（农业生物环境与能源工程专业论文）蔬菜中有机磷农药残留快速检测方法的研究.pdf

山东理工大学硕士学位论文摘要 摘要 本文针对有机磷农药残留快速检测技术存在的问题，主要进行了以下三个 方面的研究： 1 、比较了三种来源( 家蝇、鲤鱼脑、鸡肝) 的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 对 三种有机磷农药( 敌敌畏、敌百虫、氧乐果) 的敏感性。发现，对于敌敌畏， 家蝇 鲤鱼脑 鸡肝；对于敌百虫，家蝇敏感性最高，鲤鱼脑和鸡肝酶对其不敏 感；对于氧乐果，在0 3 0 0 g l 一浓度时，对三种酶的抑制率相差不大，当浓度 大于3 0 0 p g l 。1 时，家蝇酶的抑制效果明显好于其余两种。综合考虑三种酶对三 种农药的敏感性，确定家蝇的a c h e 是较为理想的指示有机磷类农药的敏感酶。 2 、研究了家蝇a c h e 在三种微孔滤膜( 尼龙、醋酸纤维素和硝酸纤维素， 孔径均为0 4 5 “m ) 上的固定化效果，确定硝酸纤维素膜的固定效果较好。对硝 酸纤维素膜固定家蝇a c h e 的最佳条件进行了研究，确定为：a c h e 用量为10 u ， 5 ( 体积分数) 的戊二醛5 l ，3 0 l1 ( 质量分数) 的牛血清蛋白( b a s ) ， 配成2 0 0 l 的酶溶液，4 固定8 h 。并对最优条件下的固定化效果进行了评价。 3 、对商品化的a c h e 试剂包进行了优化研究。在保证较高灵敏度的前提 下，确定了一种更经济的试剂配方，即酶和底物的用量调整为推荐用量的3 4 ， 显色剂用量调整为推荐用量的1 2 ，总体上节约了l 3 的成本。通过f 检验证 明，调整后配方和原配方之间无显著性差异。调整后的配方对三种常见有机磷 农药氧乐果、敌百虫和敌敌畏的检出下限大约分别为o 3 7 m g l 、 0 0 9 m g l 叫和o 0 3 5 m g l ，检测限基本不变。 关键词：有机磷农药，快速检测，抑制率，固定化酶 a b s t r a c t i no r d e rt os o l v et h ep r o b l e m si nr a p i dd e t e c t i o nt e c h n o l o g yf b rp e s t i c i d e r e s i d u e s ，t h r e ep a r t sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r 1 c o m p a r i n gt h es e n s i t i v i t yo ft h r e es o u r c e s ( m u s c ad o m e s t i c a ，c y p r i n o i d s b r a i n ，f o w ll i v e r ) a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) t ot h r e eo r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e s ( d i c h l o r v o s ，t r i c h l o r f o n ，o m e t h o a t e ) i ti sf o u n dt h a tf o rd i c h l o r v o s ，t h e s e n s i t i v i t yf r o mh i g ht ol o w a r em u s c ad o m e s t i c a ，c y p r i n o i d sb r a i n ，f o w l l i v e r ；f o r t r i c h l o r f o n ，t h eh i g h e s ts e n s i t i v ea c h ei sf r o mm u s c ad o m e s t i c a ，a c h ef r o m c y p r i n o i d sb r a i na n df o w ll i v e re n z y m ea r en o ts e n s i t i v e ；f o ro m e t h o a t e ，b e l o w 3o ou g l 1c o n c e n t r a t i o n ，t h ei n h i b i t i o nr a t eo ft h r e ea c h ea r el i t t l ed i f f e r e n c e ， w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ng r e a t e rt h a n3 0 0 p g l ，i n h i b i t i o ne f 伯c to f a c h ef r o m m u s c ad o m e s t i c ai sb e t t e rt h a nt h er e s tt w o c o m p r e h e n s i v ec o n s i d e rt h e s e n s i t i v i t