（临床兽医学专业论文）粮食、饲料中蛋白质含量测定方法的研究.pdf

孛交擒簧中文摘要蛋鑫鹱是粮食、键料釉食晶中赞重要蓄养残努，对辘捧熬生长、发育具有不可替代的作用，但某些饲料、食品生产企业为了降低成本，向产品中添加非蛋良含氮物质冒充高蛋白产品。这种低蛋囱饲料一方面影响动物生长，另一方面是危害畜禽健康并进藤严重影响人类食品卫生安全。圉蘸，测定粮食、饲料以及食品筹蛋皇质含量的匿家标准方法为凯氏定氮法，其最大缺点是将样品本身含有或添加的非蛋白含氮物与蛋自质中的氮一同测出并换算为蛋裔质，结果使含菲蛋自氮祥晶测定毽魄蛋鲁质实际含量瞬显偏高。解决该闻题戆途径是建立一种不受菲蛋白氮等箕它爨素干扰、能够准确测定样品中蛋臼质的方法来取代或作为凯氏定氮法的补充。本研究通过比较目前各种测定蛋囱质方法的优缺点，建立种能够简捷、灵敏、准确地测定粮食、饲辩帮食暴中蛋自鹱麓方法。研究主要包括以下蠹容：确定各种比色法稳定性和线性范围，干扰因素对测定方法的影响，样品前处理最馒消化条件，干扰物对消化样品测定的影响，并用凯氏定氮法对建立方法的验证。确定了大米、玉米、大豆、瑟粉、玉米秸秆、营蓿于革块、火腿、鲜巍等不同样品消化的最佳温度、n 姻h 浓度、时阉、样鼎稀释倍数等。最佳消化条件是：称取粉碎样品o 3 9 ：n a o h 浓度为1 om o l 几( 面粉采用o 2 5m o 此除外) ：消化温度为水浴5 0 ；消纯时间为面粉0 5 h ，大米粉、玉米粉、鲜离、火腿等l h ，大豆粉殛，营蓿于莘、玉米秸群4 h ；耩器倍数除大豆l o 倍外，其它均为5 0 0 倍。按照上述消化条件用l o 州法进行实际样品测定，结果与凯氏定氮法测定结果比较基本吻合，符合度从9 5 2 ( 大豆) 至1 1 0 ( 玉米) 不等，其它大多数种类样暴接近l o 嘲。添加干扰试验表明，菲蚕皇含氮物中三聚鬣胺、硫酸铵、尿素、生物蛋白精添加浓度3 3 3 。3 9 瓜g 仍无干扰作用。缩二脲添加浓度6 6 。7 9 l ( g 无干扰。氯化钠、蔗糖、柠檬酸钠、维生索c 、维生素b l 、肌醇、多种氨基酸( 酪氨酸除外) 等在添耱常规焉量数倍不产生葫显干扰。实验结果表黢，l o 唧法具有灵敏度毫、结巢篦较准确、不受大多数干扰物影响，操作简便、适合大量样品测定等优点。本研究建立的样品碱消化、l o 哪法可以作为粮食、饲料及食品中真蛋臼质的铡定方法，对防止添热葛蛋鑫含氮物冒充蛋盎质具有积极鲍 誊角。关键词：粮食；饲料；蛋白质含爨测定；l o w r y 法；凯氏定氮法：三聚氰胺里堡丝a b s t r a c ti h ep r o t e mc o 枷b u t e ss u b s 锄i a l l yt 0 a na n dt l l ea i l i m a l ，sg r o w 也a 1 1 dd e v e i o p m e n t ，a n dnp l a y s 姐m p l a c e a b l er o l e 1 1 1o r d e rt 0r e d u c ec o s t s s o m em a j l u f a c n l r e sp r o d u c i i l gf e e do rf o o da d de x c e s s i v en o n e s s e n t i a lm 仃o g e n - c o n t a i n i n gc h e r i l i c a js u b s 切n c e s t 1 1 ed e t e r n l i n a t i o nr e s u l ts e e mt 0b et h es 锄p l ep r o t e i l la c 删c o m e 鸭b u ti ti sa c t u a l l y1 1 i g h e rt l mt l l e i rp r o d u c t sp r o t e i nc o n t e n t t h e s ek i i l do fl o w 。p r o t e mp r o m l c t s1 1 0 to m y 龇rm ea 血m a l sg r o w t l l ，b u ta l s od oh 锄t 0t 1 1 ea n 觚a l s h e a l t l la n de v e nh u n l a nf o o ds 疵够。a tp r e s e n t ，t h en a t i o r l a ls t a n d a r dm e t h o d 均e l d a l l li su s e dt 0d e t e 肋i n ep r o t e i nc o m e n ti nf o o da i l df e e da s 、e l la sg r a i n s a c c o r d j n gt 0i t st l l e o r y ，t l l ed e t e m i l l a t i o nr e s u ni s0 b v i o u s l y1 1 i 曲e rm a n 也a to ft h es a n l p l ep r o t e i l la c t l l a lc o n t e n ti fs 锄p l e sm c l u d en o n p r o t e mn i 仃0 9 e n 。