dt h a tt p y - c yc a nm o n i t o rt h em i n o r p h y s i o l o g i c a lp hf l u c t u a t i o n sw i t hap k ao f 。7 10n e a rp h y s i o l o g i c a lp h t h ep r o b e r e s p o n d sl i n e a r l ya n dr a p i d l yt om i n o rp hf l u c t u a t i o n sw i t h i nt h er a n g eo f6 7 0 7 9 0a n d e x h i b i t ss t r o n gd e p e n d e n c eo np hc h a n g e s i ti ss h o w nt h a tt h ep r o b ee f f e c t i v e l ya v o i d s t h ei n f l u e n c eo fa u t o f l u o r e s c e n c ea n dn a t i v ec e l l u l a rs p e c i e si nb i o l o g i c a ls y s t e m sa n d m e a n w h i l ee x h i b i t sh i g hs e n s i t i v i t y , g o o dp h o t o s t a b i l i t y , a n de x c e l l e n tc e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t h er e a l - t i m ei m a g i n go fc e l l u l a rp ha n dt h ed e t e c t i o no fp hi ns i t uw a s a c h i e v e ds u c c e s s f u l l yi nl i v i n gh e p g 2a n dh l - 7 7 0 2c e l l sb yt h i sp r o b e s e c o n d ，ap r o b ec o m p o s e do fc y a n i n e ( c y - s 0 3 ) a n dt e r p y r i d i n e ( t p y ) i sd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d t od e t e c tf e z + a n dc 1 。i nv i v o i t sw o r k i n gp r i n c i p l ei sb a s e do n p r o b e m e t a l - a n i o nc o o r d i n a t i o na n dh e a v ya t o me f f e c t t h es t r o n g l yf l u o r e s c e n tp r o b e c o u l dc h e l a ew i t hf e 2 十w h e nc 1 a p p e a r e d ，t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga n dt h ec o l o u r c h a n g ef r o mb l u et op u r p l e t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep r o b eh a sh i 曲s e l e c t i v i t yt o f e 2 + a n dc 1 。1 1 1 ep r o b er e s p o n d sl i n e a r l ya n dr a p i d l yt om i n o r f e 2 + 】a n d c 1 。 v a r i a t i o n r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h ep r o b ec a nd e t e c tf e 2 + a n dc 1 。