yo ft h r e ea c h et ot h r e ep e s t i c i d e s ，f r o mt h em u s c ad o m e s t i c ai sb e t t e r i ni n s t r u c t i o no r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d e 2 r e s e a r c ht h ei m m o b i l i z a t i o ne f 亿c t so fa c h ef r o mm u s c ad o m e s t i c a0 nt h e t h r e em i c r o v o i dn l t e rj f i l m ( n y l o n ，a c e t a t ea n dn i t r a t ef i l m ) i ti sf o u n dt h a tt h e i m m o b i l i z e dr e s u l t so fa c h eo nn i t r o c e u u l o s em e m b r a n ei st h eb e s t a c h e i m m o b i l i z e do nn i t r o c e l l u l o s em e m b r a n ew e r es t u d i e d ，t h eb e s ti m m o b i l i z a t i o n c o n d i t i o n sa r et h a t10 uo fa c h e ，5 u lo f5 ( v o l u m ef r a c t i o n ) g l u t a r a l d e h y d e ， 3 0 “lo f1 ( m a s sf r a c t i o n ) b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b a s ) ，d u b b e d2 0 0 肛le n z y m e s o l u t i o n 4 i m m o b i l i z e d8 h 3 t h eo p t i m i z a t i o no fd e t e r m i n a t i o nf b ro r g a n o p h o s p h a t ep e s t i c i d er e s i d u e s w a ss t u d i e d i np r o m i s eo fh i g h e rs e n s i t i v i t y ，an e wl o wc o s tr e a g e n tc o m p o n e n t s ， w h o s ed o s a g eo fa c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ( a c h e ) ，s u b s t r a t ea n dc h r o m o g e n i cr e a g e n t a r e3 4 ，3 4a n d1 2t h a to fo r i g i n a lc o m p o n e n t sr e s p e c t i v e l y f t e s tp r o v e dt h a t t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e na d j u s t e da n do r i g i n a lc o m p o n e n t s t h e l o w e rd e t e r m i n a t i o nl i m i to fa d ；u s t e dc o m p o n e n t st ot h r e ep e s t i c i d e sa r et h a t o m e t h o a t eo 3 7 m g l - 1 ，t r i c h l o r p h o n0 0 9 m g l ，d i c h l o r v o s0 0 3 5 m g 。l ，w h i c hi s c o n s i s t e n tw i t ht h o s eo fn a t i o n a ls t a n d a r dr a p i dd e t e r m i n a t i o nm e t h o d k e yw o r d s ： o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e ，r a p i dd e t e c t i o n ， i n h i b i t i o nr a t e ， i m m o b 订i z e de n z y m e ， 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得山东理工大学蠛其它教 育桃梅的学位或证书丽使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：力小别翁 