c o n t a j n i n gc h e 耐c a js u b s 锄c e s m ss h o r t c o m 崦r e s u l t sma 、r o n gv a l u a t l o no ft 1 1 e s ep r o d u c t s q u a l i t i e s t h ew a yt os o l v et 1 1 ep r o b l e mi st oe s t a b l i s ham e t h o d ，w 1 1 i c hc a n tb ei n t e m u p t e d 、h e nd e t e n n i n et h es 锄p l e se v e ni ft 1 1 e yc o m a l nn o n 。p r o t e mm t r o g e n 。c o n t a i l l i n gc h e m i c a js u b s t a n c e s a tl a s t ，、v ec 锄t a k et 址sm e m o da sas u p p l e m e n t0 rr 印l a c e m e n to f k j e l d a h li l lt h j ss t u d y ，b yc o m p 撕n gt 1 1 ec 眦e mm e m o d so fp r o t e i nc o h t e n td e t e m i n a t i o i lt i l ea u t h o re s t a b l i s h e sas h p l e ，s e n s i t i v ea i l da c c u r a t ed e t e 肋i n a t i o n0 fp r o t e i i l 抽f o o d觚dt e e d 雒w e l l 船伊a i l l s t h e s es t l j d ya s p e c t sa r ea sf o l l o w s ：t h ei d e n t i f i c a t i o no fs 切b l l i 够a n dl i l l e a rr a n g e ；h t e 疵r e n c et od e t e n n i n a t i o nm e t l l o d ；t l l eh p a c tf a c t o r so ns 觚1 p l ep r e 。t r e 咖1 e ma 1 1 d 廿1 eb e s td i g e s t i v ec o n d i t i o n s ；i n t e 疵r e n c eo fm es a n l d l ep r o t e i nd e t e n i l i l l a t i o n ；v e r i 母e s t a b l i s e n tm e 也o du s 吨垧e l d a h l 。i1 1 ea u m o rh a si d e n t i f i e dm e 1 eb e s td i g e s t i v ec o n d i t i o i l so fd i 饪e r e n ts a 力叩j e s ，s u c ha l sn c e ，c o m ，s o y b e a i l ，w h e a tf l o 峨c o ms t r a w a l f a l f ah a y ，h a m ，厅e s hm e a t t h ed i g e s t i v ec o n d i t i o l l si 1 1 c l u d et l l et e m p e 魁t u r e ，n a o hc o n c e n t r a t i o n ，t i m e s a n l p l e sd i i u t i o ne t c w h e ns 锄p l e sw e i g h to 3g ，t h eb e s td i g e s t i v ec o n d i t i o n s ：w a t 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i v ec 。n c e n t r a t i o ni s3 3 3 。3g 埏ab i u r e tc o n c e n t r a t i o n6 6 。7g ，趣i sw i m o u ti n t e r f e r e n c e 。s o d i u mc h l o d e ，s u g 越s o 蠢豫e i 潍e ，v i t a m 遮c v i 豁m i n 鸯l ，i n o s i 稔l ，av 越i e 玲o f 勰i n oa c i d se x c c p l 怒f移筠s i 鼗e 醚d i 鑫gc o 毪v o 魏基。嚣a 至d o s a g e v e 毂s o v o r 8 lt 主趣e sh a v e 撼te l e 封i 蛾烈蠹r e n e e 。