s e l e c t i v e l y k e y w o r d s ：h y d r i o n ；c h l o r i d e ；f e r r o u si r o n ；n e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n t i v p r o b e ；c o n f o c a lm i c r o s c o p yi m a g e ；c o l o r i m e t r y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他 需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：寸伤石百弋 翩擀气劫之 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权堂校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本 授权书) 学位论文作者签名： 寺法梅 签字日期：2 0 0 夕年对月弓f 日 导师签字：彳拟移 l 签字日期：2 0 07 年蝴? f 日 山东师范大学硕士论文 第一章绪论 生物体内存在着各种各样的活性物种( 如阳离子、阴离子等) ，它们有着特殊的 生理功能，并对生命过程起着至关重要的影响。如果要详细阐述这些活性小分子物 种在生命过程中所发挥的作用、所引起的各种生物学效应和生物学功能，那么就必 须对它们进行准确实时地检测。但是由于生物本身环境的多样性和复杂性，对这些 活性物种的研究就必须采用选择性好、灵敏度高的分析方法。随着荧光生物分析技 术的发展，荧光显微成像的方法比其他侵入性方法提供了更好的灵敏性和操作的简 便性，因此，检测生物体内活性物种的可视荧光探针技术也迅速发展起来。 第一节引言 分子识另u ( m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ) 是广泛存在的自然现象，特别是在化学、材料 科学和生命科学领域中，分子识别起着极其重要的作用。所谓分子识别是指分子之 间( 主体与客体或称之为受体与底物) 靠非共价键力的选择性结合并产生某种特定功 能的过程。它不同于我们所熟悉的宏观意义上的说法，单纯的结合不是识别，识别 是有目标的结合，它是通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过 程【i 】。结合形成的超分子体系是由它的稳定性和选择性即形成过程中以能量和信息量 的变化来表征的。分子识别作为分子之间发生的事件，必须借助一定的技术手段才 能感知伴随分子事件发生所产生的物理化学信号，也就是检测力、热、光、电、声 等物理化学信息来直观地反映识别事件的进行过程，从而达到人与分子间直接对话 的目的【2 州。这些传感装置门类众多、检测方法也是林林总总。根据各行业需要的不 同，它们已经广泛地应用于分析化学、环境科学、生物化学分析、生命科学和临床 医学等领域。除了以上所说的的传感器外，还有一种重要的分子装置由于它的潜在 信息过程而用于分子识别事件，这种传感装置的机理是基于在有外界环境刺激的情 况下它们的光发射可受控于其两种截然不同的分子状态 1 m 3 1 1 ，其所发射的光信号就 是分子荧光。分子荧光作为传感信号具有以下优点：单分子检测的高灵敏性【3 2 。8 】、 开关可控性、实现人与分子的直接通讯的可行性、对亚微粒具有可视的亚纳米空间 分辨性，并且这种分辨可以达到亚毫秒级别【3 9 。4 3 1 。荧光分子探针( f l u o r e s c e mm o l e c u l a r p r o b e ) 、荧光分子开关( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs w i t c h ) 和荧光分子传感器( f l u o r e s c e n t 近红外荧光活性物种检测 m o l e c u l a rs e n s o r ) 是在荧光分子识别( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g l l i t i o n ) 中经常使用的 概念。荧光分子探针是其中内涵最广的一个概念，一般凡是在一定体系内，当某一 种物质或体系的某一物理性质发生变化时，该分子的荧光信号能发生相应改变的分 子就可称为某一物质或某一物理性质的荧光分子探针。荧光分子开关是指在识别过 程中分子荧光信号有明显强弱变化的荧光分子探针。荧光分子传感器是指在识别过 程中分子荧光信号能够快速、可逆响应的荧光分子探针。通常评价荧光分子探针的 性能主要考虑灵敏性、选择性、实时性和原位检测性能等四方面因素。灵敏性中包 括许多因素：首先，探针与被检测物的结合强度是识别灵敏性的前提；其次，识别 信息的荧光信号转换效率同样影响识别灵敏性，荧光增强的探针般会比荧光猝灭 的相应灵敏性高；另外，荧光团的荧光波长、量子产率、斯托克斯位移和背景荧光 干扰等也会影响探针的检测灵敏性；灵敏性还与仪器性能有关。