时闻：年 月 丑 关于论文使用授权的说明 本人完全了解山东理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅；学校可以用不同方 式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ， 保密的学位论文在解赛后应遵守此协议) 研究生签名：z ，l 、z 岔 导师签名： 时间： 时间： 年月日 年月日 山东理工大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 果蔬中有机磷农药残留的现状及危害 农药是指用于预防、消灭或控制危害农业、林业的病虫草和其他有害生物， 以及有目的地调控植物和昆虫生长的化学合成物，或者来源于生物及其他天然 物质的一种或几种物质的混合物及其制剂j 。 随着我国人口的不断增加和有效耕地面积的同益减少，对单位面积农作物 的产量提出了越来越高的要求。农药对控制农作物病、虫、草鼠危害，促进农 产品高产优质，保证农业丰产丰收具有重要作用【3 q j 。因此，2 l 世纪的农业仍 将离不开农药，农药的研究、生产和使用将继续得到发展1 2 4 j 。 目前我国农药的生产量约1 5 1 0 4t ( 有效成分) ，使用量则一直维持在2 0 1 0 4 t ( 有效成分) 以上。与国外相比，我国的杀虫剂用量在农药中占有绝对优势， 约占总量的7 0 左右，其中又以有机磷农药为主，占杀虫剂的7 0 以上1 5 j 。 农药施于农作物上仅有1 0 2 0 依附在农作物本体上，其他农药散落在 农作物的周边环境中，部分存在于大气中。生物本体及其生活环境中的农药经 过降解、代谢等作用，其含量会降低到一定的水平，我们把残存在环境中和生 物体内的微量农药，称作农药残留1 6 】。农药残留如果超过最大残留限量，会 对人畜产生不良影响，或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害。已有研究 表明，高残存农药与致癌、致畸变【7j 和诸如沮丧、应激性一类神经性现象以及 记忆、思维、思想交流等方面的问题具有因果关系1 8 j 。 我国蔬菜中的农药残留十分普遍且比较严重【9 1 0 】。2 0 0 2 年农业部门对主要 城市郊区的蔬菜质量进行检查中发现，上海蔬菜中敌敌畏超出标准8 6 倍，菊 醋类农药超出标准4 5 3 倍，甲胺磷在广州蔬菜中的检出率高达4 0 【5 l 。2 0 0 2 年3 月到5 月间，对中国部分蔬菜瓜果市场的抽查发现，在1 1 种8 1 件蔬菜样品中， 农药残留超过国家标准的有4 1 件，其中最为严重的是韭菜和小白菜，超标率分 别为8 0 和6 0 1 5 j 。由此我们可以看出，国内食用农产品特别是果蔬等中的农 药残留污染已经达到了相当严重的程度，长期食用如此品质的农副产品必定对 人们的身心健康构成极其严重的损害。近十年来，我国平均每年发生农药中毒 事故1 0 万人，死亡近1 万人，其中杀虫剂约占8 0 左右的比例，而在杀虫剂中， 又以高毒有机磷农药为主，占9 0 以上i l 。因而对农药残留的检测就显得迫在 眉睫，食品中特别是果蔬等有机磷农药残留的检测是一项重要的检测项引1 2 j 。 1 。2 国内捧关于蔬菜中有撬磷农药残翟限量的要求 国际及豳外先进蔬菜农药残壁拣准是蓬酥食瑟法典委员会( c a c ) 和发达 国家在长期的w t o 贸易规则框架下形成的，是国际农产品贸易市场本射的产 物，符合国际农产晶贸易市场对蔬菜质量安全的需求i l 。 发达国家( 或组织 在制定农药残留标准时，献贸易角度考虑酌因素沈较 多，我国在制定蔬菜农药残留标准时，单纯从生产和安全的角度考虑的比较多， 死乎没有考虑贸易方巍豹因素。壶表l ，l 霹觅，我雹农药残蟹标准与发达蓬家 ( 或组织) 差别较大。在我圈蔬菜农药残留标准中有玛拉硫磷、氧化乐果、对 硫磷、甲胺磷、学拌磷、久效磷、涕灭藏等夕弋种农药新有种类蔬菜要求不褥检 出，这比欧盟、日本等发达圜家要求得还严。 表 中国与主要发达国家大翔菜中农药残警韵标准比较( 辩g k g ) 注：“一”表示没有找到相关的标准，或该国不使用 我国加入世贸组织( w t 0 ) 以来，发达国家对中圜实行“绿色技术壁垒， 使我燃比较具有优势的劳动密集型产晶如蔬菜、水果、茶叶等农产品因不符合 进露阑的绿色条款而遭到退赞、销毁、暂停进日的事件频频发生，据镛计，仪 2 0 0 2 因国外的技术性贸易壁垒尤其是“绿色壁垒”给中国农产照造成的宜接损 失在1 0 0 亿美元左右骥引。这主要是由于我莺的蔬菜生产一觳都是以家庭淹主， 农药使用难以管理，以及在农药残留检测方面，精密昂贵的检测仪器难以推广 使用，释缺少适合现场检测的快速检测方法积仪器等原因，造成了我圈农药残 留监测体系的落后。因此，研究农药残留的快速检测方法，对于保障我国食品 安全昶促进农产品出霞贸易其有重要意义。 2 山东理工大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 有机磷农药 1 3 1 有机磷农药的性质 有机磷农药15 1 ( o 唱a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ，o p s ) 是目前最常用、最重 要的一类农药。