我l e 聪s 议招s 蛔一w e d 也a t ，l o w 秽m e 也o dh a sh i 曲s e n s i i i v i 织m o r ea c c u r a t er e s u l t s ，i i t t l ei n t e 疵r e n c ea n di ti sa l s oac o n v e n i e n tm e m o df o rd e t e n l l i n a t i o no fal a r g en u l n b e ro fs 躺p l e s 凳l ee 熊南l i s m e n to f 壤e 己o w 帮礅蕊o d 毒od 。专e f m i 黜t es 鞠华l o ss u 蘸鑫s 孙o d ，凳e 莲麓嚣鑫g r 鑫遮p 国d u e ei d e 窿羚s u i 终，e s p e e i 蔹l y 强辫霉v e 瞧n 暴鑫强巾捃遮婆蛰鑫暇i n s 姥勰o fr e 俎p r o d u 烈e n 啦，t h em a r k e t k q ，w o r d s ：f o o d ，f e e d ，p r o t e i nd e t e r m i n a t i o n ，l o w 搿，k j e i d a h l ，m e i a m i n e符号说明英文缩写英文f d au v sh p l cl o w 搿m e 氆硼b f a d f o 堪m e t h o dc b b g - 2 5 0b c a蜀e l d 馥l转s ao v ac a s e i nm e l a m i n e( n k ) 2 s 瞳c o ( n h 2 ) 2c 2 h 5 n 3 0 2v b lv cs d se d t al - c y sn a ! 。hn a c l1 1 r i s1 r i t o nn a 2 s 2 0 4烈4 强瓯h 3 p q fc u s 0 4 - 5 h 2 0符号说明o 畦艄dd 壤a d 嫩i s 拉a 幻建u l 协a v i o l e ts p e c 虮m lh i g hp e m m 锄c el i q u i dc h r o m a t o 鲫h y& l i np 酝n o lm e l 斓c o o m a s s i eb r i l l i a mb l u eg 2 5 0b i c i n c h o n i n i ca c i d圣江i s h i d i n 鲥a nb o v l 羹es e 灌撼a 羯驻爨汛o v a i b u m i l lc a s e i ni 谭e l a l t l i n e叠攥瓣。曩i 鞋l 疆s 珏l 触u r e ab i u r e tt h i a m i n eb ( v i 铷i nb 1 )鑫s e o r b i e l c l 莲s o d i u ml a u 拶ls u l f a t ee t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d1 a e v 0 - c y s t e i n es o d i u mh y d r o x i d es o d i u mc h l o 蛀d e( 2 - h y d r o x y m e t h y l ) - a m i n o m e t h a n et - o c 妙p h e n o x y p o l y e t h o x y e t h a n o ld i s u l 允r o u sa c i dd i s o d i u ms a l tp o t 鑫s s i h 燃s o d i 毪瓣镪穗镶ep h o s p h o “ca c i dc o p p e r ( i i ) s u l f a t ep e n t i h y d r a t e中文名称( 美嚣) 食晶药品管理局紫外分光光度法高效液相色谱幻哪法，福秫一酚法考马凝亮蓝法考马斯亮蓝g 一2 5 0二辛可酸凯氏定氮牛血清皇蛋自卵清蛋白酪蛋白三聚氰胺硫酸铵尿素缩二脲盐酸硫胺素抗坏盎酸十二烷基硫酸镳乙二胺四乙酸左旋半胱氮酸氢氧化钠氯化钠三羟甲基氨基甲烷聚乙二醇辛基苯基醚二亚硫酸钠溪石黢钾镳磷酸五水硫酸铜符号说明塑n a 2 w 。