选择性主要取决于 探针与被检测物的结合选择性；有时被结合的客体可直接影响荧光团的荧光发射性 能，在这种情况下，识别选择性还与被结合的客体性质有关；实时性主要包括识别 响应的速度和可逆性两个方面，如果可逆响应的速度快于或与被检测客体的变化速 度相匹配，则可称之为实时响应探针( 传感器) ；原位检测性能主要取决于探针分子与 被检测体系的相容性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体系并发出识别信号。 从目前的实际情况来看，水溶性探针比非水溶性探针更有发展潜力。其实在一定限 度内，荧光探针检测的时空分辨率取决于仪器。 第二节荧光探针分子识别事件的主要设计原理 2 1 光诱导电子转移系统( p h o t o i n d u e e de l e c t r o nt r a n s f e rs y s t e m s ，p e t ) 在荧光分子探针设计过程中，利用p e t 原理设计的荧光分子探针是较为常见的。 这类探针设计原理明确【4 4 4 7 】，特别是对于碱金属、碱土金属，过渡金属和氢离子通 常都可获得荧光增强的探针。典型的p e t 荧光探针体系是由具有电子给予能力的识 别基团r ，通过连接基团s 和荧光基团f 相连而构成功能分子。其中荧光团的作用 是转换吸收光为荧光发射信号，并且荧光发射强度与识别基团的结合状态相关；识 别基团的责任是结合客体并将结合信息传递给荧光团；连接基团将这两部分连成一 个分子并且使其各自保持独立状态，以达到使识别信息变化转化为荧光强度变化的 目的。 2 山东师范大学硕士论文 2 1 1 “关一开力和“开一关 型操控机理 在p e t 荧光分子探针中，识别基团与荧光团之间的识别信息与荧光信号之间的 转化是靠光诱导电子转移完成的。p e t 荧光分子探针的具体工作过程如下：具有电 子给予能力的识别基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态荧光团因电子激发 而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁回原基态轨道发射荧光，导致 荧光团的荧光猝灭；然而，当识别基团与客体结合后，降低了识别基团的给电子能力， p e t 过程被减弱或不再发生，使荧光团的荧光发射增强。因此在未结合客体之前， 探针分子不发射荧光或荧光很弱。一旦受体与客体相结合，荧光团就会发射出强荧 光( 图1 1 ，1 2 ，1 3 ，1 4 ) 。 图1 - 1 p e t 系统处“关”状态图1 2 图1 1 的前线轨道能量图示 i 一十上斗一 图1 - 3 p e t 系统处“开”状态图1 - 4 图1 3 的前线轨道能量图示 2 1 2 利用客体氧化还原态的“开一关 型操控机理 光诱导电子转移系统的延伸应用可以扩展到那些涉及客体自身拥有电子转移性 质的体系。此机理过程示意见图1 5 。客体分子依赖其对荧光团单独或相互的氧化还 原潜能来引发光诱导电子转移系统。但是荧光开关的结果总是由开到关。 图1 - 5 荧光p e t “开一关”型装置对具有氧化还原本质的客体的响应 2 2 电荷转移激发态( c h a r g e - t r a n s f e re x c i t e ds t a t e ss y s t e m s ，c t ) 2 2 1 分子内电荷转移( i n t e r n a lc h a r g et r a n s f e r , i c r r ) 分子内电荷转移又称光诱导电荷转移( p h o t o i n d u c e dc h a r g et r a n s f e r , p c t ) 4 8 - 5 1 。由于分子内的电荷转移，非碳氢( 如杂原子) 兀电子体系在基态和最低能量单 3 近红外荧光活性物种检测 线激发态时存在两种截然不同偶极矩。典型的i c t 荧光探针分子是由荧光团与识别 基团直接相连构成的。这类探针的荧光团上分别连有推电子基( 电子给体) 和吸电子 基( 电子受体) ( 图1 6 ) ，并且推电子基或吸电子基团本身又充当识别基团或识别基团 的一部分，该分子被光子激发后会进一步增加从电子给体向电子受体的电荷转移。 当识别基团与客体结合时，会对荧光团的推一拉电子作用产生影响( 减弱或强化电荷 转移) ，从而导致荧光光谱的变化，主要是光谱蓝移或红移( 图1 7 ，1 8 ) 。4 一氨基邻 苯二甲酰亚胺、二胺类物质、二芳基烯类、呋喃香豆素类、芘甲醛等就具有这种性 质。就大体情况而言，i c t 荧光探针对荧光强度的影响不像p e t 荧光探针那样显著。 