我国生产和使用的有机磷农药绝大多数品种为杀虫剂，有些品 种可用作除菌剂、除草剂和脱叶剂。成品剂型有乳剂、油剂、粉剂、喷雾剂和 颗粒剂等。该类农药杀虫效果好，残效期较短，但对温血动物具有一定毒性， 且不同品种的毒性差异较大。有机磷农药品种多，多数属于中毒和低毒，少数 属于高毒类1 5 ，16 1 。其化学通式如下： y r ，o i l p x r2o 。 式中r l 和r 2 多为甲基和乙基，x 为烷氧基、芳香基、卤素或杂环取代基 团。 1 3 2 有机磷农药的种类 有机磷化合物毒性的大小与其化学结构中的r 、x 、y 三个基团的改变有 关。通常按化学结构分为6 大类15 ，1 刚。 1 磷酸酯：是有机磷农药的基本结构。其化学结构为 o i | r 1o 、j j 、p o x r2 0 本组化合物杀虫效率高，发挥作用快，常用品种有敌敌畏( d d v p ) ，对 氧磷( e 6 0 0 ) 等。 2 硫代磷酸酯：磷酸酯结构上有4 个点的氧原子可为硫原子代替。其代替方 式凡以p s 代替p 一0 者为硫逐，凡以p s r 代替p o r 或以p s x 代替p o x 的称硫赶。硫代磷酸酯比原型磷酸酯化合物毒性低。但多数硫 代磷酸酯化合物在体内的代谢顺序是先氧化后降解，氧化后去硫代，毒性升高。 常用的品种有对硫磷、内吸磷等。 3 瞵酸酯与硫代瞵酸酯：凡碳原子与中心磷原子直接相连p c x ，而不是 山东理工大学硕士学位论文第一章绪论 以o 或s 与磷原子相连结者，称为瞵酸酯。硫代瞵酸酯毒性较瞵酸酯低。本 组化合物杀虫作用快，多数有抑制神经靶酯酶的作用。杀虫作用也较快，常用 的品种有敌百虫。 4 氟磷酸酯：其基本化学结构为 o r ，o 、1 1 p f r2 0 。 本组化合物的特点是毒性极大，抑制神经靶酯酶的作用强，现已基本淘汰。 我国从未生产，也不组织进口。 5 磷酰胺与硫代磷酰胺：凡奋一。一x 基的氧原子位点被氮原子所代替者称为 酰胺。酰胺化合物使磷原子位点的阳电荷增强，抑制胆碱酯酶作用强。 6 焦磷酸酯：两磷酸分子缩合的产物成为焦磷酸，焦磷酸酯基本化学结构为 oo r ，o | ii i o r ， ，p o p r 2 0 7、o r 2 本组化合物杀虫作用强，进入人体极易水解。代表化合物为特普，其衍生 物中主要有八甲磷。 1 3 3 有机磷农药的毒理 有机磷杀虫剂大多数为油状体，具有类似大蒜样特殊气味，遇碱性物质能 迅速分解。有机磷农药能通过消化道、呼吸道及完整的皮肤和粘膜进入人体。 所有的有机磷都具有高度经皮毒性，即使属低毒类的敌百虫，也可因小量的持 续吸收而引起中毒。生产性中毒主要是由于皮肤污染和( 或) 呼吸道吸入而引 起的【l 川。有机磷的急性毒性，主要是归因于对胆碱能神经突触后膜上的乙酰 胆碱酯酶( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，a c h e ) 的抑制。 a c h e 能催化其天然底物乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，反应机理为乙酰胆 碱首先和酶的活性部位结合形成一个m i c h a e l i s 酶一底物络合体，酰基转移到 酯酶分子上以形成乙酰化乙酰胆碱酯酶，乙酰化乙酰胆碱酯酶不稳定，迅速水 解使酶复活( 图1 1 ) 。o p s 能够模仿乙酰胆碱与a c h e 作用形成磷酰化乙酰胆 碱酯酶( 图1 2 ) ，但是磷酰化乙酰胆碱酯酶比乙酰化乙酰胆碱酯酶稳定得多， 水解速度很慢，不能使酶复活。由于o p s 与酶的作用速率高于天然底物，因 4 山东理工大学硕士学位论文第一章绪论 此o p s 是a c h e 的有效抑制剂，抑制机制属竞争性抑制。o p s 的毒性也是这样 产生的，a c h e 是昆虫和哺乳动物神经系统的重要组分，其底物乙酰胆碱是神 经冲动传输中的传递介质，神经冲动传输过程中释放大量的乙酰胆碱，乙酰胆 碱只有迅速被a c h e 水解为无活性的乙酸和胆碱，才能保证神经信号在生物 体内的正常传递。当有o p s 存在时，o p s 抑制了a c h e 的活性，使得乙酰胆碱 在神经突触处滞留，神经功能扰乱，机体受到严重的损害【1 7 j 。 9o 。c h 3 ，3 n + c h 2 c h 2 。世c h 3 + e c h 2 。h ：。c h 3 ，3 n + c h 2 c h 2 。c h 3e c h 2 。h 乙酰胆碱 邺丁岁3 c 洲 h 2 0 c h 3 c o o h c h 3 c o o c h 2 e + ( c h 3 ) 3 n + c h 2 c h 2 0 h 图卜1a c h e 和乙酰胆碱间的反应 磷酰化乙酰胆碱酯酶 图1 - 2a c h e 和有机磷农药之间的反应 1 4 农药残留分析方法综述 根据所用试剂及仪器的不同，农药残留分析方法大体上可分为以下两类 1 1 9 2 l 】 1 4 1 仪器分析方法 1 4 1 1 气相色谱分析技术( g c ) 采用气体作流动相的色谱法，用于挥发性农药的检测，具有高选择性、高 分离效能、高灵敏度等特点。