4n a 2 m o ( kn a 2 c 0 3 i gm gg蚝此m ll弘g ，m lm g lm o l 乙羲m l nr 加i nd t t乃错e 埘鸯l sc a se c rf 乙众s 翻i u 辩n n g s 锯t es o d i u mm o l y b d a t es o d i u mc a r l ) o n a t em i c r o g r a mm i l l i g r a m舯k i l o g r a mm i c r o l i t e rm i l l i l i t c rl i l e fm i c r o 影a 打l ，m i l l m t e rr n i l l i g r a i l i t e rm o l ep e rl i t r e魏o 珏ff n i n i 据r o u n dp e rm i n u t e1 ，4 - d i t h i o t h r e i t o l骶i f l u o r o a c e t i ca c ( 1h e x 鑫d o e y l 撼m e 凌y l a 糙掇o n i 娃激b 约糙i d ol y o 订0 p i c r j e sc h r o m e a 2 = u r o lse r i o c h r o m ec y a n i n er翁l 】攫s c 锄l 霸e钨酸钠锻酸钠碳酸钠微克毫克克千克微升毫升舞微克每毫升毫克每升摩尔每升小时分钟转每分钟二硫苏糖醇三氟乙酸+ 六烷基三甲基溴化铵感胶离子序列铬天青s依来铬青r荧光胺声明与授权扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导f 独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：起彳遗、签字日期：加器年月f 日学位论文版权使用授权书4本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文作者签名：娥、签字日期：ng 年f 月抄日导师虢孑绺签字日期：夕浑彩月乡日赵书景：粮食、饲料中蛋白质含量测定方法的研究三1 选题背景第一章前言帚一早月i ji蛋白质是粮食、饲料和食品中的重要营养成分，对机体的生长、发育具有不可替代的作用。反刍动物瘤胃内微生物将饲料中的大部分蛋白质和含氮化合物分解为氨，再利用氨合成菌体蛋白，菌体蛋白质进入后段消化道被吸收利用，因此反刍动物饲料中补充一定量的非蛋白含氮化合物可以部分节省饲料中的蛋白质。然而，氨化物并不能被单胃动物( 如猪、禽等) 利用，给非反刍动物添加非蛋白含氮化合物或给反刍动物添加过量，一方面会发生氨中毒，另一方面这种非蛋白含氮物质冒充蛋白饲料使动物得不到足够的蛋白质供给，出现营养障碍，最为令人担忧的是污染动物性食品，危害人类健康。然而，当前蛋白原料存在着较为严重的掺假现象，植物蛋白粉的掺假现象也较为普遍。2 0 0 7 年3 月中旬以来，美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件。美国食品药品管理局( f d a ) 调查发现从江苏徐州安营生物技术开发公司和山东滨州富田生物科技有限公司进口的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出三聚氰胺，并初步认为宠物食品中含有的三聚氰胺是导致猫、狗中毒死亡的原斟。三聚氰胺( m e l a n l i n e ) 是一种氮杂环化合物，分子式c 3 n 6 h 6 ，分子量1 2 6 1 2 ，来源自石油或煤炭的有机化工原料。主要作为浴缸、粘合剂、餐具等塑料制品的生产原料，还会添加到化肥中。三聚氰胺如果被加热，就会产生毒性物质氨成分i 引。美国f d a 禁止在食品、饲料中添加三聚氰胺。为此，5 月8 日国家质检总局正式通报了近期美国调查发现的我国出口美国植物蛋白生产企业涉嫌违规添加三聚氰胺问题的调查结果。另据f d a 透露，一些州的猪和鸡也被喂食含有三聚氰胺的饲料，美卫生官员目前正在调查，这些猪和鸡是否进入了人类的食物供应链【3 l 。报道称出现猪只污染事件的农场位于北卡罗来纳、南卡罗来纳、加利福尼亚、纽约和犹他州，俄亥俄州相信也受到影响，密苏里州则有一个养鸡场受到调查。当局已隔离数以千计的猪只，并为它们进行检验。另外，还有关于在植物性饲料中添加尿素、硫酸铵等非蛋白氮化合物以提高检测蛋白质含量的报道。饲料生产企业在动物饲料中添加三聚氰胺、硫酸铵等非蛋白氮化合物是因为这样会提高饲料中蛋白质的检出量，从而使饲料价格也得到提高。因而，某些饲料甚至食品生产企业为了降低成本，向产品中添加非蛋白含氮2一扬州大学硕士学位论文物质冒充高蛋白产品。这应当引起人们的重视。兰聚氰胺的检测方法主要是高效液相色谱法，如2 0 0 5 年吴明礼、陈彩虹等利用高效液相色谱法( h p l c ) 测定单氰胺中三聚氰胺的含量洚】。但应用该方法排除进出弱饲料、粮食中三聚氰胺掺假造成的蛋自质含量升高现象时，操作比较麻烦，成本较高。因此，通过排除三聚氰胺对蛋白质含量的影响，选择一种可以直接测定粮食、饲料中蛋白质含量的方法显的特别重要。舀前，测定谷物、粮食、饲料以及食品等中的蛋白质含量的方法，园标和相关行业标准一般均采用凯氏定氮法。如g b 厅5 0 0 9 。5 一1 9 8 5 和g 8 玎5 0 0 9 。5 2 0 0 3 食品中蛋白质的测定，g b 2 9 0 5 一1 9 8 2 谷类、豆类作物种子粗蛋白测定法，g b 6 4 3 21 9 8 6 和g b 厂r 6 4 3 2 一1 9 9 4 饲料蛋白质测定法，s n 厂r0 8 0 0 3 1 9 9 9 进出口粮食、饲料粗蛋自质检验方法等等，与美国f d a 规定的用于营养标签的法定蛋自质分析方法基本相同。凯氏定氮法仍是目前食品中粗蛋白测定的最主要甚至是唯的方法。