i r p l w 坤 到ro i砸1 t w | s t e e l i f 一叵 胁帅r c 图1 6 荧光团( f ) 和受体( r ) 三种不同的连接方法 卿吁t 乏圃 j 疆回矗o 一乜臣甄e 簟 图l - 7 荧光团处于激发态时阳离子对吸收或激 图1 墙荧光团处于激发态时阳离子对发 发光谱波长的影响 射光谱波长影响的抑制效果 2 2 2 扭曲的分子内电荷转移( t w i s t e di n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r , t i c t ) 在具有推拉电子共轭体系的荧光分子中，如果推电子基( 如二甲氨基) 是通过 单键与荧光团相连的，当荧光团被光子激发时，由于强烈的分子内光诱导电荷转移， 导致原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋转，而与芳环平面处于正交状态，原来的 共轭系统被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形成t i c t 激发态 s 2 , 5 3 。当形 成t i c t 激发态时原有的i c t 荧光则被猝灭。t i c t 态常常不发射荧光或者发射弱的 长波荧光，少数情况下出现i c t 与t i c t 双重荧光现象 5 4 , 5 5 】。 2 3 单体一激基缔合体系( m o n o m e r - e x e i m e rs y s t e m s ) 当两个相同的荧光团，如多环芳烃萘、蒽和芘等连接到一个受体分子的合适位 置时，其中一个被激发的荧光团( 单体) 会和另一个处于基态的荧光团形成分子内激基 缔合物。它的发射光谱不同于单体，表现为一个新的、强而宽、长波、无精细结构 发射峰【5 6 1 。由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到“碰撞”距离 4 山东师范大学硕士论文 ( 3 5a ) ，因此荧光团间的距离是激基缔合物形成和破坏的关键。所以利用各种分子 间作用力改变两个荧光团之间的距离，如用结合客体前后单体一激基缔合物的荧光 光谱变化表达客体被识别的信息。萘、芘、葸等荧光团由于具有较长的激发单线态 寿命易形成激基缔合物，因此常常被用于此类探针中。探针的常见设计类型见图1 - 9 ， l 一1 0 ，1 1 1 ，1 1 2 。 f i g u r e1 - 9 b i a s i n go f m o n o m e r - g r o u n ds t a t e d i m m e re q u i l i b r i u mo fat e t h e r e db i f l u o r o p h o r e b yar e c e p t o rw h i c hs t a b i l i z e so n eo rt h eo t h e r f i g u r e l - l o g u e s t - i n d u c e df o l d i n ga n d s t a c l ( i n go faf l e x i b l yt e t h e r e d b i f l u o r o p h o r e 霞= l ：止竺竺啤严o 。l1 一 i 一、 f i g u r e1 - 1 1 g u e s t i n d u c e du n s t a c k i n g f i g u r e1 - 1 2 s e l f - e o m p l e x i n gw i t h i nas y s t e mw i t h o faf l e x i b l yf l u o r o p h o r e t w of l u o r o p h o r e sf l e x i b l yt e t h e r e dt o ar i g i d r e c 印t o t 2 4 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e rs y s t e m s ，f r e t ) 科研工作者们一直向往能够将复杂生物大分子的结构剖析清楚，测定生物大分 子的结构时。使用最多、最成熟的技术是x 一射线晶体衍射法和h n m r 中的n o e 效应。这些技术已成功地用于分析蛋白质及核酸等分子的结构和构象，但又各有弊 端：x 一射线分析法不能描述对于生物大分子来说至关重要的动态性质与多样性，而 n o e 效应适用的测定距离仅限于十分之几纳米，使其对于尺寸为几至几十纳米的大 部分蛋白质和核酸等生物大分子的研究受到了很大的限制。 荧光共振能量转移( f r e t ) 方法的出现为大分子内部结构的测定及动态监视提供 5 飘 近红外荧光活性物种检测 了条快速、简捷、灵敏的途径5 7 击6 】。所谓f r e t 是指电子激发能在适当的能量给 体( d ) 和能量受体( a ) 对之间的传递，传递距离最大可达7 o 一1 0 0n n l 。1 9 4 8 年，f 6 r s t e r 对于这种实验现象提出了偶极一偶极相互作用发生能量转移的理论，1 9 6 7 年s t r y e l 和h a u g l a n d m 提出能量转移可以作为光学尺，用来测量1 o 一6 0i l r n 之间的距离。