用g c 法测定农药的关键是如何选择检测器，理 ho 2 hce ， z s 一 ，i、 一 o i 矿 r ，f、 hohce+z s oi垆风r o 山东理工大学硕士学位论文第一章绪论 想的检测器应具备灵敏度高，稳定性和重复性好，线性范围宽，响应速度快等 特点。如电子捕获检测器( e c d ) ，被广泛用于有机氯农药和其他含电负性较大 原子的农药残留物的检测。氮磷检测器( f p d ) ，主要用于检测含硫、磷类的农 药。 蒋合举【2 2 】建立了毛细管柱气相色谱法测定蔬菜中有机磷农药残留的分析 方法，一次进行7 种有机磷农药残留检测，检出限在o 0 2 3 0 0 4 7m g k g 之间。 p r i e t oa 等【2 3 】用活性炭层析柱进行净化，并用毛细管气相色谱仪测定了15 种 有机磷农药，回收率达7 4 1 1 0 。 1 4 1 2 气相色谱一质谱连用技术( g c m s ) g c m s 是将气相色谱仪和质谱仪串联起来，成为一个整体使用的检测技 术。它既具有g c 的分离性能，又具有m s 准确鉴定化合物结构的特点，可达 到同时定性、定量检测的目的。g c m s 使用于多残留分析，m s 的优点是能在 多种残留物同时存在的情况下。对其进行定量定性分析。仅用g c 检测需用多 个检测g c m s 联用一般只需一次提取和一次g c m s 检测即可。 1 4 1 3 高效液相色谱法( h p l c ) h p l c 的检出限比气相色谱高，是一种传统的检测方法。它可以分离检测 极性强，分子量大的离子型农药，尤其是g c 不能分析的高沸点或热不稳定的 农药可进行有效的分离检测。h p l c 在进行农药残留分析时，一般用c 1 8 、c 8 做填料，以甲醇一已腈等水溶性溶剂作流动相的反相色谱。与g c 相比，h p l c 的流动相参与分离机制，其组成比例和p h 值可灵活调节，这样更有利于分离。 但其只能检测对紫外线有吸收和本身发射荧光的农药，限制了h p l c 的使用。 1 4 1 4 液相色谱一质谱连用技术( l c m s ) 对于极性或热不稳定性农药，不能直接用g c m s 分析。正是由于许多有 机化合物的强极性、热不稳定性、高分子量和低挥发等原因推动了l c m s 技 术的进步。l c m s 可检测具有上述特点的农药。据统计l c m s 可分析的物质 占世界上已知化合物的8 0 以上。内喷射式和粒子流式接口技术可将l c 与 m s 连接起来，已成功地用于分析一些难以用g c 分析的化合物。且l c m s 具 有检测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行和结果可靠等优点。如果对一 种用于毛细管电泳的新型电喷射接口加以改进使其适用于液质联用仪，将可大 大提高分析灵敏度。 1 4 1 5 高效毛细管电泳分析法( h p c e ) 毛细管电泳技术又称高效毛细管电泳或毛细管分离法，是以高压电场为驱 动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度( 或) 分离系数的 不同而进行分离的一项新型液相分离技术。近年来，将液相色谱的固定相引入 毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的分析范围。 6 山东理工大学硕士学位论文第一章绪论 1 4 1 6 薄层色谱 薄层色谱法是利用被检测物经显色后同标准o p s 比较来定性，用薄层扫 描仪来定量的测定方法。由于该法成本低、速度快，易于推广普及，实用性强， 而被一些国家的药典和药品规范所采用。 1 4 2 农药残留快速筛选检测技术 由于仪器分析法检测灵敏度高、选择性好、定性定量可同时进行、结果准 确可靠，因此目前国内外农药残留检测方法应用较多是仪器分析法，其中气相 色谱、气质联用占了很大比例，气相色谱法还被定为中国国家标准农药残留分 析方法。但仪器分析法由于使用实验室昂贵的大型分析仪器，需要依靠专业技 术人员完成分析工作，从采样、样品预处理到分析结果需要一两天时间，因而 常常失去了现场测试以便及时检查及控制的意义，更不利于该法在基层的推广 应用。 而农药残留快速检测技术由于其操作简单、快速，成本较低等优点，已在 中国香港、中国台湾、韩国、泰国、越南等国家和地区得到推广使用1 2 引。根 据反应的原理不同，目前国内外已经实现快速测量的技术可大致分为以下几 类： 1 4 2 1 活体测定法 由于农药与细菌作用后可影响细菌的发光程度，或喂食敏感家蝇，农药残 留导致农药中毒，通过测定细菌发光情况或家蝇死亡率则可以测出农药残留 量，由于该方法使用活的生物，故称为活体测定法。 1 4 2 2 免疫分析法 免疫分析法( i a ) 包括放射性免疫分析法、酶联免疫分析法、荧光免疫 法、免疫胶体金法、多组分分析物免疫分析法、流动注射免疫分析法、免疫传 感器分析法等，最为常用的是酶联免疫法( e l i s a ) 。e l i s a 是以抗原与抗体的 特异性、可逆性结合反应为基础的农药残留检测方法，具有专一性强、灵敏度 高、快速、操作简单等优点，试剂盒可用于大量样品的现场快速检测，定性、 定量准确，但该法对试剂的选择性高，很难同时分离多种成分，对结构类似的 化合物也有一定的交叉反应。 