该方法最大的问题是如果样品中存在非蛋白含氮物时，一同被蒸馏而测出并折算成了蛋自质，严重影响蛋自质测定结果。磊翦还没有“适焉于添加无枫含氮物质、有机非蛋自质含氮物质的食品测定的方法。因此建立一种准确测定粮食、饲料中实际蛋白质含量的方法已成为当务之急，以杜绝添加非蛋白含氮物质冒充高蛋白产品。2 蛋白质测定方法概述样品中蛋自质含量是衡量其营养价值高低的一项重要指标，因此有关蛋白质的分析检测对于人和动物健康来说尤为重要。目前囡内外所采用的检测方法主要有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲分光光度法、l o m y 法( f o i “酚试剂法) 、二辛可酸比色法( 8 c a 法) 、b r 纛拯穗法黛；马斯亮蓝法) 、荧光光度法、电流法【涸、毛细管电泳分析法、罗丹明生物探针法以及高效光谱遥感技术分析法等【7 】。下面就常用的几种检测方法分别作简单介绍。2 1 凯氏定氮法测定爱鲁质最常用的方法是凯氏定氮法( 瑙e l d 硅1 ) ，它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。测定的原赵书景：粮食、饲料中蛋囱质含燕测定方法的研究兰理是：蛋白质是含氮有机化合物，样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解出的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氮游离，餍硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数i 即为蛋自质含量【引。该法关键环节有浓硫酸用量、催化剂选择、消化时间、氢氧化钠用量和硼酸吸收液指示剂选择等嘲。样品在消化时加入的浓硫酸必须过量，一是脱水作用，将样品中有机物脱水然后碳忱成c ；二是氧化作用，浓硫酸彝硫酸钾、硫酸镳一阕加热使温度达到4 0 0 以上，碳还原硫酸生成s 0 2 ，而碳本身被氧化成c 0 2 ；三是分解作用，将蛋白质分解，s 0 2 还原n 生成眦，本身被氧化成s 0 3 ；四是吸收作用，生成的n 臣+ ，与浓硫酸反应生成( n h 4 ) 2 s 0 4 | 溺。提高分解时溶液的温度，使溶液沸点由2 9 0 提高到o ，加入硫酸铜、氧化汞和硒粉则能促进试样的分解，缩短消化时间。有试验证明，用硒粉作催化剂可加快消化速率，缩短试样消化时间，其测定结果与硫酸铜作为催化剂的传统方法相当吻合瑟疑，但硒粉使用量过多或与硫酸作用时间过久会使铵态氮成为分子氮丽损失【1 2 1 。虽然加入氧化汞能够节省消化时间，但由予污染较重，多用于仲裁检验【1 3 】。目前包括国标方法在内的大多数方法是加入硫酸钾和硫酸铜混合催化剂，但众多文献中二者用量的比例有所不同，硫酸钾：硫酸铜比例主要有1 5 ：l 、1 0 ：l 、1 9 ：0 9 和9 ：l 等f 8 或1 3 舶】，国标方法采用l o ：l 比铡，硫酸铜雳量是影响消化时闻的主要因素【1 5 】。自动凯氏定氮分析仪也是根据传统凯氏定氮的原理，不过分析过程实现了自动化，如予雯用全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质珏q 。g b 厂r5 0 0 9 5 2 3 ：修订时增加了比色法作为第二法，即样品经凯氏消化后不需蒸馏，菰是通过铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3 ，5 二乙酰2 ，6 二甲基1 ，4 二氢化吡啶化合物，在4 0 0 l 珧波长下测定吸光度，与标准管参比计算出氮含量，然后折算成蛋白质含量，操作步骤有所简化。此法较常规或改龟凯氏定氮法具有快速简便、精确精密、准确、灵敏度高等优点，且所用的消化设备简单易推广，但此第二法同样不能解决非蛋白含氮物的干扰问题，因此该标准特别作了“不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定”的说明。觊氏定氮法操作比较复杂，操作过程中容易孳| 入导致结莱偏差麴不稳定蠢素( 如试样消化是否完全、催化剂用量是否适当、消化液转移是否完全、接收瓶处理是否干净等) ，这些因素在安国民等测定饲料中粗蛋白质含量应注意的几个问题中已经傲了详细说明瓣”。另外，对于含有大量碱性氨基酸的蛋白质利用凯氏定氮4一扬州大学硕士学位论文法测定结果偏离。凯氏定氮法是舀前食品、饲料中粗蛋自测定的标准方法，在食品、饲料中粗蛋自质含量测定方面应用广泛，如中华人民共和国标准g 转愿1 4 7 7 1 9 3 f 1 8 】，张玉葵等凯氏定氮法测定牛乳中蛋白质含量的方法f l9 】等，此外，杨翠英等对凯氏定氮法进行优化，采用带回流管的测砷瓶消化样品，改进蚤白质样品的消化速度，即满足了样品消化过程串对消化液回流与微沸的要求，又可以采用电热板砂浴消化，实现一次阉时消化多个样品的圈的；测砷瓶消化过程中可以摇晃，回流管比较细，缩短了消化时间，减少了取样量，同时也减少了试剂用量和消化过程中酸雾对周围环境的污染】。将消化好的样品用于测定，精密度和准确度均符合要求。