荧 光共振能量转移技术作为一种物理技术，常用于分子生物学技术可将待研究分子进 行荧光蛋白标记并在细胞中表达；研究受体配基的相互作用：测定受体配基相互作 用的距离、测定受体亲和常数、受体二聚化、受体构象变化；该技术的最显著特点 是在平衡条件下，无需分离游离配基和结合配基，即可测定平衡常数。 荧光物质分子之间能量转移的方式可以分为辐射能量转移和非辐射能量转移。 荧光共振能量转移属于非辐射能量转移。该种方式的能量转移可以发生在不同分子 以及同一分子的不同生色团之间( 式1 1 ) 。提供能量与接受能量的分子或者生色团 分别称为供体与受体。在供体与受体之间产生荧光共振能量转移需要满足三个条件： 供体荧光发射光谱与受体吸收光谱之间具有相当程度的重叠；供体与受体偶极具有 一定的相对取向；供体与受体之间的距离在1 1 0n l n 之间。在满足以上条件的情形下， 对供体的激发将导致受体荧光发射( 图1 3 ) 。 d 木+ 彳d + 彳木j 彳+ h v ( 1 - i ) 毫tb ( d b e = 1 罩i s l 啦 图1 - 1 3 发生荧光共振能量转移的条件 f r e t 技术有着众多的优点。高灵敏度：现在可以用此方法在溶液中或单细胞水 平研究单个受体分子；可以和许多技术结合：如显微镜、流式细胞计、共聚焦显微 镜、稳态和瞬态荧光光谱，在生理条件即活细胞状态下，选择性地研究分子间的相 互作用；有高时间分辨率，可以迅速的跟踪记录下i l l s 甚至“s 级时间内的距离变化， 所以适用于酶的催化、肌肉收缩、信号传递、主动运输等方面的研究；空间上的分 辨率受方位因子不确定度及d 、a 基团本身的大小影响，但是现有的分辨程度已 经可以满足f r e t 技术在构象变化等方面研究的需要；可以从商业上得到各种荧光 6 霪 s 蓬。羔 山东师范大学硕士论文 探剂：用它们可以标记各种所要研究的无荧光特性的分子如配体，因而大大地开阔了 研究途径。 2 s 电子能量转移体系( e l e c t r o n i ce n e r g yt r a n s f e rs y s t e m s ，e e t ) 电子能量转移体系含有两种或者更多种类的荧光团，而且这些感光单元是不等 性的。电子能量转移体系的重要性就是是它的光合作用中心在较小超分子中促进了 分子模拟的进程。分子处于激发态时，它可将激发能传递给其他分子，自身失活到 基态，接受了能量的分子由基态跃迁到激发态，这一过程称为能量传递过程f 6 7 7 1 】。 激发态分子的激发能传递给不同种类的基态分子，称为能量传递，如果激发态分子 将激发能传递给同种类的基态分子，又称为能量迁移。有些物质能够有效地加速处 于电子激发态分子的失活，这种物质称为猝灭剂，猝灭剂使激发态分子失活的过程 叫猝灭。本身容易被激发、并能将自己的激发能再传给其他分子使之到达激发态的 物质称为敏化剂，该过程称为敏化。敏化和猝灭都是能量传递过程，并且是同时发 生的，过程发生时，激发态分子是敏化剂，它本身被猝灭，回到基态，原来处于基 态的物质是猝灭剂，它在能量传递过程被敏化，到达激发态。能量传递可以发生在 分子间也可以发生在分子内，这些分子可以是相同的或是不同的。能量传递可分为 两大类，即辐射能量传递和非辐射能量传递。 辐射机制的能量传递是一个两步过程，能量给体d 发射一个光子，由受体a 吸 收光子，达到激发态a ，从而实现能量传递。这一过程可表示如下： d 率 d + h v l w + a 卜a 搴 辐射能量传递的一个特点是它不需要给体与受体间的直接相互作用，一般说来， 经这种机制能量传递的给体一受体间有效距离约为5 卜1 0 0a 。辐射机制能量传递的 速率和效率与给体激发态d 发射的量子产率、受体a 的浓度和摩尔消光系数以及 d 的发射光谱与a 的吸收光谱的重叠程度有关。辐射能量传递过程，给体的发射光 谱可以发生变化，这是因为荧光强度不是激发态的固有性质，它随所吸收的光强或 激发光波长而改变，但给体发射寿命不变，能量传递速率常数与介质的粘度无关。 非辐射能量传递过程是一个一步过程，没有光子的发射与吸收。可表示为： ，、 d 幸+a- +fd 牵a1 叶 d+a 枣 7 近红外荧光活性物种检测 非辐射能量传递的机制包括库仑机制和电子交换机制两种。发生库仑机制 ( f 6 r s t e r 理论) 能量传递时，给体与受体的分子间不需要发生接触，它也是一种远 程的能量传递，又称为诱导偶极或共振机制。如图1 1 4 所示，给体和受体间的能 量传递是协同的，共振的条件是a e ( d - d ) = a e ( a - a 。) ，能量传递就是通过给体d 的电子和受体a 的电子之间的偶合实现的。 d i p o l e - d i p o l e 亡i ) 一 d a d _ | t a 图1 1 4 共振机制能量传递示意图 电子交换机制( d e x t e r 理论) 要