1 4 2 3 酶抑制法 酶抑制法是模拟生物的中毒机理，利用有机磷、氨基甲酸酯类农药专一性 的抑制生物中枢和周围神经系统中胆碱酯酶活性，造成神经传导介质胆碱的积 累而影响正常传导使生物中毒的原理来检测该类农药残留毒性的一种快速筛 选检测方法。酶抑制法的基本原理是： 山东理工大学硕士学位论文 第一章绪论 胆碱酯酶+ 有机磷或氨基甲酸酯类农药呻酶活性被抑制； 胆碱酯酶+ 样本，如活性被抑制则含有有机磷或氨基甲酸酯类农药，如活性不 被抑制则不含有此类物质。 该方法主要包括p h 法、电化学法、胆碱酯酶比色法、荧光法、植物酯酶 比色法。其中胆碱酯酶比色法是目前国内应用最广泛的快速分析方法，已在小 型的快速测定仪上得到了应用，国内已有许多商业化的产品如天津基宏电子技 术有限公司生产的农药残留快速检测仪等，国标g b t5 0 0 9 1 9 9 2 0 0 3 的酶抑 制率法也是采用该反应的原理。该法优点是显色灵敏、测量时间短，可半定量 测定，结果可靠。但目前也存在一些问题，如：样品预处理大多采用振荡提取 的方法，提取效率不高；底物、显色剂等主要试剂要从国外进口，酶的制备复 杂，因此试剂消耗成本仍相对较高，每测一个样品成本约1 元；操作步骤繁琐， 测量条件苛刻( 恒温测量，显色时间要求准确、一致) ；受叶绿素、植物次生 物质的干扰，容易产生假阳性结果【7 4 】；酶和底物不易保存等。因此该法在快 速化、市场化的实现上仍有一定的困难。 1 4 2 4 生物传感器法 检测有机磷农药( 0 p s ) 的生物传感器研究集中在酶生物传感器上，酶生 物传感器( e n z y m a t i cb i o s e n s o r s ，e b s ) 是以酶为敏感元件的一种生物传感器， 主要由识别底物的固定化酶层和与之密切结合的信号转换器组成。 t r a n s d u c e r 一一彳e ： d m t c b e e e c e ( c e ：c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，e e ：电鳗，b e ：牛血 红细胞，t c ：t o r p e d oc a l i f o r n i c a ，d m ：d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ，y 4 0 8 f ：果 蝇变种) 。n u n e s 等1 2 9 j 用取白果蝇突变型、野生型和电鳗的乙酰胆碱酯酶制作 生物传感器，对甲胺磷的最低检测浓度分别为1 4 斗g l 、4 8 肛g l 。1 和5 3 肛g l 。 国内也有关于这方面的大量研究【3 0 3 2 】。 酶的固定是胆碱酯酶生物传感器的关键一步，直接影响着传感器的灵敏 度、稳定性、响应时间、重现性。研制胆碱酯酶生物传感器的前提条件是a c h e 的固定化，即利用物理或化学方法将a c h e 固定在各种载体上。酶的固定化方 法主要有物理吸附法、包埋法、共价键交联法【3 3 】。b o n n e t 等【3 4 】采用物理吸附 法将a c h e 固定在丝网印刷石墨电极的表面。l a r o s ac 等【3 5 】在进行固定化时， 将戊二醛、牛血清白蛋白( b s a ) 及a c h e 在室温下混合制备酶溶液，易使酶失 活。a n d r e e s c u 【3 6 弼j 等采用了聚合体和溶胶一凝胶材料将酶固定在丝网印刷电 极上。国内也有较多的研究【3 9 4 2 1 ，例如余孝颖等【3 9 1 用戊二醛将胆碱脂酶和牛 血清白蛋白共价交联到玻璃电极上，制成酶电极，除测底物乙酰胆碱外，还可 测酶抑制剂一有机磷农药。各农药的检出限和线性范围与它对酶的抑制程度有 关，表现出一定的选择性，辛硫磷的检测限是4 9 1 0 墙m 0 1 l ，敌敌畏是 5 1 0 。m 0 1 l ，叶蝉散是8 5 1 0 巧m 0 1 l 一。 信号转换器是e b s 中把生化反应信号转换成可测信号的元件，反应信号可 被转换为各种信号输出。根据信号转换模式的不同，e b s 可以划分为电化学 e b s 、热学e b s 、光学e b s 、半导体e b s 、声学e b s 等多种类型。其中电化学e b s 9 山东理工大学硕士学位论文 第一章绪论 因为结构简单、灵敏度高、检测范围宽而被普遍采用，在传感器领域中占有重 要地位。将a c h e 固定在金属锑电极表面【4 3 】组成的电位型e b s 对敌百虫 ( t r i c h l o f o n ) 的检测限可以达到0 1 2 1 0 面g l ，响应时间只有1 0 s ；c h o u 曲等 h 4 j 把有机磷水解酶( o p h ) 固定在碳电极上组成了简单的电流型e b s ，最优条 件下对硫磷和对氧磷的最低检测限分别为0 5 1 0 。8m 0 1 l 一和2 1 0 墙m 0 1 l 。 1 4 2 5 化学法 原理是将具有强催化作用的金属离子催化剂，使各类有机磷农药在催化作 用下水解，水解产物与显色剂反应，使显色剂的紫红色退去变成无色。这种方 法操作简单、成本低、检测速度快，通过进一步改善试剂性能，规范测定技术， 可提高检测的灵敏度和准确性。 