夏道宗等采用过氧化觊氏定氮法焉一定比例的过氧化氢硫酸混合液为消化试剂，消化迅速( 一般样品消化少于8 m i n ) 比常规凯氏法快l o 2 0 倍，且省去了常规法必需的蒸馏步骤，大大提高了分析效率口1 1 。有人通过微波消解法处理样品，进行凯氏定氮，如牛江梅对微波消解凯氏定氮法测定食品中蛋自质的方法研究【2 筋。还有人通过改进凯氏定氮法的消化装置来提嵩消化速度，如黄梅兰等对凯氏定氮法消化装置的改进i 驯。然而，无论是常规或改良的凯氏定氮法，其蛋白质分析过程均包括碳化、消佬、蒸馏、滴定等步骤，操作繁琐，试剂消耗量大，耗时长( 需4 5 h ) ，而蛋白质测定仪价格昂贵，且露专门试荆，遴难普及。因此，该方法不适合用于大量样品强白质含量的测定，一般只做为其它方法的验证方法。2 2 紫外吸收法蛋自质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基的苯环含有共轭双键，使蛋自质具有吸收紫外光的能力。特征吸收峰在2 8 0 娥波长处。各种蛋自质中都含有酪氨酸，因此在2 8 0 i 吼具有吸光度是蛋白质的一种普遍性质。在定范围内，蛋白质溶液在勰o 姗的吸光度与其浓度成正比，因此可用于蛋白质定量测定。最常用的紫终吸收法是2 8 0 潍的光吸收法。含有核酸杂质的蛋白质溶液使用2 8 0 嫩和2 6 0 呲的吸收差法较好。蛋白质的稀溶液采用2 1 5 嫩与2 2 5 啦的光吸收差法，该法在蛋白质浓度2 0 1 0 0 “g 范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比。o 1 m o 阢氢氧化钠和乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的。2 1 5 胁光吸收值较大，必须将其浓度降到o 。5 趣。沈以下才无显著反应矧。肽键测定法比2 8 0 姒光吸收法灵敏，但多种有机物如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧赵书景：粮食、镄料中鬣瞧蕨禽量测定方法的研究兰化物等都有干扰作用，所以最好用无机盐、无机碱和水溶液进行测定f z 4 1 。紫外吸收法篱便、灵敏、快速，不清耗样燕+ ， 氐浓度盐类不干扰测定辫l ，因此，在蛋自质和酶的生化制各中( 特别是在柱屡橇分离中) 广泛应用。毽在测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的强自质，有一定的误差。如果样品中含有噪掩、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰箨弼。核酸在紫外区氇有强吸收，但通过校正可以消除1 2 ，2 4 l 。2 ，3 双编艨法双缩脲( n h 2 c 饼叮h c o n h 2 ) 在碱性溶液中能与c u 2 + 产生紫红色络合物，这一反应称鸯双缩脲( 8 i 氆锐) 反应。蛋自震分子串含有两个以上肽键，函此有双缩骤反应，溶液紫红色的深浅与蛋盎质含量在一定范基虑符合朗馋比尔定律，焉与蛋鸯质的氨基酸组成及分子量无关。当脲加热至1 5 0 1 6 0 时，可由两个分子间脱去一个分子氨而生成二缩脲f 也翼罐双缩脲。双缩骤与碱及少量硫酸锅溶液作用生成紫红色麴配合物，就反应称为双缩脲反应：由于蛋白质允予中含有肽键q o n h 与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，凡含有一个肽键和一个c s n h 、c r m 姐2 、- c 翘寸鞭2 一c 粼逊- e h 2 0 鞭、一c h o h c h 2 0 h 、* c h 0 l 一c h 峦i h 及乙二酰二乙胺等物震也畜此反应。在一定条 孛下生成紫红色配合物的颜色深浅与蛋囱震含量戚线性关系。蛋白质浓度越嵩，体系的颜色越深，据此可用吸收光度法测蛋囱质含量。该配合物最大吸收波长为5 6 0 1 1 i n ，将来知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋自质溶液溺时与取缩朦试裁反应，并于5 6 0 蝴院色，可通过标准浓度蛋自质绘制的标准蛙线，求褥未知样暴蛋白鹱的浓度。0 珏o 瓣lf潮2h 2 岬广h 2 k o 喊如鼽o 夕唧c i 增阻攘h ，-鞭珏鞋拜烈毹越0 oc。c脚旬、髯h 2等h 史2筏a 蜒：鹣ll溅耀对于脂肪含量较高的样燕，脂浊对双缩滕法测定总蛋自的干扰早为人们所知，脂浊越明显，干扰越大。杨爱华将双缩脲试剂由单试剂改为双试剂方法。双试剂6一扬州大学硕士学位论文配制，第l 试剂为不会硫酸铜靛双缩躲空鑫试剂，第2 试翔系将单试剂中的硫酸铜增加l 倍，二者等量混合即成单试剂。结果显示双试剂型双缩脲法在不改变单试剂法测定原理，保留其优点的基础上，能克服脂浊、色素等的干扰，鬃有穰好翰准确度和耩鬻度，显适合于囊动分耩翟捌。徨该方法新需试裁及仪器要求条释较高，聪蘸尚不能推广使用。有文献报道用乙醚抽提能解决腊浊于扰，但操作繁琐1 27 1 。也有研究人员将双缩脲试剂中的n a o h 换成k o h ，来排除其干扰【2 8 1 。