1 5 本课题研究的内容 ( 1 ) 比较三种不同来源( 家蝇、鲤鱼脑、鸡肝) 的乙酰胆碱酯酶对三种 有机磷农药( 敌敌畏、敌百虫、氧乐果) 的敏感性，选择适合指示这三种农药 的敏感乙酰胆碱酯酶，并研究有机磷农药对不同生物来源乙酰胆碱酯酶的选择 性抑制和影响这种选择性抑制机制的因素。 ( 2 ) 通过试验乙酰胆碱酯酶在不同载体上的固定效果，选出一种适合敏 感乙酰胆碱酯酶固定的载体，并对乙酰胆碱酯酶在该载体上的固定方法和参数 进行研究，优化得到一种最佳的酶固定方案，并检测最优三条件下固定化酶的 使用寿命和储存寿命。 ( 3 ) 对商品化的乙酰胆碱酯酶试剂包进行优化研究。在保证较高灵敏度 的前提下，确定一种更经济的试剂配方，并测定调整后配方对三种常见有机磷 农药氧乐果、敌百虫、敌敌畏的检出下限。 l o 山东理工大学硕士学位论文 第二章酶源选择 2 1 前言 第二章酶源选择 目前，有机磷和氨基甲酸酯类农药快速检测所使用的酶主要为乙酰胆碱酯 酶( a c h e ) ，检测手段是以测定乙酰胆碱酯酶活力被抑制的程度来判断农药残 留是否超标【4 引。乙酰胆碱酯酶作为一种由蛋白质分子构成的生物催化剂，其 主要功能是将神经系统突出部位的传导神经兴奋化学物质即乙酰胆碱迅速水 解为乙酸和胆碱，以维持神经系统的正常生理功能1 4 引。 有机磷农药杀虫的主要机制是抑制昆虫体内乙酰胆碱酯酶的活性，引起神 经系统中毒而死亡j 。动物组织中的a c h e 对有机磷农药具有灵敏度高、反应 专一的优点，因此，动物体尤其是中枢神经系统中a c h e 活性大小常常作为表 征环境中有机磷农药污染状况的生物标志物【4 。 然而，这种方法所用的a c h e 价格昂贵、检测成本高。另外，酶的来源也 是影响酶抑制法检测限的重要因素。不同来源的a c h e 结构上存在一定的差异， 对有机磷农药的抑制表现出不同的选择性。利用这种选择性可以建立检测农药 污染的高效特异方法【3 。因此，不同来源的a c h e 的分离纯化，并研究其对有 机磷农药的灵敏度也是目前研究的热点。很多研究利用植物来源或动物来源 ( 肝脏、血液等) 的a c h e 粗酶液，通过测定酶活力的抑制程度来对有机磷农 药和氨基甲酸酯类农药进行检测【3 0 ，7 0 ，4 8 5 1 】，此外，也有直接应用家蝇头部进行 农药残留检测的报道【5 引。 本研究拟通过比较三种有机磷农药( 敌敌畏、氧乐果、敌百虫) 对三种不同 来源的a c h e 活力的抑制效果，筛选出适于指示这些农药的敏感酶。并研究这 三种酶对三种农药各自的检测限和三种酶对不同有机磷农药的选择性抑制以 及影响这种选择性抑制机制的因素。 2 2 材料与仪器 2 2 1 材料与试剂 酶：家蝇( 讹s c 口如聊p s 咖口) a c h e 购自上海诺亚威生物技术有限公司； 鸡肝粗酶和鲤鱼( 唧厂砌d f 出) 脑粗酶自制。使用前配制成比活相等的酶溶液。 山东理工大学硕士学位论文第二章酶源选择 底物：碘化乙酰硫代胆碱( a t c h ) ，购自s i g m a 公司，用双蒸水配制成浓 度为1 0 0 9 l _ 的溶液。 显色剂：5 ，5 一双二硫代( 2 硝基) 苯甲酸( d t n b ) 购自s i g m a 公司， 称取7 9 2 m g ，溶于1 0 m lp h 值为7 5 的磷酸盐缓冲溶液中，并加入1 5 m g n a h c 0 3 助溶，得到2 0 m m o l l 1 的d t n b 的溶液。 氧乐果( d 朋p ，办d 口地) ，4 0 乳油：敌敌畏( 讲c 办7 d ，v d s ) ，8 0 乳油；敌百虫 ( 删c 办，d r 加力) 4 0 ，均购自山东大成农药股份有限公司。 磷酸盐缓冲溶液：将15 6 9n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 融于7 5 0m l 蒸馏水 ( 0 1 m o l l 。1 ) ，用0 1 m o l l 一的n a o h 溶液调节p h 值至8 o ，并定容到1 0 0 0m l 。 其余试剂均为国产分析纯。 2 2 2 主要试验药品 试验过程中所用主要仪器如表2 1 所示： 表2 1 试验中所用的主要仪器 2 3试验部分 2 3 1 粗酶液的制备 2 3 1 1 鸡肝粗酶液的制备 鸡肝酶：活鸡购自淄博张店金塔农贸市场。将鸡斩首，迅速取出鸡肝。将 1 2 山东理工大学硕士学位论文 第二章酶源选择 鸡肝切碎，去掉筋和筋膜，称重后按l g ：3 m l 加低温蒸馏水，为了防止过快 的凝结，可加入适量的抗凝剂柠檬酸钠或肝素。冰浴条件下在玻璃匀浆器中匀 浆5 m i n ( 8 0 0 0r m i n ) ，在离心机中4 下以8 0 0 0r m i n 离心4 0m i n ，取上清液 ( 记录体积) ，即粗酶液，在4 冰箱内保存，备用。 2 3 2 鲤鱼脑粗酶液的制备 鲤鱼脑：新鲜鲤鱼购自淄博张店金塔农贸市场。将鲤鱼剪开头骨，用镊子 取出脑组织，用滤纸吸去表面的血丝和非脑组织，放入表面皿中称重。然后， 加入预冷的含1 t r i t o nx 1 0 0 的磷酸盐缓冲液( p h = 8 0 ，o 1 m o l l 以) ，在下 冰浴条件按匀浆比1 9 ：3 m l 进行匀浆( 玻璃匀浆器) ，所得匀浆液在4 下离 心( 8 0 0 0r m i n ) 4 0 m i n ，取上清液( 记录体积) ，即粗酶液，在4 冰箱内保 存，备用。 2 3 2 测定指标与方法 2 3 2 1 基础酶活测定 参照e l l m a n l 5 3 j ( 1 9 6 1 ) 的方法，稍做修改。测空白酶活时，将1 0 m l 具 塞比色管洗净烘干，加入3 0 0 m l 磷酸盐缓冲液( 0 1 m o l l ，p h 8 o ) ，加入10 0 l 不同种类的酶液充分混匀3 0 s ，在3 0 下保温2 0 m i n 。然后依次加入1 0 0 “l 显 色剂和2 0 l 底物，再次充分混合3 0 s ，尽快将混合液倒入1 c m 比色皿内，在 4 1 2n m 处比色。选择某一时刻作为零时刻，记下吸光度值作为初始值，记录 3 m i n 内吸光度的变化值。则酶活力定义为每m l 酶溶液每m i n 水解底物的“m o l 数，即： 酶活力( p m o l m i n m l ) = 彳1 0 6 ( v k 三) 式中彳吸光度随时间的变化率( m i n ) 卜酶活力测定时所取酶液的体积( m l ) ，v = 0 1 0 艮一消光系数( l m m 0 1 m m ) ，k = 1 3 6 三测定酶活力时溶液的光径长度，( 1o m m ) 卜反应体系的总体积( m l ) ，v = 3 2 2 2 3 2 2 酶活抑制率测定 农药对a c h e 抑制后酶活力的测定方法与酶活性的方法基本相同，只是在 加入1 0 0 h l 酶液后，再加入2 0 p l 浓度分别为1 0 、5 0 、1 0 0 、3 0 0 、6 0 0 、1 0 0 0 g l 。1 的农药溶液。在没有农药存在时，底物的水解速率用吸光度值随时间的变化率， 即空白斜率以翰表示：当有农药存在时，体系的反应速率，即农药斜率以缸 山东理工大学硕士学位论文 第二章酶源选择 表示，则酶活抑制率按下面的公式计算： 】，：鱼些1o o k o 式中杨一空白斜率 幻一农药斜率 2 3 2 3 酶活稳定性 测定三种酶的空白斜率硒，每种酶测定1 0 组，计算其标准偏差，标准偏 差越小，酶活稳定性越高。 2 3 2 4 反应显色时间 通过比较三种酶的最长线性反应时间，验证三种酶在检测时间为3 m i n 是 否满足线性测量的要求。 操作方法：于试管中加入3 o m l 磷酸缓冲溶液，然后加入1 0 0 l 酶液和 1 0 0 p l 显色剂，3 0 恒温水浴锅中保温2 0 m i n 后加入2 0 u l 的底物摇匀，立即 倒入比色皿中于4 1 2 n m 处测定吸光度值随时间的变化趋势，直到吸光度有明显 的线性偏差。对测量数据进行线性回归处理。 2 3 2 5 酶活保存性能 取比活相等的三种乙酰胆碱酯酶于4 保存，分别测定保存1 2 0 天内的 的胆碱脂酶活力，每两天测定一次，比较三种酶的保存性能。 2 4 结果与分析 2 4 1 三种酶的酶活稳定性 分别用比活相等的三种酶溶液进行酶活稳定性试验，其测定结果如表2 2 所示。 由表2 - 2 可以看出，家蝇a c h e 酶活力的标准偏差小于鲤鱼脑a c h e 和鸡 肝a c h e 的酶活力。因此，家蝇乙酰胆碱酯酶的活力离散水平低于另外两种。 所以，家蝇a c h e 的酶活力的稳定性高于鲤鱼脑a c h e 和鸡肝a c h e 。 1 4 山东理工大学硕士学位论文第二章酶源选择 2 4 2 三种酶反应显色时间的对比 三种酶反应显色时间测量数据进行线性回归处理，结果如图2 1 、图2 2 和图2 3 所示。 蜊 米 螫 o 68l o 图2 1家蝇a c h e 空白溶液吸光度随时间的变化 2 8 6 4 2 8 6 4 2 o l 1 1 l o o o o 山东理工大学硕士学位论文 第二章酶源选择 瑙 米 整 、 魁 米 签 024681 0 图2 2鲤鱼脑a c h e 空白溶液吸光度随时间的变化 024681 0 时间m i n 图2 3鸡肝a c h e 空白溶液吸光度随时间的变化 由吸光度时间趋势图比较可知，家蝇a c h e 的吸光度在9 m i n 时开始有 较明显的向下弯曲趋势；鲤鱼脑a c h e 在6 m i n 时开始有较明显的下降；而鸡 肝a c h e 在7 m i n 时开始有较明显的下降。三种a c h e 空白样品的吸光度 时间曲线在6 m i n 中内均能保持较好的线性相关( 相关系数分别为o 9 9 9 4 、 0 9 9 8 7 和0 9 9 6 7 ) ，这说明6 m i n 内底物和显色剂已经基本反应完全。农药残留 分析的吸光度读数时间为3 m i n ，因此，即使分析人员在操作技术上不够熟练， 但只要在加入显色剂后6 m i n 内将比色皿放入比色池中并读数，就能准确地进 行测量，因此，三种a c h e 在反应显色时间上完全可以满足测试的要求。 另外，家蝇、鲤鱼脑、鸡肝乙酰胆碱酯酶的相关系数分别为：0 9 9 9 4 、0 9 9 8 7 1 6 8 6 4 2 1 8 6 4 2 o 1 l 1 1 o o 0 0 8 6 4 2 8 6 4 2 o 1 1 1 l 0 0 o 0 山东理工大学硕士学位论文 第二章酶源选择 和0 9 9 6 7 ，说明家蝇乙酰胆碱酯酶的吸光度时间的相关性好于其余两种， 更能满足农药残留分析的需