对于新鲜肉样食品，血红鬣白中的珠蛋自与双缩脲试帮起反应，其中的血红素在碱性条件下形戒豹碱纯蛊红素也产生嵩吸光度，从蓊干扰总蛋叁测定，因此将肉样去除血液，清洗于净，可以减少其对总蛋白测定的干扰。本法操作简便，迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，可快速测定蛋毒质含量潮。西前利用双缩脲法测定食品中蛋鑫质含量的报道穰多即引。该方法测定范鬓为l 2 慨g 蛋叁质，灵敏度低，一般适用予需要快速，但精确度要求不高的蛋白质禽量测定【2 4 l 。2 。4l o w 翠法l o w y 法亦称改良福林酚试裁法。福林酚试藕法( l i nm e 凌o d ) 剥惩福拣一嚣奥卡特试剂( f o l i 臻c i o e 鼓舞珏羚鑫g e 鞋1 ) 或称酚试剂( “p k n o l 沁a g 鳃t ) 与蛋自质作用呈现蓝色而进行比色测定聊j 。酚试剂含磷钼酸与磷钨酸，与酚类如酪氨酸及某些菲酚类物质如半胱氨酸、色氮酸等作用时被还原而呈现磷镭蓝及磷钨蓝的蓝色。由于蛋自质氨基酸组成不阕，景色亦有差异，这是禳栋酚试裁法的缺点。l 鳄1 年b 嘲等将该法与双维脲法结合进行了改良，是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应【3 5 1 。其中包括两步反应，第一步是在碱性条件下蛋白质中的肽键与铜试剂起显色反应，生成蛋囱质铜络合物；第二步是蛋白质镉络合物主的酪氨酸和色氨酸等芳香族菱基酸残基将磷锾酸磷钨酸试荆 酚试剂还原，生成深蓝色的化合物，其颜色深浅与蛋白质含量呈难相关。凡是干扰双缀脲反应的基团，以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均干扰此反应【l 引。还原性物质如某些巯基亿合物及糖类均有干扰。由于双缩脲法系利用肽键在碱性条件下与铜离子络合显色的反应，此反应与铜离子配位结合豹氮原予为亳子供给体，起还原剂翡作用。因此，甘油能显色应作空白校芷【3 6 】。在蛋白质溶液中硫酸铵超过o 1 5 时，显色反应会有所降低1 3 ”。l o 嘲法较觊氏法简单，基灵敏度高，广泛应用子永溶往蛋宣震含量的测定。赵书景：粮食、镯料中蛋白质禽量测定方法的研究三l o w 法先用碱性铜溶液处理蛋白质，然后加入酚试剂，所显颜色较单用酚试剂时增加3 5 倍，灵敏度为双缩脲法的0 倍，肽键显色效果增强从而减少了因蛋自质种类引起的偏差p 引，由蛋白质不同所引起的显色差异减少。该法由予两步呈色反应可以叠加，其灵敏度特别高p 9 1 ，所以适于2 0 2 5 0 pg 微量蛋白质的测定，可检测的最低蛋白质量达5 p 引。己。坝y 法的缺点：反应在膏l = l o 时才发生，酚试剂仅在酸性条件下稳定，嚣此酚试剂的保存要特别注意。f o l i n - 酚法试剂配制繁琐耗时。酚类和柠檬酸、硫酸铵、t r i s 缓冲液、s d s 、t r i t o n 、甘氨酸、糖类、甘油【2 4 】、还原剂( 如二硫苏糖醇( d 1 了) 、巯基乙醇) 挎l 、嚣d 张和脲转嘲均会干扰反应，以及曼色反应较慢、标准曲线非完全线性等。目前，有l o 、哪法测定生物蛋白含量的文献报道很多，罗芳利用经凯氏定氮法校正的入血清白蛋白为标准，进行f o l i l l 酚试剂法蛋白质定量测定【4 1 1 。吴瑾瑾、石森林等利用f l i 珏1 0 w 搿法测定康克胶囊可溶性蛋自质含量嗽l 。另外，有人对l o 、删法做了进一步的研究，、张莉、李海生等对劳力氏( l o 哪) 法测定蛋自质含量的最佳样品量的考察，对照品及供试品量在约1 2 0 嵋时显色后的吸收度在o 3 以上，符合中国药典附录中的有关要求邓l 。在缩短l o 唧法反应时间，提高效率方面，1 9 8 6 年l a 描滩报道利用温和还原剂d 订加快f o l i 廷试剂还原速度，缩短了分析周期，提高了测定的灵敏度】。d t t 法的原理是：f o l i n 试剂在碱性条件下极不稳定，四元复合物蛋白质钼埤；f o l i l l 试剂的形成可能对结合的f o l i n 试剂起着一种暂时的缓冲保护作用。当反应体系中加入d 玎嚣于，可促使四元复合物中结合的f o l 融试剂进一步充分还原，从而使反应迅速完成，提高了反应的灵敏度。1 9 8 8 年康建对该法进行了改进，改进后的l o 、哪蛋白质测定法已被广泛应用，但存在d t t 价格昂贵的问题m j 。为弥补此不足，石磊、黄德盈等用同样具有两个硫原子的温和还原剂连二翌硫酸钠懋a 2 s 2 瓴) 代替d 翻f ，实验证暖连二亚硫酸钠也可促使露元复合物中结合的f o l 嫩试剂充分还原，使反应迅速完成并增加了色泽强度【4 6 】。本法的灵敏度稍低于d t t 法，但比d t t 法有更高的显色稳定性且价格低廉的优点。但针对大多数普通实验室，由于受到各种条件的限制，仍以常规l o 州法应用广泛。应用l o 畔法测定蛋白质含量时应注意糖、醇、酚、钾、e d 歌等物质对该测定方法有明显的干扰作用，主要表现在增强或减弱显色程度，还原或者破坏福林试剂或产生沉淀等。为了测得准确结果，必须排除干扰物质的影响，一般用蛋白沉淀的方法去除干扰物质。在其有脱氧胆酸钠的情况下，用6 的三氯乙酸可以8一扬州大学硕士学位论文定量流淀蛋鑫，然嚣进行测定。2 。s 考马斯亮蓝g 一2 0 法一考马斯亮蓝g 2 5 0 法简称c b b 法，即b r a d f o r d 法。考马斯亮蓝g 2 5 0 是一种有枫染料，在游离状态下呈经色，在稀酸溶液幸与蛋宣质的碱性氨基酸( 特别是精氨酸) 农芳香族氨基酸残基结合后变为篮色，其最大吸收峰的位置也融4 6 5 髓变为5 9 5 m 【47 1 。蛋白质在1 1 0 0 0 雌范围内，蛋白质色素结合物在5 9 5 蝴波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用予蛋自质的定量测定。c b bg 2 5 0 与蛋白震结合反应十分迅速嚣稳定，2 鞭i 建左右嚣达到平衡，其缝合物室温下l h 内保持稳定1 4 嚣1 。c b bg - 2 5 0 法是题翦灵敏度最高的蛋白质测定方法，最低蛋自质检测量可达l 腭，比f o l i n 。酚法约高4 倍，这是因为蛋白质与染料结合厝产生的颜色反应比l o 靴y 法要大得多蹬蛳。该法方法简便，易于操俸，所用试剂较少，显色裁易于配稍。干扰物质少，如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色【5 0 】。研究表明n a c l 、k c l 、m g c l 2和乙醇等对该方法无干扰1 5 。该法主要问题是线性关系较差 嗍，在蛋自质含量很高时线性编低，这是蠢子染料本身两种状态的颜色光谱有重叠，试剡背景筐隧更多染料与蛋自质结合丽不断降低f 引。郭敏亮等研究发现h + 浓度是影响线性关系的主要因素，控制好显色液的时浓度就能使被测液5 9 5 础的吸光度与蛋白质浓度之间保持较好的线性关系，用 c l 攫鑫c l 缓滓液代替磷酸缓冲液确实能改善标礁超线的线性关系f 捌。不同来源蛋鑫质与考马凝亮蓝 i g - 2 5 0 结合状况有定差异，在制作标准鳇线对可选用y 球蛋白为标准物质以减少这方面的偏差【5 引。此外，仍有强碱性缓冲液、啊t o 1 0 0 、十二烷基硫酸钠( s d s ) 、去污剂等干扰该反应玲3 l ，这可以用适当的缓冲液对照扣除箕影响。考马薪亮蓝g 2 5 0 与蛋自质麴反寂物易附着在院色杯蠹壁上，毖色盈使用翦，要用滔精浸泡，用蒸馏水冲洗予净。2 。6 二辛可酸比色法二辛可酸眈色法简称b c a 法，是近年来发展超来静鬣自浓度测定方法，又称劳里改良法 检测法。这是近年来研制兹种改进k 嶝法，反应简单丽且几乎没有干扰物质的影响。这种方法的原理是在碱性环境下蛋自质分子中的肽键结构能与c u 2 + 络合生成络舍物，同时将c u 2 + 还原成c u + 。赵书景：粮食、镛科幸蛋自覆含量测定方法的研究2而b c a 试剂( b c a ，b i c i n c h o m i l i ca c i d ) 可敏感特异地与c r 结合，形成稳定的有颜色的复合物，在5 6 2 越处有嵩的吸收值，其吸光度与蛋鑫浓度成正沈，线性范围2 0 l o o p 触【5 4 1 。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。此法的优点是试剂单一，终产物稳定，与l o 哪法相比几乎没有干扰物质的影响。但是该方法所需试剂昂贵且反应时间长，蛋白质可能会发生不可逆的变性。2 。7 荧光光度法蛋白质与荧光物质的结合早在免疫工作中就已被应用，目的是为了增加测定蛋自的灵敏度。应用荧光测定蛋自质韵探针有1 苯基8 磺酸( 1 ，8 a n s ) 、曙红y ( e o s i n ey ) 、维生素8 l ( 1 h 搬i 戏) 、铬天青s ( c a s ) 、依来铬青r ( e c r ) 以及荧光胺( f l a ) 。曙红y 在p h = 3 1 和血清白蛋白等蛋白结合，曙红y 的荧光降低( 沁m _ 5 4 0 衄) 。这一性质已经用于测定多种( 老鼠的大脑、肝脏、甲状腺、肌肉、脾脏、心脏等)组织蛋自含量，并获得了成功。本法极其灵敏，但是操作繁杂，故不适用大量样品的分析测定。然而在样品极其珍贵的情况下，此法是一个有效的分析方法。荧光胺是比较好的荧光试剂，它能够与一级胺反应生成荧光性物质。p b o i l l e n等成功的把这一试剂用于蛋白质的荧光检测，可以测定纳克级蛋自质，该法己实现半自动化垮引。在p 珏= 8 的磷酸钠缓冲溶液孛，荧光胺与蛋鑫质中的赖氨酸残基作用。在3 9 0 激发，荧光胺蛋白质复合物产生4 7 5 姗的荧光发射。过量的荧光胺试剂水解成为不发荧光的物质，因而，不存在试剂空白荧光，测定灵敏度高，手工测定快速、简单，于扰l o 唧法的物质在此都不予扰。僵该法有一定的局限性如：仍然存在不同的蛋白荧光胺复合物因赖氨酸残基数量的不同焉有不同的量子产率，这给混合蛋白质样品的测定时蛋白标准物的选择带来了一定的困难。荧光胺同时也与小分子胺以及氨基酸反应，因而不能选用含有氨基的缓冲液。综上所述，露前蛋宣质含量的测定的方法各有优缺点，觊氏定氮法测定食磊中蛋白质以其测定结果的准确及其重复性强而被国内外所广泛采用和认可，常作为其它蛋白质测定方法的校准或定标方